JP4917891B2 - 差次的酵素的断片化の方法 - Google Patents
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Description
本願は、米国特許出願第 号(2004年10月21日に出願された、代理人整理番号021031-000830US)に関連し、2003年10月21日に出願された米国特許出願第60/513,426号、2004年4月12日に出願された第60/561,721号、および2004年4月12日に出願された第60/561,563号の恩典を主張し、それらのそれぞれの開示は、すべての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられている。
DNAは、典型的には、メチル化および非メチル化塩基を含む。原核生物のDNAは、シトシンおよびアデノシン残基でメチル化されている(例えば、McClelland et al., Nuc. Acids. Res. 22:3640-3659 (1994)参照)。原核生物のDNAのメチル化は、同族の制限酵素による消化からDNAを保護する、すなわち、細胞へ導入された外来DNA(このようにメチル化されていない)は、メチル化原核生物DNAを分解することができない制限酵素により分解される。DNAメチル化パターンは、特定の細菌型(例えば、属、種、菌株および分離株)を同定するために用いられうる。
本発明は、メチル化依存性制限酵素、メチル化感受性制限酵素、および/またはメチル化非感受性制限酵素を用いて核酸の集団内で座におけるメチル化を検出する方法を提供する。
I. 序論
本発明は、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素および/またはメチル化非感受性制限酵素を用いて、核酸の集団内で座におけるメチル化の存在を検出する方法を提供する。本発明の方法により、対象となる座を含む核酸は、本明細書に記載されているような1つまたは複数の制限酵素で切断されて、無傷のメチル化座、無傷の非メチル化座、および/または無傷のヘミメチル化座の集団を生じる。座は、増幅され、増幅産物は比較される。増幅産物の比較は、座におけるメチル化に関する情報を提供する。
「メチル化」は、シトシンのC5位もしくはN4位における(それぞれ、「5mC」および「4mC」)、アデニンのN6位における(「6mA」)メチル化、または核酸のメチル化の他の型を指す。DNA配列の異常型メチル化(すなわち、過剰メチル化または過少メチル化)は、疾患、状態または表現型(例えば、癌、血管疾患、認識力障害または他の後成的形質)と関連しうる。「非メチル化」DNA配列は、DNAを評価するために用いられる特定のメチル化依存性またはメチル化感受性制限酵素についての少なくとも認識配列において、実質的に、メチル化残基を含まない。「メチル化」DNAは、DNAを評価するために用いられる特定のメチル化依存性またはメチル化感受性制限酵素についての少なくとも認識配列において、メチル化残基を含む。「非メチル化」と呼ばれるDNA配列は、一般的に、その長さ全体に沿って、実質的に、メチル化ヌクレオチドを有しないであろうが、定義は、制限酵素についての認識配列以外の位置にメチル化ヌクレオチドを有する核酸配列を含むことは、理解されている。同様に、「メチル化」と呼ばれるDNA配列は、一般的に、その長さ全体に沿って、メチル化ヌクレオチドを有するであろうが、定義は、制限酵素についての認識配列以外の位置に非メチル化ヌクレオチドを有する核酸配列を含むことは理解されている。「ヘミメチル化」DNAは、DNAの一方の鎖が特定の座でメチル化されており、他方の鎖はその特定の座でメチル化されていない、二本鎖DNAを指す。
本発明の方法は、少なくとも2つの部分へ分割された試料の制限後、無傷DNAの存在もしくは非存在または量を比較する段階であって、部分が異なる制限酵素で処理される、段階を含みうる。多くの態様において、第一部分は、メチル化依存性制限酵素と接触させられ(無傷の非メチル化DNAおよび断片化メチル化DNAを生じる)、第二部分は、メチル化感受性制限酵素と接触させられる(無傷のメチル化DNAおよび断片化非メチル化DNAを生じる)。各部分由来の座の無傷コピーは、制限消化後に分析され、比較される。
(1)座のコピーの事実上すべてが無傷の状態のままである、処理されていない、または偽の処理された集団;
(2)座の非メチル化コピーの事実上すべてが無傷の状態のままである、メチル化依存性制限酵素で処理された集団;
(3)座のメチル化コピーの事実上すべてが無傷の状態のままである、メチル化感受性制限酵素で処理された集団;
(4)座の有るか無しかの無傷コピーを含むメチル化依存性制限酵素およびメチル化感受性制限酵素の両方で処理された集団;ならびに
(5)制限酵素の認識部位において突然変異している座のコピーを除いて、座の有るか無しかの無傷コピーを含むメチル化非感受性制限酵素(すなわち、その認識配列においての、または、その認識配列の近くの、アデノシン残基におけるかまたはシトシン残基におけるメチル化のいずれかに対して非感受性)で処理された集団。
含む。適したメチル化感受性制限酵素は、例えば、Aat II、Aci I、Acl I、Age I、Alu I、Asc I、Ase I、AsiS I、Bbe I、BsaA I、BsaH I、BsiE I、BsiW I、BsrF I、BssH II、BssK I、BstB I、BstN I、BstU I、Cla I、Eae I、Eag I、Fau I、Fse I、Hha I、HinP1 I、HinC II、Hpa II、Hpy99 I、HpyCH4 IV、Kas I、Mlu I、MapA1 I、Msp I、Nae I、Nar I、Not I、Pml I、Pst I、Pvu I、Rsr II、Sac II、Sap I、Sau3A I、Sfl I、Sfo I、SgrA I、Sma I、SnaB I、Tsc I、Xma I、およびZra Iのような、認識配列内のシトシンがC5位でメチル化されている場合、切断しない制限酵素を含む。適したメチル化感受性制限酵素は、例えば、Mbo Iのような、認識配列内のアデノシンがN6位でメチル化されている場合、切断しない制限酵素を含む。当業者は、本明細書に記載された制限酵素の相同体および相同分子種もまた本発明に用いるのに適していることを理解しているものと思われる。
制限酵素に依存する、部分的かまたは完全のいずれかの制限酵素消化は、特定のDNA座内のメチル化密度に関する情報を提供するために用いられうる。本発明で用いる制限酵素は、典型的には、対象となる座の配列分析に基づいて選択される。その後、各カテゴリー(例えば、メチル化依存性またはメチル化感受性)における1つまたは複数の酵素が選択される。配列分析は、既知の配列のデータベースを評価することに基づいて行われうる、または場合によっては、例えば、特定の被験者に存在する可能性がある、突然変異のような変異体を考慮に入れるために、経験的な決定に基づきうる。
DNAは、用いられうる任意の生物試料から、例えば、生物(例えば、動物、植物、真菌、原核生物)由来の細胞、組織、および/または体液から、得られうる。試料は、新鮮でありうる、凍結状態でありうる、固定液(例えば、アルコール、ホルムアルデヒド、パラフィン、またはPreServeCyte(商標))に保存されうる、または緩衝液に希釈されうる。生物試料は、例えば、皮膚、血液またはその画分、組織、生検(例えば、肺、結腸、乳房、前立腺、頸部、肝臓、腎臓、脳、胃、食道、子宮、睾丸、皮膚、骨、心臓、胆嚢、および膀胱など由来)、体液および分泌物(例えば、血液、尿、粘液、痰、唾液、子宮頸管スミア検体、骨髄、大便、汗、および濃縮呼気など)を含む。生物試料はまた、葉、茎、根、種、花弁、花粉、胞子、キノコの傘、および樹液を含む。
対象となる座を含むDNA試料がメチル化を感知する制限酵素(すなわち、メチル化依存性またはメチル化感受性制限酵素)で完全に消化される場合、提供される情報は、制限酵素の認識配列におけるメチル化の存在または非存在を含む。制限酵素の切断部位を含む座における無傷DNAの存在は、メチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素による切断に必要な認識部位の適切なメチル化状態が、座に、または、の近くに、存在しなかったことを示す。
部分的(すなわち、不完全)消化におけるメチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素での切断の量は、座において任意のDNAメチル化を含む断片の数だけでなく、試料におけるDNAの座内の平均メチル化濃度もまた反映する。例えば、座を含むDNA断片が、より高いメチル化密度を有する場合、メチル化依存性制限酵素を用いる部分的消化は、座内においてこれらの断片をより頻繁に切断するであろう。同様に、座を含むDNA断片がより低いメチル化密度を有する場合、メチル化依存性制限酵素を用いる部分的消化は、より少しの認識部位しか存在しないため、座内においてこれらの断片をより少ない頻度で切断するであろう。または、メチル化感受性制限酵素が用いられる場合、より高いメチル化密度をもつDNA断片は、より少なく切断され、それに従って、座を含むより多くの無傷DNAが存在する。これらの場合のそれぞれにおいて、問題のDNA試料の消化は、完全消化について上で考察されたもののような対照値と比較される。
対照値は、外部値(例えば、既知もしくは予想される数のメチル化ヌクレオチドまたはメチル化制限酵素認識配列をもつ第二DNA試料における無傷の座の数)かまたは内部値(例えば、同じDNA試料における第二座、または第二DNA試料における同じ座)のいずれかを表しうる。有用であるが、対照においてどれくらいの数のヌクレオチド(すなわち、絶対値)がメチル化されているかを知る必要はない。例えば、メチル化が結果として疾患状態を生じる座について、座が正常細胞においてより多くメチル化されているという知識は、試料を得た被験者が疾患をもちうる、または疾患を発症する初期にありうることを示しうる。
本明細書に記載されているように、サイクル閾値(Ct)は、増幅反応においてDNA鋳型の最初の量を決定するための有用な測定である。従って、本明細書に記載されているように、メチル化依存性および/またはメチル化感受性制限酵素で処理され、かつ増幅された試料からのCt値は、メチル化密度を計算するために用いられうる。1つの試料と対照値(第二試料からのCt値を示すことができる)の間のCt値における変化は、相対的メチル化密度を予測する。PCRにおける増幅は、理論的には、サイクルごとにコピーを2倍にするため、2Xは、指数関数的増幅中の増幅におけるコピーの数に比例し、Xは、サイクルの数である。従って、2Ctは、増幅の開始時における無傷DNAの量に比例する。2つの試料の間、または試料と対照値(例えば、対照からのCt値を示す)の間のCtの変化(ΔCt)は、試料における最初の出発鋳型における差を表す。それゆえに、2|ΔCt|は、試料と対照または第二試料の間の相対的メチル化密度差に比例する。例えば、2つの試料間のCtにおける1.46の差は、一方の試料が、他方の試料より、座においてのモニターされる部位内に約2.75(すなわち、2(1.46)=2.75)倍多いメチル化ヌクレオチドを有することを示している。
制限酵素により切断されたDNAの存在および量は、例えば、定量的増幅、ハイブリッド捕獲、またはそれらの組み合わせを含む、当技術分野において公知の任意の手段を用いて検出されうる。
いくつかの態様において、制限酵素により切断されたDNAの存在および量は、消化後、座を増幅することにより測定されうる。増幅のために無傷DNA鎖の存在を必要とする増幅技術(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR))を用いることにより、残っている非切断DNAの存在および量が測定されうる。例えば、増幅プライマーが対象となる特定の座に隣接するPCR反応が、設計されうる。増幅は、2つのプライマーを含む座が制限消化後に無傷の状態のままである場合に起こる。全体および無傷のDNAの量がわかっている場合には、切断されたDNAの量が決定されうる。DNAの切断は、DNAのメチル化状態に依存するため、無傷および切断されたDNAは、異なるメチル化状態を表す。
いくつかの態様において、メチル化特異的PCRは、DNA座における特定のヌクレオチドのメチル化状態をモニターするために用いられうる。これらの態様において、制限酵素での消化後または前に、DNAは、非メチル化シトシンを修飾する作用物質と混合される。例えば、亜硫酸水素ナトリウムがDNAに加えられ、それにより、非メチル化シトシンをウラシルへ変換させ、メチル化シトシンを無傷のままにしておく。1つまたは複数のプライマーは、亜硫酸水素ナトリウムで処理されたメチル化と非メチル化の配列の間を識別するように設計される。例えば、亜硫酸水素塩処理されたメチル化配列に相補的なプライマーは、内因性シトシンに相補的であるグアノシンを含む。亜硫酸水素塩処理された非メチル化配列に相補的なプライマーは、ウラシル、非メチル化シトシンの変換産物、に相補的であるアデノシンを含む。好ましくは、変換されたメチル化および非メチル化配列の間を区別するヌクレオチドは、プライマーの3'末端に、または、の近くに、ある。亜硫酸水素ナトリウムに基づいたPCRを用いる方法のバリエーションは、例えば、Herman et al., PNAS USA 93:9821-9826 (1996); 米国特許第5,786,146号および同第6,200,756号に記載されている。
いくつかの態様において、核酸ハイブリッド捕獲アッセイ法は、制限酵素により切断されたDNAの存在および量を検出するために用いられうる。この方法は、DNAを増幅しようがしまいが、用いられうる。制限消化後、対象となるDNA配列に特異的にハイブリダイズするRNAプローブは、DNAと混合されて、RNA:DNAハイブリッドを形成する。その後、RNA:DNAハイブリッドに結合する抗体が、ハイブリッドの存在、ならびにそれゆえに、非切断DNAの存在および量を検出するために用いられる。RNAプローブに相補的である配列のウィンドウにおいて制限されたDNA断片は、モニターされることになっている配列のウィンドウにおいて無傷の状態のままであるDNA断片がハイブリダイズするより低効率でRNAプローブにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの量は、無傷DNAを定量化することを可能にし、DNAメチル化の量は、異なる制限酵素処理(すなわち、メチル化感受性および/またはメチル化依存性制限酵素処理)からの無傷DNAの量から直接的に推測されうる。
に記載されている。場合によっては、抗体は、検出を容易にするために、検出可能な標識(例えば、酵素標識、同位元素、または蛍光標識)で標識される。または、抗体:核酸複合体は、検出可能な標識で標識された二次抗体とさらに接触させられうる。適した免疫学的およびイムノアッセイ手順の概説について、例えば、Harlow & Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publication, New York (1988); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds., 第7版 1991); 米国特許第4,366,241号;同第4,376,110号;同第4,517,288号;および同第4,837,168号; Antibodies in Cell Biology, 37巻 (Asai, ed. 1993)を参照されたい。
いくつかの態様において、本発明の方法は、座のメチル化密度を測定するために用いられうる。メチル化密度の測定は、例えば、2003年10月21日に出願された、米国特許出願第60/513,426号に記載されている。
本発明の方法は、核酸試料(例えば、DNAまたはゲノムDNA)間および/または特定の座におけるメチル化の差を検出するために用いられうる。いくつかの態様において、方法は、ゲノムDNA座のすべてのコピーが同一のメチル化パターンを有するDNAの試料を分析するために用いられうる。いくつかの態様において、DNA試料は、ある対立遺伝子が別のものより多くメチル化されているDNA座の対立遺伝子を含むDNAの混合物である。いくつかの態様において、DNA試料は、2つまたはそれ以上の異なる細胞型由来のDNAを含み、各細胞型は、特定の座において異なるメチル化密度をもつ(例えば、病気に罹っているのではないかと疑われる組織由来の細胞、および非罹患組織試料由来の細胞)。例えば、ある座において、腫瘍性細胞は、正常細胞と比較して異なるメチル化密度をもつ。組織、体液または分泌物が、正常および腫瘍性細胞の両方由来のDNAを含む場合には、組織、体液または分泌物由来のDNA試料は、異なってメチル化された対立遺伝子の不均一な混合物を含む。この場合、与えられた座において、DNA内の1組の対立遺伝子(例えば、試料における腫瘍性細胞由来のもの)は、別の組の対立遺伝子(例えば、正常細胞由来のもの)とは異なるメチル化密度をもつ。
上記のように、対象となる遺伝子座におけるメチル化の相対的量を測定するために、多数の可能性が利用できる。例えば、部分的または完全消化が行われうる、メチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素が用いられうる、亜硫酸水素ナトリウム処理が用いられうるなど。本発明を特定のシリーズの段階に限定することを意図することなく、以下の可能性がさらに例示される。
本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットを提供する。例えば、本発明のキットは、例えば、メチル化依存性制限酵素またはメチル化感受性制限酵素、あらかじめ決められた数のメチル化ヌクレオチドを含む対照DNA分子、および対照DNA分子にハイブリダイズする1つまたは2つの異なる対照オリゴヌクレオチドプライマーを含みうる。場合によっては、キットは、ユーザーが試料の増幅を既知の数のメチル化ヌクレオチドを含むいくつかのDNAと比較することができるように、メチル化ヌクレオチドの異なるあらかじめ決められた数を含む複数のDNA分子を含む。
実施例1:座におけるメチル化を同定するための比較
以下の実施例は、どのようにして本発明の方法が、核酸の集団において、座のメチル化コピーの数、座の非メチル化コピーの数、座のヘミメチル化コピーの数、座の突然変異したコピーの数、および座のコピーの総数を測定するために用いられうるかを例証している。核酸は、試料から単離され、部分へ分割され、各部分は、試料に存在する配列のすべてを含む。この実施例は、例証的な目的として、Sau3A Iの制限部位を用い、6mAメチル化をモニターする。当業者は、異なる酵素がシトシンメチル化をモニターするために選択されうることを理解しているものと思われる。
(1)hemi+(2)meth+(3)unmeth+(4)mut。
B. 核酸の第二部分をメチル化感受性制限酵素Mbo Iで切断し、続いて、定量的PCRを行うことは、試料における座のメチル化コピーの増幅を導き、以下に等しい:
(1)hemi+(2)meth+(4)mut。
C. 核酸の第三部分をメチル化依存性制限酵素Dpn Iで切断し、続いて定量的PCRを行うことは、試料における非メチル化コピーの増幅を導き、以下に等しい:
(1)hemi+(3)unmeth+(4)mut。
D. 核酸の第四部分をメチル化感受性制限酵素Mbo Iおよびメチル化依存性制限酵素Dpn Iで切断し、続いて定量的PCRを行うことは、試料におけるヘミメチル化コピーの増幅を導き、以下に等しい:
(1)hemi+(4)mut。
E. 核酸の第五部分をSau3A I、制限依存性制限酵素(Dpn I)のアイソシゾマーであるメチル化非感受性制限酵素、で切断し、続いて定量的PCRを行うことは、試料における突然変異体コピー、すなわち、PCRプライマーと相補的であるコピー、の増幅を導くが、ヘミメチル化、メチル化、または非メチル化制限部位を含まず、以下に等しい:
(4)mut。
F. AおよびBからの結果の比較は、試料における非メチル化座の数へと導く:
unmeth=A[hemi+meth+unmeth+mut]−B[hemi+meth+mut]。
G. AおよびCからの結果の比較は、試料におけるメチル化コピーの数へと導く:
meth=A[hemi+meth+unmeth+mut]−C[hemi+unmeth+mut]。
H. A、BおよびCからの結果の比較は、試料におけるヘミメチル化コピーおよび非メチル化コピーの数へと導く:
hemi+unmeth=C[hemi+unmeth+mut]−(A[hemi+meth+unmeth+mut]−B[hemi+meth+mut])。
hemi+unmeth=B[hemi+meth+mut]−(A[hemi+meth+unmeth+mut]−B[hemi+unmeth+mut])。
I. AおよびDからの結果の比較は、試料におけるメチル化および非メチル化コピーの数へと導く:
meth+umneth=A[hemi+meth+unmeth+mut]−D[hemi+mut]。
J. DおよびEからの結果の比較は、試料におけるヘミメチル化コピーの数へと導く:
hemi=D[hemi+mut]−E[mut]。
K. EおよびDからの結果のBまたはCとの比較は、それぞれ、試料におけるメチル化または非メチル化コピーの数へと導く:
meth=B[hemi+meth+mut]−E[mut]−(D[hemi+mut]−E[mut])
unmeth=C[hemi+unmeth+mut]−E[mut]−(D[hemi+mut]−E[mut])。
ヒト男性胎盤DNAを得て、シトシンの後にグアノシンが続く(すなわち、GCモチーフ)場合シトシンをメチル化する(5mC)M.SssIを用いてインビトロでメチル化した。結果として生じるインビトロメチル化DNAを、その後、既知の比率で非メチル化男性胎盤DNAへ混合し、それにより、1組の混合物を生じ、それぞれはメチル化されている総コピーの異なるパーセンテージを含む。
および標準PCR条件は以下のものを用いた。
1サイクル[95℃で3分間]
続いて、49サイクル[95℃で30秒間、65℃で15秒間、および68℃で15秒間、プレートを68℃で読み取り、その後、もう一つのプレートを83℃で読み取る]。
83℃での第二プレート読み取りは、反応プロファイルへのプライマーダイマーの蛍光寄与を排除するために行われた。温度の関数として蛍光を測定する融解曲線は、サイクルの終わりに80℃と95℃の間で行われ、産物特異性が測定された。対象となる座は、長さが181 bpであり、約89℃の融解温度をもつ。増幅産物蓄積は、それが二本鎖核酸に結合する場合蛍光を発する、インターカレーティング色素、MJ ResearchからのSYBR Green(商標)Dynamo Kit、を用いて測定され、反応は循環されて、蛍光強度は、MJ Opticon IIリアルタイムPCR装置を用いてモニターされた。
標準試料セットは多数の方法で作製される。例えば、メチル化密度の増加を有することがわかっているDNAの標準セットを作製するために、メチラーゼ(例えば、M.SssIまたはM.HhaI、M.AluIのような他のメチラーゼ)が、一連のDNA試料へインビトロで適用される。この標準セットは、最初に既知の配列(例えば、対象となる座)の試料を得ることにより作製される。次に、試料は、1シリーズの試料へ分割され、シリーズにおける各試料は、マグネシウムの存在下で、かつ結果として、シリーズにおける試料のメチル化密度を増加させるような様式において、選択されたメチラーゼで処理される。
DNAは、以下の2つの源:試験集団(罹患した)および対照集団(正常)、から収集される。
DNAは、単一の源から得られ、2つの集団へ分割される。DNAの第一集団は、酵素McrBCで完全に消化され、一方、残りの集団は処理されない。または、第一集団は、1つまたは複数のメチル化感受性制限酵素(例えば、Hpa II、Hha I、またはAci Iなど)のカクテルで消化され、一方、DNAの第二集団は処理されない。
DNAは、単一の源から得られ、1シリーズの2つまたはそれ以上の部分へ分割される。
DNAは、以下の2つの源:試験集団(罹患した)および対照集団(正常)、から収集される。各集団は、2つまたはそれ以上の部分の群へ分割される。各群は、メチル化感受性制限酵素(例えば、Hpa II、Mbo I(A))による増加性量の部分的消化に曝される。DNA断片の第一部分は処理されず、第二部分はメチル化感受性制限酵素で軽く消化され、その後の集団は、その酵素でより完全に消化される(しかし、完了までには満たない)。部分的消化の範囲は、酵素量、消化時間、温度、反応物、緩衝液または他の必要とされる成分の滴定のような反応条件の操作を通して得られる。
DNAは、単一の源から得られ、2つまたはそれ以上の部分の群へ分割される。または、DNAは、以下の2つの源:試験集団(罹患した)および対照集団(正常)、から収集され、2つまたはそれ以上の均一な部分の群へ分割される。
DNAは、単一の源から得られ、2つの部分へ分割される。または、DNAは、以下の2つの源:試験集団(罹患した)および対照集団(正常)、から収集され、各集団は2つの部分へ分割される。
この実施例は、座内のメチル化の平均密度(すなわち、メチル化ヌクレオチドの平均数)を測定することを実証している。図7に提供されているように、多くの疾患において、1つまたは複数の座のメチル化は、疾患進行に対応してメチル化密度の増加の進行を受ける。以前に記載されたメチル化検出技術は、1つもしくは複数の特定のヌクレオチドにおけるメチル化の存在または非存在を検出することを含むが、座に渡っての密度の分析を提供しない。対照的に、本発明は、座内のメチル化事象の平均数を検出するための方法を提供する。
この実施例は、メチル化依存性およびメチル化感受性制限酵素の、座における異なるメチル化密度を識別できることを実証する。
Dynamo MJ qPCR緩衝液、65℃アニール、2サイクルPCR(95℃で30 sec、65℃で20 sec)が49回サイクルされ、MJ opticon II定量的PCRシステムでモニターされた。
a)McrBC切断により、T=1についての0ΔCtからT=4(60分間)における最大ΔCtまで進む際の各試料についてのより大きなΔCtを示すはずである。
b)Aci I反応は、正反対の関係を示すはずである。
c)偽処理された消化物および二重消化物は一定の参照点であるはずである。
この実施例は、モロコシ(Sorghum bicolor)においてカフィリン(kafirin)遺伝子クラスターに繰り返されている配列をモニターするアッセイ法を用いて、一度より多く(すなわち、1コピーより多く)ゲノムに存在する標的配列のメチル化を測定する本方法の能力を実証する。
SYBR greenリアルタイムPCRサイクリングパラメーターは、MJ Research (Boston, MA)からのDynamo Kitを用いて、95℃で3分間、続いて、2段階PCR、95℃で30秒間、56℃で30秒間、の50サイクルである。低温(70℃)および高温(82℃)の両方のプレート読み取りを利用した。ゲノムDNAの投入量は、PCR反応あたり10 ngであった。閾値は、鋳型希釈標準対照を用いて設定された。
Claims (78)
- 以下の段階を含む、核酸の集団内で座における相対的なメチル化の量を測定する方法:
(a) 核酸の集団を少なくとも3つの部分へ分割する段階;
(b) 段階(a)の後、座の断片化された非メチル化コピーおよび座の無傷のメチル化コピーを有する核酸の第一部分を得るために、第一部分をメチル化感受性制限酵素と接触させる段階;
(c) 段階(b)の後、第一部分における座の無傷コピーの数を定量化する段階であって、該定量化が定量的増幅を含む段階;
(d) 段階(a)の後、座の断片化されたメチル化コピーおよび座の無傷の非メチル化コピーを有する核酸の第二部分を得るために、第二部分をメチル化依存性制限酵素と接触させる段階であって、該メチル化依存性制限酵素が、第二部分と、座におけるメチル化依存性制限酵素についての可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させられる、段階;
(e) 段階(d)の後、第二部分における座の無傷コピーの数を定量化する段階であって、該定量化が定量的増幅を含む段階;および
(f) 第一部分における座の無傷コピーの数および第二部分における座の無傷コピーの数を比較することにより座におけるメチル化の量を測定する段階。 - (g) 段階(a)の後、制限酵素で消化されていない核酸の第三部分における座の無傷コピーの数を定量化する段階であって、該定量化が定量的増幅を含む、段階をさらに含み;
段階(f)が、第三部分における座の無傷コピーの数を第一部分における座の無傷コピーの数および/または第二部分における座の無傷コピーの数と比較することにより核酸の集団内の座におけるメチル化の量を測定する段階を含む、請求項1記載の方法。 - (h) 段階(a)の後、核酸の第三部分をメチル化依存性制限酵素およびメチル化感受性制限酵素と接触させる段階;および
(i) 段階(h)の後、第三部分における座の無傷コピーの数を定量化する段階であって、該定量化が定量的増幅を含む、段階
をさらに含み;かつ
段階(f)が、第三部分における座の無傷コピーの数を第一部分における座の無傷コピーの数および/または第二部分における座の無傷コピーの数と比較することにより核酸の集団内の座におけるメチル化の量を測定する段階を含む、請求項1記載の方法。 - 段階(g)が実施され、かつ
核酸の第四部分をメチル化依存性制限酵素およびメチル化感受性制限酵素と接触させる段階;および第四部分における座の無傷コピーの数を定量化する段階であって、段階(f)が、第四部分における座の無傷コピーの数を、第三部分における座の無傷コピーおよび/または第一部分における座の無傷コピーおよび/または第二部分における座の無傷コピーの数と比較することにより、核酸の集団内の座におけるメチル化の量を測定することを含む段階をさらに含む、請求項2記載の方法。 - 座内の突然変異の同定をさらに含む、請求項4記載の方法。
- 核酸の第五部分をメチル化非感受性制限酵素と接触させる段階;およびメチル化非感受性制限酵素と接触させた後に第五部分における座の無傷コピーの数を定量化する段階であって、座における突然変異の存在を決定する段階が、第五部分における座の無傷コピーの数を、第四部分における座の無傷コピーおよび/または第三部分における座の無傷コピーおよび/または第一部分における座の無傷コピーおよび/または第二部分における座の無傷コピーの数と比較することを含む段階を含む、請求項5記載の方法。
- 段階(g)において測定される第三部分における座の無傷コピーの数から、第一部分がメチル化感受性制限酵素で切断された後に残っている第一部分における座の無傷コピーの数を引くことにより、座の非メチル化コピーの数が決定される、請求項2記載の方法。
- 段階(g)において測定される第三部分における座の無傷コピーの数から、第二部分がメチル化依存性制限酵素で切断された後に残っている第二部分における座の無傷コピーの数を引くことにより、座のメチル化コピーの数が決定される、請求項2記載の方法。
- 座のヘミメチル化および突然変異体コピーの数が以下の段階により決定される、請求項2記載の方法:
(i) 段階(g)において測定される第三部分における座の無傷コピーの数から、第一部分がメチル化感受性制限酵素で切断された後に残っている第一部分における座の無傷コピーの数を引き、それにより、座の非メチル化コピーの数を決定する段階;ならびに
(ii) 第二部分がメチル化依存性制限酵素で切断された後に残っている第二部分における座の無傷コピーの数から、(i)からの座の非メチル化コピーの数を引き、それにより、座のヘミメチル化および突然変異体コピーの数を決定する段階。 - 座のヘミメチル化および突然変異体コピーの数が以下の段階により決定される、請求項2記載の方法:
(i) 段階(g)において測定される第三部分における座の無傷コピーの数から、第二部分がメチル化依存性制限酵素で切断された後に残っている第二部分における座の無傷コピーの数を引き、それにより、座のメチル化コピーの数を決定する段階;ならびに
(ii) 第一部分がメチル化感受性制限酵素で切断された後に残っている第一部分における座の無傷コピーの数から、(i)からの座のメチル化コピーの数を引き、それにより、座のヘミメチル化および突然変異体コピーの数を決定する段階。 - 段階(f)の測定段階が、段階(g)において測定される第三部分における座の無傷コピーの数から、第四部分がメチル化依存性制限酵素およびメチル化感受性制限酵素で切断された後に残っている第四部分における座の無傷コピーの数を引き、それにより座のメチル化および非メチル化コピーの数を決定することを含む、請求項4記載の方法。
- 第四部分がメチル化依存性制限酵素およびメチル化感受性制限酵素で切断された後に残っている第四部分における座の無傷コピーの数から、核酸の第五部分がメチル化非感受性制限酵素と接触させられた後に残っている第五部分における無傷の座の数を引くことにより、座のヘミメチル化コピーの数が決定される、請求項6記載の方法。
- 座のメチル化コピーの数が以下の段階により決定される、請求項6記載の方法:
(i) 第四部分がメチル化依存性制限酵素およびメチル化感受性制限酵素で切断された後に残っている第四部分における座の無傷コピーの数から、核酸の第五部分がメチル化非感受性制限酵素と接触させられた後に残っている第五部分における座の無傷コピーの数を引き、それにより、座のヘミメチル化コピーの数を決定する段階;ならびに
(ii) 核酸の第一部分がメチル化感受性制限酵素と接触させられた後に残っている第一部分における座の無傷コピーの数から、(i)からの座のヘミメチル化コピーの数、および核酸の第五部分がメチル化非感受性制限酵素と接触させられた後に残っている第五部分における座の無傷コピーの数を引き、それにより、座のメチル化コピーの数を決定する段階。 - 座の非メチル化コピーの数が以下の段階により決定される、請求項6記載の方法:
(i) 第四部分がメチル化依存性制限酵素およびメチル化感受性制限酵素で切断された後に残っている第四部分における座の無傷コピーの数から、核酸の第五部分がメチル化非感受性制限酵素と接触させられた後に残っている第五部分における座の無傷コピーの数を引き、それにより、座のヘミメチル化コピーの数を決定する段階;ならびに
(ii) 核酸の第二部分がメチル化依存性制限酵素と接触させられた後に残っている第二部分における座の無傷コピーの数から、(i)からの座のヘミメチル化コピーの数、および核酸の第五部分がメチル化非感受性制限酵素と接触させられた後に残っている第五部分における座の無傷コピーの数を引き、それにより、座の非メチル化コピーの数を決定する段階。 - 定量化段階が定量的増幅を含む、請求項4記載の方法。
- 定量化段階が定量的増幅を含む、請求項6記載の方法。
- 核酸が、定量的増幅の前に非メチル化シトシンを修飾する作用物質と接触させられ;座の無傷コピーが、メチル化と作用物質と接触させられた非メチル化のDNAの間を識別する少なくとも1つのプライマーを含む1対のオリゴヌクレオチドプライマーで増幅される、請求項1記載の方法であって、作用物質が、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、過マンガン酸塩、およびヒドラジンから選択される、方法。
- 核酸が、定量的増幅の前に非メチル化シトシンを修飾する作用物質と接触させられ;座の無傷コピーが、メチル化と作用物質と接触させられた非メチル化のDNAの間を識別する少なくとも1つのプライマーを含む1対のオリゴヌクレオチドプライマーで増幅される、請求項15記載の方法であって、作用物質が、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、過マンガン酸塩、およびヒドラジンから選択される、方法。
- 核酸が、定量的増幅の前に非メチル化シトシンを修飾する作用物質と接触させられ;座の無傷コピーが、メチル化と作用物質と接触させられた非メチル化のDNAの間を識別する少なくとも1つのプライマーを含む1対のオリゴヌクレオチドプライマーで増幅される、請求項16記載の方法であって、作用物質が、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、過マンガン酸塩、およびヒドラジンから選択される、方法。
- 作用物質が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項17記載の方法。
- 作用物質が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項18記載の方法。
- 作用物質が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項19記載の方法。
- 段階(h)のメチル化依存性制限酵素が、第三部分と、座におけるメチル化依存性制限酵素についての可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させられる、請求項3記載の方法。
- メチル化依存性制限酵素が、第四部分と、座におけるメチル化依存性制限酵素についての可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させられる、請求項4記載の方法。
- メチル化依存性制限酵素が第三部分に接触させられた後の第三部分における無傷メチル化座の数を、対照DNAにおけるメチル化の量を表す対照値と比較することにより、座におけるメチル化の密度が決定される、請求項23記載の方法。
- メチル化依存性制限酵素が第四部分に接触させられた後の第四部分における座の無傷コピーの数を、対照DNAにおけるメチル化の量を表す対照値と比較することにより、座におけるメチル化の密度が決定される、請求項24記載の方法。
- メチル化感受性制限酵素が、第一部分と、座におけるメチル化感受性制限酵素についての可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させられる、請求項1記載の方法。
- メチル化感受性制限酵素が、段階(h)の第三部分と、座におけるメチル化感受性制限酵素についての可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させられる、請求項3記載の方法。
- メチル化感受性制限酵素が、第四部分と、座におけるメチル化感受性制限酵素についての可能性のある制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されない状態のままであることを可能にする条件下で接触させられる、請求項4記載の方法。
- 座がメチル化の密度を有し、かつ、メチル化感受性制限酵素が第一部分に接触させられた後の第一部分における無傷非メチル化座の数を、対照DNAにおけるメチル化の量を表す対照値と比較することにより、座におけるメチル化の密度が決定される、請求項27記載の方法。
- 座がメチル化の密度を有し、かつ、メチル化感受性制限酵素が第三部分に接触させられた後の第三部分における無傷非メチル化座の数を、対照DNAにおけるメチル化の量を表す対照値と比較することにより、座におけるメチル化の密度が決定される、請求項28記載の方法。
- 座がメチル化の密度を有し、かつ、メチル化感受性制限酵素が第四部分に接触させられた後の第四部分における無傷非メチル化座の数を、対照DNAにおけるメチル化の量を表す対照値と比較することにより、座におけるメチル化の密度が決定される、請求項29記載の方法。
- メチル化が座内のシトシンのC5位にある、請求項1記載の方法。
- 核酸がDNAである、請求項1記載の方法。
- DNAがゲノムDNAである、請求項34記載の方法。
- メチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素の認識配列内のシトシンがC5位においてメチル化されている場合、切断しない、請求項1記載の方法。
- メチル化感受性制限酵素が以下のものからなる群より選択される、請求項36記載の方法:Aat II、Aci I、Acl I、Age I、Alu I、Asc I、Ase I、AsiS I、Bbe I、BsaA I、BsaH I、BsiE I、BsiW I、BsrF I、BssH II、BssK I、BstB I、BstN I、BstU I、Cla I、Eae I、Eag I、Fau I、Fse I、Hha I、HinP1 I、HinC II、Hpa II、Hpy99 I、HpyCH4 IV、Kas I、Mbo I、Mlu I、MapA1 I、Msp I、Nae I、Nar I、Not I、Pml I、Pst I、Pvu I、Rsr II、Sac II、Sap I、Sau3A I、Sfl I、Sfo I、SgrA I、Sma I、SnaB I、Tsc I、Xma IおよびZra I。
- メチル化依存性制限酵素がMcrBCである、請求項1記載の方法。
- ゲノム核酸の第一部分が少なくとも第二のメチル化感受性酵素とさらに接触させられる、請求項1記載の方法。
- ゲノム核酸の第二部分が少なくとも第二のメチル化依存性酵素とさらに接触させられる、請求項1記載の方法。
- メチル化感受性制限酵素がメチルシトシン感受性である、請求項1記載の方法。
- 核酸の第三部分を第二のメチル化感受性制限酵素と接触させ、かつ核酸の第四部分を第二のメチル化依存性制限酵素と接触させる段階;接触後に第三および第四部分における無傷の座を定量化する段階;ならびに、第三および第四部分における座の無傷コピーの数を、座の総無傷コピーおよび/または制限酵素との接触前の部分における座の無傷のメチル化コピーおよび/または段階(e)で決定された座の無傷コピーの数と比較することにより、座におけるメチル化の量を測定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 座におけるメチル化の量が少なくとも2つの核酸試料間で比較される、請求項1記載の方法。
- 少なくとも2つの核酸試料が、同じ表現型をもつ少なくとも2つの生物から単離される、請求項43記載の方法。
- 少なくとも2つの核酸試料が、異なる表現型をもつ少なくとも2つの生物から単離される、請求項43記載の方法。
- 第一試料および第二試料において座の無傷のメチル化コピーを定量化する段階;ならびに、その2つの試料のメチル化の量を比較し、それにより、その2つの試料間での座における相対的メチル化を決定する段階を含む、請求項43記載の方法。
- 第一の核酸試料が、癌細胞ではないかと疑われる細胞から単離され、かつ第二の核酸試料が非癌性細胞から単離される、請求項43記載の方法。
- 2つまたはそれ以上の座におけるメチル化の量を段階(a)から(f)によって測定し、かつ、その2つの座について測定されたメチル化の量を比較する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 核酸の集団が細胞から単離される、請求項1記載の方法。
- 細胞が、以下のものからなる群より選択されるメンバーである、請求項49記載の方法:植物細胞、真菌細胞、原核細胞、動物細胞、哺乳動物細胞および癌細胞。
- 核酸の集団が被験者由来の試料から単離され、その試料が体液および分泌物からなる群より選択されるメンバーである、請求項1記載の方法。
- 被験者がヒトである、請求項51記載の方法。
- 被験者が癌をもつのではないかと疑われる、請求項52記載の方法。
- 核酸の集団が被験者由来の組織生検から単離される、請求項1記載の方法。
- 被験者がヒトである、請求項54記載の方法。
- 被験者が癌をもつのではないかと疑われる、請求項54記載の方法。
- 座が、非罹患細胞より罹患細胞においてメチル化の多い配列を含む、請求項54記載の方法。
- 座が、非罹患細胞より罹患細胞においてメチル化の少ない配列を含む、請求項54記載の方法。
- 定量化段階が定量的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、請求項1記載の方法。
- 定量的増幅産物が、二本鎖DNA配列の塩基間に介入された標識の検出により検出される、請求項59記載の方法。
- 定量的増幅産物が、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのその増幅産物へのハイブリダイゼーションを検出することにより検出される、請求項59記載の方法。
- 検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、フルオロフォアおよびヘアピン構造を含む標識オリゴヌクレオチドプローブである、請求項61記載の方法。
- 検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、1対の相互作用的標識を含む二重標識されたオリゴヌクレオチドプローブである、請求項61記載の方法。
- 1対の相互作用的標識がクエンチャーおよびフルオロフォアである、請求項63記載の方法。
- プローブがその標的核酸配列にハイブリダイズした場合、フルオロフォアが活性化されて検出可能なシグナルを発生する、請求項63記載の方法。
- プローブがその標的核酸配列にハイブリダイズし、かつ5'エキソヌクレアーゼ活性をもつ酵素が、クエンチャーを含むプローブの部分を切断する場合、フルオロフォアが活性化されて検出可能なシグナルを発生する、請求項63記載の方法。
- 核酸の集団を均等に分割する前に、配列タグを核酸の集団の末端上へ付加する段階をさらに含む、請求項1記載の方法であって、
段階(c)が、第一部分における座の無傷コピーの数をその配列タグから増幅を開始するプライマーで定量化する段階を含み;ならびに、
段階(e)が、第二部分における座の無傷コピーの数をその配列タグから増幅を開始するプライマーで定量化する段階を含む方法。 - 第一部分がメチル化依存性制限酵素によって消化されず、第二部分がメチル化感受性制限酵素によって消化されない、請求項1記載の方法。
- 段階(c)と(e)における定量的増幅がリアルタイムでモニターされる、請求項1記載の方法。
- 段階(c)と(e)における定量的増幅が定量的PCRを含む、請求項1記載の方法。
- 定量的増幅がサイクル閾値の決定を含む、請求項70記載の方法。
- 定量的増幅産物が、二本鎖DNA配列の塩基間に介入された標識の検出により検出される、請求項70記載の方法。
- 定量的増幅産物が、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのその増幅産物へのハイブリダイゼーションを検出することにより検出される、請求項70記載の方法。
- 検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、フルオロフォアおよびヘアピン構造を含む標識オリゴヌクレオチドプローブである、請求項73記載の方法。
- 検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、1対の相互作用的標識を含む二重標識されたオリゴヌクレオチドプローブである、請求項73記載の方法。
- 1対の相互作用的標識がクエンチャーおよびフルオロフォアである、請求項75記載の方法。
- プローブがその標的核酸配列にハイブリダイズした場合、フルオロフォアが活性化されて検出可能なシグナルを発生する、請求項75記載の方法。
- プローブがその標的核酸配列にハイブリダイズし、かつ5'エキソヌクレアーゼ活性をもつ酵素が、クエンチャーを含むプローブの部分を切断する場合、フルオロフォアが活性化されて検出可能なシグナルを発生する、請求項75記載の方法。
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