CN110785490A - 用于检测基因组变异和dna甲基化状态的组合物和方法 - Google Patents

用于检测基因组变异和dna甲基化状态的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

在一个方面中，本文提供了一种集成的方法，用于同时检测一个或多个(例如，成千上万个)靶上的基因组变异和DNA甲基化状况/状态的定量，而无需将有限的材料分配给两个不同的工作流程。本公开涉及用于遗传和基因组分析(例如，在特定方面通过多核苷酸测序)的组合物、试剂盒、装置和方法，本文提供了用于基于有限的DNA输入，例如个体体内的循环多核苷酸片段，包括循环肿瘤DNA，构建供同时检测基因组变异和DNA甲基化状态用的文库的组合物、试剂盒和方法。

Description

用于检测基因组变异和DNA甲基化状态的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年4月19日提交的美国临时申请序列号62/487,422的优先权的权益，所述申请的内容以全文引用的方式并入，并适用于所有目的。在某些方面，本公开涉及2017年4月19日提交的美国临时申请序列号62/487,423和2018年4月13日提交的美国临时申请序列号62/657,544，这两个申请的内容以全文引用的方式并入，并适用于所有目的。
技术领域
本公开涉及用于进行遗传和基因组分析(例如通过多核苷酸测序)的组合物、试剂盒、装置和方法。在特定方面，本文提供了组合物、试剂盒和方法，用于基于有限的DNA输入(例如个体体内的循环多核苷酸片段，包括循环肿瘤DNA)，构建用于同时检测基因组变异和DNA甲基化状态的文库。
现有技术
在下面的讨论中，出于背景和介绍目的描述了某些文章和方法。本文中所含的任何内容均不得解释为“承认”现有技术。申请人明确保留在恰当的时候证明此处引用的文章和方法不构成适用法律条文中的现有技术的权利。
哺乳动物(包括人类)细胞通常在CpG二核苷酸处具有DNA甲基化。CpG甲基化的状态通常可以通过至少四种机制确定：(i)亚硫酸氢钠处理将修饰状态转化为不同的遗传密码；(ii)利用抗体或甲基-CpG结合蛋白的亲和力富集；(iii)用甲基敏感性限制酶消化；(iv)通过纳米孔直接测序或用PacBio聚合酶实时监测。根据每次分析的靶数量，可以通过凝胶电泳、实时定量PCR、桑格尔测序(Sanger sequencing)、微阵列、第二代测序或质谱法读取甲基化信息。值得注意的是，尽管全基因组范围的测量为发现目的提供了非常丰富的信息，但许多临床分析只关注有限数量的最能提供信息和最可靠的标志物，并使用PCR、基于杂交的富集或挂锁捕获(padlock capture)来特异性富集待测靶。Laird(2010),“《全基因组DNA甲基化分析的原理和挑战(Principles and challenges of genome-wide DNAmethylation analysis)》,”《自然综述：遗传学(Nat Rev Genet)》11:191-203；和Plongthongkum等人(2014),“《DNA修饰分析的进展：胞嘧啶甲基化以及其它(Advances inthe profiling of DNA modifications:cytosine methylation and beyond)》”,《自然综述：遗传学》15:647-661。通常，基于亚硫酸氢盐的方法在单碱基分辨率下提供绝对定量，这两个都是非常理想的性能。然而，化学处理非常苛刻，并容易导致材料损失，这可能会损害基于低输入样品的分析的灵敏度。
在过去的三十年中，检测和量化生殖系或体细胞遗传变异的方法得到了发展。在临床实验室中已常规实施基于桑格尔测序和实时定量PCR的方法，与此同时基于下一代测序的几种靶向测序方法已开始作为临床测试实施。Rehm(2013).“《疾病靶向测序：临床的基石(Disease-targeted sequencing:a cornerstone in the clinic)》”,《自然综述：遗传学》14:295-300。这些测试通常使用杂交捕获方法、多重PCR或使用锁式探针或选择器的环化捕获。这些方法在可放大性、均匀性、文库转化效率和分析成本方面有所不同。
许多临床样品中含有数量有限的DNA分子，这些DNA分子经常会降解或断裂。对于多种诊断目的，获得多层信息以对疾病状态或疾病类型进行准确而具体的预测将是有益的。人们越来越需要能够从量非常有限的DNA材料中有效读出基因组学和表观遗传学信息，并且可以在临床实验室中轻松部署和可靠实施的分析。本公开解决了这个需求和其它相关需求。
发明内容
本发明内容并不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。根据包括在附图和所附权利要求书中公开的那些方面的具体描述，所要求保护的主题的其它特征、细节、效用和优点将是显而易见的。
在一个方面，本文提供了一种用于分析样品中的第一靶多核苷酸序列和第二靶多核苷酸序列的甲基化状态的方法，其包含使含有或怀疑含有多核苷酸的样品与甲基化敏感性限制酶(MSRE)接触。在一个方面，MSRE在未被甲基化的残基处选择性切割所述多核苷酸，或在所述残基被甲基化时在所述残基处选择性切割所述多核苷酸。
在另一方面，所述方法包含使用以下各项的混合物，对经过MSRE处理的样品进行多核苷酸扩增：i)用于扩增所述样品中的第一靶多核苷酸序列的第一引物组，和ii)用于分析所述样品中的第二靶多核苷酸序列的甲基化状态的第二引物组。
在任何前述实施方式中，甲基化状态可以是第二靶多核苷酸序列中的残基的甲基化状态，并且所述第二引物组中的一个引物与未被切割的第二靶多核苷酸序列杂交，且与所述组中的另一个引物一起，可以扩增所述未被切割的序列，但不扩增被所述MSRE在所述残基处切割的所述第二靶多核苷酸序列。
在任何前述实施方式中，所述方法可以进一步包含对扩增的多核苷酸进行测序。
在任何前述实施方式中，可以使用来自经过扩增的第一靶多核苷酸序列的测序读段来分析所述第一靶多核苷酸序列。
在任何前述实施方式中，通过比较来自经过扩增的第二靶多核苷酸序列的测序读段的观察数(No)与参考数来分析所述第二靶多核苷酸序列的所述残基的甲基化状态。
在另一方面，本文提供了一种用于分析样品中的第一靶多核苷酸序列和第二靶多核苷酸序列的甲基化状态的方法。在一个实施方式中，所述方法包含：(1)使包含多核苷酸的样品与甲基化敏感性限制酶(MSRE)接触，且所述MSRE在未被甲基化的残基处选择性切割所述多核苷酸，或在所述残基被甲基化时在所述残基处选择性切割所述多核苷酸；(2)使用以下各项的混合物，对来自步骤(1)的所述样品进行多核苷酸扩增：i)用于扩增所述样品中的第一靶多核苷酸序列的第一引物组，和ii)用于分析所述样品中的第二靶多核苷酸序列的甲基化状态的第二引物组，且所述甲基化状态是所述第二靶多核苷酸序列中的残基的甲基化状态，并且所述第二引物组中的一个引物与未被切割的第二靶多核苷酸序列杂交，且与所述组中的另一个引物一起，扩增所述未被切割的序列，但不扩增被所述MSRE在所述残基处切割的所述第二靶多核苷酸序列；以及(3)对步骤(2)中扩增的多核苷酸进行测序，且使用来自经过扩增的第一靶多核苷酸序列的测序读段来分析所述第一靶多核苷酸序列，并且通过比较来自经过扩增的第二靶多核苷酸序列的测序读段的观察数(No)与参考数来分析所述第二靶多核苷酸序列的所述残基的甲基化状态。
在任何前述实施方式中，MSRE可以在未被甲基化的残基处切割所述多核苷酸，且在所述残基被甲基化时不在所述残基处切割。
在任何前述实施方式中，所述方法可以进一步包含对来自未与所述MSRE接触的样品的多核苷酸进行扩增和测序。
在任何前述实施方式中，MSRE可以选自由以下组成的群组：HpaII、SalI、
Figure BDA0002321900100000031
ScrFI、BbeI、NotI、SmaI、XmaI、MboI、BstBI、ClaI、MluI、NaeI、NarI、PvuI、SacII、HhaI以及其任何组合。
在任何前述实施方式中，第一靶多核苷酸序列可以包含遗传或表观遗传信息，例如突变、单核苷酸多态性(SNP)、拷贝数变异(CNV)、DNA修饰(如DNA甲基化)和/或组蛋白修饰。在一个实施方式中，突变包含点突变、插入、缺失、插入/缺失、倒位、截短、融合、易位、扩增或其任何组合。在任何前述实施方式中，遗传或表观遗传信息可以与个体或群体中的病况或疾病相关，例如癌症相关的突变。
在任何前述实施方式中，第二靶多核苷酸序列可以在所述MSRE的识别位点内包含一个或多个CpG位点。在一个实施方式中，在每个CpG位点处，胞嘧啶(C)包含5-甲基部分或5-氢部分。
在任何前述实施方式中，第二靶多核苷酸序列可以包含基因的调控序列，例如启动子区、增强子区、绝缘子区、沉默子区、5'UTR区、3'UTR区或剪接控制区，并且所述一个或多个CpG位点位于所述调控序列内。在一个方面，所述基因与个体或群体中的病况或疾病相关，例如在癌症或肿瘤中过度表达、表达不足、组成性激活、沉默或异位表达的基因。
在任何前述实施方式中，所述样品可以是生物样品。在一个方面，生物样品来自患有或怀疑患有疾病或病况，例如癌症或肿瘤的个体。
在任何前述实施方式中，样品可以包含循环肿瘤DNA(ctDNA)的样品，例如血液、血清、血浆或体液样品，或其任何组合。
在任何前述实施方式中，样品中的多核苷酸可以是或包含双链序列。
在任何前述实施方式中，样品中的多核苷酸可以是或包含单链序列。
在任何前述实施方式中，所述方法可以包含基于序列互补性将所述单链序列转化为双链序列，例如，通过引物延伸转化。
在任何前述实施方式中，第一和第二靶多核苷酸序列可以在所述样品中的相同的分子上或不同的分子上，例如两个不同的DNA片段上。
在任何前述实施方式中，第一和第二靶多核苷酸序列可以在相同的基因上。
在任何前述实施方式中，第一靶多核苷酸序列可以在基因的编码区中，而第二靶多核苷酸序列可以在相同的基因的非编码和/或调节区或用于相同的基因的非编码和/或调节区中。
在任何前述实施方式中，第一和第二靶多核苷酸序列可以在不同的基因上。在一个方面，基因在相同生物通路或网络中起作用。
在任何前述实施方式中，第一和第二靶多核苷酸序列可以在相同或不同的染色体上，或者在相同或不同的染色体外DNA分子(例如线粒体DNA)上，或者一个在染色体上，而另一个在染色体外DNA分子上。
在任何前述实施方式中，扩增步骤可以包含聚合酶链反应(PCR)、逆转录PCR扩增、等位基因特异性PCR(ASPCR)、单碱基延伸(SBE)、等位基因特异性引物延伸(ASPE)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、引物延伸、滚环扩增(RCA)、自主序列复制(3SR)、使用Qβ复制酶、切口平移或环介导的等温扩增(LAMP)或其任何组合。
在任何前述实施方式中，等位基因特异性PCR(ASPCR)可以用于扩增所述第一靶多核苷酸序列，并且所述第一引物组包含至少两个等位基因特异性引物和共同引物。在一个方面，ASPCR使用没有3'至5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。在另一方面，至少两个等位基因特异性引物中的至少一个对癌症突变具有特异性。
在任何前述实施方式中，第二引物组可以包含共同引物和至少两个各自用于所述第二靶多核苷酸序列中的不同CpG位点的引物。
在任何前述实施方式中，所述方法可以进一步包含从经过MSRE处理的样品中纯化多核苷酸，从来自扩增步骤的样品中纯化多核苷酸，和/或在测序步骤之前、期间和/或之后纯化多核苷酸。
在任何前述实施方式中，测序步骤可以包含将测序接头和/或样品特异性条形码与每个多核苷酸连接。在一个方面，连接步骤是使用聚合酶链反应(PCR)进行的。
在任何前述实施方式中，测序可以是高通量测序、数字测序或下一代测序(NGS)，例如Illumina(Solexa)测序、Roche 454测序、离子激流:质子/PGM测序和SOLiD测序。
在任何前述实施方式中，参考数可以是预先确定的(例如，基于文献)或在对所述第一和第二靶多核苷酸序列进行分析时平行确定。在一个方面，参考数是在有或没有使用甲基化不敏感的MSRS的同裂酶的对照反应的情况下，基于对照基因座和/或参考样品的测序读段的预期数(Ne)。
在任何前述实施方式中，样品可以是肿瘤样品，并且参考样品可以来自与肿瘤相邻的正常组织。
在任何前述实施方式中，第二靶多核苷酸序列中的所述残基处的所述甲基化状态是定性或定量读数，例如，如由甲基化水平mC＝No/Ne所指示。
在任何前述实施方式中，所述第一引物组和/或所述第二引物组以任何合适的组合包含表1和/或表2中列出的一个或多个引物。
在任何前述实施方式中，第一引物组可以包含用于选自由以下组成的群组的基因的一个或多个引物：ABCB1、CYP2C19、CYP2C8、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5、DPYD、GSTP1、MTHFR、NQO1、RHEB、SULT1A1、UGT1A1、MPL、JAK1、NRAS、DDR2、PTEN、FGFR2、HRAS、ATM、CBL、KRAS、ERBB3、CDK4、HNF1A、FLT3、RB1、AKT1、IDH2、CDH1、TR53、ERBB2、STAT3、SMAD4、STK11、GNA11、JAK3、PPP2R1A、RET、DNMT3A、ALK、NFE2L2、SF3B1、PIK3CA、ERBB4、GNAS、U2AF1、SLC19A1、SMARCB1、CHEK2、VHL、RAF1、CTNNB1、PDGFRA、KIT、KDR、FBXW7、APC、NEUROG1、CSF1R、NPM1、TPMT、EGFR、MET、SMO、BRAF、EZH2、FGFR1、JAK2、CDKN2A、PAX5、PTCH1、ABL1、NOTCH1、ARAF、MED12、BTK以及其任何组合。
在任何前述实施方式中，来自第一引物组的一个或多个引物可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:61-788中所述的序列或其任何组合。
在任何前述实施方式中，第二引物组可以包含用于选自由以下组成的群组的基因的一个或多个引物：NDRG4、SEPT、MLH1、WTN5A、AGTR1、BMP3、SFRP2、NEUROG1、TFPI2、SDC2以及其任何组合。
在任何前述实施方式中，来自第二引物组的一个或多个引物可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1-60中所述的序列或其任何组合。
在任何前述实施方式中，扩增可以是多重的。
在任何前述实施方式中，可以在单个反应中同时进行所述第一靶多核苷酸序列的分析和所述第二靶多核苷酸序列的甲基化状态的分析。
在任何前述实施方式中，样品中的多核苷酸浓度可以小于约0.1ng/mL，小于约1ng/mL，小于约3ng/mL，小于约5ng/mL，小于约10ng/mL，小于约20ng/mL或小于约100ng/mL。
在任何前述实施方式中，所述方法可以用于诊断和/或预后个体的疾病或病况，预测个体对治疗的反应性，鉴别所述疾病/病况或治疗的药物遗传学标志物，和/或从群体中筛选遗传信息。在一个方面，疾病或病况是癌症或肿瘤，并且所述治疗是癌症或肿瘤治疗。
在另一方面，本文公开了一种试剂盒，其包含：甲基化敏感性限制酶(MSRE)，且所述MSRE在未被甲基化的残基处选择性切割，或在所述残基被甲基化时在所述残基处选择性切割；用于扩增样品中的第一靶多核苷酸序列的第一引物组；和/或用于分析所述样品中的第二靶多核苷酸序列的甲基化状态的第二引物组，且所述甲基化状态是所述第二靶多核苷酸序列中的残基的甲基化状态，并且所述第二引物组中的一个引物与未被切割的第二靶多核苷酸序列杂交，且与所述组中的另一个引物一起，扩增所述未被切割的序列，但不扩增被所述MSRE在所述残基处切割的所述第二靶多核苷酸序列。在一个实施方式中，MSRE选自由以下组成的群组：HpaII、SalI、ScrFI、BbeI、NotI、SmaI、XmaI、MboI、BstBI、ClaI、MluI、NaeI、NarI、PvuI、SacII、HhaI以及其任何组合。
在任何前述实施方式中，第一引物组可以包含至少两个等位基因特异性引物和共同引物。
在任何前述实施方式中，试剂盒可以包含没有3'至5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。
在任何前述实施方式中，试剂盒的第二引物组可以包含共同引物和至少两个各自用于所述第二靶多核苷酸序列中不同CpG位点的引物。
在任何前述实施方式中，试剂盒可以进一步包含用于从样品中纯化多核苷酸的试剂。
在任何前述实施方式中，试剂盒可以进一步包含用于测序的试剂，例如测序接头和/或样品特异性条形码。
在任何前述实施方式中，第一和第二引物组可以例如在试剂盒内的一个小瓶中混合，或者第一和第二引物组可以在单独的小瓶中，并且所述试剂盒可以进一步包含将所述引物的全部或部分进行混合的说明书。
在任何前述实施方式中，试剂盒的第一引物组和/或第二引物组可以以任何合适的组合包含表1和/或表2中列出的一个或多个引物。
在任何前述实施方式中，试剂盒的第一引物组可以包含用于选自由以下组成的群组的基因的一个或多个引物：ABCB1、CYP2C19、CYP2C8、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5、DPYD、GSTP1、MTHFR、NQO1、RHEB、SULT1A1、UGT1A1、MPL、JAK1、NRAS、DDR2、PTEN、FGFR2、HRAS、ATM、CBL、KRAS、ERBB3、CDK4、HNF1A、FLT3、RB1、AKT1、IDH2、CDH1、TR53、ERBB2、STAT3、SMAD4、STK11、GNA11、JAK3、PPP2R1A、RET、DNMT3A、ALK、NFE2L2、SF3B1、PIK3CA、ERBB4、GNAS、U2AF1、SLC19A1、SMARCB1、CHEK2、VHL、RAF1、CTNNB1、PDGFRA、KIT、KDR、FBXW7、APC、NEUROG1、CSF1R、NPM1、TPMT、EGFR、MET、SMO、BRAF、EZH2、FGFR1、JAK2、CDKN2A、PAX5、PTCH1、ABL1、NOTCH1、ARAF、MED12、BTK以及其任何组合。
在任何前述实施方式中，试剂盒的第一引物组可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:61-788中所述的序列或其任何组合。
在任何前述实施方式中，试剂盒的第二引物组可以包含用于选自由以下组成的群组的基因的一个或多个引物：NDRG4、SEPT、MLH1、WTN5A、AGTR1、BMP3、SFRP2、NEUROG1、TFPI2、SDC2以及其任何组合。
在任何前述实施方式中，试剂盒的第二引物组可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1-60中所述的序列或其任何组合。
在任何前述实施方式中，试剂盒可以进一步包含将测序读段的观察数与参考数进行比较的说明书。在一个实施方式中，试剂盒进一步包含参考样品和/或对照基因座的信息。
在任何前述实施方式中，试剂盒可以进一步包含用于一种或多种组分的单独的小瓶和/或使用所述试剂盒的说明书。
附图的简要说明
图1是根据本公开的一个方面的MSA-Seq(甲基化特异性扩增测序)方法的概述。
图2显示了使用来自癌细胞系HCT116的片段化基因组DNA(其在24CpG位点被甲基化)与来自NA12878的基因组DNA(其在所有这些位点均未被甲基化)的合成DNA混合物(1％、5％、10％、20％、50％)进行分析性能的验证。一式三份地对这些混合物进行MSA-seq。
图3显示了用于肿瘤聚类的MSMC-Seq定量的CpG甲基化。MSMC代表多重顺序马尔可夫溯祖(Multiple Sequentially Markovian Coalescent)，一种将多个基因组序列聚类的方法，在这种情况下，MSMC基于量化的CpG甲基化进行肿瘤亚组的无偏层次聚类。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了许多具体细节，以便提供对本公开的透彻理解。提供这些细节是出于示例的目的，并且所要求保护的主题可以根据权利要求来实践，而无需这些特定细节中的一些或全部。应该理解的是，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以使用其它实施方式并且可以进行结构上的改变。应当理解，在一个或多个单独实施方式中描述的各种特征和功能的适用性不限于描述它们的特定实施方式。相反，它们可以被单独地或以某种组合地应用于本公开的一个或多个其它实施方式，而不管是否描述了这样的实施方式，以及这些特征是否被表示为所描述的实施方式的一部分。为了清楚起见，没有详细描述与所要求保护的主题有关的技术领域中已知的技术材料，从而避免使所要求保护的主题模糊。
本申请中提及的所有出版物，包括专利文件、科学文章和数据库，以全文引用的方式并入，并适用于所有目的，其程度与每个单独出版物以引用的方式分别并入的程度相同。引用出版物或文档并不意味着承认它们中的任一者是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文档的内容或日期的任何承认。
所有标题都是为了方便读者，除非另有说明，否则不应将其用于限制标题后面的文字的含义。
除非另有说明，否则提供的实施方式的实施将采用常规技术和有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和测序技术的描述，这些都是本领域技术人员的能力范围内的。这样的常规技术包括多肽和蛋白质的合成和修饰、多核苷酸的合成和修饰、聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接、杂交的检测以及核苷酸测序。合适的技术的具体说明可参考本文的实例。然而，当然也可以使用其它等效的常规程序。这样的常规技术和描述可以在标准实验室手册中找到，例如Green等人编,《基因组分析：实验室手册系列(Genome Analysis:A Laboratory Manual Series)》(第I-IV卷)(1999)；Weiner,Gabriel,Stephens编,《遗传变异：实验室手册(Genetic Variation:A LaboratoryManual)》(2007)；Dieffenbach,Dveksler编,《(PCR Primer:A Laboratory Manual)》(2003)；Bowtell和Sambrook,《DNA微阵列：分子克隆手册(DNA Microarrays:A MolecularCloning Manual)》(2003)；Mount,《生物信息学：序列与基因组分析(Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis)》(2004)；Sambrook和Russell,《分子克隆的精简方案：实验室手册(Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(2006)；和Sambrook和Russell,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》(2002)(均来自冷泉港实验室出版社)；Ausubel等人编,《分子生物学的当前方案(Current Protocols in Molecular Biology)》(1987)；T.Brown编,《基础分子生物学(Essential Molecular Biology)》(1991),IRL Press；Goeddel编,《基因表达技术(Gene Expression Technology)》(1991),Academic Press；A.Bothwell等人编,《真核基因的克隆和分析方法(Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes)》(1990),Bartlett Publ.；M.Kriegler,《基因转移和表达(Gene Transfer andExpression)》(1990),Stockton Press；R.Wu等人编,《重组DNA方法论(Recombinant DNAMethodology)》(1989),Academic Press；M.McPherson等人,《PCR：实用方法(PCR:APractical Approach)》(1991),Oxford University Press的IRL Press；Stryer,《生物化学(Biochemistry)》(第4版)(1995),W.H.Freeman,New York N.Y.；Gait,《寡核苷酸合成：实用方法(Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach)》(2002),IRL Press,London；Nelson和Cox,Lehninger,《生物化学原理(Principles of Biochemistry)》(2000)第3版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；Berg等人,《生物化学(Biochemistry)》(2002)第5版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.，所有这些标准实验室手册以全文引用的方式并入本文中，并适用于所有目的。
A.定义
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如果本章节中提出的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其它出版物中提出的定义相反或以其它方式不一致，则本章节中提出的定义优先于以引用的方式并入本文中的定义。
如本文所用，“一个(a/an)”意指“至少一个”或“一个或多个”。如本文所用，单数形式的“一个”和“所述”包括复数个引用物，除非上下文另外明确指出。
在整个本公开中，以范围格式呈现了所要求保护的主题的各个方面。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的固定的限制。因此，应该认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在所述范围的上限与下限之间的每个中间值以及所陈述范围内的任何其它指定的值或中间值都涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，但要遵守所陈述范围内的任何明确排除的限制。在陈述的范围包括一个或两个界限的情况下，所要求保护的主题中还包括排除那些包括的界限中的一个或两个的范围。无论范围的广度如何，这都适用。
本文中所提及的“约”某值或参数包括(并描述)指向该值或参数本身的变量。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。另外，在任何数字系列之前使用“约”包括在所述系列中的“约”每个列举的数字。例如，提及“约X、Y或Z”的描述旨在描述“约X、约Y或约Z”。
除非上下文另外明确指出，否则本文所用的术语“平均”是指平均值或中值，或用于近似于平均值或中值的任何值。
如本文所用，“个体”是指可以对其施用或施加所提供的组合物、方法、试剂盒、装置和系统的生物体或生物体的一部分或组分。例如，个体可以是哺乳动物或哺乳动物的细胞、组织、器官或一部分。如本文所用，“哺乳动物”是指任何种类的哺乳动物，优选人类(包括人类、人类个体或人类患者)。哺乳动物包括但不限于家畜、竞技动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫和啮齿动物，例如小鼠和大鼠。
如本文所用，术语“样品”是指因可能含有靶分子而需要对其进行分析的任何物质，包括生物样品。如本文所用，“生物样品”可以指从活的或病毒来源或其他大分子和生物分子来源获得的任何样品，并且包括个体中任何可以从其获得核酸、蛋白质和/或其它大分子的细胞类型或组织。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。例如，经过扩增的被分离核酸构成生物学样品。生物样品包括但不限于体液(例如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水等、积液、骨髓样品、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液)，鼻、喉或生殖器拭子的提取物，来自消化的组织的细胞悬浮液，或粪便提取物，以及来自动植物的组织和器官样品和由其衍生的经处理的样品。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，并且包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和其类似物或混合物。所述术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。其还包括例如通过烷基化和/或通过加帽修饰的多核苷酸，和未修饰形式的多核苷酸。更具体地说，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)；多核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA和mRNA，无论是剪接的还是未剪接的；作为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其它类型的多核苷酸；以及含有非核苷酸主链的其它聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸(“PNA”))和多吗啉代(可作为Neugene商购自Anti-Virals,Inc.,Corvallis,OR)聚合物；以及其它合成的序列特异性核酸聚合物，条件是所述聚合物以可使碱基配对和堆叠的方式含有核碱基，例如在DNA和RNA中所见。因此，这些术语包括例如3'-脱氧-2',5'-DNA；寡脱氧核糖核苷酸N3'→P5'氨基磷酸酯；2'-O-烷基取代的RNA；DNA与RNA之间或PNA与DNA或RNA之间的杂合体；并且还包括已知类型的修饰，例如标记、烷基化、“帽”、一个或多个核苷酸被类似物取代、核苷酸间修饰(例如具有不带电荷的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯，氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带负电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)和带正电荷的键(例如，氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯)的修饰)、含有侧链部分的修饰(例如蛋白质(包括酶(例如核酸酶)、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等))、具有插层(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合物(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷基化剂的修饰、具有修饰键(例如α异头核酸等)的修饰以及未修饰形式的多核苷酸或寡核苷酸。核酸通常会含有磷酸二酯键，不过在某些情况下，可能包括核酸类似物，其具有替代主链，例如亚磷酰胺、二硫代磷酸酯或甲基亚磷酰胺键；或肽核酸骨架和键。其它类似物核酸包括具有双环结构的那些，包括锁核酸、正骨架(positive backbones)、非离子骨架和非核糖骨架。可以进行核糖-磷酸骨架的修饰以增加分子的稳定性。例如，PNA:DNA杂合体在某些环境中可以表现出更高的稳定性。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可以包含任何合适的长度，例如至少5、6、7、8、9、10、20、30、40、50，100、200、300、400、500、1,000个或更多个核苷酸。
应当理解，如本文所用，术语“核苷”和“核苷酸”包括不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，而且还含有已被修饰的其它杂环碱基的那些部分。这样的修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶或其它杂环。修饰的核苷或核苷酸还可以包括对糖部分的修饰，例如其中一个或多个羟基被卤素、脂肪族基团置换，或被官能化为醚、胺等。术语“核苷酸单位”旨在涵盖核苷和核苷酸。
术语“互补的”和“基本上互补的”包括在核苷酸或核酸之间，例如在双链DNA分子的两条链之间或在寡核苷酸引物与单链核酸上的引物结合位点之间的杂交或碱基配对或双链体形成。互补核苷酸通常是A和T(或A和U)或C和G。当一条链的核苷酸进行最佳比对并比较时，两个单链RNA或DNA分子被称为基本上互补，且在有适当的核苷酸插入或缺失的情况下，与另一条链的至少约80％配对，通常至少约90％到约95％，且甚到约98％到约100％。在一个方面，核苷酸的两个互补序列能够杂交，在相对的核苷酸之间的错配优选少于25％、更优选地少于15％、甚至更优选地少于5％、最优选地没有错配。优选地，两个分子将在高严格条件下杂交。
如本文所用，对于参考序列，反向互补序列是呈反向次序的参考序列的互补序列。例如，对于5'-ATCG-3'，互补序列是3'-TAGC-5'，而反向互补序列是5'-CGAT-3'。
如本文所用，“杂交”可以指其中两个单链多核苷酸非共价结合以形成稳定的双链多核苷酸的过程。在一个方面，所得的双链多核苷酸可以是“杂合体”或“双链体”。“杂交条件”通常会包括低于约1M、更通常的是低于约500mM且可能低于约200mM的盐浓度。“杂交缓冲液”包括缓冲盐溶液，如5％SSPE或本领域已知的其它此类缓冲液。杂交温度可以低至5℃，但通常大于22℃，且更通常大于约30℃，并且通常超过37℃。杂交通常在严格条件下进行，即，在所述条件下，一个序列将与其靶序列杂交而不会与其它非互补序列杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下有所不同。例如，更长的片段可能需要比短片段更高的杂交温度才能进行特异性杂交。由于其它因素可能会影响杂交的严格性，包括碱基组成和互补链的长度、有机溶剂的存在以及碱基错配的程度，因此参数组合比单独使用任何一个参数的绝对度量值更为重要。通常，在确定的离子强度和pH值下，严格条件的选择应比特定序列的Tm低约5℃。解链温度Tm可以是一群双链核酸分子一半解离成单链的温度。用于计算核酸的Tm的几个方程式是本领域众所周知的。如标准参考文献所示，当核酸在1M NaCl的水溶液中时，可以通过方程式Tm＝81.5+0.41(G+C％)计算出Tm值的简单估计值(例如，参见Anderson和Young,《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》中的《定量过滤杂交(Quantitative Filter Hybridization)》(1985))。其它参考文献(例如，Allawi和SantaLucia,Jr.,《生物化学(Biochemistry)》,36:10581-94(1997))包括将结构和环境以及序列特征考虑在内的替代计算方法来计算Tm。
大体上，杂合体的稳定性是离子浓度和温度的函数。通常，杂交反应在较低严格性的条件下进行，然后进行严格性不同但更高的洗涤。示例性的严格条件包括在约7.0到约8.3的pH和至少25℃的温度下至少0.01M至不超过1M的钠离子浓度(或其它盐)的盐浓度。例如，5×SSPE(750mM NaCl、50mM磷酸钠、5mM EDTA，在pH 7.4下)和温度约30℃的条件适用于等位基因特异性杂交，不过合适的温度取决于杂交区域的长度和/或GC含量。在一个方面，用于确定错配百分比的“杂交严格性”可以如下：1)高严格性：0.1×SSPE、0.1％SDS、65℃；2)中严格性：0.2×SSPE、0.1％SDS、50℃(也称为中等严格性)；和3)低严格性：1.0×SSPE、0.1％SDS、50℃。应理解，使用其他的缓冲液、盐和温度也可以达到等效的严格性，例如，中等严格性杂交可以是指允许核酸分子(例如探针)结合互补核酸分子的条件，杂交的核酸分子通常具有至少60％的同一性，包括例如至少70％、75％、80％、85％、90％或95％一致性中的任何一种。中等严格性条件可以是等同于以下的条件：在42℃下在50％甲酰胺、5×丹哈特氏溶液(Denhardt's solution)、5×SSPE、0.2％SDS中杂交，然后在42℃下在0.2×SSPE、0.2％SDS中洗涤。高严格性条件可以例如通过以下提供：在42℃下在50％甲酰胺、5×丹哈特氏溶液、5×SSPE、0.2％SDS中杂交，然后在65℃下在0.1×SSPE和0.1％SDS中洗涤。低严格性杂交可以指等同于以下的条件：在22℃下在10％甲酰胺、5×丹哈特氏溶液、6×SSPE、0.2％SDS中杂交，然后在37℃下在1×SSPE、0.2％SDS中洗涤。丹哈特氏溶液含有1％Ficoll、1％聚乙烯吡咯烷酮和1％牛血清白蛋白(BSA)。20×SSPE(氯化钠、磷酸钠、EDTA)含有3M氯化钠、0.2M磷酸钠和0.025M EDTA。其它合适的中等严格性和高严格性杂交缓冲液和条件是本领域技术人员众所周知的，并且描述于例如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第2版,冷泉港出版社(Cold SpringHarbor Press),Plainview,N.Y.(1989)；和Ausubel等人,《分子生物学中的简短方案(Short Protocols in Molecular Biology)》,第4版,John Wiley&Sons(1999)。
另外，当RNA或DNA链在选择性杂交条件下与其互补链杂交时，存在实质上的互补。通常，当在一段至少14至25个核苷酸上具有至少约65％的互补性，优选至少约75％，更优选至少约90％的互补性时，将发生选择性杂交。参见M.Kanehisa,《核酸研究(Nucleic AcidsRes.)》12:203(1984)。
本文所用的“引物”可以是天然的或合成的寡核苷酸，其在与多核苷酸模板形成双链体后能够充当核酸合成的起始点，并从其3'端沿模板延伸，从而形成经过延伸的双链体。在延伸过程期间添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列确定。引物通常通过聚合酶，例如DNA聚合酶延伸。
“连接”可以指在模板驱动的反应中，在两个或更多个核酸(例如寡核苷酸和/或多核苷酸)的末端之间形成共价键或键联。所述键或键联的本质可以是广泛多样的，而且连接可以是以酶促方式进行的。如本文所用，连接一般以酶促方式进行，以在一个寡核苷酸的末端核苷酸的5'碳与另一个核苷酸的3'碳之间形成磷酸二酯键联。
如本文所用，“扩增”通常是指产生多个拷贝的所需序列的过程。“多个拷贝”意指至少2个拷贝。“拷贝”并不一定意味着与模板序列具有完美的序列互补性或一致性。例如，拷贝可以包括在扩增期间出现的核苷酸类似物(例如脱氧肌苷)、有意的序列改变(例如通过包含与模板可杂交但不互补的序列的引物引入的序列改变)和/或序列错误。
“序列测定”等包括测定与核酸的核苷酸碱基序列有关的信息。这样的信息可以包括核酸的部分以及全部序列信息的鉴别或测定。可以以不同程度的统计可靠性或置信度来确定序列信息。在一个方面，所述术语包括确定核酸中多个连续核苷酸的身份和顺序。
术语“测序”、“高通量测序”或“下一代测序”包括使用以本质上平行的方式测定许多(通常成千上万个)核酸序列的方法进行序列测定，即准备用于测序的DNA模板不是一次一个，而是一次批量处理，并且大量序列优选并行读取，或者使用本身可以并行化的超高通量串行过程读取。这样的方法包括但不限于焦磷酸测序(例如，如由454Life Sciences,Inc.提供，康涅狄格州布兰福德(Branford,CT))；连接法测序(例如，如在SOLiDTM技术中，由Life Technologies,Inc.提供，加利福尼亚卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))；使用修饰的核苷酸边合成边测序(如由以下生产商提供：加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA)的Illumina，Inc.的TruSeqTM和HiSeqTM技术；马萨诸塞州剑桥(Cambridge,MA)的HelicosBiosciences Corporation的HeliScopeTM；加利福尼亚门洛帕克(Menlo Park,CA)的Pacific Biosciences of California,Inc.的PacBio RS)；通过离子检测技术测序(例如Ion TorrentTM技术，加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies))；DNA纳米球的测序(Complete Genomics,Inc.，加利福尼亚州山景城(Mountain View,CA))；基于纳米孔的测序技术(例如，由英国牛津(Oxford,UK)的Oxford Nanopore Technologies,LTD开发)，以及类似的高度并行的测序方法。
“SNP”或“单核苷酸多态性”可以包括个体之间的遗传变异；例如，生物体DNA中的单个含氮碱基位置是可变的。SNP的存在遍及整个基因组；个体之间的许多遗传变异是由于SNP位点的变异，通常这种遗传变异会导致个体之间的表型变异。本公开中使用的SNP和其各自的等位基因可以来自许多来源，例如公共数据库(加州大学圣克鲁兹分校人类基因组浏览器网关(U.C.Santa Cruz Human Genome Browser Gateway)(genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)或NCBI dbSNP网站(ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)，或可以如美国专利第6,969,589号和标题为“《人类基因组多态性(Human Genomic Polymorphisms)》”的美国公开第2006/0188875号中所述通过实验方式确定。尽管在本文呈现的一些实施方式中描述了SNP的使用，但应当理解，也可以使用其它双等位基因或多等位基因遗传标志物。双等位基因遗传标志物具有两种多态形式或等位基因。如上所述对于与性状相关的双等位基因标志物，与对照组相比在病例组的遗传组成中更丰富的等位基因称为“相关等位基因”，而另一等位基因可以称为“非相关等位基因”。因此，对于与给定性状(例如疾病或药物反应)相关的每个双等位基因多态性，存在相应的相关等位基因。可以与本文提出的方法一起使用的其它双等位基因多态性包括但不限于多核苷酸改变、插入、缺失和易位。
将进一步理解的是，本文中提及的DNA可以包括基因组DNA、线粒体DNA、游离型DNA和/或DNA的衍生物，例如扩增子、RNA转录物、cDNA、DNA类似物等。在关联研究中筛选的多态性基因座可能处于二倍体或单倍体状态，且理想情况下，将来自跨越基因组范围的多个位点。测序技术可以用于SNP测序，例如可以使用BeadArray平台(GOLDENGATETM分析)(Illumina,Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥)(参见Fan等人,冷泉港定量生物学研讨会(ColdSpring Symp.Quant.Biol.),68:69-78(2003))。
在一些实施方式中，术语“甲基化状况”或“甲基化状态”是指在DNA序列内的一个或多个CpG二核苷酸处存在或不存在5-甲基胞嘧啶(“5-mC”或“5-mCyt”)。DNA序列内一个或多个特定CpG甲基化位点(各自具有两个CpG二核苷酸序列)的甲基化状态包括“未甲基化”、“完全甲基化”和“半甲基化”。术语“半-甲基化”或“半甲基化”是指其中仅一条链被甲基化的双链DNA的甲基化状态。术语“高甲基化”是指受测DNA样品的DNA序列中这样的一种平均甲基化状态，其对应于在一个或多个CpG二核苷酸处相对于在正常对照DNA样品中的相应CpG二核苷酸处发现的5-mCyt的量增加。术语“低甲基化”是指受测DNA样品的DNA序列中这样的一种平均甲基化状态，其对应于在一个或多个CpG二核苷酸处相对于在正常对照DNA样品中的相应CpG二核苷酸处发现的5-mCyt的量减少。
本文中的“多重”或“多重分析”可以指其中可以通过使用多于一种标志物同时分析多个靶(例如多个核酸序列的存在和/或量)的分析或其它分析方法，所述多于一种标志物各自具有至少一种不同的检测特征，例如荧光特征(例如激发波长、发射波长、发射强度、FWHM(半峰全宽)或荧光寿命)或独特的核酸或蛋白质序列特征。
如本文所用，“疾病或病况”是指生物体中由例如感染或遗传缺陷引起的病理状况，并以可识别的症状为特征。
B.遗传变异检测.
突变的DNA分子具有特异性，因此比癌症相关的生物标志物具有独特的优势。尽管个别正常细胞中的突变发生率较低(约10～9至10～10个突变/bp/世代)，但此类突变仅占全部正常DNA的很小一部分，以致它们比某些现有技术方法的检出限低数个数量级。数项研究表明，可以在CRC患者的粪便、尿液和血液中检测到突变型DNA(Osbom和Ahlquist,《大肠癌的粪便筛查：分子方法(Stool screening for colorectal cancer:molecularapproaches)》,《胃肠病学(Gastroenterology)》2005；128:192-206)。
基于测序结果，可以检测患者中的突变体DNA(包括肿瘤相关的突变)，并且可以诊断如癌症的疾病并预测肿瘤复发。基于这些预测，可以做出治疗和监视决策。例如，指示未来复发的循环肿瘤DNA可以带来附加的或更积极的疗法以及其它或更复杂的成像和监测。循环DNA是指异位于肿瘤的DNA。
可以分析的样品包括血液和粪便。血液样品可以是例如血液的级分，例如血清或血浆。类似地，粪便可以分级分离以从其它成分中纯化DNA。肿瘤样品用于鉴别肿瘤中的体细胞突变基因，所述基因可用作体内其它位置的肿瘤的标志物。因此，例如，可以通过本领域已知的任何标准方法鉴别肿瘤中的特定体细胞突变。典型的方法包括使用等位基因特异性探针对肿瘤DNA进行直接测序、等位基因特异性扩增、引物延伸等。一旦识别出体细胞突变，就可以将其用于身体其它部位，以区分来源于肿瘤的DNA与来源于身体其它细胞的DNA。通过确定体细胞突变不会在同一患者身体的正常组织中出现，可以对其进行确认。可以以此方式诊断和/或监测的肿瘤类型实际上是没有限制的。可以使用任何使细胞和/或DNA脱落到血液或粪便或其它体液中的肿瘤。除结肠直肠肿瘤外，此类肿瘤还包括乳腺、肺、肾、肝、胰腺、胃、脑、头颈、淋巴、卵巢、子宫、骨、血液等的肿瘤。
在一个方面，高度平行的下一代测序方法用于分析样品中的靶序列，以检测与疾病或病况例如癌症相关的遗传变异。这样的测序方法可以例如使用单程测序方法或使用配对末端测序来进行。下一代测序方法包括但不限于基于杂交的方法，例如公开在Drmanac的美国专利第6,864,052号、第6,309,824号和第6,401,267号；Drmanac等人,U.S.专利公开2005/0191656；，以及边合成边测序方法，例如Nyren等人,美国专利第6,210,891号；Ronaghi,美国专利第6,828,100号；Ronaghi等人,(1998),《科学(Science)》,281:363-365；Balasubramanian,美国专利第6,833,246号；Quake,美国专利第6,911,345号；Li等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci)》,100:414-419(2003)；Smith等人,PCT公开WO2006/074351；使用可逆延伸终止子，例如Turner,美国专利第6,833,246号和Turner,美国专利第6,833,246号；和基于连接的方法，例如，Shendure等人(2005),《科学》,309:1728-1739；Macevicz,美国专利第6,306,597号；Soddart等人,《美国国家科学院院刊(PNASUSA)》.2009年4月20日；Xiao等人,《自然-方法》.2009年3月；6(3):199-201，所有这些参考文献通过引用并入本文，并适用于所有目的。
对于Illumina测序，这些构建体在每一端均具有流通池结合位点P5和P7，这些位点可使文库片段附着至流通池表面。单链文库片段的P5和P7区与流通池表面的互补寡核苷酸粘合。流动细胞寡核苷酸充当引物，并合成与文库片段互补的链。然后，原始链被洗去，留下与流通池表面以混合方向共价结合的片段拷贝。然后通过桥式扩增产生每个片段的拷贝，产生簇。然后，切割P5区，产生仅含有由P7区连接的片段的簇。这样可以确保所有拷贝都按相同方向测序。测序引物粘合至片段的P5末端，并开始边合成边测序的程序。当样品带有条形码时，将执行索引读取。当读段1完成后，将除去来自读段1的所有东西并添加索引引物，所述引物在片段的P7末端粘合并对条形码进行测序。然后，将所有东西从模板上剥离下来，然后通过桥式扩增如在读段1形成簇。这留下了与流通池表面以混合方向共价结合的片段拷贝。这次，切割P7，而非P5，从而产生仅含有由P5区连接的片段的簇。这样可以确保所有拷贝都按相同方向(与读段1相反)测序。测序引物粘合至P7区并测序模板的另一端。
下一代测序平台，例如MiSeq(Illumina Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥)，也可以用于高度多重分析读数。各种统计工具，例如比例检验、基于错误发现率的多重比较校正(参见Benjamini和Hochberg,1995,《英国皇家统计学会会刊系列B(方法学)(Journal of theRoyal Statistical Society Series B(Methodological))》57,289-300)和多重检验的邦费罗尼校正(Bonferroni correction)，可以用于分析这些分析结果。此外，为从RNA-Seq数据分析差异表达而开发的方法可以用于减少每个靶序列的差异并增加分析的总体能力。参见Smyth,2004,《遗传学和分子生物学中的统计应用(Stat.Appl.Genet.Mol.Biol.)》3,文章3。
在任何前述实施方式中，所述方法可以用于诊断和/或预后个体的疾病或病况，预测个体对治疗的反应性，鉴别所述疾病/病况或治疗的药物遗传学标志物，和/或从群体中筛选遗传信息。在一个方面，疾病或病况是癌症或肿瘤，并且所述治疗是癌症或肿瘤治疗。
在一些实施方式中，本文公开的所关注的核酸分子是无细胞DNA，例如无细胞的胎儿DNA(也称为“cfDNA”)或ctDNA。cfDNA在怀孕母亲的体内(例如血液中)循环并代表胎儿基因组，而ctDNA在癌症患者的体内(例如血液中)循环，并且通常是预先片段化的。在其它实施方式中，本文公开的所关注的核酸分子是古老的和/或受损的DNA，例如归因于储存在破坏性条件下，例如在福尔马林固定的样品或部分消化的样品中的。
随着癌细胞的死亡，它们将DNA释放到血液中。这种DNA被称为ctDNA，是高度片段化的，平均长度约为150个碱基对。一旦去除了白细胞，ctDNA通常仅占剩余血浆DNA的很小一部分，例如，ctDNA可能构成血浆DNA的不到约10％。通常，此百分比小于约1％，例如小于约0.5％或小于约0.01％。另外，血浆DNA的总量通常非常低，例如约10ng/mL血浆。
如果样品中存在突变序列，可将DNA样品与使得特异性扩增该突变序列的引物接触。“特异性扩增”意指该引物扩增特定的突变序列，而不扩增其它突变序列或野生型序列。基于等位基因特异性扩增的方法或基于延伸的方法描述于WO 93/22456和美国专利第4,851,331号、第5,137,806号、第5,595,890号和第5,639,611号，其有关教导均以引用的方式特意并入到本文中。尽管可以使用诸如连接酶链反应、链置换分析和各种基于转录的扩增方法的方法(参见例如Abramson和Myers,《现代生物技术杂志(Current Opinion inBiotechnology)》4:41-47(1993)的综述)，但可以使用PCR和/或测序方法。
多个等位基因特异性引物，例如多个突变体等位基因或野生型和突变体等位基因的各种组合，可以在单个扩增和/或测序反应中同时使用。扩增产物可以通过不同的标签或大小来区分。
C.DNA甲基化和分析。
DNA甲基化是首先发现的表观遗传标志。表观遗传学是对除基本的DNA序列变化以外的机制引起的基因表达或细胞表型变化的研究。甲基化主要涉及在二核苷酸CpG的胞嘧啶残基的碳5位上添加甲基，并与阻遏或抑制转录活性有关。
DNA甲基化可能以两种方式影响基因的转录。首先，DNA本身的甲基化可能在物理上阻碍转录蛋白与基因的结合，其次，可能更重要的是，甲基化的DNA可以被称为甲基-CpG结合域蛋白(MBD)的蛋白结合。MBD蛋白然后将其它蛋白募集到该位点，例如组蛋白脱乙酰基酶和其它可以修饰组蛋白的染色质重塑蛋白，从而形成致密的、无活性的染色质，称为异染色质。DNA甲基化与染色质结构之间的这一联系非常重要。尤其是，甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)的丢失与雷特综合症(Rett syndrome)有关；且甲基-CpG结合域蛋白2(MBD2)介导癌症中高甲基化基因的转录沉默。
DNA甲基化是基因转录的重要调节者，且大量证据表明，在其启动子区中具有高水平5-甲基胞嘧啶的基因在转录上是沉默的，并且DNA甲基化在长期的基因沉默后逐渐积累。DNA甲基化在胚胎发育过程中至关重要，且在体细胞中，DNA甲基化模式通常以高保真度传递给子细胞。与正常组织相比，异常的DNA甲基化模式(高甲基化和低甲基化)与大量人类恶性肿瘤有关。高甲基化通常发生在启动子区中的CpG岛处，并与基因失活有关。整体低甲基化也通过不同机制与癌症的发展和进展有牵连。
因此，甲基化DNA的检测可以用于某些癌症的诊断，以及用于例如跟进治疗功效。例如，WO1998056952A1公开了一种基于特定CpG位点的DNA甲基化差异的癌症诊断方法，且所述方法包含对DNA进行亚硫酸氢盐处理，然后进行甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)，以确定链特异性的胞嘧啶残基甲基化状态。U.S.8,541,207B2公开了用基因阵列分析DNA的甲基化状态的方法。WO2005123942A2公开了一种用于分析DNA中的甲基化模式并鉴别疾病组织中异常甲基化基因的方法。WO2005071106A1、WO2003074730A1、EP1342794A1、EP1461458A2、EP1360317A2、U.S.7,524,629 B2、WO2000070090A1、WO2000026401A1、US20060134650A1和U.S.7,247,428B2中公开了其它检测胞嘧啶甲基化的方法。本段中的所有专利文件均以引用的方式并入本文中，并适用于所有目的。
已证明亚硫酸氢盐测序适用的一个癌症实例是用于结肠直肠癌的筛查，其中甲基化的Septin 9(mS9)的检测被用作生物标志物。亚硫酸氢盐转化的靶序列的其它实例是食道鳞状细胞癌(Baba等人,《今日外科学(Surg.Today)》,2013)、乳腺癌(Dagdemir等人,《体内(In vivo)》,2013,27(1):1-9)、前列腺癌(Willard和Koochekpour,《美国癌症研究杂志(Am.J.Cancer Res.)》2012,2(6):620-657)、非霍奇金淋巴瘤(Yin等人,《遗传学前沿(Front Genet)》,2012,3:233)、口腔癌(Gasche和Goel,《未来肿瘤学(Future Onocol.)》,2012,8(11):1407-1425)等。本领域普通技术人员将认识到，本发明的方法可应用于并且容易地适应于这些和其它已知至少部分表现出靶基因序列的高甲基化或低甲基化的癌症的改进的检测。同样地，通过应用本文所公开的方法，本领域技术人员已知的其他高甲基化和/或低甲基化构成部分已知病因的医学病况也将获得改进的检测，以用于诊断和/或预后和/或作为伴随诊断。
亚硫酸氢盐转化是使用亚硫酸氢盐试剂处理DNA以确定其甲基化模式。用亚硫酸氢盐处理DNA将胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，但5-甲基胞嘧啶残基不受影响。因此，亚硫酸氢盐处理在DNA序列中引入了特定的变化，这些变化取决于各个胞嘧啶残基的甲基化状态。可以对改变的序列进行各种分析以获得这些信息，例如，用于区分由亚硫酸氢盐转化产生的单核苷酸多态性(SNP)。美国专利第7,620,386号、美国专利第9,365,902号和美国专利申请公开2006/0134643(其全部以引用的方式并入本文中)举例说明了本领域普通技术人员已知的关于检测由于亚硫酸氢盐转化而改变的序列的方法。然而，亚硫酸氢盐转化的一个结果是原始靶的双链构象由于序列互补性的丧失而被破坏。此外，亚硫酸氢盐转化是一种苛刻的处理，往往会导致材料损失，这可能会损害低输入样品的分析灵敏度，例如无细胞DNA，包括循环肿瘤DNA(也称为“无细胞肿瘤DNA”)或“ctDNA”)。
D.在有限的样品输入上同时检测遗传变异和DNA甲基化.
对于第一代和第二代测序，很难同时检测遗传变异和DNA甲基化，特别是当输入DNA量很低并且有限的输入需要进一步划分给两个单独的工作流程时，即，一部分用于遗传变异检测，而另一部分用于DNA甲基化分析。
Flusberg等人(2010)"《在单分子实时测序过程中直接检测DNA甲基化(Directdetection of DNA methylation during single-molecule,real-time sequencing)》",《自然-方法(Nat.Methods)》7:461-465和Manrao等人(2012)"《用突变的MspA纳米孔和phi29 DNA聚合酶以单核苷酸分辨率读取DNA(Reading DNA at single-nucleotideresolution with a mutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase)》",《自然-生物科技(Nat.Biotechnol)》30:349-353尝试将第三代测序与DNA甲基化分析相结合。但是，它们的检测准确度很低，远远不足以进行常规临床测试。
在一个方面，本文公开了一种方法(MSA-seq)，用于有效定量多个CpG位点的DNA甲基化状态，并同时检测和定量多个靶上的遗传变异。在一些实施方式中，首先用甲基化敏感性限制酶(例如Hap 11和/或Sa/I)消化输入DNA(例如ctDNA)，然后进行所分析靶的多重扩增和下一代测序(图1，左图)。通过相对读段深度推断靶CpG位点的甲基化水平，而从原始测序读段中调用遗传变异(图1，右图)。在一个方面，大多数遗传变异可通过单反应分析获得。ctDNA中的变异可以使用各种方法进行询问(interrogate)，包括上面讨论的下一代测序。
在一些实施方式中，对于太靠近限制酶识别位点定位的少数变异，针对单独的测序文库，对未消化的输入DNA进行第二次多重扩增反应。
尽管甲基化敏感性限制酶消化已用于多种甲基化分析，包括几种基于NGS的方法，例如Methyl-seq、MCA-seq、HELP-seq和MSCC，但MSA-seq的独特之处在于含有靶向CpG位点的基因组片段通过具有至少一个确定末端的多重扩增从剩余的基因组片段中提取，并且甲基化水平与可扩增片段相关。有关甲基化分析方法的综述，参见Laird(2010),"《全基因组DNA甲基化分析的原理和挑战(Principles and challenges of genome-wide DNAmethylation analysis)》,"《自然综述：遗传学》11:191-203。
在一个方面，本方法不依赖于接头与消化末端的连接。每次分析的靶向CpG位点的数量非常灵活，范围从一到几万。甲基化水平可以通过使用不含有消化位点的内部对照位点的读段深度信息进行归一化来定量，而无需使用甲基不敏感性限制酶进行第二次对照反应。在另一种方法中，本方法不涉及可能导致DNA分子损失>90％的亚硫酸氢盐转化。这些特征的组合带来了高可扩展性、优异的灵敏度和低输入要求，这尤其关系到液体活检。
在本公开的一个方面，可以用至少三种不同的方法来实现靶标捕获，包括多重PCR(Qiagen Multiplexed PCR，Thermo Fisher AmpliSeq)、挂锁捕获(Roche Heat-Seq)和选择器捕获(Agilent HaloPlex)。在一些实施方式中，设计靶向覆盖所关注的CpG位点的短基因组区间(40-200bp，包括寡核苷酸退火区)的引物或探针。还针对所关注的遗传变异(突变)设计了一组单独的引物或探针。通常，第二组中较大比例的靶序列不含有限制酶识别位点，因此其测序读段深度可用作计算CpG甲基化水平的内部对照。在极少数情况下，第二组中的所有靶均可被限制酶消化，附加的扩增子将被设计为未消化的内部对照。分析中所有扩增子的相对读段深度(均值和方差)首先通过对未消化的DNA片段(模拟真实样品的片段大小分布)进行多重扩增和测序来确定。在一个方面，对于每种类型的临床样品仅需要这样做一次。对于每个所关注的临床样品，通过计算回归归一化后的读段深度观察值与读段深度预期值之比，从而确定每个靶CpG位点的甲基化。在一个方面，遗传变异通过常规变异调用程序来调用，包括读段映射、局部比对、变异调用和/或过滤。
在一个方面，本方法具有许多直接的临床应用。这种应用之一是对患者血浆、粪便、尿液或其它类型生物流体进行肿瘤的非侵入性筛查、早期检测或监测。另一个应用是胎儿非整倍性的非侵入性产前筛查，例如21三体唐氏综合症。
在一个方面，本文提供了一种用于分析样品中的第一靶多核苷酸序列和第二靶多核苷酸序列的甲基化状态的方法，其包含使含有或怀疑含有多核苷酸的样品与甲基化敏感性限制酶(MSRE)接触。在一个方面，MSRE在未被甲基化的残基处选择性切割所述多核苷酸，或在所述残基被甲基化时在所述残基处选择性切割所述多核苷酸。在任何前述实施方式中，MSRE可以选自由以下组成的群组：HpaII、SalI、ScrFI、BbeI、NotI、SmaI、XmaI、MboI、BstBI、ClaI、MluI、NaeI、NarI、PvuI、SacII、HhaI以及其任何组合。
在一个方面，本文公开了一种用于分析样品中的第一靶多核苷酸序列组的序列变化和第二靶多核苷酸序列组的甲基化状态的方法，其包含：1)使包含多核苷酸的样品与MSRE接触，其中所述MSRE在未被甲基化的残基处选择性切割所述多核苷酸，或在所述残基被甲基化时在所述残基处选择性切割所述多核苷酸；2)使用以下各项的混合物，对来自步骤1)的所述样品进行多核苷酸扩增：i)用于扩增所述样品中的第一靶多核苷酸序列组的第一引物组，和ii)用于分析所述样品中的第二靶多核苷酸序列组的甲基化状态的第二引物组，其中所述甲基化状态是所述第二靶多核苷酸序列组中的残基的甲基化状态，并且所述第二引物组中的一个引物与未被切割的第二靶多核苷酸序列杂交，且与所述组中的另一个引物一起，扩增所述未被切割的序列，但不扩增被所述MSRE在所述残基处切割的所述第二靶多核苷酸序列；以及3)对步骤2)中扩增的多核苷酸进行测序，其中使用来自经过扩增的第一靶多核苷酸序列组的测序读段来分析所述第一靶多核苷酸序列组，并且通过比较来自经过扩增的第二靶多核苷酸序列组的测序读段的观察数(No)与参考数(Ne)来分析所述第二靶多核苷酸序列的所述残基的甲基化状态。
在另一个实施方式中，使用来自经扩增的第一靶多核苷酸序列组的测序读段与参考序列，例如靶序列的野生型序列和/或人类序列相比，分析第一靶多核苷酸序列组。可以通过序列比对进行比较。
在另一个实施方式中，使用第一靶多核苷酸序列组的测序读段并且不与参考序列相比，分析第一靶多核苷酸序列组。例如，通过比对所有测序读段以获得共有序列，因此可以分辨出哪些变体是少数等位基因。在一个方面，少数等位基因包含突变。
在一个实施方式中，可以通过连接构建单链文库来分析与MSRE接触的样品，如在2017年4月19日提交的题为“用于文库构建和序列分析的组合物和方法(Compositions andMethods for Library Construction and Sequence Analysis)”的美国临时申请第________号中所公开的(代理人案卷号737993000200)，所述申请出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。在一个方面，MSRE处理是在单链连接方法的去磷酸化和/或变性步骤之前。在一个实施方式中，提供了一种方法，所述方法包含将一组接头连接到单链多核苷酸文库，并且在所述方法中，使经MSRE处理的样品变性以产生单链多核苷酸文库，并通过单链DNA(ssDNA)连接酶催化所述连接，每个单链多核苷酸的5'端被封闭，以防止在5'端连接，每个接头包含一个独特的分子标识符(UMI)序列，所述序列专门用于标记接头所连接的单链多核苷酸，每个接头的3'端被封闭，以防止在3'端连接，并且接头的5'端通过ssDNA连接酶与单链多核苷酸的3'端连接以形成线性连接产物，从而获得线性单链连接产物文库。在任何前述实施方式中，所述方法可以进一步包含将线性单链连接产物文库转化为线性双链连接产物文库。在一个方面，所述转化使用引物或引物组，所述引物或引物组各自包含与接头反向互补和/或与接头可杂交的序列。在任何前述实施方式中，所述方法可以进一步包含扩增和/或纯化线性双链连接产物文库。在任何前述实施方式中，本文的方法可以包含例如通过聚合酶链反应(PCR)，使用各自包含与接头反向互补和/或与接头可杂交的序列的引物或引物组、与靶序列(例如EGFR基因序列)可杂交的引物，扩增线性双链连接产物文库，从而获得包含靶序列的序列信息的经扩增线性双链连接产物文库。在任何前述实施方式中，所述方法可以进一步包含对经扩增线性双链连接产物文库进行测序。因此，可以使用单链文库的半靶向扩增来进行一个或多个靶序列的甲基化状态和/或遗传变异分析。
用于甲基化分析的靶序列和/或用于变异检测的靶序列可以在样品中的相同的分子或不同的分子上，例如两个不同的DNA片段上。在一个方面，靶多核苷酸序列可以在相同的基因上。在另一方面，靶多核苷酸序列可以在基因的编码区中，而第二靶多核苷酸序列可以在相同基因的非编码和/或调节区或用于相同基因的非编码和/或调节区中。在另一方面，靶多核苷酸序列可以在不同的基因上。在一个方面，基因在相同的生物通路或网络中起作用。在另一方面，靶多核苷酸序列可以在相同或不同的染色体上(例如，如表3所示)或在相同或不同的染色体外DNA分子(例如线粒体DNA)上，或者一个在染色体上，而另一个在染色体外DNA分子上。
在一个方面，本公开的一个方面提供了一种集成的方法，用于同时检测一个或多个(例如，成千上万个)靶上的基因组变异和DNA甲基化状况/状态的定量，而无需将有限的材料分配给两个不同的工作流程。
E.试剂盒.
本文的另一方面公开了一种试剂盒，其包含：用于扩增样品中的第一靶多核苷酸序列的第一引物组；和/或用于分析所述样品中的第二靶多核苷酸序列的甲基化状态的第二引物组，且所述甲基化状态是所述第二靶多核苷酸序列中的残基的甲基化状态，并且所述第二引物组中的一个引物与未被切割的第二靶多核苷酸序列杂交，且与所述组中的另一个引物一起，扩增所述未被切割的序列，但不扩增被所述MSRE在所述残基处切割的所述第二靶多核苷酸序列。在一个实施方式中，试剂盒进一步包含MSRE，且所述MSRE在未被甲基化的残基处选择性切割，或在所述残基被甲基化时在所述残基处选择性切割。在一个实施方式中，MSRE选自由以下组成的群组：HpaII、SalI、
Figure BDA0002321900100000251
ScrFI、BbeI、NotI、SmaI、XmaI、MboI、BstBI、ClaI、MluI、NaeI、NarI、PvuI、SacII、HhaI以及其任何组合。
在任何前述实施方式中，试剂盒的第一引物组可以包含用于选自由以下组成的群组的基因的一个或多个引物：ABCB1、CYP2C19、CYP2C8、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5、DPYD、GSTP1、MTHFR、NQO1、RHEB、SULT1A1、UGT1A1、MPL、JAK1、NRAS、DDR2、PTEN、FGFR2、HRAS、ATM、CBL、KRAS、ERBB3、CDK4、HNF1A、FLT3、RB1、AKT1、IDH2、CDH1、TR53、ERBB2、STAT3、SMAD4、STK11、GNA11、JAK3、PPP2R1A、RET、DNMT3A、ALK、NFE2L2、SF3B1、PIK3CA、ERBB4、GNAS、U2AF1、SLC19A1、SMARCB1、CHEK2、VHL、RAF1、CTNNB1、PDGFRA、KIT、KDR、FBXW7、APC、NEUROG1、CSF1R、NPM1、TPMT、EGFR、MET、SMO、BRAF、EZH2、FGFR1、JAK2、CDKN2A、PAX5、PTCH1、ABL1、NOTCH1、ARAF、MED12、BTK以及其任何组合。
在任何前述实施方式中，试剂盒的第一引物组可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:61-788中所述的序列或其任何组合。
在任何前述实施方式中，试剂盒的第二引物组可以包含用于选自由以下组成的群组的基因的一个或多个引物：NDRG4、SEPT、MLH1、WTN5A、AGTR1、BMP3、SFRP2、NEUROG1、TFPI2、SDC2以及其任何组合。
在任何前述实施方式中，试剂盒的第二引物组可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1-60中所述的序列或其任何组合。
还提供了基于上述试剂盒组分的诊断试剂盒，且其可以用于诊断个体的疾病或病况，例如癌症。在另一方面，试剂盒可以用于预测个体对药物、疗法、治疗或其组合的反应。这样的测试试剂盒可以包括个体能够用来获得例如ctDNA的样品的装置和说明书，而无需医疗保健提供者的帮助。
为了在上文描述或建议的应用中使用，还提供了试剂盒或制品。这样的试剂盒可以包含至少一种专用于对疾病或病况的标志物进行基因分型的试剂，并且可以进一步包括用于实施本文所述方法的说明书。
在一些实施方式中，本文提供了组合物和试剂盒，所述组合物和试剂盒包含引物和引物对，所述引物和引物对允许多核苷酸或其任何特定部分的特异性扩增；以及，提供了探针，所述探针出于定性或定量检测目的而选择性或特异性地与核酸分子或其任何部分杂交。探针可以用可检测的标志物标记，例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。这样的探针和引物可以用于检测样品中多核苷酸的存在，并且可作为检测由多核苷酸编码的细胞表达蛋白的手段。如本领域技术人员将理解的，可以基于本文提供的序列制备许多不同的引物和探针，并有效地用于扩增、克隆和/或确定多核苷酸，例如基因组DNA、mtDNA和其片段的存在和/或水平。
在一些实施方式中，试剂盒可另外包含用于检测多肽的存在的试剂。这样的试剂可以是特异性结合多肽的抗体或其它结合分子。在一些实施方式中，这样的抗体或结合分子可能能够区分由于多态性而引起的多肽的结构变异，且因此可以用于基因分型。抗体或结合分子可以用可检测的标志物标记，例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。试剂盒中可能包括其它用于进行结合分析(如ELISA)的试剂。
在一些实施方式中，试剂盒包含用于对至少两种、至少三种、至少五种、至少十种或更多种标志物进行基因分型的试剂。标志物可以是多核苷酸标志物(例如癌症相关突变或SNP)或多肽标志物(例如蛋白质的过表达或翻译后修饰，包括高磷酸化或低磷酸化)或其任何组合。在一些实施方式中，试剂盒可以进一步包含用于捕获用于检测经过扩增的核酸的探针的表面或衬底(例如微阵列)。
试剂盒可以进一步包含携带装置，其中进行分隔以紧密地容纳一个或多个容器装置，例如小瓶、试管等，每个容器装置包含在所述方法中使用的不同的元件之一。例如，容器装置之一可以包含被标记的或者可以被可检测地标记的探针。这样的探针可以是对生物标志物具有特异性的多核苷酸。试剂盒还可以具有含有用于扩增靶核酸序列的核苷酸的容器和/或包含与报告分子(例如酶促、荧光或放射性同位素标记)结合的报告装置的容器。
试剂盒通常包含上述容器和一个或多个其它容器，所述的其他容器包含从商业和用户角度考虑需要的材料，包括缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装插页。容器上可以有标签，以指示所述组合物用于特定疗法或非疗法用途，并且还可以指示体内或体外使用的说明，例如上述那些。
试剂盒可以进一步包含一组说明书和材料，用于制备组织或细胞或体液样品并从所述样品制备核酸(例如ctDNA)。
H.其它示例性实施方式
在任何前述实施方式中，ssDNA连接酶可以是栖热菌(Thermus)噬菌体RNA连接酶，例如噬菌体TS2126 RNA连接酶(例如，CircLigaseTM和CircLigase IITM)；或古细菌RNA连接酶，例如嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)RNA连接酶1。在其它方面，ssDNA连接酶是RNA连接酶，例如T4 RNA连接酶，例如T4 RNA连接酶I，例如NewEngland Biosciences,M0204S。T4 RNA连接酶2，例如，New England Biosciences,M0239S；T4 RNA连接酶2截短型，例如，New England Biosciences,M0242S；T4 RNA连接酶2截短型KQ，例如M0373S；或T4 RNA连接酶2截短型K227Q，例如，New England Biosciences,M0351S。在任何前述实施方式中，ssDNA连接酶也可以是热稳定的5'App DNA RNA连接酶，例如NewEngland Biosciences,M0319S；或T4 DNA连接酶，例如New England Biosciences,M0202S。
在一些实施方式中，本方法包含使用单链DNA(ssDNA)连接酶将一组接头连接到单链多核苷酸文库。可以使用任何合适的ssDNA连接酶，包括本文公开的ssDNA连接酶。接头可以以任何合适的水平或浓度使用，例如约1μM到约100μM，例如约1μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM或100μM，或其任何子范围。接头可以包含任何合适的序列或碱基或以任何合适的序列或碱基开始。例如，接头序列可以以所有2bp的碱基组合开始。
在一些实施方式中，连接反应可以在拥挤剂的存在下进行。在一个方面，拥挤剂包含聚乙二醇(PEG)，例如PEG 4000、PEG 6000或PEG 8000；葡聚糖；和/或Ficoll。拥挤剂，例如PEG，可以以任何合适的水平或浓度使用。例如，拥挤剂，例如PEG的使用水平或浓度可以是约0％(w/v)到约25％(w/v)，例如约0％(w/v)，1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)、9％(w/v)、10％(w/v)、11％(w/v)、12％(w/v)、13％(w/v)、14％(w/v)、15％(w/v)、16％(w/v)、17％(w/v)、18％(w/v)、19％(w/v)、20％(w/v)、21％(w/v)、22％(w/v)、23％(w/v)、24％(w/v)或25％(w/v)，或其任何子范围。
在一些实施方式中，连接反应可以进行任何合适的时间长度。例如，连接反应可以进行约2到约16小时的时间，例如进行约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、或16小时或其任何子范围。
在一些实施方式中，连接反应中的ssDNA连接酶可以以任何合适的体积使用。例如，连接反应中的ssDNA连接酶可以以约0.5μl到约2μl的体积使用，例如以约0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl、1μl、1.1μl、1.2μl、1.3μl、1.4μl、1.5μl、1.6μl、1.7μl、1.8μl、1.9μl或2μl或其任何子范围使用。
在一些实施方式中，连接反应可以在连接增强剂例如甜菜碱的存在下进行。连接增强剂，例如甜菜碱，可以以任何合适的体积使用，例如约0μl到约1μl，例如约0μl、0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl、1μl或其任何子范围。
在一些实施方式中，连接反应可以使用T4 RNA连接酶I，例如来自New EnglandBiosciences,M0204S的T4 RNA连接酶I，在以下示例性反应混合物(20μl)中进行：1×反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5、10mM MgCl2、1mM DTT)、25％(wt/vol)PEG 8000、1mM六胺氯化钴(任选的)、1μl(10单位)T4 RNA连接酶和1mM ATP。所述反应可以在25℃下培育16小时。所述反应可以通过加入40μl 10mM Tris-HCl pH 8.0、2.5mM EDTA来停止。
在一些实施方式中，连接反应可以使用热稳定的5'App DNA/RNA连接酶，例如来自New England Biosciences,M0319S的热稳定的5'App DNA RNA连接酶，在以下示例性反应混合物(20μl)中进行：ssDNA/RNA底物20pmol(1pmol/μl)、5'App DNA寡核苷酸40pmol(2pmol/μl)、10×NEBuffer 1(2μl)、50mM MnCl2(仅用于ssDNA连接)(2μl)、热稳定的5'AppDNA/RNA连接酶(2μl(40pmol))和无核酸酶的水(至20μl)。所述反应可以在65℃下培育1小时。所述反应可以通过在90℃下加热3分钟来停止。
在一些实施方式中，连接反应可以使用T4 RNA连接酶2，例如来自New EnglandBiosciences,M0239S的T4 RNA连接酶2，在以下示例性反应混合物(20μl)中进行：T4 RNA连接酶缓冲液(2μl)、酶(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、接头(2μl)和水(4μl)。所述反应可以在25℃下培育16小时。所述反应可以通过在65℃下加热20分钟来停止。
在一些实施方式中，连接反应可以使用T4 RNA连接酶2截短型，例如来自NewEngland Biosciences,M0242S的T4 RNA连接酶2截短型，在以下示例性反应混合物(20μl)中进行：T4 RNA连接酶缓冲液(2μl)、酶(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、接头(2μl)和水(4μl)。所述反应可以在25℃下培育16小时。所述反应可以通过在65℃下加热20分钟来停止。
在一些实施方式中，连接反应可以使用T4 RNA连接酶2截短型K227Q，例如来自NewEngland Biosciences,M0351S的T4 RNA连接酶2截短型K227Q，在以下示例性反应混合物(20μl)中进行：T4 RNA连接酶缓冲液(2μl)、酶(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、腺苷酸化接头(0.72μl)和水(5.28μl)。所述反应可以在25℃下培育16小时。所述反应可以通过在65℃下加热20分钟来停止。
在一些实施方式中，连接反应可以使用T4 RNA连接酶2截短型KQ进行，例如来自New England Biosciences,M0373S的T4 RNA连接酶2截短型KQ，在以下示例性反应混合物(20μl)中进行：T4 RNA连接酶缓冲液(2μl)、酶(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、腺苷酸化接头(0.72μl)和水(5.28μl)。所述反应可以在25℃下培育16小时。所述反应可以通过在65℃下加热20分钟来停止。
在一些实施方式中，连接反应可以使用T4 DNA连接酶进行，例如来自New EnglandBiosciences,M0202S的T4 DNA连接酶，在以下示例性反应混合物(20μl)中进行：T4 RNA连接酶缓冲液(2μl)、酶(1μl)、PEG(10μl)、DNA(1μl)、腺苷酸化接头(0.72μl)和水(5.28μl)。所述反应可以在16℃下培育16小时。所述反应可以通过在65℃下加热10分钟来停止。
第二链合成步骤可以使用任何合适的酶来进行。例如，第二链合成步骤可以使用Bst聚合酶，例如New England Biosciences,M0275S或Klenow片段(有3'->5'外切酶活性)，例如New England Biosciences,M0212S进行。
在一些实施方式中，第二链合成步骤可以使用的Bst聚合酶，例如New EnglandBiosciences,M0275S，在以下示例性反应混合物(10μl)进行：水(1.5μl)、引物(0.5μl)、dNTP(1μl)、ThermoPol反应缓冲液(5μl)和Bst(2μl)。所述反应可以在62℃下培育2分钟，并在65℃下培育30分钟。反应后，双链DNA分子可以被进一步纯化。
在一些实施方式中，第二链合成步骤可以使用Klenow片段(有3'->5'外切酶活性)，例如New England Biosciences,M0212S，在以下示例性反应混合物(10μl)进行：水(0.5μl)、引物(0.5μl)、dNTP(1μl)、NEB缓冲液(2μl)和exo-(3μl)。所述反应可以在37℃下培育5分钟并在75℃下培育20分钟。反应后，双链DNA分子可以被进一步纯化。
在第二条链合成后，但在第一或半靶向PCR之前，可以纯化双链DNA。可以使用任何合适的技术或程序纯化双链DNA。例如，可以使用以下试剂盒中的任一种来纯化双链DNA：Zymo clean and concentrator,Zymo research,D4103；Qiaquick,Qiagen,28104；ZymossDNA纯化试剂盒,Zymo Research,D7010；Zymo Oligo纯化试剂盒,Zymo Research,D4060；和AmpureXP beads,Beckman Coulter,A63882:1.2x-4x珠粒比率。
第一或半靶向PCR可以使用任何合适的酶或反应条件进行。例如，多核苷酸或DNA链可在介于约52℃到约72℃范围内的温度下退火，例如在约52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃或72℃或其任何子范围下退火。第一或半靶向PCR可以进行任何合适的循环轮数。例如，第一或半靶向PCR可以进行10-40个循环，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个循环。引物池可以任何合适的浓度使用。例如，引物池可以按介于约5nM到约200nM范围内的浓度使用，例如约5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、110nM、120nM、130nM、140nM、150nM、160nM、170nM、180nM、190nM或200nM或其任何子范围。
第一或半靶向PCR可以使用任何合适的温度循环条件进行。例如，第一或半靶向PCR可以使用以下循环条件中的任一种进行：95℃3分钟，(95℃15秒，62℃30秒，72℃90秒)×3或×5；或(95℃15秒，72℃90秒)×23或×21，72℃1分钟，4℃保持。
在一些实施方式中，第一或半靶向PCR可以使用KAPA SYBR FAST，例如KAPAbiosciences,KK4600在以下示例性反应混合物(50μl)中进行：DNA(2μl)、KAPASYBR(25μl)、引物池(各自26nM)(10μl)、Aprimer(100μM)(0.4μl)和水(12.6μl)。第一或半靶向PCR可以使用以下循环条件中的任一种进行：95℃30秒，(95℃10秒，50-56℃45秒，72℃35秒)×40。
在一些实施方式中，第一或半靶向PCR可以使用KAPA HiFi，例如KAPABiosciences,KK2601在以下示例性反应混合物(50μl)中进行：DNA(15μl)、KAPAHiFi(25μl)、引物池(各自26nM)(10μl)和Aprimer(100μM)(0.4μl)。第一或半靶向PCR可以使用以下循环条件中的任一种进行：95℃3分钟，(98℃20秒，53-54℃15秒，72℃35秒)×15，72℃2分钟，4℃保持。
亚硫酸氢盐转化可以使用任何合适的技术、程序或试剂进行。在一些实施方式中，亚硫酸氢盐转化可以使用以下试剂盒中的任一种与试剂盒中提供的程序进行：EpiMark亚硫酸氢盐转化试剂盒，New England Biosciences，E3318S；EZ DNA甲基化试剂盒，ZymoResearch，D5001；MethylCode亚硫酸氢盐转化试剂盒，赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)，MECOV50；EZ DNA甲基化金试剂盒，Zymo Research,D5005；EZ DNA甲基化直接试剂盒，Zymo Research，D5020；EZ DNA甲基化闪电试剂盒，Zymo Research，D5030T；EpiJET亚硫酸氢盐转化试剂盒，赛默飞世尔科技，K1461；或EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒，Qiagen，59104。
在一些实施方式中，DNA分子可以使用实施例4中所示的程序来制备，包括以下步骤：构建单链多核苷酸，将单链多核苷酸文库转化为双链多核苷酸文库，半靶向扩增双链多核苷酸文库，以及构建序列文库。可以使用任何合适的方法或程序进一步分析此类DNA分子的甲基化状态。
I.实施例.
实施例1
在此实施例中，选择了十个基因(AGTR1、BMP3、MLH1、NDRG4、NEUROG1、SDC2、SEPT、SFRP2、TFPI2、WNT5A)的启动子中与HpaII识别基序重叠的24个CpG位点。AmpliSeq定制引物组被设计用于覆盖这些甲基化靶，以及癌症中通常突变的370个基因组区域。
形成来自癌细胞系HCT116的片段化基因组DNA(其在这24个CpG位点被甲基化)与来自NA12878的基因组DNA(其在所有这些位点均未被甲基化)的混合物(1％、5％、10％、20％、50％)。一式三份地对这些混合物进行MSA-seq。甲基化测量值与预期值具有高相关性(平均相关系数R＝0.983)和线性(图2)。图3显示了用于肿瘤聚类的MSMC-Seq定量的CpG甲基化状态。这种肿瘤样品的无偏层次聚类的方法会根据甲基化生物标志物的水平/状态将这些肿瘤样品分为3组：A组、B组以及A与B之间的组。
下表1列出了所使用的示例性引物对。
Figure BDA0002321900100000331
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表3列出了用于甲基化分析和变异检测的基因的染色体位置以及起点和终点位置.
Figure BDA0002321900100000781
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为了展现对肿瘤样品量化DNA甲基化和鉴别遗传变异的可行性，对来自结肠直肠癌(CRC)患者的10对肿瘤和邻近正常组织进行MSA-seq。
每个样品使用20ng FFPE输入DNA，对十个基因上的24个启动子CpG位点的DNA甲基化水平进行定量，并将十个肿瘤样品分为两个不同的组，一组对于SEPT、AGTR1、SDC2、SFRP2和TFPI2高度甲基化，而第二组在其它基因(例如WNT5A、MLH1和BMP3)上也高度甲基化。使用相同的数据集，也在10个肿瘤样品中的每一个中鉴别出0-12个体细胞突变(表4)。
全部28个突变都在对HpaII消化的DNA进行的单次反应中检测到，而无需对未消化的DNA进行单独反应。
表4.在10个CRC肿瘤样品中鉴别的体细胞突变.
Figure BDA0002321900100000881
使用在ampliseq.com可获得的Ion AmpliSeq Designer工具设计了定制的AmpliSeq引物组。出于方法校准的目的，使用Bioruptor将来自细胞系HCT116和NA12878的基因组DNA片段化。制备了含有0％、1％、5％、10％、20％和50％的HCT116的一系列合成DNA混合物。在每个反应中，将10ng DNA混合物在37℃下用NEB MspI/HpaII消化4小时，用AmPure珠粒纯化，并用体积略有修改的AmpliSeq扩增和Ion library制备方案处理。衍生自结肠直肠癌患者的十份肿瘤样品以经消化的和未消化的成对形式经历了相同的程序以校准背景。所得测序文库在Ion pgm/S5测序仪上测序。突变调用是使用Torrent Suite执行的。使用定制的Perl/Python脚本从扩增子读段深度数据计算CpG甲基化水平。
序列表
<110> 鹍远基因公司
<120> 用于检测基因组变异和DNA甲基化状态的组合物和方法
<130> 4552-2000140
<150> 62/487,422
<151> 2017-04-19
<160> 1556
<170> PatentIn 3.5版
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<213> 智人
<400> 51
caatcggcgt gtaa 14
<210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 52
tcttcttttc ctctgg 16
<210> 53
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 53
ctctgctccg gattcg 16
<210> 54
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 54
ggtgagcagg atccac 16
<210> 55
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 55
gtttagggtg tttgaa 16
<210> 56
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 56
ccggacgagc gcattt 16
<210> 57
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 57
tgacctggaa acttcg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 58
cttttctctc tggaca 16
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<211> 15
<212> DNA
<213> 智人
<400> 59
acgcgtccga aaatg 15
<210> 60
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 60
tcccgtgtaa ctccta 16
<210> 61
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 61
cccaggctgt ttattt 16
<210> 62
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 62
aacattgcct atggag 16
<210> 63
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 63
gagcatagta agcagt 16
<210> 64
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 64
caagcactga aagata 16
<210> 65
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 65
tcccacagcc actgtt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 66
ttcctatatc ctgtgt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 67
cccactgtct atggtg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 68
caggctgtat ttcttc 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 69
taactagtca agtact 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 70
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<213> 智人
<400> 71
agatcaaaca ccctaa 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 72
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 73
ctttttcttt agacag 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 74
ttcccgtagg tcatga 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 75
cctcctggac tacctg 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 76
acctgtggat gaagtt 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 77
ttggtgaagg tagctg 16
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<213> 智人
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cttgatggag aacttg 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 79
ggtggtgtga tggtga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 80
cgaagctcat gactgt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 81
cggaagtcca tctcct 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 82
gctcctgatc tggtac 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 83
gtgaggatgg ctacag 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 84
ccatgtggag actcct 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 85
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 86
acgcagacag aggctc 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 87
cacgttggtc cacatc 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 88
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 89
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 90
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 91
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 92
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 93
aatgtgagcc cttgag 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 94
tggctgtcag tatttg 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 95
ctcggaggaa ggactt 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 96
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<212> DNA
<213> 智人
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ccttggagat atcgat 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 98
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 99
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<213> 智人
<400> 100
tcttgtcttc tccttt 16
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<212> DNA
<213> 智人
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ttgctcagct tgtact 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 102
gtgtagtgct tcaagg 16
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<212> DNA
<213> 智人
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acgctcaggt tggag 15
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<212> DNA
<213> 智人
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atgagtgact gcctct 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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gcatagagcc tacctg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 106
gtgctagtgg agaaca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 107
ttcagggcaa agaagt 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 108
gttttccaat gcaacc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 109
aaatcctaag agagaa 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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atgcttcctg gtcttt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 111
cacaggaagc agattc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 112
tctgctggat ttggtt 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 113
cccaaaagtc cacctg 16
<210> 114
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 114
tccactgcat ggttca 16
<210> 115
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 115
aagcagaagt aaaaca 16
<210> 116
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 116
tgaactgcag cattta 16
<210> 117
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 117
atgctgatac tttatt 16
<210> 118
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 118
ctggaggcat tattct 16
<210> 119
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 119
cagagcagcc taaaga 16
<210> 120
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 120
tggcagaaat aataca 16
<210> 121
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 121
tcagcccatc ttgaca 16
<210> 122
<211> 14
<212> DNA
<213> 智人
<400> 122
gtgcgttgct tgtt 14
<210> 123
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 123
tgagaggcat ggctat 16
<210> 124
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 124
catcgagtct tcactg 16
<210> 125
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 125
tcagattcca aacaag 16
<210> 126
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 126
agacttacac acaaaa 16
<210> 127
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 127
cacctaggct aaaatg 16
<210> 128
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 128
agtattttct cacaga 16
<210> 129
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 129
tctgctagtg aatgag 16
<210> 130
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 130
acttactgta cctggt 16
<210> 131
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 131
tcaccttcag aagtca 16
<210> 132
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 132
ttgagatgaa aggatt 16
<210> 133
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 133
caccagtata gttcca 16
<210> 134
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 134
tctaactgat agaata 16
<210> 135
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 135
tggtttactt taagat 16
<210> 136
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 136
tctggaataa ttctga 16
<210> 137
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 137
gttctttgtt tgtctt 16
<210> 138
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 138
aacaggaagc atactt 16
<210> 139
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 139
aagttcttgt gtttgt 16
<210> 140
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 140
atgcaggtgg agggat 16
<210> 141
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 141
taccacagca atgtgt 16
<210> 142
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 142
ttgagcatcc cttgtg 16
<210> 143
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 143
ttttctgagt gctttt 16
<210> 144
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 144
aagcaaagtt ttaagg 16
<210> 145
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 145
cttaacacat tgactt 16
<210> 146
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 146
cttgaagatt tagcca 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 147
taaaaagtgg cttagg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 148
agaacaggat agaaag 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 149
tttctctcag taagtg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 150
aaaattagca ccctga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 151
tatgtagagg ctgttg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 152
ctgaagttct ttatct 16
<210> 153
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 153
ctggtgtact tgatag 16
<210> 154
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 154
tgttgtcatc ttataa 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 155
caaactattg ggtgga 16
<210> 156
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 156
tgtgtagaaa gcagat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 157
tttgtcagag tcagag 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 158
gatcctaaac gtaaga 16
<210> 159
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 159
gctttctggc tggatt 16
<210> 160
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 160
taccttttct cttgat 16
<210> 161
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 161
tgcatttgaa gaagga 16
<210> 162
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 162
caaagtatga gataaa 16
<210> 163
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 163
ttcttcaatt tttgtt 16
<210> 164
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 164
atttacctag taatgg 16
<210> 165
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 165
tttaggcctt gcagaa 16
<210> 166
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 166
actgcatatt cctcca 16
<210> 167
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 167
cagtagaagt tgctgg 16
<210> 168
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 168
atgatttcat gtagtt 16
<210> 169
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 169
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 170
cactcagtta actggt 16
<210> 171
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 171
tgttaaagtt catggc 16
<210> 172
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 172
cataagaagc gtttac 16
<210> 173
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 173
acagagatga atttct 16
<210> 174
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 174
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<210> 175
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 175
ccacacagga gaatat 16
<210> 176
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 176
acaagctgtc tcctct 16
<210> 177
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 177
aatatgaagt cttcat 16
<210> 178
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 178
tagctacact gcgcgt 16
<210> 179
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 179
ttggtgatag acatgt 16
<210> 180
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 180
acaacattcc atgatg 16
<210> 181
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 181
cttttgaaca gggcaa 16
<210> 182
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 182
ctcctttact tcatat 16
<210> 183
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 183
cctcactgaa accttt 16
<210> 184
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 184
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<210> 185
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 185
ggacaagtga atttgc 16
<210> 186
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 186
aaaggctgaa tgaaag 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 187
tgtttttgga gaagca 16
<210> 188
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 188
attctcgcct ctattg 16
<210> 189
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 189
tggaaaaata gcctca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 190
atgaagacct cacagt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 191
aagaaaaagt caggat 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 192
tactcaggtt aaaatg 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 193
ctcaatgata tggaga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 194
atttctttgt acagga 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 195
atgacttgtc acaatg 16
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<213> 智人
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cgagtgatga ttggga 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 197
atttttggat tactta 16
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<212> DNA
<213> 智人
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gctgcttttc cagggt 16
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<213> 智人
<400> 199
tttcgacaaa agtcac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 200
acaagagagt agatac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 201
aggccctcag ttcaag 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 202
tcccttcaca ggtggt 16
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<212> DNA
<213> 智人
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ggagaaactc ccagat 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 204
ccagtcagat caggat 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 205
gaacaatatg aattat 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 206
ctgccaggat gtaaga 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 207
gatgcatctg ttacta 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 208
actccctcta ggatca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 209
tcataaccca cagatc 16
<210> 210
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 210
gaaaaatgcc aacata 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 211
tgttcctggt cctgac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 212
tcagtgactg tgatca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 213
tgaaaagaga gtggaa 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 214
gctgcaagtc agttga 16
<210> 215
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 215
aagaacagca cgtaca 16
<210> 216
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 216
tgaactcttc cctcca 16
<210> 217
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 217
tcttgagggc cacaaa 16
<210> 218
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 218
attgtagggt ctccct 16
<210> 219
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 219
atcgaagcgc tacctg 16
<210> 220
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 220
ccaacgcacc gaatag 16
<210> 221
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 221
acctggtctt ctagga 16
<210> 222
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 222
gttttcgtgg ttcaca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 223
ccacataagg ttctca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 224
ctggcagact atgtta 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 225
tacaggaata gccaca 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 226
ctgtgtagta ccttca 16
<210> 227
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 227
accatgactt tgaggt 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 228
ggacatcttc ccacta 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 229
ccatggaacc agacag 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 230
catcctcttc ctcagg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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aagttgtttt gttttg 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 232
ttgagctgag gtcttc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 233
aacgtttcga ttataa 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 234
agactgtaag tggttt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 235
aataattttc ccacta 16
<210> 236
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 236
agggttgttg atgtcc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 237
agggtcaaag atattt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 238
ctcctcactt ctggac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 239
aggattcgat gaatca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 240
caccaagcat cactgg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 241
taaggtcaat gacgca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 242
acaaccttgc ggaatt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 243
ttttgtccta ctcctt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 244
ttcagtgttt ctccat 16
<210> 245
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 245
ttggaggagg tcaggc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 246
agcccatctg ggaaac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 247
acatccggat gtagga 16
<210> 248
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 248
cctgagagca gcttca 16
<210> 249
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 249
tctcaccttc tccatc 16
<210> 250
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 250
gtcctacgct tccaaa 16
<210> 251
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 251
cggctttgtc caagag 16
<210> 252
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 252
tgggcagaag ggcaca 16
<210> 253
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 253
ggtgtgttct ggaagt 16
<210> 254
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 254
atagtggcca tcttcc 16
<210> 255
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 255
atgactgtcc tgtaga 16
<210> 256
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 256
ccgtgaccca aagtac 16
<210> 257
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 257
atcaaatctt aaaagc 16
<210> 258
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 258
tctccactca gcgtct 16
<210> 259
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 259
gctgcgcttc tactta 16
<210> 260
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 260
gggtggtgtt gtgttt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 261
gaggagcctg gacagt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 262
gaagactcag aggaga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 263
aagtcctctc aagtct 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 264
tatccaattc tgtttc 16
<210> 265
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 265
ttcatatgat gaaggg 16
<210> 266
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 266
agatacccac gtatgt 16
<210> 267
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 267
ctgatgacct gaagga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 268
gactgtaatt gatctt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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gacccaaaca tcatcc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 270
gctggaggaa gaatta 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 271
gagaagagat acgaag 16
<210> 272
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 272
gtggtaggtc ttgtag 16
<210> 273
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 273
gtgccctcat ttacct 16
<210> 274
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 274
cacgacagcg atgaga 16
<210> 275
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 275
ctccatatgt agttcg 16
<210> 276
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 276
atgttgatgt gtcttg 16
<210> 277
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 277
caccaactta tgccaa 16
<210> 278
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 278
ctgaatattg agctca 16
<210> 279
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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ccagcttcaa aagctc 16
<210> 280
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 280
cttttacact cctatt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 281
agcatgaaat agtgta 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 282
gctttaaatc ctcgaa 16
<210> 283
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 283
ttgggcactt ttgaag 16
<210> 284
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 284
aaagtcacca accttt 16
<210> 285
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 285
tgtcctcatt gccctc 16
<210> 286
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 286
agtccggttt tatttg 16
<210> 287
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 287
aatgtgtctt cacttt 16
<210> 288
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 288
tgggcacaga tgattt 16
<210> 289
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 289
ggcaaataca gctttg 16
<210> 290
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 290
ctccaagatg ggatac 16
<210> 291
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 291
ggagatgtga taattt 16
<210> 292
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 292
gacttactgc agctgt 16
<210> 293
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 293
gtcactgact gctgtg 16
<210> 294
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 294
acattccggc aagaga 16
<210> 295
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 295
agttatttgg aatttt 16
<210> 296
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 296
ctgtatgcac tcagag 16
<210> 297
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 297
catgaacatt tttctc 16
<210> 298
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 298
cagaccaggg tgttgt 16
<210> 299
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 299
acacccagtg gagaag 16
<210> 300
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 300
ccagggacct tacctt 16
<210> 301
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 301
gtcttccttc tctctc 16
<210> 302
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 302
gaaactcaca tcgagg 16
<210> 303
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人
<400> 303
cctacgtgat ggcca 15
<210> 304
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 304
ctttgtgttc ccggac 16
<210> 305
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 305
ggaacgtact ggtgaa 16
<210> 306
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 306
ctaaagccac ctcctt 16
<210> 307
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 307
agagtgagtt aacttt 16
<210> 308
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 308
actctggtgg gtatag 16
<210> 309
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 309
agaaacgcat ccagca 16
<210> 310
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 310
agcgacaatg aaaaac 16
<210> 311
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人
<400> 311
gggtatgtgg ctaca 15
<210> 312
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 312
ctcacaccgc tgtgtt 16
<210> 313
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人
<400> 313
ccctgaccct ggctt 15
<210> 314
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 314
acttccggat cttctg 16
<210> 315
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人
<400> 315
ggatctggcg ctttt 15
<210> 316
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 316
actgcctcca gctctt 16
<210> 317
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 317
catctggatc cctgat 16
<210> 318
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 318
ctgtcctcct agcagg 16
<210> 319
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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aggtctacat gggtgc 16
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<212> DNA
<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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caactggatt cttttt 16
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atgacctttg gaggaa 16
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<213> 智人
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<213> 智人
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gacatggcca agagaa 16
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<213> 智人
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<213> 智人
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<211> 16
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<213> 智人
<400> 422
tttattggtc tctcat 16
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<211> 16
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<213> 智人
<400> 423
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<213> 智人
<400> 424
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<213> 智人
<400> 425
gacccgtatt cattct 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 426
aggattgtta aataac 16
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<213> 智人
<400> 427
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 428
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 429
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 431
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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<213> 智人
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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<213> 智人
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 437
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 438
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 439
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 440
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 441
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 442
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 443
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 444
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 445
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 446
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 447
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 448
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<211> 16
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<400> 449
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<213> 智人
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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actttgtcca cctgga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 453
ggatgataca tggtgg 16
<210> 454
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 454
tctcccacaa tgaagg 16
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<211> 14
<212> DNA
<213> 智人
<400> 455
tggtacgtcc gcaa 14
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 456
tggtgaagct tccagc 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 457
gaagagccca caggtg 16
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<213> 智人
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tccttgctag ggttct 16
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<212> DNA
<213> 智人
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tactggtgga tgtcct 16
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<213> 智人
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gttggacatc ctggat 16
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<213> 智人
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aggctcacct ctatag 16
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<212> DNA
<213> 智人
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gcgatgacgg aatata 16
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<212> DNA
<213> 智人
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ttgtactgca gagaca 16
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<212> DNA
<213> 智人
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accaagccca tcacca 16
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<213> 智人
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aggcgtggga tgtttt 16
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<213> 智人
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gaccactatt atctct 16
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<213> 智人
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gaggttcctt aagatc 16
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<213> 智人
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gttgagctct gcaggt 16
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<213> 智人
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cctagacagc accgta 16
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<213> 智人
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ggataaagac ctggtc 16
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ttctggtggg accatt 16
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tctggatctc ttcatg 16
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aagagaacac acttac 16
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<213> 智人
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gacattccta tgtcct 16
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<213> 智人
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ctctgtaaat tctacc 16
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ctcggctttc atttga 16
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<213> 智人
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taactctaat aggaag 16
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<213> 智人
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aatactaatg ccagga 16
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<213> 智人
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actgaggtat cgcctc 16
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<213> 智人
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cacatcatcc ttggtt 16
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<213> 智人
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gtggatgctt cctttt 16
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<213> 智人
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ctccagtgag gaagca 16
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<213> 智人
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caaacctgct gagcat 16
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<212> DNA
<213> 智人
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atcagtgttt tgcttc 16
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<213> 智人
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gctgacactg gacatc 16
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<213> 智人
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catctcatct gttaca 16
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<213> 智人
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tgagagctcg atgctc 16
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<213> 智人
<400> 488
gagggtaagt tgtata 16
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ttttgcacag ccaaga 16
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aatgatcgtt ttcttc 16
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gtgctcaaaa atttct 16
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attgggtaat gttata 16
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attaattttt gcttca 16
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catccatcca ggaaaa 16
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cattcattct gcttat 16
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ctgtagcaaa accaga 16
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aatcatctca cctctg 16
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tggatgtgca gacact 16
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cttgcccaca tcgttg 16
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cagaaaccca tgtatg 16
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<213> 智人
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accaaaactc agcctg 16
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agttgtgctt tttgct 16
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<213> 智人
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caagtagatt cacaat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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ttctttctaa cctttt 16
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<213> 智人
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gctttgaaca aataaa 16
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actcatggtc ggatca 16
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<213> 智人
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aaactaaaaa tccttt 16
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tgttcaattt tgttga 16
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<212> DNA
<213> 智人
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gacgtcactt tcaaac 16
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<213> 智人
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ggtcctatgg gatttt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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agcagtgtta atcaca 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 513
tgctcatctt ttcttt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 514
aaatttgtta cctgta 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 515
tcacacagcc aggagt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 516
tgcaacagac tttaaa 16
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<213> 智人
<400> 517
tgattttgca gaaaac 16
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<212> DNA
<213> 智人
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tctagaacag tagaca 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 519
tactggtccc tcattg 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 520
taatccagac tgtgtt 16
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<211> 16
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<400> 521
tctattgttg gatcat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 522
ataaggcctg ctgaaa 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 523
ggctcattaa gatgac 16
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<213> 智人
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tatcactcct tgaagc 16
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<212> DNA
<213> 智人
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caatcatact gctgac 16
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<213> 智人
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aaccggtcct ttacag 16
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cacaaagcaa gccaga 16
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cgtaaaaatg ctggag 16
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<213> 智人
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tgtaataaca agtatt 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 530
tttttaaagt acatgt 16
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<212> DNA
<213> 智人
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gtaagtgccc gaagtg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 532
acccactgag gtatat 16
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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ggttaaataa aatgcc 16
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<213> 智人
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tgttccataa tgaagt 16
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<213> 智人
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caggagcgag aggaca 16
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<212> DNA
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gtggtcctac cataca 16
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<212> DNA
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agcaggccta ttttga 16
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<213> 智人
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tttctaactc tctttg 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 540
tacagtttct tgcagc 16
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<212> DNA
<213> 智人
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cacgggtaat aatttt 16
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<212> DNA
<213> 智人
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ctttgcacct gttttg 16
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<212> DNA
<213> 智人
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atacagctga ttgcca 16
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<212> DNA
<213> 智人
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tctgctttgg tccatc 16
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aagtctgacc cttttt 16
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cctgtagtgt gcagga 16
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tttgtgacca ttccgg 16
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ttctacctga agagca 16
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tgtcagcctc aaagaa 16
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<213> 智人
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catccctatt ggcagg 16
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<213> 智人
<400> 552
ccgaagactt caccta 16
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<213> 智人
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tgttactctg tgccag 16
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<213> 智人
<400> 554
gacatcactc agga 14
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 555
ttattttata cctcac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 556
tcctttgtgt cattcc 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 557
agaactgagt actctg 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 558
agaaagcctt tttcgc 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 559
gttcttgtct ttcctt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 560
tggatttgat tgacat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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gctcatcatc tgggac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 562
aaccaataca accctc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 563
ggcctcgatc ttgtag 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 564
tacctggaga ttgaca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 565
tgtttagtga tgaaaa 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 566
atacctacta agtgct 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 567
attctccagg cgtttc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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tatcctcaga gtggca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 569
tacacagagg aagcct 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 570
gattcttaca gaaaac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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acctctatgg tgggat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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gttcttgctg gtgtga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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aaacatggtg ggattt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 574
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 575
ctgtcaacct gcatga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 576
tcttttccac atcagt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 577
ttttggccaa caatgt 16
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<211> 16
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<213> 智人
<400> 578
caaggagatt cttagc 16
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<213> 智人
<400> 579
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 580
atgacaacca ggacaa 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 581
ttacctgtcc tggtca 16
<210> 582
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 582
actcccatct tgagtc 16
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 584
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<213> 智人
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gtctgcagga caattc 16
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 587
aacaatggtg actaca 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 588
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<212> DNA
<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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catatcaaat tcacac 16
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catttgactt tacctt 16
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tttccagata ctagag 16
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aatctttggc cagtac 16
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<213> 智人
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agagagaagg tttgac 16
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<213> 智人
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gccaattggt ctgtat 16
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<213> 智人
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ccttttccat agagaa 16
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<213> 智人
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gagacaatga attaag 16
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<213> 智人
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agaatctcca ttttag 16
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<213> 智人
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atggctcatt cacaac 16
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taattacagt ccagaa 16
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gattctttta gatctg 16
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<213> 智人
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tttccattgc ctcgac 16
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gctcattaac ttaact 16
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gtatatacac tgggct 16
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ttgtagatat gatgca 16
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<213> 智人
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accattactt gtccat 16
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<213> 智人
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ctctaatttt gtgaca 16
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<213> 智人
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tgctgtcgaa tagcta 16
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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ctctgcaatt aaattt 16
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 708
ttcccagtcc actata 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 709
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 713
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 714
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<212> DNA
<213> 智人
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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ccttcaagct gcccta 16
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<211> 16
<212> DNA
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tatacaatca atacct 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 719
ctaaggttgc acatag 16
<210> 720
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 720
agcttctctg tctaag 16
<210> 721
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 721
aaaggtcttt gatttg 16
<210> 722
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 722
ctattccacc tactga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 723
acccaagaca gagcat 16
<210> 724
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 724
gtaaaagacc tcagtc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 725
gacccttata atgagc 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 726
ctattttctt cctctc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 727
gctgtgatcc atgaga 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 728
ctgccttgta ccattc 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 729
gcagaacatc aagttc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 730
tcagcctctg tgaaga 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 731
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 732
tgccacagtg aggaca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 733
gtaacccacc ttctgt 16
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<213> 智人
<400> 734
agcaccaggc cgatt 15
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 735
cctccacagg catttt 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 736
cactcacagc acatag 16
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<212> DNA
<213> 智人
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ccctgactgt gagatc 16
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<213> 智人
<400> 738
gtacgcctcc agatga 16
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<213> 智人
<400> 739
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<213> 智人
<400> 740
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<213> 智人
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atgagccctc agctga 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 742
aagcttgaac tctcat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 743
gtctctcctc ctgtca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 744
acctccttct tcctct 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 745
ggtctccaac ccatt 15
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 746
ggtgcgggag tgaata 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 747
acaaagtctg tcaacc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 748
tgcagcaata ccattg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 749
atcaccacgg gtctgt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 750
aggctcccac ctttca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 751
gtggtgtagt tggtca 16
<210> 752
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 752
gattcaaaag atcctg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 753
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<211> 15
<212> DNA
<213> 智人
<400> 754
tgctgcacca ggttg 15
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 755
gagttccaag gcctca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 756
aacttgaacc atcttt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 757
ttagtacctg aagggt 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 758
gcagttatgc ctcaga 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 759
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 760
cttactgcct cttgct 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 761
gagtcttcca gtgtga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 762
atcttgggcc tgtgtt 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 763
agggcaccac cacact 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 764
tctgattcct cactga 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 765
gctcaccatc gctatc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 766
tgtgggttga ttccac 16
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 767
gcattgaagt ctcatg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 768
tctgtccctt cccaga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 769
ttctgggagc ttcatc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 770
ctgctctttt caccca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 771
cctcaaaaac atgtca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 772
atgcttttga agaacg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 773
caaccttctc aagaca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 774
ccagccaatt ttgagt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 775
catttgcgat cacctg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 776
tcatcttctt aaagat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 777
gtatcccaag ttcact 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 778
ttactctaat ataacc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 779
gaccacggtc tctaga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 780
agagagtggg tgtggt 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 781
aggcaaacaa acctgg 16
<210> 782
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 782
gcaaaataat cagctc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 783
tctgaaagtg aactcc 16
<210> 784
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 784
ttcgccctct cctact 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 785
catgaaatag ttgtcc 16
<210> 786
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 786
ttatgcccga gactaa 16
<210> 787
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 787
gcttgtcccg ataggt 16
<210> 788
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 788
gtgtgatatt ggcaaa 16
<210> 789
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 789
ccactctcac cttctccatc tct 23
<210> 790
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 790
caaggtccta cgcttccaaa ag 22
<210> 791
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 791
gggaaacggt cgcactcaa 19
<210> 792
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 792
ccgtctgcct cgatgaccta 20
<210> 793
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 793
gatataaaaa gtggcttagg aggagctt 28
<210> 794
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 794
aggaagaaca ggatagaaag actgcttata 30
<210> 795
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 795
ctcacagaag tcgatggcat ca 22
<210> 796
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 796
cacaagctga ccaaacgtat cc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 797
catgtactgg tccctcattg ca 22
<210> 798
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 798
gtaataatcc agactgtgtt tctccctt 28
<210> 799
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 799
ctcccatacc ctctcagcgt a 21
<210> 800
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 800
agccataggg cataagctgt g 21
<210> 801
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 801
gcattcagat tccaaacaag gaaaatattt g 31
<210> 802
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<400> 802
gttaagactt acacacaaaa gtaatatcac aac 33
<210> 803
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 803
atgatctgct agtgaatgag ataagtca 28
<210> 804
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 804
acctacttac tgtacctggt gaca 24
<210> 805
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 805
gcaaacagag atgaatttct gactaaacc 29
<210> 806
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 806
gactgaatat cacacttcta aaaggtacgt 30
<210> 807
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人
<400> 807
gctgagtggg ctacgtct 18
<210> 808
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人
<400> 808
gtcttcgggc tcgcagaa 18
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<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 809
gggtacattc aggaggaagt gc 22
<210> 810
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 810
aacacatgga aaccttttag aaactgtttt 30
<210> 811
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 811
ccatccctga ctgtgagatc aa 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 812
ccaggtacgc ctccagatga 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 813
aaaagggagt tccaattctc acgt 24
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<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 814
ttttcttttt agattttgtg gtggatgcaa 30
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<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 815
gtctctcgga ggaaggactt ga 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 816
cctctctgct ctgcagcaaa tt 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 817
caccaagcag aagtaaaaca cctc 24
<210> 818
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 818
cctctgaact gcagcattta ctg 23
<210> 819
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 819
agttgttctt gtctttcctt ttcaagtttt 30
<210> 820
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 820
gacatggatt tgattgacat actttggag 29
<210> 821
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 821
ccagatgctg atactttatt acattttgcc 30
<210> 822
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 822
tgaactggag gcattattct taattccac 29
<210> 823
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 823
actattttgg ccaacaatgt ctcaaac 27
<210> 824
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 824
gctccaagga gattcttagc ca 22
<210> 825
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 825
agggcatctg gatccctgat 20
<210> 826
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 826
cttcctgtcc tcctagcagg a 21
<210> 827
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人
<400> 827
cccaagaact gagtactctg tacct 25
<210> 828
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 828
caagagaaag cctttttcgc tca 23
<210> 829
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 829
gccagggtat gtggctaca 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 830
acttctcaca ccgctgtgtt 20
<210> 831
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 831
cacctcagcc catcttgaca aa 22
<210> 832
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人
<400> 832
caccgtgcgt tgcttgtt 18
<210> 833
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 833
tgatggagat gtgataattt caggaaaca 29
<210> 834
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 834
cggtgactta ctgcagctgt tt 22
<210> 835
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 835
agggtgagag gcatggctat ta 22
<210> 836
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 836
gctccatcga gtcttcactg tg 22
<210> 837
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 837
catggctgcg cttctactta ct 22
<210> 838
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 838
ctatgggtgg tgttgtgttt tgtg 24
<210> 839
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 839
ccgctacatt gattccattt gtaataaacc 30
<210> 840
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 840
ccatttcctc aatgtttcca gataagg 27
<210> 841
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 841
agaagaggag cctggacagt ta 22
<210> 842
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 842
aaaggaagac tcagaggaga gagataag 28
<210> 843
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 843
catgttatgt taaccaacct ccctagt 27
<210> 844
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 844
gttccaatcg tcagaaaatt ttggaaagaa 30
<210> 845
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 845
cagaaggatt cgatgaatca caaaatgg 28
<210> 846
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 846
agaacaccaa gcatcactgg atg 23
<210> 847
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 847
actcccgatc tggatcagca ta 22
<210> 848
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 848
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<212> DNA
<213> 智人
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cctcacctct atggtgggat ca 22
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<212> DNA
<213> 智人
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acaggttctt gctggtgtga aat 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
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gaagctgtca acctgcatga ag 22
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<212> DNA
<213> 智人
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tgaatctttt ccacatcagt ggtgatc 27
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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tgcatgtctg ccaggaaact tt 22
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<212> DNA
<213> 智人
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ccaaatgaca accaggacaa taagtga 27
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<213> 智人
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ctgggacatg gccaagagaa gt 22
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<213> 智人
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<213> 智人
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aatggctgac actggacatc tt 22
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<213> 智人
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cctgaaactt atgggagaaa cagga 25
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<213> 智人
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tcagagcagg cctattttga agg 23
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<213> 智人
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gatggacccg tattcattct cca 23
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<213> 智人
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tgctaggatt gttaaataac cgccttt 27
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<213> 智人
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gagaaccagt tcagagtgga ctac 24
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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gcatgccaat tggtctgtat cc 22
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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ggtcaatcct atgcaaaaat ctttcacc 28
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<213> 智人
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gatctatgtt cgaacaggta tctaccatg 29
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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gttcttcagg gcaaagaagt cca 23
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<213> 智人
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<213> 智人
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tttcctgtag caaaaccaga aatcct 26
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<213> 智人
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aaataatcat ctcacctctg ctcagttc 28
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<213> 智人
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gatagaggtt ccttaagatc tcgatttcc 29
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<212> DNA
<213> 智人
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gaaggttgag ctctgcaggt at 22
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<212> DNA
<213> 智人
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tttcagcatg aaatagtgta tcagtggt 28
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<212> DNA
<213> 智人
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cctggcttta aatcctcgaa cacaa 25
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<212> DNA
<213> 智人
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tggtttctgg tgggaccatt atg 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 962
gtcctctgga tctcttcatg ca 22
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 963
agggcttttg ttttcttccc tttaga 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
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gccattgtgc ttgaatgcac ta 22
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<213> 智人
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ctctgtcaca gtggattcga ga 22
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<212> DNA
<213> 智人
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
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gttgcttttg aacagggcaa aatc 24
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<212> DNA
<213> 智人
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ttccctcctt tacttcatat cacttacct 29
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<213> 智人
<400> 969
aaaaaggcaa acaaacctgg cta 23
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<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 970
cccagcaaaa taatcagctc tcattttc 28
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<212> DNA
<213> 智人
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tctgcgtgta cctgtcgtag ta 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 972
cctgaccact ttccctctct tttg 24
<210> 973
<211> 25
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 1459
gtttaacctt tctactgttt tctttgtctg a 31
<210> 1460
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1460
atctgttcca gaatcaagat tctgagatg 29
<210> 1461
<211> 26
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1461
cagtcttaca tttgaccatg accatg 26
<210> 1462
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1462
actgatgacc tttggaggaa aacc 24
<210> 1463
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1463
cctccttcct agagagttag agtaact 27
<210> 1464
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1464
cacccacact tacacatcac tttg 24
<210> 1465
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1465
ccagttacct gtcctggtca tt 22
<210> 1466
<211> 26
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1466
ggaaactccc atcttgagtc ataagg 26
<210> 1467
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1467
tttttctgtc caccagggag ta 22
<210> 1468
<211> 31
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1468
acattggaat agtttcaaac atcatcttgt g 31
<210> 1469
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1469
agacgacaca ggaagcagat tc 22
<210> 1470
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1470
cagtctgctg gatttggttc tagg 24
<210> 1471
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1471
aagatcacct tcagaagtca cagaatg 27
<210> 1472
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1472
ctggttgaga tgaaaggatt ccact 25
<210> 1473
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1473
tggaccacac aggagaatat gga 23
<210> 1474
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1474
cttaacaagc tgtctcctct cctt 24
<210> 1475
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1475
gttctgttaa agttcatggc ttttgtgt 28
<210> 1476
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1476
tttacataag aagcgtttac gatcctcttt 30
<210> 1477
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1477
aggtgcagaa catcaagttc aaca 24
<210> 1478
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1478
gtgctcagcc tctgtgaaga g 21
<210> 1479
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1479
cagaaggtct acatgggtgc tt 22
<210> 1480
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1480
gccagcccga agtctgtaat ttt 23
<210> 1481
<211> 26
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1481
tctatatgta gaggctgttg gaagct 26
<210> 1482
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1482
tccactgaag ttctttatct tcaaataact 30
<210> 1483
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1483
tgctttagat tggcaattat tactgtttcg 30
<210> 1484
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1484
gttgactttg tccacctgga act 23
<210> 1485
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1485
aaggcttttt ctttagacag ttgtttgtt 29
<210> 1486
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1486
gaggttcccg taggtcatga ac 22
<210> 1487
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1487
ctgcgaccct tataatgagc ct 22
<210> 1488
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1488
gcaactattt tcttcctctc ttccaca 27
<210> 1489
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1489
ggcacggttg aatgtaaggc tta 23
<210> 1490
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1490
actgatatgg tagacagagc ctaaacat 28
<210> 1491
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1491
aggcttcata tgatgaaggg taatgtg 27
<210> 1492
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1492
taggagatac ccacgtatgt accac 25
<210> 1493
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1493
ccactccatc gagatttcac tgta 24
<210> 1494
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1494
tcataatgct tgctctgata ggaaaatga 29
<210> 1495
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1495
aaaaatcaaa tcttaaaagc ttcttggtgt 30
<210> 1496
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1496
tctttctcca ctcagcgtct ttg 23
<210> 1497
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1497
gattgaagag cccacaggtg at 22
<210> 1498
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1498
ctcctccttg ctagggttct tc 22
<210> 1499
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1499
cagaaacgtt tcgattataa agatcagca 29
<210> 1500
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1500
aaaaagactg taagtggttt ctcaggaa 28
<210> 1501
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1501
ggacttggtg atagacatgt acagaat 27
<210> 1502
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1502
gcaaacaaca ttccatgatg accaaatatt 30
<210> 1503
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1503
ctgcacatcc ggatgtagga tc 22
<210> 1504
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1504
gaaccctgag agcagcttca at 22
<210> 1505
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1505
ttctttgtag atatgatgca gccattga 28
<210> 1506
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1506
gaaaaccatt acttgtccat cgtctttc 28
<210> 1507
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1507
agaaaattga ctaacctgtg tttctttaca 30
<210> 1508
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1508
cctttggaag tggacccaga aac 23
<210> 1509
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1509
ccattttctc tcagtaagtg tttatgatgc 30
<210> 1510
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1510
atttaaaatt agcaccctga gaagctct 28
<210> 1511
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1511
gaacaggccc tcagttcaag at 22
<210> 1512
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1512
actctccctt cacaggtggt att 23
<210> 1513
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1513
tttgtttgtc agagtcagag cact 24
<210> 1514
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1514
tctagatcct aaacgtaaga agcaacac 28
<210> 1515
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1515
gtgacaaacc tgctgagcat tag 23
<210> 1516
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1516
tgaaatcagt gttttgcttc tctaggtac 29
<210> 1517
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1517
cctgtttagg ccttgcagaa tttg 24
<210> 1518
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1518
tcccactgca tattcctcca tg 22
<210> 1519
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1519
gcatagagga gagaggaaaa gtgg 24
<210> 1520
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1520
attggcagct ccgaggacca 20
<210> 1521
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1521
tggtggacaa gtgaatttgc tca 23
<210> 1522
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1522
ttctaaaggc tgaatgaaag ggtaattcat 30
<210> 1523
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1523
ctgccaatcg gcgtgtaa 18
<210> 1524
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1524
ctcctcttct tttcctctgg ct 22
<210> 1525
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1525
tctttgctca tcttttcttt atgttttcga att 33
<210> 1526
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1526
aatgaaattt gttacctgta cacatgaagc 30
<210> 1527
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1527
gttcttttgt cctactcctt ctttcca 27
<210> 1528
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1528
ttacttcagt gtttctccat catcacag 28
<210> 1529
<211> 26
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1529
aaaatctctg tccaagtcct gtgaaa 26
<210> 1530
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1530
gctttgtgta tgcctataat tgaaactgt 29
<210> 1531
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1531
tcttacaccc agtggagaag ct 22
<210> 1532
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1532
tgtgccaggg accttacctt ata 23
<210> 1533
<211> 26
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1533
tgcattacct acgatggtaa ccaaag 26
<210> 1534
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1534
cctattcaac aaacagaact atgatacgga 30
<210> 1535
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1535
gcattaacta gtcaagtact tacccact 28
<210> 1536
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1536
atctctttca tgactgcagc ttctt 25
<210> 1537
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1537
gtgttcactt tcaggaattc tatgagc 27
<210> 1538
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1538
gttgggtggc ggttacttac ta 22
<210> 1539
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1539
aaagagatca aacaccctaa cctgg 25
<210> 1540
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1540
cgaggttttg tgcagtgagc 20
<210> 1541
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1541
gcctctctaa ttttgtgaca tttgagc 27
<210> 1542
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1542
ggcatgctgt cgaatagcta ga 22
<210> 1543
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1543
ctcctgaaaa gagagtggaa gtgt 24
<210> 1544
<211> 26
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1544
agttgctgca agtcagttga aaaatc 26
<210> 1545
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1545
gggtgtggat gcttcctttt aaac 24
<210> 1546
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1546
tgtactccag tgaggaagca gaa 23
<210> 1547
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1547
gatcgtctcc atcatcatca tcgt 24
<210> 1548
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1548
gacattattg cttctcctgt gtgtttc 27
<210> 1549
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1549
catcattaat ttttgcttca cagaagacca 30
<210> 1550
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1550
tattacccag agatacccag aaaagagatt 30
<210> 1551
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1551
tttgtggttt actttaagat tacaaattca gaa 33
<210> 1552
<211> 32
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1552
gctttctgga ataattctga cttatatgct tc 32
<210> 1553
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1553
tgctactatc atcagactga tcaaaatcg 29
<210> 1554
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1554
ggtagatgag gactcctcag gaaa 24
<210> 1555
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1555
ccacgaccac ggtctctaga 20
<210> 1556
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1556
gttgagagag tgggtgtggt t 21

Claims (54)

1.一种用于分析样品中的第一靶多核苷酸序列和第二靶多核苷酸序列的甲基化状态的方法，其包含：
1)使包含多核苷酸的样品与甲基化敏感性限制酶(MSRE)接触，其中所述MSRE在未被甲基化的残基处选择性切割所述多核苷酸，或在所述残基被甲基化时在所述残基处选择性切割所述多核苷酸；
2)使用以下各项的混合物，对来自步骤1)的所述样品进行多核苷酸扩增：
i)用于扩增所述样品中的第一靶多核苷酸序列的第一引物组，和
ii)用于分析所述样品中的第二靶多核苷酸序列的甲基化状态的第二引物组，其中所述甲基化状态是所述第二靶多核苷酸序列中的残基的甲基化状态，并且所述第二引物组中的一个引物与未被切割的第二靶多核苷酸序列杂交，且与所述组中的另一个引物一起，扩增所述未被切割的序列，但不扩增被所述MSRE在所述残基处切割的所述第二靶多核苷酸序列；以及
3)对步骤2)中扩增的多核苷酸进行测序，
其中使用来自经过扩增的第一靶多核苷酸序列的测序读段来分析所述第一靶多核苷酸序列，并且通过比较来自经过扩增的第二靶多核苷酸序列的测序读段的观察数(No)与参考数来分析所述第二靶多核苷酸序列的所述残基的甲基化状态。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述MSRE在未被甲基化的残基处切割所述多核苷酸，且在所述残基被甲基化时不在所述残基处切割。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包含对来自未与所述MSRE接触的样品的多核苷酸进行扩增和测序。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述MSRE选自由以下组成的群组：HpaII、SalI、
Figure FDA0002321900090000011
ScrFI、BbeI、NotI、SmaI、XmaI、MboI、BstBI、ClaI、MluI、NaeI、NarI、PvuI、SacII、HhaI以及其任何组合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一靶多核苷酸序列包含遗传或表观遗传信息，例如突变、单核苷酸多态性(SNP)、拷贝数变异(CNV)、DNA修饰如DNA甲基化和/或组蛋白修饰。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述突变包含点突变、插入、缺失、插入/缺失、倒位、截短、融合、易位、扩增或其任何组合。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述遗传或表观遗传信息与个体或群体中的病况或疾病相关，例如癌症相关的突变。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第二靶多核苷酸序列在所述MSRE的识别位点内包含一个或多个CpG位点，其中在每个CpG位点处，胞嘧啶(C)包含5-甲基部分或5-氢部分。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二靶多核苷酸序列包含基因的调控序列，例如启动子区、增强子区、绝缘子区、沉默子区、5'UTR区、3'UTR区或剪接控制区，并且所述一个或多个CpG位点在所述调控序列内。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述基因与个体或群体中的病况或疾病相关，例如在癌症或肿瘤中过度表达、表达不足、组成性激活、沉默或异位表达的基因。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述样品是生物样品。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物样品来自患有或怀疑患有疾病或病况，例如癌症或肿瘤的个体。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述生物样品是包含循环肿瘤DNA(ctDNA)的样品，例如血液、血清、血浆或体液样品，或其任何组合。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述样品中的所述多核苷酸是或包含双链序列。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述样品中的所述多核苷酸是或包含单链序列，并且所述方法任选地包含基于序列互补性将所述单链序列转化为双链序列，例如，通过引物延伸转化。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述第一和第二靶多核苷酸序列在所述样品中的相同的分子上或不同的分子上，例如两个不同的DNA片段上。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述第一和第二靶多核苷酸序列在相同的基因上，任选地，其中所述第一靶多核苷酸序列在所述基因的编码区中，而所述第二靶多核苷酸序列在所述基因的非编码调控区中。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述第一和第二靶多核苷酸序列在不同的基因上，任选地，其中所述基因在相同生物通路或网络中起作用。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述第一和第二靶多核苷酸序列在相同或不同的染色体上，或者在相同或不同的染色体外DNA分子(例如线粒体DNA)上，或者一个在染色体上，而另一个在染色体外DNA分子上。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤包含聚合酶链反应(PCR)、逆转录PCR扩增、等位基因特异性PCR(ASPCR)、单碱基延伸(SBE)、等位基因特异性引物延伸(ASPE)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、引物延伸、滚环扩增(RCA)、自主序列复制(3SR)、使用Qβ复制酶、切口平移或环介导的等温扩增(LAMP)或其任何组合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述等位基因特异性PCR(ASPCR)用于扩增所述第一靶多核苷酸序列，并且所述第一引物组包含至少两个等位基因特异性引物和共同引物，并且任选地，所述ASPCR使用没有3'至5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少两个等位基因特异性引物中的至少一个对癌症突变具有特异性。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述第二引物组包含共同引物和至少两个各自用于所述第二靶多核苷酸序列中的不同CpG位点的引物。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其进一步包含在步骤1)中从所述样品中纯化多核苷酸，在步骤2)中从所述样品中纯化多核苷酸，和/或在测序步骤3)中纯化多核苷酸。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述测序步骤包含将测序接头和/或样品特异性条形码与每个多核苷酸连接。
26.根据权利要求25所述的方法，其中连接步骤是使用聚合酶链反应(PCR)进行的。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述测序是高通量测序、数字测序或下一代测序(NGS)，例如Illumina(Solexa)测序、Roche 454测序、离子激流:质子/PGM测序和SOLiD测序。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述参考数在对所述第一和第二靶多核苷酸序列进行分析时平行确定，其确定为在有或没有使用甲基化不敏感的MSRS的同裂酶的对照反应的情况下，基于对照基因座和/或参考样品的测序读段的预期数(Ne)。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述样品是肿瘤样品，并且所述参考样品来自与所述肿瘤相邻的正常组织，和/或所述第二靶多核苷酸序列中的所述残基处的所述甲基化状态是定性或定量读数，例如，如由甲基化水平mC＝No/Ne所指示。
30.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述第一引物组和/或所述第二引物组以任何合适的组合包含表1和/或表2中列出的一个或多个引物。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述第一引物组包含用于选自由以下组成的群组的基因的一个或多个引物：ABCB1、CYP2C19、CYP2C8、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5、DPYD、GSTP1、MTHFR、NQO1、RHEB、SULT1A1、UGT1A1、MPL、JAK1、NRAS、DDR2、PTEN、FGFR2、HRAS、ATM、CBL、KRAS、ERBB3、CDK4、HNF1A、FLT3、RB1、AKT1、IDH2、CDH1、TR53、ERBB2、STAT3、SMAD4、STK11、GNA11、JAK3、PPP2R1A、RET、DNMT3A、ALK、NFE2L2、SF3B1、PIK3CA、ERBB4、GNAS、U2AF1、SLC19A1、SMARCB1、CHEK2、VHL、RAF1、CTNNB1、PDGFRA、KIT、KDR、FBXW7、APC、NEUROG1、CSF1R、NPM1、TPMT、EGFR、MET、SMO、BRAF、EZH2、FGFR1、JAK2、CDKN2A、PAX5、PTCH1、ABL1、NOTCH1、ARAF、MED12、BTK以及其任何组合。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述一个或多个引物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:61-788中所述的序列或其任何组合。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述第二引物组包含用于选自由以下组成的群组的基因的一个或多个引物：NDRG4、SEPT、MLH1、WTN5A、AGTR1、BMP3、SFRP2、NEUROG1、TFPI2、SDC2以及其任何组合。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述一个或多个引物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1-60中所述的序列或其任何组合。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述扩增是多重的。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中在单个反应中同时进行所述第一靶多核苷酸序列的分析和所述第二靶多核苷酸序列的甲基化状态的分析。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述样品中的多核苷酸浓度小于约0.1ng/mL，小于约1ng/mL，小于约3ng/mL，小于约5ng/mL，小于约10ng/mL，小于约20ng/mL或小于约100ng/mL。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其用于诊断和/或预后个体的疾病或病况，预测个体对治疗的反应性，鉴别所述疾病/病况或治疗的药物遗传学标志物，和/或从群体中筛选遗传信息。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述疾病或病况是癌症或肿瘤，并且所述治疗是癌症或肿瘤治疗。
40.一种试剂盒，其包含：
甲基化敏感性限制酶(MSRE)，其中所述MSRE在未被甲基化的残基处选择性切割，或在所述残基被甲基化时在所述残基处选择性切割；
用于扩增样品中的第一靶多核苷酸序列的第一引物组；和/或
用于分析所述样品中的第二靶多核苷酸序列的甲基化状态的第二引物组，其中所述甲基化状态是所述第二靶多核苷酸序列中的残基的甲基化状态，并且所述第二引物组中的一个引物与未被切割的第二靶多核苷酸序列杂交，且与所述组中的另一个引物一起，扩增所述未被切割的序列，但不扩增被所述MSRE在所述残基处切割的所述第二靶多核苷酸序列。
41.根据权利要求40所述的试剂盒，其中所述MSRE选自由以下组成的群组：HpaII、SalI、ScrFI、BbeI、NotI、SmaI、XmaI、MboI、BstBI、ClaI、MluI、NaeI、NarI、PvuI、SacII、HhaI以及其任何组合。
42.根据权利要求40或41所述的试剂盒，其中所述第一引物组包含至少两个等位基因特异性引物和共同引物，以及任选地没有3'至5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的试剂盒，其中所述第二引物组包含共同引物和至少两个各自用于所述第二靶多核苷酸序列中不同CpG位点的引物。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的试剂盒，其进一步包含用于从样品中纯化多核苷酸的试剂。
45.根据权利要求40至44中任一项所述的试剂盒，其进一步包含用于测序的试剂，例如测序接头和/或样品特异性条形码。
46.根据权利要求40至45中任一项所述的试剂盒，其中将所述第一和第二引物组混合。
47.根据权利要求40至45中任一项所述的试剂盒，其中所述第一和第二引物组在单独的小瓶中，并且所述试剂盒进一步包含将所述引物的全部或部分进行混合的说明书，和/或其中所述第一引物组和/或所述第二引物组以任何合适的组合包含表1和/或表2中列出的一个或多个引物。
48.根据权利要求40至47中任一项所述的试剂盒，其中所述第一引物组包含用于选自由以下组成的群组的基因的一个或多个引物：ABCB1、CYP2C19、CYP2C8、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5、DPYD、GSTP1、MTHFR、NQO1、RHEB、SULT1A1、UGT1A1、MPL、JAK1、NRAS、DDR2、PTEN、FGFR2、HRAS、ATM、CBL、KRAS、ERBB3、CDK4、HNF1A、FLT3、RB1、AKT1、IDH2、CDH1、TR53、ERBB2、STAT3、SMAD4、STK11、GNA11、JAK3、PPP2R1A、RET、DNMT3A、ALK、NFE2L2、SF3B1、PIK3CA、ERBB4、GNAS、U2AF1、SLC19A1、SMARCB1、CHEK2、VHL、RAF1、CTNNB1、PDGFRA、KIT、KDR、FBXW7、APC、NEUROG1、CSF1R、NPM1、TPMT、EGFR、MET、SMO、BRAF、EZH2、FGFR1、JAK2、CDKN2A、PAX5、PTCH1、ABL1、NOTCH1、ARAF、MED12、BTK以及其任何组合。
49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述一个或多个引物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:61-788中所述的序列或其任何组合。
50.根据权利要求40至49中任一项所述的试剂盒，其中所述第二引物组包含用于选自由以下组成的群组的基因的一个或多个引物：NDRG4、SEPT、MLH1、WTN5A、AGTR1、BMP3、SFRP2、NEUROG1、TFPI2、SDC2以及其任何组合。
51.根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述一个或多个引物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:1-60中所述的序列或其任何组合。
52.根据权利要求40至51中任一项所述的试剂盒，其进一步包含将测序读段的观察数与参考数进行比较的说明书。
53.根据权利要求52所述的试剂盒，其进一步包含参考样品和/或对照基因座的信息。
54.根据权利要求40至53中任一项所述的试剂盒，其进一步包含用于一种或多种组分的单独的小瓶和/或使用所述试剂盒的说明书。
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