ES2383970T3 - Fragmentación enzimática diferencial - Google Patents

Fragmentación enzimática diferencial Download PDF

Info

Publication number
ES2383970T3
ES2383970T3 ES04796072T ES04796072T ES2383970T3 ES 2383970 T3 ES2383970 T3 ES 2383970T3 ES 04796072 T ES04796072 T ES 04796072T ES 04796072 T ES04796072 T ES 04796072T ES 2383970 T3 ES2383970 T3 ES 2383970T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
locus
methylation
copies
dna
intact
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES04796072T
Other languages
English (en)
Inventor
Jeffrey A. Jeddeloh
Nathan D. Lakey
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Orion Genomics LLC
Original Assignee
Orion Genomics LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orion Genomics LLC filed Critical Orion Genomics LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2383970T3 publication Critical patent/ES2383970T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Un procedimiento de detectar la presencia de metilación en un locus dentro de una población de ácidos nucleicos, comprendiendo el procedimiento: (a) dividir la población de ácidos nucleicos en al menos cuatro porciones; (b) poniendo en contacto la primera porción con una enzima de restricción sensible a la metilación para obtener una población que comprende copias no metiladas fragmentadas del locus y copias metiladas intactas del locus: (c) amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la primera porción; (d) poner en contacto una segunda porción con una enzima de restricción dependiente de metilación para obtener una población que comprende copias metiladas fragmentadas del locus y copias no metiladas intactas del locus; (e) amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la segunda porción; (f) determinar la presencia de metilación en el locus comparando el número de copias intactas del locus en la primera porción y una serie de copias intactas del locus en la segunda porción; (g) amplificar cuantitativamente una tercera porción de los ácidos nucleicos, amplificando de este modo las copias intactas totales del locus en la población; y (k) comparar el número de copias intactas totales del locus con el número de copias intactas del locus en la primera porción y/o de copias intactas del locus en la segunda porción; (i) poner en contacto una cuarta porción de los ácidos nucleicos con una enzima de restricción dependiente de metilación y una enzima de restricción sensible a la metilación; (j) amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la cuarta porción; y (k) determinar la presencia de metilación en el locus comparando el número de copias intactas del locus en la cuarta porción con el número de copias intactas totales del locus en la tercera porción y/o copias intactas del locus en la primera porción y/o copias intactas del locus en la segunda porción.

Description

Fragmentación enzimática diferencial
Referencia a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica beneficio de las solicitudes de patente de EE.UU. nº 60/513.426, presentada el 21 de octubre de 2003, 60/561,721, presentada el 12 de abril de 2004 y 60/561.563 presentada el 12 de abril de 2004.
Antecedentes de la invención
El ADN normalmente comprende bases metiladas y no metiladas. El ADN procariótica está metilado en los residuos de citosina y adenosina (véase, por ejemplo, McClelland y coI., Nuc. Acids. Res. 22:3640-3659 (1994). La mutilación del ADN procariótico protege el ADN de la digestión por enzimas de restricción afines, es decir ADN extraños (que no están metilados de este modo) que se introducen en la célula son degradados por las enzimas de restricción que no pueden degradar el ADN procariótico metilado. Los patrones de mutilación del ADN se pueden usar para identificar tipos de bacterias específicos (p. ej., género, especie, cepas y aislamientos).
El ADN de mamífero solo puede mutilarse en los residuos de citosina, normalmente estas citosinas son vecinas en 5’ de guanina (CpG). Varias líneas de evidencia han demostrado que esta metilación desempeña un papel en la actividad génica, la diferenciación celular, la tumorigénesis, la inactivación del cromosoma X, la impresión genómica y otros procesos biológicos principales (Razin y Riggs eds. en DNA Methylation Biochemistry and Biological Significance, Springer-Verlag, N.Y., 1984)
En las células eucarióticos, la metilación de los residuos de citosina inmediatamente en 5’ de una guanosina se produce principalmente en los loci con pocas GC (Bird, Nature 321 :209 (1986)). En contraste con ello, regiones pequeñas de dinucleótidos GC denominadas islas de CpG permanecen sin mutilar en las células normales, excepto durante la inactivación del cromosoma X y la impresión específica parental (Li, y col., Nature 366:362 (1993)) en la que la metilación de las regiones reguladoras en 5’ puede conducir a represión de la transcripción.
La metilación aberrante, incluida la metilación aberrante en loci específicos, a menudo se asocia con un estado patológico. Por ejemplo, la metilación de novo del gen Rb se ha demostrado en una fracción pequeña de retinoblastomas (Sakai, y col., Am. J. Hum. Genet., 48:880 (1991 )) y un análisis más detallado del gen VHL mostró metilación aberrante en una subpoblación de carcinomas esporádicos de células renales (Herman, y coI., PNAS USA, 91 :9700 (1994)). La expresión de un gen supresor tumoral también se puede anular mediante la metilación del ADN de novo de una isla de 5' CpG no metilada. Véase, por ejemplo, Issa, y col., Nature Genet. 7:536 (1994); Merlo, y coI., Nature Med. 1:686 (1995); Herman, y coI., Cancer Res. 56: 722 (1996); Graff, y coI., Cancer Res., 55:5195 (1995); Herman, y coI., Cancer Res. 55:4525 (1995). La metilación del locus p16 se asocia con el cáncer pancreático. Véase, por ejemplo, Schutte y coI., Cancer Res. 57:3126-3131 (1997). Los cambios de metilación en el locus II/H 19 del factor de crecimiento similar a la insulina en riñón se asocian con la tumorigénesis de Wilms. Véase , por ejemplo, Okamoto y coI., PNAS USA 94:5367-5371 (1997).. La asociación de la alteración de la metilación en los loci p15, de E-caderina y de von Hippel-Lindau también se asocian con cáncer, Véase , por ejemplo, Herman y coI., PNAS USA 93:9821-9826 (1997). El estado de metilación de GSTP1 se asocia con el cáncer de próstata. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5,552,277. Por tanto, la detección de perfiles de metilación alterados en loci en los que dichas alteraciones se asocian con enfermedad se puede usar para proporcionar diagnósticos o pronósticos de enfermedad.
Los procedimientos actuales para determinar si el ADN está metilado o sin mutilar usaron normalmente enzimas de restricción sensibles a metilación o una combinación de enzimas de restricción sensibles a metilación e insensibles a metilación (véase, por ejemplo, Burman y coI., Am. J. Hum. Genet. 65:1375-1386 (1999); Toyota y coI., Cancer Res. 59:2307-2312 (1999); Frigola y coI., Nucleic Acids Res. 30(7):e28 (2002); Steigerwald y coI., Nucleic Acid Res. 18(6):1435-1439 (1990); documento WO 03/038120; y publicación de patente de EE.UU. Nº 2003/0129602 AI. En estos procedimientos, las secuencias de ADN metiladas permanecen intactas para el análisis. Chotai y col. (1998) J. Med. Genet., 35:472-475 hace referencia a un ensayo rápido basado en PCR para diagnóstico molecular diferencial de los síndromes de Prader-Willi y Angelman. El documento US 5.912.147 se refiere a medios para cuantificar la inestabilidad genómica. Dahl et al (2003) Biogerontology, 4:233-250 se refiere a técnicas de análisis de la metilación del ADN. Chu y col. (2002) Journal of Urology, 167: 1854-1858 se refiere al uso de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real para detectar la hipermetilación de las islas de CpG en la región promotora que flanquea al gen GSTP1 para diagnosticar el carcinoma de próstata.
Por tanto, existe la necesidad en la técnica de procedimientos más eficientes de detectar metilación de ADN, en particular ADN en loci específicos. La presente invención aborda estas y otras necesidades.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona procedimientos de detectar metilación en un locus dentro de una población de ácidos nucleicos que usan una enzima de restricción dependiente de metilación y una enzima de restricción sensible a la metilación y, opcionalmente, una enzima de restricción insensible a la metilación, como se especifica en las reivindicaciones.
Una realización, la presente invención proporciona un procedimiento de detectar la presencia de metilación en un locus dentro de una población de ácidos nucleicos mediante (a) dividiendo la población de ácido nucleico en al menos cuatro porciones, (b) poniendo en contacto la primera porción con una enzima de restricción sensible a la metilación para obtener una población que comprende copias no metiladas fragmentadas del locus y copias metiladas intactas del locus: (c) amplificando cuantitativamente las copias intactas del locus en la primera porción;
(d) poniendo en contacto una segunda porción con una enzima de restricción dependiente de metilación para obtener una población que comprende copias metiladas fragmentadas del locus y copias no metiladas intactas del locus; (e) amplificando cuantitativamente las copias intactas del locus en la segunda porción; (f) determinando la presencia de metilación en el locus comparando el número de copias intactas del locus en la primera porción y una serie de copias intactas del locus en la segunda porción; (g) amplificando cuantitativamente una tercera porción de los ácidos nucleicos, amplificando de este modo las copias intactas totales del locus en la población; y (h) comparando el número de copias intactas totales del locus con el número de copias intactas del locus en la primera porción y/o de copias intactas del locus en la segunda porción; (i) poniendo en contacto una cuarta porción de los ácidos nucleicos con una enzima de restricción dependiente de metilación y una enzima de restricción sensible a la metilación; (j) amplificando cuantitativamente las copias intactas del locus en la cuarta porción; y (k) determinando la presencia de metilación en el locus comparando el número de copias intactas del locus en la cuarta porción con el número de copias intactas totales del locus en la tercera porción y/o copias intactas del locus en la primera porción y/o copias intactas del locus en la segunda porción. El procedimiento puede además comprender la identificación de mutaciones dentro del locus. En una realización, el procedimiento comprende además poner en contacto una primera porción de los ácidos nucleicos con una enzima de restricción insensible a la metilación; amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la quinta porción para obtener una población de ácidos nucleicos que comprenden una mutación en el locus; y determinar la presencia de una mutación en el locus comparando el número de las copias intactas del locus en la quinta porción con el número de copias intactas del locus en la cuarta porción y/o las copias intactas totales del locus en la tercera porción y/o las copias intactas del locus en la primera porción y/o las copias intactas del locus en la segunda porción.
El número de copias no metiladas del locus se puede determinar restando el número de copias intactas del locus que permanece después de cortar la primera porción con la enzima de restricción sensible a la metilación del total de las copias intactas del locus. El número de copias metiladas del locus se puede determinar restando el número de copias intactas del locus que permanece después de cortar la segunda porción con la enzima de restricción dependiente de metilación del total de las copias intactas del locus. El número de copias hemimetiladas y mutantes del locus se puede determinar (a) restando el número de copias intactas del locus que permanecen después de cortar la primera porción con la enzima de restricción sensible a la metilación del total de copias intactas del locus, determinando de este modo el número de copias no metiladas del locus; y (b) restando el número de copias no metiladas del locus del número de copias intactas del locus que permanece después de cortar la segunda porción con la enzima de restricción dependiente de metilación, determinando de este modo el número de copias mutantes y hemimetiladas del locus. El número de copias hemimetiladas y mutantes del locus se puede determinar del siguiente modo: (a) restando el número de copias intactas del locus que permanecen después de cortar la segunda porción con la enzima de restricción dependiente de metilación del total de copias intactas del locus, determinando de este modo el número de copias metiladas del locus; y (b) restando el número de copias metiladas del locus del número de copias intactas del locus que permanece después de cortar la primera porción con la enzima de restricción sensible a metilación, determinando de este modo el número de copias mutantes y hemimetiladas del locus. El número de copias metiladas y no metiladas del locus se puede determinar restando el número de copias intactas del locus que permanece después de cortar la cuarta porción con la enzima de restricción dependiente de metilación y la enzima de restricción sensible a metilación del total de las copias intactas del locus, determinando de este modo el número de copias metiladas y no metiladas del locus. El número de copias hemimetiladas del locus se puede determinar restando el número de loci intactos que permanece después de poner en contacto la quinta porción de los ácidos nucleicos con una enzima de restricción insensible a metilación del número de copias intactas del locus que permanece después de cortar la cuarta porción con la enzima de restricción dependiente de metilación y la enzima de restricción sensible a metilación. El número de copias metiladas del locus se puede determinar (a) restando el número de copias intactas del locus que permanece después de poner en contacto la quinta porción de los ácidos nucleicos con una enzima de restricción insensible a metilación del número de copias intactas del locus que permanece después de cortar la cuarta porción con la enzima de restricción dependiente de metilación y la enzima de restricción sensible a metilación, determinando de este modo el número de copias hemimetiladas del locus; y(b) restando el número de copias hemimetiladas del locus y el número de copias intactas del locus que permanece después de poner en contacto la quinta porción de los ácidos nucleicos con la enzima de restricción insensible a metilación del número de copias intactas del locus que permanece después de poner en contacto la primera porción de los ácidos nucleicos con la una enzima de restricción sensible a metilación, determinando de este modo el número de copias metiladas del locus. El número de copias no metiladas del locus se puede determinar (a) restando el número de copias intactas del locus que permanece después de poner en contacto la quinta porción de los ácidos nucleicos con una enzima de restricción insensible a metilación del número de copias intactas del locus que permanece después de cortar la cuarta porción con la enzima de restricción dependiente de metilación y la enzima de restricción sensible a metilación, determinando de este modo el número de copias hemimetiladas del locus; y(b) restando el número de copias hemimetiladas del locus y el número de copias intactas del locus que permanece después de poner en contacto la quinta porción de los ácidos nucleicos con la enzima de restricción insensible a metilación del número de copias intactas del locus que permanece después de poner en contacto la segunda porción de los ácidos nucleicos con la una enzima de restricción dependiente de metilación, determinando de este modo el número de copias no metiladas del locus.
Las etapas de cuantificación pueden comprender la detección directa de copias intactas del locus con captura híbrida. Las etapas de cuantificación comprenden amplificación cuantitativa, incluida, por ejemplo, PCR cuantitativa. El producto de la amplificación cuantitativa se puede detectar detectando un marcador intercalado entre bases de secuencias de ADN bicatenario. El producto de la amplificación cuantitativa se puede detectar detectando la hibridación de un oligonucleótido marcado de forma que se pueda detectar con el producto de la amplificación. El oligonucleótido marcado de forma que se pueda detectar puede ser una sonda oligonucleotídica marcada que comprende un fluoróforo y una estructura en horquilla o una sonda oligonucleotídica marcada de forma doble, que comprende un par de marcadores interactivos (p. ej., un inactivador y un fluoróforo). El fluoróforo se puede activar para generar una señal detectable cuando la sonda hibrida con su secuencia de ácido nucleico diana. El fluoróforo se puede activar para generar una señal detectable cuando la sonda hibrida con su secuencia de ácido nucleico diana y una enzima con actividad 5' exonucleasa escinde la porción de la sonda que comprende el inactivador.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se ponen en contacto con un agente que modifica las citosinas no metiladas antes de la etapa de amplificación; y las copias intactas del locus se amplifican con un par de cebadores oligonucleotídicos que comprenden al menos un cebador que distingue entre ADN no metilado y metilado modificado.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se ponen en contacto con un agente (p. ej., bisulfito sódico) que modifica las citosinas no metiladas antes de la etapa de amplificación; y las copias intactas del locus se amplifican con un par de cebadores oligonucleotídicos que comprenden al menos un cebador que distingue entre el ARN metilado protegido y no metilado modificado.
La enzima de restricción dependiente de metilación se puede poner en contacto con las porciones segunda, tercera
o cuarta en condiciones que permitan que permanezcan sin escindir al menos algunas copias de los potenciales sitios de escisión de la enzima de restricción para la enzima de restricción dependiente de metilación en el locus. La densidad de la metilación en el locus se puede determinar comparando el número de loci metilados intactos en las porciones segunda, tercera o cuarta tras la escisión con un valor control que representa la cantidad de metilación en un ADN control.
La enzima de restricción sensible a metilación se puede poner en contacto con las porciones primera o tercera en condiciones que permitan que permanezcan sin escindir al menos algunas copias de los potenciales sitios de escisión de la enzima de restricción para la enzima de restricción sensible a metilación en el locus. La densidad de la metilación en el locus se puede determinar comparando el número de loci no metilados intactos en las porciones primera o tercera tras la escisión con un valor control que representa la cantidad de metilación en un ADN control.
La metilación puede estar en la posición C4 de una citosina, la posición C5 de una citosina en el locus o en la posición N6 de una adenosina en el locus.
Los ácidos nucleicos pueden ser ADN, incluido, por ejemplo, ADN genómico.
La enzima de restricción sensible a metilación puede no cortar cuando una citosina dentro de la secuencia de reconocimiento está metilada en la posición C5.
La enzima de restricción sensible a metilación puede ser Aat II, Aci I, Ac/I, Age I, A/u I, Asc I, Ase I, AsiS I, Bbe I, BsaA I, BsaH I, BsiE I, BSIW I, BsrF I, BssH II, BssK I, BstB I, BstN I, BstU I, Cia I, Eae I, Eag I, Fau I, Fse I, Hha I, HinP 1 I, HinC II, Hpa II, Hpy99 I, HpyCH4 IV, Kas I, Mbo I, M/u I, MapAI I, Msp I, Nae I, Nar I, Not I, Pm/I, Pst I, Pvu I, Rsr II, Sac 11, Sap 1, Sau3A 1, Sfl1, Sfo I, SgrA I, Sma I, SnaB I, Tsc I, Xma I y Zra I.
La enzima de restricción sensible a metilación puede no cortar cuando una adenosina dentro de la secuencia de reconocimiento está metilada en la posición N6.
La enzima de restricción sensible a metilación puede ser Mho I.
La enzima de restricción dependiente de metilación es McrBC, McrA, MrrA o Dpn I.
La primera porción de los ácidos nucleicos genómicos puede ponerse en contacto después con al menos una segunda enzima de restricción sensible a metilación.
La segunda porción de los ácidos nucleicos genómicos puede ponerse en contacto después con al menos una segunda enzima de restricción dependiente de metilación.
La enzima de restricción sensible a metilación puede ser sensible a metil-adenosina. La enzima de restricción sensible a metilación puede ser sensible a metil-citosina.
La presencia de metilación en el locus se puede comparar entre al menos dos muestras de ácido nucleico (p. ej., aisladas de al menos dos organismos que tienen el mismo fenotipo o un fenotipo diferente). Los procedimientos pueden comprender cuantificar las copias metiladas intactas del locus en una primera muestra y en una segunda muestra y comparar la cantidad de productos amplificados de las dos muestras, determinando de este modo la metilación relativa en el locus entre las dos muestras. Una primera muestra de ácido nucleico puede aislarse de una célula que se sospecha que es una célula de cáncer y una segunda muestra de ácido nucleico puede aislarse de una célula no cancerosa.
La presencia de metilación en dos o más loci se puede determinar mediante amplificación cuantitativa de las copias de ADN intacto en los dos loci diferentes de una primera porción en contacto con una enzima de restricción dependiente de metilación; mediante amplificación cuantitativa del ADN intacto como los dos loci de una segunda porción en contacto con una enzima de restricción sensible a metilación; y mediante comparación de las cantidades de los productos amplificados para los dos loci.
La población de ácidos nucleicos puede aislarse de una célula, incluida, por ejemplo, una célula vegetal, una célula fúngica, una célula procariótica, una célula animal, una célula de mamífero o una célula de cáncer.
La población de ácidos nucleicos puede aislarse de una muestra de un sujeto (p. ej., un ser humano, incluida, por ejemplo, un fluido corporal, una secreción o una biopsia de tejido. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto tiene cáncer.
El locus puede comprender una secuencia que está más metilada en células enfermas que en células no enfermas. El locus puede comprender una secuencia que está menos metilada en células enfermas que en células no enfermas.
Los procedimientos pueden comprender además añadir marcas de secuencia a los extremos de una población de ácidos nucleicos antes de dividir la población de ácidos nucleicos en porciones iguales y la etapa (c) comprende amplificar cuantitativamente el resto de las copias metiladas intactas del locus en la primera porción con cebadores que inicien la amplificación a partir de las marcas de secuencia; y la etapa € comprende cuantificar el resto de las copias intactas no metiladas del locus en la segunda porción con cebadores que inicien la amplificación a partir de las marcas de secuencia.
Estas y otras realizaciones de la invención se ilustran adicionalmente mediante la descripción detallada siguiente.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 ilustra como se pueden usar los procedimientos de la invención para determinar la metilación en un locus.
La Figura 2 ilustra los resultados de la amplificación de ADN en diferentes diluciones metiladas:no metiladas.
La Figura 3 ilustra la capacidad de McrBC para distinguir entre ADN a diferentes diluciones metiladas:no metiladas. Las flechas de la parte inferior de la figura indican el LCt aproximado entre muestras sometidas a doble corte con Hhal-cut y Hhal/McrBC.
La Figura 4 ilustra el análisis del ADN a una dilución de 1:2000 de metiladas:no metiladas.
La Figura 5 ilustra una representación del cambio en el umbral del ciclo como función de la dilución de ADN metilado/no metilado.
La Figura 6 ilustra los resultados de diferentes diluciones de metiladas:no metiladas..
La Figura 7 ilustra una progresión hipotética de la densidad de metilación en el desarrollo de la enfermedad.
La Figura 8 ilustra la restricción con McrBC del ADN.
La Figura 9 ilustra los resultados de la amplificación de diferentes diluciones con McrBC que restringen el ADN escasamente metilado.
La Figura 10 ilustra los resultados de la amplificación de diferentes diluciones con McrBC que restringen el ADN densamente metilado.
La Figura 11 ilustra el uso de diferentes diluciones de enzimas de restricción para determinar la resolución óptima entre ADN con diferentes densidades de metilación.
La Figura 12 ilustra qué datos se obtienen cuando se detecta el estado de metilación de únicamente nucleótidos concreta en una progresión de enfermedad hipotética.
La Figura 13 ilustra qué datos se obtienen cuando la densidad media de metilación de un locus se detecta en una progresión de enfermedad hipotética.
La Figura 14 representa una porción del promotor p16 metilado in vitro con MSss I (SEC ID Nº 1)
La Figura 15 ilustra los datos que demuestran que las enzimas de restricción dependientes de metilación (es decir, McrBC) y sensibles a metilación (es decir, ci) distinguen diferentes densidades de metilación en un locus de ADN.
La Figura 16 ilustra los datos del umbral de ciclo que demuestran que las enzimas de restricción dependientes de metilación (es decir, McrBC) y sensibles a metilación (es decir, Aci) distinguen diferentes densidades de metilación en un locus de ADN.
La Figura 17 ilustra un mapa de restricción de consenso de los genes de kanrina. Los sitios de restricción relevantes están indicados verticalmente y los números indican la escala de distancias en pares de bases. Cada secuencia de codificación se representa con la flecha sombreada en azul y la región analizada se indica con la barra negra. Los círculos representan sitios que no están presentes en todos los genes de kafirina y el color representa el número de genes que no comparten el sitio. El círculo naranja (sitio Hhal más 5’) está conservado en 9 de 11 genes de kafirina y el círculo rojo (sitio Pstl más 3’) está presente en 10 de los 11.
La Figura 18 ilustra la metilación de CG heterogénea y la metilación de CNG homogénea de once genes de kafirina.
Descripción detallada de la invención
I. Introducción
La presente invención proporciona procedimientos de detectar la presencia de metilación en un locus dentro de una población de ácidos nucleicos usando enzimas de restricción sensibles a la metilación y enzimas de restricción dependientes de metilación y, opcionalmente, enzimas insensibles a la metilación, como se especifica en las reivindicaciones. De acuerdo con los procedimientos de la invención, los ácidos nucleicos que comprenden el locus de interés se cortan con una o más enzimas de restricción, como se describe en el presente documento, para generar poblaciones de loci metilados intactos, loci no metilados intactos y/o loci hemimetilados intactos. Los loci se amplifican y se comparan los productos de la amplificación. La comparación de los productos de amplificación proporciona información sobre la metilación en el locus.
La metilación del ADN desempeña papeles importantes en la regulación génica y, por tanto, es deseable evaluar la metilación genómica para diversos fines. Por ejemplo, la presencia o ausencia de metilación en un locus concreto puede proporcionar información diagnóstica y pronóstica con respecto a enfermedades asociadas con la metilación aberrante en el locus.
II. Definiciones
“Metilación” se refiere a la metilación de citosina en las posiciones C5 o N4 de la citosina (("5mC" and "4mC," respectivamente) en la posición N6 de la adenina ("6mA"), u otros tipos de metilación del ácido nucleico. La metilación aberrante de una secuencia de ADN (es decir hipermetilación o hipometilación) se puede asociar con una enfermedad, afección o fenotipo (p. ej., cáncer, enfermedad vascular, trastornos cognitivos u otro rasgo epigenético). Una secuencia de ADN “no metilado” contiene sustancialmente ningún residuo metilado al menos en las secuencias de reconocimiento para una enzima de restricción dependiente de metilación o sensible de metilación concreta usada para evaluar el ADN. Un ADN “metilado” contiene residuos metilados al menos en las secuencias de reconocimiento para una enzima de restricción dependiente de metilación o sensible de metilación concreta usada para evaluar el ADN. Se entiende que, aunque una secuencia de ADN denominada “no metilada” puede tener, en general, ningún nucleótido sustancialmente no metilado a lo largo de la totalidad de su longitud, la definición abarca secuencias de ácido nucleico que tienen nucleótidos metilados en posiciones distintas a las secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción.
Asimismo, se entiende que, aunque una secuencia de ADN denominada “metilada” puede tener, en general, nucleótidos metilados a lo largo de la totalidad de su longitud, la definición abarca secuencias de ácido nucleico que tienen nucleótidos no metilados en posiciones distintas a las secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción. ADN “hemimetilado” se refiere a ADN bicatenario en la que una hebra de ADN está metilada en un locus concreto y la otra hebra no está metilada en dicho locus concreto.
Una “enzima de restricción dependiente de metilación” se refiere a una enzima de restricción que se escinde en o cerca de una secuencia de reconocimiento metilada, pero no se escinde en o cerca de la misma secuencia cuando la secuencia de reconocimiento no está metilada. Las enzimas de restricción dependientes de metilación incluyen las que cortan en una secuencia de reconocimiento metilada (p. ej., Dpnl) y enzimas que cortan en una secuencia que no está en la secuencia de reconocimiento (p. ej., McrBC). Por ejemplo, McrBC dos medios sitios. Cada medio sitio debe ser una purina seguida de 5-metil-citosina (R5mC) y los dos medios sitios no deben estar más cerca que 20 pares de bases y no más lejos que 4000 pares de bases (N20-4000). McrBC generalmente corta cerca de un medio sitio o del otro, pero las posiciones de escisión normalmente se distribuyen por varios pares de bases a aproximadamente 32 pares de bases de la base metilada. Ejemplos de enzimas de restricción dependientes de metilación incluyen, por ejemplo, McrBC (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.405.760), McrA, MrrA y Dpn
I. Un experto en la técnica apreciará que los homólogos y los ortólogos de las enzimas de restricción descritas en el presente documento también son adecuados para usar en la presente invención.
Una “enzima de restricción sensible a metilación” se refiere a una enzima de restricción (p. ej., PstI) que escinde en
o cerca de una secuencia de reconocimiento no metilada, pero no escinde en o cerca de la misma secuencia cuando la secuencia de reconocimiento está metilada. Ejemplos de enzimas de restricción sensibles a metilación se describen en, por ejemplo, McClelland y col., Nucleic Acids Res. 22(17):3640-59 (1994) y http://rebase.neb.com. Enzimas de restricción sensibles a metilación adecuadas que no escinden en o cerca de su secuencia de reconocimiento cuando una citosina dentro de la secuencia de reconocimiento está metilada en la posición C5 incluyen, p. ej., Aat II, Aci I, Ac/I, Age I, A/u I, Asc I, Ase I, AsiS I, Bbe I, BsaA I, BsaH I, BsiE I, BSIW I, BsrF I, BssH II, BssK I, BstB I, BstN I, BstU I, Cia I, Eae I, Eag I, Fau I, Fse I, Hha I, HinP1 I, HinC II, Hpa II, Hpy99 I, HpyCH4IV, Kas I, Mba I, M/u I, MapA1 I, Msp I, Nae I, Nar I, Nat I, Pm/I, Pst I, Pvu I, Rsr II, Sac II, Sap I, Sau3A I, Sf/I, Sfa I, SgrA I, Sma I, SnaB I, Tscl, Xma I, y Zra L. Enzimas de restricción sensibles a metilación adecuadas que no escinden en o cerca de su secuencia de reconocimiento cuando una adenosina dentro de la secuencia de reconocimiento está metilada en la posición N6 incluyen, por ejemplo, Mbo I. Un experto en la técnica apreciará que homólogos y ortólogos de las enzimas de restricción descritas en el presente documento son también adecuados para usar en la presente invención. Un experto en la técnica apreciará también que una enzima de restricción sensible a metilación que no corta en presencia de metilación de una citosina en o cerca de su secuencia de reconocimiento puede ser insensible a la presencia de metilación de una adenosina en o cerca de su secuencia de reconocimiento. Asimismo, una enzima de restricción sensible a metilación que no corta en presencia de metilación de una adenosina en o cerca de su secuencia de reconocimiento puede ser insensible a la presencia de metilación de una citosina en o cerca de su secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, Sau3AI es sensible (es decir, no corta) a la presencia de una citosina metilada en o cerca de su secuencia de reconocimiento, pero es insensible (es decir, corta) a la presencia de una adenosina metilada en o cerca de su secuencia de reconocimiento.
Una “enzima de restricción insensible a metilación” se refiere a una enzima de restricción que corta el ADN con independencia del estado de metilación de a base de interés (A o C) en o cerca de la secuencia de reconocimiento de la enzima. Un experto en la técnica apreciará también que una enzima de restricción insensible a metilación que corta en presencia de metilación de una adenosina en o cerca de su secuencia de reconocimiento, puede ser sensible a la presencia de metilación de una citosina en o cerca de su secuencia de reconocimiento, es decir no cortará. Asimismo, una enzima de restricción insensible a metilación que corta en presencia de metilación de una citosina en o cerca de su secuencia de reconocimiento, puede ser sensible a la presencia de metilación de una adenosina en o cerca de su secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, Sau3AI es insensible (es decir, corta) a la presencia de una adenosina metilada en o cerca de su secuencia de reconocimiento, pero es sensible (es decir, no corta) a la presencia de una citosina metilada en o cerca de su secuencia de reconocimiento.
“Isoesquizómeros” se refieren a distintas enzimas de restricción que tienen la misma secuencia de reconocimiento. Como se usa en esta definición, con “la misma secuencia de reconocimiento” no se pretende diferencian entre secuencias metiladas y no metiladas. Por tanto, una “pareja isoesquizomérica” de una enzima de restricción dependiente de metilación o sensible a metilación es una enzima de restricción que reconoce la misma secuencia de reconocimiento que la enzima de restricción dependiente de metilación o sensible a metilación con independencia de si un nucleótido en la secuencia de reconocimiento está metilado o no.
Como se usa en el presente documento, una "secuencia de reconocimiento” se refiere a una secuencia de ácido nucleico primario y no refleja el estado de metilación de la secuencia.
La “densidad de metilación” se refiere al número de residuos metilados en un locus dado de ADN dividido por el número total de nucleótidos en la misma secuencia de ADN que se pueden metilar. La densidad de metilación viene determinada solo por las citosinas o solo por las adenosinas.
“De división” o “dividido” en el contexto del ADN de división normalmente se refiere a dividir una población de ácidos nucleicos aislados de una muestra en dos o más porciones físicamente distintas, cada una de las cuales comprende todas las secuencias presentes en la muestra. En algunos casos, “de división” o “dividido” se refiere a dividir una población de ácidos nucleicos aislados de una muestra en dos o más porciones físicamente distintas, cada una de las cuales contiene todas las secuencias presentes en la muestra.
Escindir ADN “en condiciones que permitan que al menos algunas copias de potenciales sitios de escisión por enzimas de restricción en el locus permanezcan sin escindir” se refiere a cualquier combinación de condiciones de reacción, concentración de enzimas de restricción y de enzima y/o ADN que tiene como resultado que al menos algo del ADN que comprende un potencial sitio de escisión para una enzima de restricción permanezca sin cortar. Por ejemplo, una digestión parcial del ADN (p. ej., limitando la cantidad de enzima o la cantidad de tiempo de la digestión) permite que algunos sitios de escisión de enzima de restricción en el locus permanezcan sin cortar. Como alternativa, una digestión completa usando una enzima de restricción tal como McrBC tendrá como resultado que algunos potenciales sitios de escisión de enzimas de restricción en el locus permanezcan sin cortar porque la enzima no siempre corta entre los dos medios sitios de reconocimiento, lo que deja sin escindir al menos algunas copias de un locus en una población de secuencias en las que el locus está definido por los dos medios sitios de reconocimiento. Un “potencial sitio de escisión de enzima de restricción” se refiere a una secuencia que una enzima de restricción puede escindir (es decir, que comprende la secuencia de nucleótidos y el estado de metilación adecuados) cuando reconoce la secuencia de reconocimiento de las enzimas, que puede ser igual o diferente del sitio de escisión.
Una “digestión parcial” de ADN, como se usa en el presente documento, hace referencia a poner en contacto el ADN con una enzima de restricción en las condiciones de reacción adecuadas de un modo tal que la enzima de restricción escinde algunos (p. ej., menos de aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %,
o 90 %) pero no todos los posibles sitios de escisión para dicha enzima de restricción concreta en el ADN. Una digestión parcial de la secuencia se pueden conseguir, por ejemplo, poniendo en contacto el ADN con una enzima de restricción activa durante un periodo de tiempo más corto de lo necesario para conseguir una digestión completa y, después, finalizar la reacción poniendo en contacto el ADN con menos enzima de restricción activa de lo necesario para conseguir una digestión completa con un periodo de tiempo fijo (p. ej., 30, 60, 90, 120, 150, 150, o 240 minutos o en otras condiciones de reacción alteradas que permitan la cantidad deseada de digestión parcial. “posibles sitios” son, en general, secuencias de reconocimiento enzimático, pero también incluyen situaciones en las que una enzima escinde en una secuencia distinta a la secuencia de reconocimiento (p.ej., McrBC).
Las condiciones, incluidos el tiempo, los tampones y otros reactivos necesarios para completar digestión normalmente son proporcionadas por los fabricantes de las enzimas de restricción. Los expertos en la técnica reconocerán que la calidad de la muestra de ADN puede evitar que la digestión sea completa.
“Un agente que modifica la citosina no metilada” se refiere a cualquier agente que altere la composición química de la citosina no metilada pero que no cambia la composición química de la citosina metilada. Ejemplos de estos agentes incluyen bisulfito sódico, metabisulfito sódico, permanganato e hidrazina.
“ADN genómico”, como se usa en el presente documento, se refiere a toda la secuencia genómica, o a una parte de la misma, de un individuo. Una ”subpoblación” del ADN genómico se refiere a una parte de la totalidad de la secuencia genómica, es decir una subpoblación contiene únicamente algunos, pero no todos, los loci de un genoma completo. El individuo puede ser un animal, una planta, un hongo o un procariota, así como una célula, tejido, órgano u otra parte de un organismo.
Un “perfil de metilación” se refiere a un conjunto de datos que representa el estado de metilación del ADN de, por ejemplo, el genoma de un individuo o células y tejidos de un individuo. El perfil puede indicar el estado de metilación de cada par de bases en un individuo o puede comprender información sobre un subconjunto de los pares de bases
(p. ej., el estado de metilación de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción específica) en un genoma.
“Amplificación” de ADN se refiere a cualquier reacción química, incluida la enzimática, que tiene como resultado un incremento del número de copias de una secuencia de ácido nucleico molde o un incremento de la señal que indica que el ácido nucleico molde está presente en la muestra. Las reacciones de amplificación incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véanse las patentes de EE.UU.
4.683.195 y 4.683.202; PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (Innis y coI., eds, 1990)), amplificación por desplazamiento de hebras (SDA) (Walker, y col. Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6 (1992); Walker PCR Methods Appl 3(1): 1-6 (1993)), amplificación mediada por transcripción (Phyffer, y coI., J. Clin. Microbiol. 34:834-841 (1996); Vuorinen, y col., J. Clin. Microbiol. 33:1856-1859 (1995)), amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) (Compton, Nature 350(6313):91-2 (1991), amplificación en círculo rodante (RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12(1): 75-99 (1999)); Hatch y coI., Genet. Anal. 15(2):35-40 (1999)); amplificación por señal de ADN ramificado (bADN) (véase, p. ej., Iqbal y coI., Mol. Cell Probes 13(4):315-320 (1999)), y amplificación lineal. Amplificación incluye, por ejemplo, ligar los adaptadores que comprenden los sitios del promotor T3 o T7 a la secuencia de ácido nucleico molde y usar las polimerasas de T3 o T7 para amplificar la secuencia de ácido nucleico diana.
Un “locus”,como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia diana dentro de una población de ácidos nucleicos (p. ej., un genoma). Si en el genoma hay una sola copia de la secuencia diana, el "locus" hará referencia a un único locus. Si en el genoma hay múltiples copias de la secuencia diana, el "locus" hará referencia a todos los loci que contengan la secuencia diana en el genoma.
III. Detección de metilación en un locus dentro de una población de ácido nucleico
Los procedimientos de la invención comprenden comparar la presencia o ausencia de cantidades de ADN intacto tras la restricción de una muestra dividida en al menos cuatro porciones, en los que al menos dos porciones se tratan con enzimas de restricción diferentes. Una primera porción se pone en contacto con una enzima de restricción dependiente de metilación (que produce ADN no metilado intacto y ADN metilado fragmentado) y una segunda porción se pone en contacto con una enzima de restricción sensible a metilación (que produce ADN metilado intacto y ADN no metilado fragmentado). Las copias intactas del locus de cada porción se analizan tras las digestiones de restricción y se comparan.
Una tercera porción de ácidos nucleicos que comprenden el locus no se digiere con una enzima de restricción para proporcionar un análisis del número total de copias intactas de un locus en una muestra. El número total de las copias intactas del locus se puede comparar con el número de loci metilados y/o el número de loci no metilados, para verificar que el número de loci metilados y de loci no metilados es igual al número total de loci.
Una cuarta porción de ácidos nucleicos que comprende el locus se digiere con la enzima de restricción sensible a la metilación y la enzima de restricción dependiente de metilación y todos los loci intactos se cuantifican (p. ej., se amplifican cuantitativamente o se detectan mediante captura híbrida). El número total de loci intactos restantes tras la digestión doble se puede comparar con el número de copias metiladas del locus, de copias no metiladas del locus y/o de copias totales del locus, para verificar que el número de copias metiladas y de copias no metiladas es igual al número total de copias y para verificar que el corte de las enzimas de restricción sensibles a metilación y dependientes de metilación es completo.
En realizaciones adicionales, una quinta porción de los ácidos nucleicos que comprenden el locus se puede digerir con una enzima de restricción insensible a metilación (Es decir, insensible a metilación de un residuo de adenosina o de citosina en su secuencia de reconocimiento) y se detectan todas las copias intactas del locus. El número total de copias intactas restantes tras la digestión se puede comparar con el número de copias metiladas, de copias no metiladas y/o de copias totales, para verificar que corte de las otras enzimas de restricción sensibles a metilación y dependientes de metilación es completo; y/o para identificar mutaciones en las copias del locus que afectan al sitio de reconocimiento de las enzimas de restricción sensibles a metilación y dependientes de metilación.
Por tanto, se puede realizar una comparación de al menos cinco poblaciones de ácido nucleico amplificado distintas:
(1)
una población sin tratar o tratada de forma simulada en la que prácticamente todas las copias del locus permanecen intactas;
(2)
una población tratada con una enzima de restricción dependiente de metilación, en la que prácticamente todas las copias no metiladas del locus permanecen intactas;
(3)
una población tratada con una enzima de restricción sensible a metilación, en la que prácticamente todas las copias metiladas del locus permanecen intactas;
(4)
una población tratada con una enzima de restricción dependiente de metilación y una enzima de restricción sensible a metilación, que no contiene copias intactas del locus, o contiene pocas; y
(5)
una población tratada con una enzima de restricción insensible a metilación (es decir, insensible a metilación en un residuo de adenosina o de citosina en o cerca de su secuencia de reconocimiento), que no contiene copias intactas del locus, o contiene pocas, excepto copias del locus que están mutadas en el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción.
Normalmente, las muestras se dividen en porciones iguales, cada una de las cuales contiene todas las secuencias presentes en la muestra. En algunos casos, las muestras se pueden dividir en partes que no contienen todas las secuencias presentes en la muestra. No obstante, comparando resultados de diferentes combinaciones de digestos de restricción, se puede determinar el número de copias metiladas y no metiladas del locus de interés. Por tanto, cualquiera de las poblaciones anteriores se puede comparar con cualquier otra población. Por ejemplo, las poblaciones (1) y (2) se pueden comparar entre sí, o cualquiera de las poblaciones (1) o (2) se pueden comparar con otra población, por ejemplo la población (4).
El orden en el que se realizan la(s) digestión(es) no es crucial. Por tanto, aunque puede ser preferible realizar una digestión en cierto orden, por ejemplo digerir primero con una clase concreta de enzimas de sensibilización a metilación, por ejemplo enzimas sensibles a metilación, no es necesario. De un modo similar, puede ser preferible realizar una digestión doble.
El ácido nucleico se puede obtener a partir de una muestra que comprende una población mixta de miembros que tienen diferentes perfiles de metilación. Por ejemplo, una muestra biológica puede comprender al menos un tipo de célula con poca o ninguna metilación en un locus de interés y al menos un tipo de célula que está metilado en el locus. La proporción de la población que constituye loci metilados o no metilados se puede evaluar determinando la cantidad de loci sin digerir en un alícuota sometido a digestión simple tratada con sólo enzima(s) de restricción sensible(s) a metilación o dependiente(s) de metilación con la cantidad de ADN sin digerir en un alícuota tratado con ambas enzima(s) de restricción sensible(s) a metilación o dependiente(s) de metilación. Como se usa en este contexto, una digestión “sencilla” puede, en la práctica, realizarse usando más de una enzima que es sensible a metilación o más de una enzima que es dependiente de metilación, se usen secuencial o simultáneamente. Por ejemplo, un alícuota que se digiere con más de una enzima de restricción sensible a metilación, pero no enzimas de restricción dependientes de metilación, se considera una digestión “sencilla”. Una “digestión "doble” se considera un alícuota que se ha tratado usando enzimas de restricción tanto sensibles a metilación como dependientes de metilación, se usen secuencial o simultáneamente, con independencia del número de enzimas restricción sensibles a metilación y dependientes de metilación empleadas.
La cantidad de ADN sin digerir en la digestión sencilla respecto a la digestión doble y el número total de copias del locus en la muestra es indicativa de la proporción de células que contienen ADN no metilado frente a metilado en el locus de interés. Además, dicho análisis puede servir como control de la eficacia de la digestión sencilla, por ejemplo la presencia de un cambio detectable en la cantidad de ADN sin digerir en la digestión doble comparada con la cantidad en la digestión sencilla con una enzima de restricción sensible a metilación es una indicación de que la digestión sencilla se había completado.
Un experto en la técnica apreciará que, seleccionando las combinaciones adecuadas de las enzimas de restricción
(p. ej., enzimas de restricción sensibles a metilación, dependientes de metilación e insensibles a metilación), los procedimientos de la invención se pueden usar para determinar la metilación de citosina o metilación de adenosina en un locus concreto basada en, por ejemplo, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción. Por ejemplo, cortando una primera porción de ácidos nucleicos que comprende un locus de interés con una enzima de restricción sensible a metilación que no corta cuando en su secuencia de reconocimiento (p. ej., Hha I) hay una citosina metilada y cortando una segunda porción de ácidos nucleicos que comprenden un locus de interés con una enzima de restricción dependiente de metilación que solo corta si su secuencia de reconocimiento comprende una citosina metilada (p. ej., McrBC), se puede determinar la metilación de citosina de un locus concreto. Asimismo, cortando una primera porción de ácidos nucleicos que comprenden un locus de interés con una enzima de restricción sensible a metilación que no corta cuando en su secuencia de reconocimiento (p. ej., Mba I), hay un residuo de adenosina que está metilada y cortando una segunda porción de ácidos nucleicos que comprende un locus de interés con una enzima de restricción dependiente de metilación que corta en presencia de adenosinas metiladas en su secuencia de reconocimiento (p. ej., Dpn I), se puede determinar la metilación de adenosina de un locus concreto. En algunas realizaciones, los cuatro conjuntos de digestiones se realizan en paralelo para la metilación de adenosina y para la metilación de citosina, para determinar simultáneamente la metilación de adenosina y la metilación de citosina de un locus concreto.
Además, las enzimas de restricción que son sensibles a citosina metilada o a adenosina metilada se pueden usar en los procedimientos de la invención para proporcionar poblaciones de loci metilados en citosina y loci metilados en adenosina para comparación.
Las enzimas de restricción dependientes de metilación adecuadas incluyen, por ejemplo, McrBC, McrA, MrrA y Dpn
l. Enzimas de restricción sensibles a metilación adecuados incluyen enzimas de restricción que no cortan cuando una citosina dentro de la secuencia de reconocimiento está metilada en la posición C5 tales como, p. ej., Aat II, Aci I, Ac/I, Age I, A/u I, Asc I, Ase I, AsiS I, Bbe I, BsaA I, BsaH I, BsiE I, BsM I, BsrF I, BssH II, BssK I, BstB I, BstN I, BstU I, Cia I, Eae I, Eag I, Fau I, Fse I, Hha I, HinP1 I, HinC II, Hpa II, Hpy991, HpyCH4IV, Kas I, M/u I, MapA1 I, Msp I, Nae I, Narl, Notl, Pm/I, Pst I, Pvu I, Rsrll, Sac II, Sap I, Sau3A I, Sf/I, Sfo I, SgrA I, Sma I, SnaB I, Tsc l, Xma I, y Zra I.. Enzimas de restricción sensibles a metilación adecuadas que no escinden en o cerca de su secuencia de reconocimiento cuando una adenosina dentro de la secuencia de reconocimiento está metilada en la posición N6 incluyen, por ejemplo, Mbo I. Un experto en la técnica apreciará que homólogos y ortólogos de las enzimas de restricción descritas en el presente documento son también adecuados para usar en la presente invención.
En algunas realizaciones, las porciones de ácido nucleico se tratan con un agente que modifica una base no metilada concreta, tal como bisulfito sódico, antes del tratamiento con enzimas de restricción. Después, los ácidos nucleicos se pueden tratar y amplificar usando al menos un cebador que distinga entre nucleótidos metilados protegidos y no metilados modificados. Las porciones amplificadas se comparan después para determinar la metilación relativa. Ciertas tecnologías de amplificación cuantitativa emplean una o más sondas de detección que son distintas de los cebadores para amplificación. Estas sondas de detección también se pueden diseñar para discriminar entre ADN metilado protegido y no metilado modificado.
La presente invención usa técnicas de rutina en el campo de la genética recombinante. Por ejemplo, los procedimientos de aislar ADN genómico, digerir ADN con enzimas de restricción, ligar las secuencias de oligonucleótidos, detectar ADN amplificado y sin amplificar, y secuenciar los ácidos nucleicos, son bien conocidos en la técnica. Entre los textos básicos que divulgan los procedimientos generales de uso en la presente invención se incluyen Sambrook y coI., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (3ª ed. 2001); Kriegler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION: A LABORATORY MANUAL (1990); and CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel y col., eds., 2001)).
A. Digestión con enzimas de restricción
Se pueden usar digestiones parciales o completas con enzimas de restricción, según la enzima de restricción, para proporcionar información sobre la densidad de metilación dentro de un locus de ADN concreto. Las enzimas de restricción para usar en la invención normalmente se seleccionan en base a un análisis de secuencia del locus de interés. Después, se seleccionan una o más enzimas de cada categoría (p. ej., dependientes de metilación o sensibles a metilación), El análisis de la secuencia se puede realizar en base a la evaluación de bases de datos de secuencias conocidas o, en algunos casos, se puede basar en determinaciones empíricas, por ejemplo tener en cuenta variantes, tales como mutaciones, que pueden estar presentes en un sujeto concreto.
1. Muestras de ADN
El ADN se puede obtener de cualquier muestra biológica, por ejemplo de células, tejidos y/o fluidos de un organismo
(p. ej., un animal, planta, hongo, procariota). Las muestras pueden ser frescas, congeladas, conservadas en un agente de fijación (p. ej., alcohol, formaldehído, parafina o PreServeCyteTM) o diluidas en un tampón. Las muestras biológicas incluyen, por ejemplo, piel, sangre o una fracción de los mismos, tejidos, biopsias (de, por ejemplo, pulmón, colon, mama, próstata, cuello uterino, hígado, riñón, cerebro, estómago, esófago, útero, testículo, piel, hueso, riñón, corazón, vesícula biliar, vejiga urinaria y similares)., fluidos corporales y secreciones (p. ej., sangre, orina, moco, esputo, saliva, especímenes de frotis cervical, médula ósea, heces, sudor, aliento condensado y similares). Las muestras biológicas también incluyen hojas, tallos, raíces, semillas, pétalos, polen, esporas, sombreros de setas y savia.
2. Digestión completa
Cuando una muestra de ADN que comprende un locus de interés está completamente digerido con una enzima de restricción de sensibilización a metilación (es decir, una enzima de restricción dependiente de metilación o sensible a metilación), la información proporcionada incluye la presencia o ausencia de metilación en las secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción. La presencia de ADN intacto en un locus que comprende el sitio de corte de la enzima de restricción indica que el estado de metilación adecuado del sitio de reconocimiento necesario para la escisión mediante las enzimas sensibles a metilación o dependientes de metilación no estaba en o cerca del locus.
La cantidad de ADN intacto se puede comparar con un control que representa una cantidad igual de ADN de la muestra que no estaba en contacto con la enzima de restricción. Como alternativa, la cantidad de ADN intacto en un locus se puede comparar con un segundo locus o con el mismo locus en el ADN aislado de otra célula. En otra alternativa, la cantidad de ADN intacto en un locus se puede comparar con ADN que tiene un número conocido o previsto de sitios de restricción metilados y monitorizables. En algunas realizaciones, el ADN que se compara es aproximadamente del mismo tamaño. Los expertos en la técnica apreciarán que también son posibles otros controles. Por tanto, detectando la cantidad de ADN intacto en el locus tras la digestión con enzimas de restricción, se determina el número relativo de alelos metilados.
El uso de enzimas de restricción que tienen un patrón de escisión variable cerca de la secuencia de reconocimiento
(p. ej., McrBC ) proporciona un caso especial de digestiones completas de ADN. En este caso, incluso si el locus contiene una secuencia de reconocimiento en el estado de metilación adecuado, algunos de los fragmentos que contienen un locus metilado permanecerán intactos porque la escisión del ADN se producirá fuera del locus de acuerdo con una función de probabilidad. Por tanto, una digestión completa con McrBC se comporta de forma similar a una digestión parcial con una enzima de restricción sensible a metilación (que corta en su sitio de reconocimiento) con respecto al número de alelos intactos.
El mecanismo del corte de ADN con McrBC se produce del siguiente modo. Un complejo de ocho subunidades de MIRV se une a cada uno de los dos medios sitios de reconocimiento (purina-metilC representada como (A o G)mC). Véase la Figura 8. Después, estos complejos reclutan una subunidad de Marc a sus respectivos medios sitios y comienzan a translocarse a lo largo del ADN mediado por hidrólisis de GTP. Cuando dos complejos unidos a McrBC contactan entre sí se forma un complejo doble y se produce restricción. En general, no se producirá el corte si los dos medios sitios están más cerca que 20 pb y se ha observado restricción resultante de los medios sitios tan alejados como a 4 kb uno de otro, aunque es infrecuente. La restricción se puede producir �32 pb a la izquierda o derecha de cualquier medio sitio unido, lo que da cuatro posibles localizaciones del sitio de corte: � 32 pb 5’ del primero medio sitio, 32 pb 3’ del primer medio sitio, 32 pb 5’ del segundo medio sitio y 32 pb 3’ del segundo medio sitio. Por tanto, es posible que existan dos medios sitios dentro de un locus definido por cebadores de PCR y para que la escisión se produzca fuera del locus. También es posible que existan dos medios sitios fuera del locus y que se produzca un corte dentro del locus. También es posible que exista un sitio en el locus y que exista otro fuera del locus y que se produzca un corte dentro o fuera del locus. Por tanto, cuanto más metilados estén los medios sitios que están “en las proximidades” del locus (literalmente entre los cebadores para amplificación o en las proximidades de la secuencia flanqueante), será más probable observar un corte dentro del locus para una concentración dada de McrBC. De acuerdo con esto, el número de copias de un locus metilado que se escinden mediante McrBC en una digestión completa o parcial será proporcional a la densidad de los nucleótidos metilados.
3. Digestiones parciales
La cantidad de escisión con una enzima de restricción sensible a metilación o dependiente de metilación en una digestión parcial (es decir, incompleta) refleja no solo el número de fragmentos que contienen cualquier metilación de ADN en un locus, pero también la densidad de metilación media dentro del locus de ADN en la muestra. Por ejemplo, cuando los fragmentos de ADN que contienen el locus tienen una densidad de metilación mayor, una digestión parcial usando una enzima de restricción dependiente de metilación escindirá estos fragmentos con mayor frecuencia dentro del locus. De un modo similar, cuando los fragmentos de ADN que contienen el locus tienen una densidad de metilación menor, una digestión parcial usando una enzima de restricción dependiente de metilación escindirá estos fragmentos con menor frecuencia dentro del locus, porque hay menos sitios de reconocimiento. Como alternativa, cuando se usa una enzima de restricción sensible a metilación, los fragmentos de ADN con una densidad metilada mayor se escinden menos y, por tanto, hay más hebras de ADN intacto que contienen el locus. En cada uno de estos casos, la digestión de la muestra de ADN en cuestión se compara con un valor control tal como los que se han tratado anteriormente para las digestiones completas.
La muestra de ADN se puede dividir en porciones iguales, en las que cada porción se somete a una cantidad diferentes de digestión parcial con McrBC o con otra enzima de restricción dependiente de metilación. La cantidad de locus intacto en las diversas porciones (p. ej., medido mediante amplificación cuantitativa del ADN) se puede comparar con una población control (bien procedente de la misma muestra que representa ADN sin cortar o porciones equivalentes de otra muestra de ADN). En los casos en los que las porciones equivalentes proceden de una segunda muestra de ADN, la segunda muestra puede tener un número previsto o conocido de nucleótidos metilados (o al menos secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción metiladas) o, como alternativa, el número de secuencias de reconocimiento metiladas pueden ser desconocidas. En el último caso, la muestra control procederá, a menudo, una muestra de relevancia biológica, por ejemplo de un tejido enfermo o normal, etc.
La muestra de ADN se puede digerir parcialmente con una o más enzimas de restricción sensibles a metilación y, después, se amplifica para identificar los loci intactos. En estos casos, los controles son similares a los usados para las digestiones con enzimas de restricción dependientes de metilación descritas anteriormente. Los controles no tratados no están digeridos y todas las muestras de ADN control tratadas se digieren con enzimas de restricción sensibles a metilación.
Puede ser útil analizar una variedad de condiciones (p. ej., tiempo de restricción, concentración de la enzima, tampones diferentes u otras condiciones que afectan a la restricción) para identificar el conjunto óptimo de condiciones para resolver diferencias sutiles o grandes en la densidad de metilación entre dos o más muestras. Las condiciones se pueden determinar para cada muestra analizada o se pueden determinar inicialmente y, después, se pueden aplicar las mismas condiciones a una serie de muestras diferentes.
4. Generación de valores control
Los valores control pueden representar valores externos (p. ej., el número de loci intactos en una segunda muestra de ADN con un número conocido o previsto de nucleótidos metilados o secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción metiladas) o valores internos (p. ej., un segundo locus en la misma muestra de ADN o el mismo locus en una segunda muestra de ADN). Aunque útil, no es necesario saber cuantos nucleótidos (es decir, el valor absoluto) en el control están metilados. Por ejemplo, para los loci en los que la metilación tiene como resultado un estado de enfermedad, conocer que el locus está más metilado de lo que lo está en las células normales puede indicar que el sujeto del que se obtuvo la muestra puede tener la enfermedad o estar en las primeras etapas del desarrollo de la enfermedad.
En los casos en los que la misma muestra de ADN incluya un locus control, se puede usar amplificación multiplex, por ejemplo PCR multiplex, para analizar dos loci más (p. ej., un locus diana y al menos un locus control).
Las muestras de ADN pueden variar en dos parámetros con respecto a la metilación: (i) el porcentaje de copias totales en una población que tienen alguna metilación en un locus específico y (ii) para copias con alguna metilación en el ADN, la densidad media de metilación entre las copias. Es ideal, aunque no necesario, usar ADN control que evalúan ambos parámetros en una muestra de ensayo.
Los ADN control con citosinas metiladas conocidas se producen usando cualquier número de ADN metilasas, cada una de los cuales pueden tener una secuencia de reconocimiento de metilación diana diferente. Este procedimiento pude crear una población de fragmentos de ADN que varían con respecto a la densidad de metilación (es decir, el número de copias metiladas por alelo). También se pueden usar reacciones parciales con metilasas para, por ejemplo, producir una población de distribución normal con una moda en la densidad media de metilación para la población. La moda se puede ajustar para una población dada como función de que la reacción de la metilasa se ha completada. Los ADN control también se pueden sintetizar con bases de ADN metiladas y no metiladas.
En algunos casos, se usa un ADN diana con una secuencia conocida. Un ADN control deseada se puede producir seleccionando la mejor combinación de metilasas y enzimas de restricción para el análisis. En primer lugar se genera un mapa de sitios que pueden ser metilados por cada metilasa disponible. En segundo lugar, también se produce un mapa de restricción del locus. En tercer lugar, se seleccionan las metilasas y se usan para mutilar in vitro la muestra de ADN control para producir un patrón de metilación deseado, que se diseña para realizar óptimamente en combinación con las enzimas de restricción usadas en el análisis de metilación del ADN de ensayo y las muestras de ADN control. Por ejemplo, M.Hhal metila el sitio (G*CGC) y McrBC reconoce dos medios sitios con el motivo (RpC). Por tanto, McrBC reconoce cada sitio M.Hhal metilado en la secuencia control.
De un modo similar, después, una población de moléculas se puede tratar con una ADN metilasa (p. ej., MSssl) en presencia de magnesio para dar como resultado una densidad de metilación deseada. Si se deja progresar la reacción hasta que finalice, casi todos los sitios que se pueden metilar, se metilarán, lo que tendrá como resultado una densidad de metilación alta y homogénea. Si se limita el curso de la reacción, se tendrá como resultado una densidad media de metilación menor (o metilación parcial) (es decir, no todos los posibles sitios se metilan debido al tiempo de la reacción y/o la concentración de la enzima). De este modo se puede producir la densidad media de metilación deseada del ADN control. El ADN control metilado se puede caracterizar con exactitud determinando el número de citosinas metiladas a través de secuenciación con bisulfito. Como alternativa, el ADN control metilado se puede caracterizar con exactitud determinando el número de citosinas metiladas a través de una comparación con otros ADN control conocidos, tal como se describe en el presente documento.
Para una predicción más precisa de las densidades de metilación, puede ser útil generar un conjunto control de ADN que puede servir de forma conveniente como una curva estándar en la que cada muestra en el conjunto control tiene una densidad de metilación diferente, conocida o desconocida. Cortando las múltiples muestras con una enzima de restricción dependiente de metilación o una enzima de restricción sensible a metilación en condiciones que permitan que al menos algunas copias de potenciales sitios de escisión por enzimas de restricción en el locus permanezcan sin escindir y, posteriormente, amplificando las restantes copias intactas de un locus, se puede generar una curva estándar de la cantidad de copias intactas (p. ej., representadas por valores Ct), de modo que se correlaciona la cantidad de ADN intacto con diferentes densidades de metilación. La curva estándar se puede usar después para determinar la densidad de metilación de una muestra de ADN de ensayo interpolando la cantidad de ADN intacto en la muestra tras la restricción y la amplificación, tal como se ha descrito en el presente documento.
B. Cálculo de la densidad de metilación basado en los umbrales del ciclo
Como se ha descrito en el presente documento, los umbrales de ciclo (Ct) son una medición útil para determinar la cantidad inicial del ADN molde en una reacción de amplificación. De acuerdo con esto, los valores Ct de muestras tratadas con una enzima de restricción dependiente de metilación y/o sensibles de metilación y amplificadas como se describe en el presente documento se pueden usar para calcular la densidad de metilación. Un cambio en el valor Ct entre una muestra y un valor control (que puede representar el valor Ct de una segunda muestra) es predictivo de la densidad de metilación relativa. Dado que la amplificación en PCR teóricamente duplica las copias cada ciclo, 2x es proporcional al número de copias en la amplificación durante la amplificación exponencial, en la que X es el número de ciclos. Por tanto, 2Ct es proporcional a la cantidad de ADN intacto en el inicio de la amplificación. El cambio de Ct (LCt) entre dos muestras o entre una muestra y un valor control (p, ej., que representa un valor Ct de un control) representa la diferencia en el molde de partida inicial en las muestras. Por tanto, 2ILCt es proporcional a la diferencia de densidad de metilación relativa entre una muestra y un control o una segunda muestra. Por ejemplo, una diferencia de 1,46 en el Ct entre dos muestras (cada una tratada con una enzima de restricción dependiente de metilación y, después, amplificada) indica que una muestra tiene aproximadamente 2,75 (es decir, 2(146)= 2,75) veces más nucleótidos metilados dentro de los sitios monitorizados en un locus que la otra muestra.
C. Detección de ADN
La presencia y la cantidad de ADN escindido mediante las enzimas de restricción se pueden detectar usando cualquier medio conocido en la técnica, incluidos, por ejemplo, amplificación cuantitativa, captura híbrida o combinaciones de los mismos.
1. Amplificación cuantitativa
La presencia y la cantidad de ADN escindido por las enzimas de restricción se pueden determinar amplificando el locus tras la digestión. Usando las técnicas de amplificación (p. ej., la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)) que requieren la presencia de una hebra de ADN intacta para amplificación, se puede determinar la presencia y la cantidad de ADN restante sin cortar. Por ejemplo, se pueden diseñar reacciones de PCR en las que los cebadores de amplificación flanquean un locus concreto de interés. La amplificación se produce cuando el locus que comprende los dos cebadores permanece intacto tras una digestión de restricción. Si la cantidad de ADN total e intacto se conoce, se puede determinar la cantidad de ADN escindido. Dado que la escisión del ADN depende del estado de metilación del ADN, el ADN intacto y escindido representa diferentes estados de metilación.
La amplificación de un locus de ADN usando reacciones es bien conocida (véanse las patentes de EE.UU.
4.683.195 y 4.683.202; PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHOD AND APPLICATIONS (Innis y col., eds, 1990)). Normalmente se usa la PCR para amplificar los moldes de ADN. No obstante, se han descrito procedimientos alternativos de amplificación y también se pueden usar siempre que los procedimientos alternativos amplifiquen el ADN intacto en mayor medida que los procedimientos amplifican el ADN escindido.
El ADN amplificado mediante los procedimientos de la invención se puede evaluar, detectar, clonar, secuenciar y similares adicionalmente, bien en solución o tras su unión a un soporte sólido, mediante cualquier procedimiento aplicado habitualmente a la detección de una secuencia de ADN específica, tal como PCR, restricción de oligómeros (Saiki, y col., BiolTechnology 3:1008-1012 (1985)), análisis con sondas oligonucleotídicas (ASO) específicas de alelos (Conner, y col., PNAS USA 80:278 (1983)), ensayos de unión a oligonucleótidos (OLA) (landegren, y col., Science 241: 1077, (1988)), y similares. Las técnicas moleculares para análisis de ADN se han revisado (Landegren, y col., Science 242:229-237 (1988)).
Se pueden usar procedimientos de amplificación cuantitativa (p. ej., PCR cuantitativa o amplificación lineal cuantitativa) para cuantificar la cantidad de ADN intacto dentro de un locus flanqueado por cebadores de amplificación tras digestión con enzimas de restricción. Los procedimientos de amplificación cuantitativa se divulgan en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 6.180.349; 6.033.854; y 5,972,602, así como en, por ejemplo, Gibson y col., Genome Research 6:995-1001 (1996); DeGraves, y col., Biotechniques 34(1):106-10,112-5 (2003); Deiman B, y col., Mol BiotechnoL 20(2):163-79 (2002). Las amplificaciones se pueden monitorizar en “tiempo real”.
En general, la amplificación cuantitativa se basa en la monitorización de la señal (p. ej., la fluorescencia de una sonda) que representa copias del molde en ciclos de una reacción de amplificación (p. ej., PCR). En los ciclos iniciales de la PCR se observa una señal muy baja por la cantidad del amplicón formado no soporta una salida de la señal mensurable del ensayo. Después de los ciclos iniciales, a medida que la cantidad de amplicón formado aumenta, la intensidad de la señal aumenta hasta un nivel mensurable y alcanza una meseta en ciclos posteriores cuando la PCR entra en una fase no logarítmica. Mediante una representación de la intensidad de señal frente al número de ciclo, el ciclo específico al cual se obtiene una señal mensurable a partir de la reacción de PCR se puede deducir y usar para volver a calcular la cantidad de la diana antes del inicio de la PCR. El número de los ciclos específicos determinado mediante este procedimiento normalmente se denomina umbral del ciclo (Ct). Ejemplos de procedimientos se describen en, por ejemplo, Heid y col., Genome Methods 6:986-94 (1996) con referencia a las sondas de hidrólisis.
Un procedimiento para la detección de los productos de amplificación es el ensayo de PCR con “hidrólisis” 5’-3’ exonucleasa (también denominado ensayo TaqMan™) (patentes de EE.UU. nº 5.210.015 y 5.487.972; Holland y col., PNAS USA 88: 7276-7280 (1991); Lee y coI., Nucleic Acids Res. 21: 3761-3766 (1993)). Este ensayo detecta la acumulación de un producto específico de PCR mediante hibridación y escisión de una sonda fluorogénica marcada doblemente (la sonda ''TaqMan™) durante la reacción de amplificación. La sonda fluorogénica consiste en un oligonucleótido marcado con un pigmento indicador fluorescente y un pigmento inactivador. Durante la PCR, esta sonda se escinde mediante la actividad 5’-exonucleasa de la ADN polimerasa si, y solo si, hibrida con el segmento que se está amplificando. La escisión de la sonda genera un incremento en la intensidad de fluorescencia del pigmento indicador.
Otro procedimiento de detección de los productos de amplificación que emplea el uso de transferencia de energía es el procedimiento con "sonda baliza” descrito por Tyagi y Kramer, Nature Biotech. 14:303-309 (1996), que también es el objeto de las patentes de EE.UU. Nº 5.119.801 y 5.312.728. Este procedimiento emplea sondas de hibridación oligonucleotídicas que pueden formar estructuras en horquilla. En un extremo de la sonda de hibridación (bien el extremo 5' o el 3'), existe un fluoróforo donante y, por otro lado, un resto aceptor. En el caso del procedimiento de Tyagi and Kramer, este resto aceptor es un inactivador, es decir, el aceptor absorbe la energía liberada por el donante, pero no es fluorescente en sí mismo. Por tanto, cuando la baliza está en la conformación abierta, la fluorescencia del fluoróforo donante se puede detectar, mientras que cuando la baliza está en la conformación de horquilla (cerrada), la fluorescencia del fluoróforo donante se inactiva. Cuando se emplea en PCR, la sonda baliza molecular, que hibrida con una de las hebras del producto de la PCR, está en la conformación abierta y se detecta la fluorescencia, mientras que las que no hibridan no producirán fluorescencia (Tyagi y Kramer, Nature Biotechnol. 14: 303-306 (1996)). Como resultado, la cantidad de fluorescencia aumentará a medida que aumenta la cantidad de producto de la PCR y, por tanto, se puede usar como medida de la progresión de la PCR. Los expertos en la técnica reconocerán que también están disponibles otros procedimientos de amplificación cuantitativa.
También se conocen otras diversas técnicas para realizar la amplificación cuantitativa de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, algunas metodologías emplean uno o más oligonucleótidos sonda que están estructurados de un modo tal que se genera un cambio en la fluorescencia cuando el(los) oligonucleótido(s) hibrida(n) con un ácido nucleico diana. Por ejemplo, uno de estos procedimientos implica un abordaje con fluoróforo doble que explota la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), por ejemplo sondas de hibridación LightCycler™, en la que dos sondas oligonucleotídicas hibridan con el amplicón. Los oligonucleótidos están diseñados para hibridar en una orientación cabeza-cola con los fluoróforos separados a una distancia que es compatible con una transferencia de energía eficiente. Otros ejemplos de oligonucleótidos marcados que están estructurados para emitir una señal cuando están unidos a un ácido nucleico o incorporados en un producto de extensión incluyen: Sondas Scorpions™ (p. ej., Whitcombe y coI., Nature Biotechnology 17: 804-807,1999, y la patente de EE.UU. nº 6.326:145), sondas Sunrise™ (o Amplifluor™) (p.ej., Nazarenko y coI., Nuc. Acids. Res. 25: 2516-2521, 1997, y la patente de EE.UU. nº 6.117:635), y sondas que forman una estructura secundaria que tiene como resultado una señal reducida sin un inactivador y que emite una señal mayor cuando se hibrida con una diana (p. ej., Lux probes™).
Se pueden usar agentes intercalantes que producen una señal cuando se intercalan en el ADN bicatenario. Ejemplos de los agentes incluyen SYBR GREENTM y SYBR GOLDTM. Dado que estos agentes no son específicos del molde, se supone que la señal se genera en base a una amplificación específica del molde. Esto se puede confirmar monitorizando la señal como función de la temperatura, ya que el punto de fusión de las secuencias molde será, en general, mucho más alto que, por ejemplo, el de los cebador-dímeros etc.
2. Amplificación específica del estado de metilación
La PCR específica de metilación se puede emplear para monitorizar el estado de metilación de nucleótidos específicos en un locus de ADN. En estos procedimientos, después o antes de la digestión con la enzima de restricción, el ADN se combina con un agente que modifica las citosinas no metiladas. Por ejemplo, se añade bisulfito sódico al ADN, de modo que convierte las citosinas no metiladas en uracilo, dejando las citosinas metiladas intactas. Se han diseñado uno o más cebadores para distinguir entre las secuencias metiladas y no metiladas que han sido tratadas con bisulfito sódico. Por ejemplo, los cebadores complementarios con la secuencia metilada tratada con bisulfito contendrán guanosinas, que son complementarias a las citosinas endógenas. Los cebadores complementarios de la secuencia no metilada tratada con bisulfito contendrán adenosinas, que son complementarias del uracilo, el producto de conversión de la citosina no metilada. Preferentemente, los nucleótidos que distinguen entre las secuencias metiladas y no metiladas convertidas estarán en o cerca del extremo 3’ de los cebadores. Las variaciones de los procedimientos que usan PCR basada en bisulfito sódico se describen en, por ejemplo, Herman y coI., PNAS USA 93: 9821-9826 (1996); las patentes de EE.UU. Nº 5.786.146 y 6.200.756.
3. Captura híbrida
Los ensayos de captura híbrida de ácido nucleico se pueden usar para detectar la presencia y la cantidad de ADN escindido mediante las enzimas de restricción. Este procedimiento se puede usar con o sin amplificación del ADN. Tras las digestiones de restricción, las sondas de ARN que hibridan específicamente con las secuencias de ADN de interés se combinan con el ADN para formar híbridos ARN-ADN. Los anticuerpos que se unen a los híbridos de ARN:ADN se usan después para detectar la presencia de los híbridos y, por tanto, la presencia y la cantidad de ADN sin cortar. Los fragmentos de ADN restringidos en una ventana de secuencia que es complementaria a la sonda de ARN hibridan con menor eficacia con la sonda de ARN que los fragmentos de ADN que permanecen intactos en la ventana de secuencia que se está monitorizando. La cantidad de hibridación permite cuantificar el ADN intacto y la cantidad de metilación del ADN se puede deducir directamente a partir de la cantidad de ADN intacto de diferentes tratamientos con enzimas de restricción (es decir, tratamientos con enzimas de restricción sensibles a metilación y/o dependientes de metilación).
Los procedimientos de detección de híbridos de ARN:ADN usando anticuerpos se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Van Der Pol y coI., J. Clin. Microbiol. 40(10): 3558 (2002); Federschneider y coI., Am. J. Obstet. Gynecol. 191 (3):757 (2004); Pretet y coI., J. Clin. Virol. 31 (2): 140-7 (2004); Giovannelli y col., J. Clin. Microbiol. 42(8): 3861 (2004); Masumoto y coI., Gynecol. Oncol. 94(2): 509-14 (2004); Nonogaki y coI., Acta Cytol. 48(4): 514 (2004); Negri y coI., Am. J. Clin. Pathol. 122(1) 90 (2004); Sarian y col., Gynecol. Oncol. 94(1) 181 (2004); Oliveira y col., Diagn. Cytopathol. 31 (1) 19 (2004); Rowe y col., Diagn. Cytopathol. 30(6): 426 (2004); Clavel y col., Br. J. Cancer 90(9): 1803-8 (2004); Schiller y coI., Am. J Clin. Pathol. 121 (4): 537 (2004); Arbyn y coI., J. Natl. Cancer Inst. 96(4): 280 (2004); Syrjanen y coI., J Clin. Microbiol. 2004 Feb; 42(2): 505 (2004); Lin y coI., J. Clin. Microbiol. 42(1): 366 (2004); Guyot y coI., BMC Infect. Dis. 25; 3(1): 23 (2003); Kim y col., Gynecol. Oncol. 89(2): 210-7 (2003); Negri y col., Am J Surg Pathol. 27(2): 187 (2003); Vince y coI., J. Clin. Virol. Suppl 3: S1 09 (2002); Poljak y col., J. Clin. Virol. Suppl 3: S89 (2002). En algunos casos, los anticuerpos están marcados con un marcador detectable (p. ej., un marcador enzimático, un isótopo o un marcador fluorescente) para facilitar la detección. Como alternativa, el complejo anticuerpo-ácido nucleico se puede poner en contacto adicionalmente con un anticuerpo secundario marcado con un marcador detectable. Para una revisión de procedimientos inmunológicos e inmunoensayo adecuados, véase, por ejemplo, Harlow & Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publication, New York (1988); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds., 7ª ed. 1991); patentes de EE.UU. 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168); Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volumen 37 (Asai, ed. 1993).
Se pueden usar anticuerpos monoclonales, policlonales o mezclas de los mismos para unir los híbridos ARN:ADN. La detección de los híbridos ARN:ADN usando anticuerpos monoclonales se describe en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.732.847 y 4.833.084. La detección de los híbridos ARN:ADN usando anticuerpos policlonales se describe en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 6.686.151. Los anticuerpos policlonales o monoclonales se pueden generar con propiedades de unión específicas. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos monoclonales o policlonales que se unen específicamente a híbridos de ARN:ADN más cortos (p. ej., menos de 20 pares de bases) o más largos (p. ej., más de 100 pares de bases. Además, se pueden producir anticuerpos monoclonales o policlonales que sean más o menos sensibles a las faltas de coincidencia dentro del híbrido ARN:ADN.
Los expertos en la técnica conocen procedimientos de producir anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan específicamente con los híbridos ARN:ADN. Por ejemplo, la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales inmunizando animales de laboratorio (p. ej., pollos, ratones, conejos, ratas, cabras, caballos y similares) con un inmunógeno adecuado (p. ej., un híbrido ARN:ADN). Dichos procedimientos se describen en, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, anteriormente; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed. 1986); y Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975).
Los anticuerpos también se pueden producir de forma recombinante. La preparación de anticuerpos mediante selección de anticuerpos en bibliotecas de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos recombinantes empaquetados en fagos o vectores similares se describe en, por ejemplo, Huse y col., Science 246: 1275-1281 (1989) y Ward y coI., Nature 341: 544-546 (1989). Además, los anticuerpos se pueden producir de forma recombinante usando procedimientos conocidos en la técnica y descritos en, por ejemplo, Sambrook y coI., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y col., eds., 1994)).
D. Detección de la densidad de metilación
Los procedimientos de la invención se pueden usar para determinar la densidad de metilación de un locus. La determinación de la densidad de metilación se describe en, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. nº 60/513.426, presentada el 21 de octubre de 2003.
La cantidad de metilación de un locus de ADN se puede determinar proporcionando una muestra de ADN genómico que comprende el locus, escindiendo el ADN con una enzima de restricción que es sensible a metilación o dependiente de metilación y, después, cuantificando la cantidad de ADN intacto o cuantificando la cantidad de ADN cortado en el locus de ADN de interés. La cantidad de ADN intacto o cortado dependerá de la cantidad inicial de ADN genómico que contiene el locus, la cantidad de metilación en el locus y el número (es decir, la fracción) de nucleótidos en el locus que están metilados en el ADN genómico. La cantidad de metilación en un locus de ADN se puede determinar comparando la cantidad de ADN intacto o cortado con un valor control que representa la cantidad de ADN intacto o cortado en una muestra de ADN tratada de forma similar. Como se trata más adelante, el valor control puede representar un número conocido o previsto de nucleótidos metilados. Como alternativa, el valor control puede representar la cantidad de ADN intacto o cortado del mismo locus en otra célula (p. ej.,, normal, no enfermo) o de un segundo locus.
Usando al menos una enzima de restricción sensible a metilación o dependiente de metilación en condiciones que permitan que al menos algunas copias de potenciales sitios de escisión de enzima de restricción en el locus permanezcan sin escindir y, después, cuantificando las restantes copias intactas y comparando la cantidad con un control se puede determinar la densidad media de metilación de un locus. Si la enzima de restricción sensible a metilación se pone en contacto con las copias de un locus de ADN en condiciones que permitan que al menos algunas copias de potenciales sitios de escisión de enzima de restricción en el locus permanezcan sin escindir, el ADN intacto restante será directamente proporcional a la densidad de metilación y, por tanto, se pueden comparar con un control para determinar la densidad de metilación relativa del locus en la muestra. De forma similar, si una enzima de restricción dependiente de metilación se pone en contacto con las copias de un locus de ADN en condiciones que permitan que al menos algunas copias de potenciales sitios de escisión de enzima de restricción en el locus permanezcan sin escindir, el ADN intacto restante será inversamente proporcional a la densidad de metilación y, por tanto, se pueden comparar con un control para determinar la densidad de metilación relativa del locus en la muestra.
La densidad media de metilación dentro de un locus en una muestra de ADN se determina digiriendo el ADN con una enzima de restricción sensible a metilación o dependiente de metilación y cuantificando la cantidad relativa del ADN intacto restante en comparación con una muestra de ADN que comprende una cantidad conocida de ADN metilado. En estas realizaciones se pueden usar digestiones parciales o digestiones completas. Como se ha descrito anteriormente para el ADN uniformemente metilado, el uso de digestiones parciales permite la determinación de la densidad media de metilación del locus.
E. Detección de las diferencias de metilación entre muestras y loci específicos
Los procedimientos de la invención se pueden usar para detectar diferencias en la metilación entre muestras de ácido nucleico (p. ej., ADN o ADN genómico) y/o en loci específicos. Los procedimientos se pueden usar para analizar una muestra de ADN en la que todas las copias de un locus de ADN genómico tienen un patrón de metilación idéntico. La muestra de ADN puede ser una mezcla de ADN que comprende alelos de un locus de ADN en el que algunos alelos están más metilados que otros. Una muestra de ADN puede contener ADN de dos o más tipos celulares diferentes, en el que cada tipo de célula tiene una densidad de metilación diferente en un locus concreto (p. ej., una célula de un tejido que se sospecha que está enfermo o una célula de una muestra de tejido no enfermo). Por ejemplo, en algunos loci, las células neoplásicas tienen diferentes densidades de metilación en comparación con células normales. Si un tejido, fluido corporal o secreción contiene ADN de células tanto normales como neoplásicas, la muestra de ADN del tejido, fluido corporal o secreción comprenderá una mezcla heterogénea de alelos metilados de forma diferente. En este caso, en un locus dado, un conjunto de alelos dentro del ADN (p. ej., los derivados de células neoplásicas en la muestra) tendrán una densidad de metilación diferente de la del otro conjunto de alelos (p. ej., los derivados de células normales).
En los casos en los que se tiene que detectar un fenotipo o enfermedad concreto, las muestras de ADN se prepararán a partir de un tejido de interés, o, según sea adecuado, a partir de sangre. Por ejemplo, se puede preparar ADN a partir de tejido de biopsia para detectar el estado de metilación de un locus concreto asociado con cáncer. El espécimen que contiene ácido nucleico usado para la detección de loci metilados (véase, por ejemplo, Ausubel y coI., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (suplemento de 1995)) puede proceder de cualquier fuente, incluidos los tejidos cerebral, de colon, urogenital, hematopoyético, de timo, testicular, ovárico, uterino, de próstata, mamario, de colon, pulmonar y renal y puede extraerse mediante diversas técnicas, tales como las descritas por Ausubel y coI., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995) o Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (3rd ed. 2001).
La detección y la identificación de loci de metilación alterada (en comparación con las células normales) en muestras de ADN pueden indicar que al menos algunas de las células de las que s obtuvo la muestra están enfermas. Dichas enfermedades incluyen, entre otras, por ejemplo, astrocitoma de grado bajo, astrocitoma anaplásico, glioblastoma, meduloblastoma, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de pulmón, cáncer renal, leucemia (p. ej., leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica), linfoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer de endometrio, neuroblastoma, cáncer de la cavidad oral (p. ej., lengua, boca, faringe), cáncer esofágico, cáncer de estómago, cáncer de intestino delgado, cáncer rectal, cáncer anal, cáncer del canal anal y anorrectal, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de vesícula biliar, cáncer biliar, cáncer de páncreas, cáncer de huesos, cáncer de las articulaciones, cáncer de piel (p. ej., melanoma, cáncer no epitelial, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas), cánceres de tejido blando, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer vulval, cáncer vaginal, cáncer urinario, cáncer del uréter, cáncer del ojo, cáncer de cabeza y cuello, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, mieloma múltiple, cáncer cerebral, cáncer del sistema nervioso. La identificación de los perfiles de metilación alterados también es útil para la detección y diagnóstico de pérdida de impresión genómica, síndrome del cromosoma X frágil e inactivación del cromosoma X.
Los loci específicos que son adecuados para analizar usando los procedimientos de la invención se describen en, por ejemplo, Costello y Plass, J. Med. Genet. 38:285-303 (2001) y Jones y Baylin, Nature. Rev. 3:415-428 (2002) y se exponen en la Tabla 1 que figura a continuación.
Tabla 1: Ejemplos de genes que exhiben hipermetilación en cancer
Gen
Efecto de la pérdida de función en el desarrollo tumoral Tipos de tumores
RB
Pérdida de control del ciclo celular Retinoblastoma
MLH1
Mayor tasa de mutación, resistencia farmacológica De colon, de ovarios, de endometrio, gástrico
BRCA1
Inestabilidad genómica De mama, de ovarios
E-CAD
Mayor motilidad celular De mama, gástrico, de pulmón, de próstata, de colon, leucemia
APC
Transducción celular aberrante De mama, de pulmón, de colon, gástrico, esofágico, pancreático, hepatocelular
Gen
Efecto de la pérdida de función en el desarrollo tumoral Tipos de tumores
p16
Pérdida de control del ciclo celular La mayoría de los tipos de tumor
VHL
Degradación proteica alterada Carcinoma de células renales de células claras
p73
Pérdida de control del ciclo celular Leucemia, linfoma, de ovarios
RASSF1A
Transducción celular aberrante De pulmón, de mama, de ovarios, renal, nasofaríngeo
p15
Pérdida de control del ciclo celular Leucemia, linfoma, gástrico, carcinoma de células escamosas, hepatocelular
GSTP1
Mayor daño celular De próstata
DAPK
Menor apoptosis Linfoma de pulmón
MGMT
Mayor tasa de mutación De colon, de pulmón, cerebral, esofágico, gástrico
P14ARF
Pérdida de control del ciclo celular Melanoma, cáncer de piel distinto al melanoma, de páncreas, de mama, de cabeza y cuello, de pulmón, mesotelioma, neurofibromatosis, de colon, sarcoma de tejidos blandos, de vejiga urinaria, de Hodgkin, sarcoma de Ewing, tumor de Wilm, osteosarcoma, rabdomiosarcoma
ATM
Reparación defectuosa del ADN Leucemia, linfoma
CDKN2B
Pérdida de control del ciclo celular De mama, de ovarios, de próstata
FHIT
Reparación defectuosa del ADN De pulmón, de páncreas, de estómago, renal, de cuello uterino, de mama
MSH2
Reparación defectuosa del ADN De colon
NF1/2
Pérdida de control del ciclo celular Neurofibroma
PTCH
Pérdida de control del ciclo celular De piel, carcinomas de células basales y escamosas, cerebral
PTEN
Pérdida de control del ciclo celular De mama, de tiroides, de piel, de cabeza y cuello, de endometrio
SMAD4
Pérdida de control del ciclo celular De páncreas, de colon
SMARCA3/B1
Pérdida de control del ciclo celular De colon
STK11
Pérdida de control del ciclo celular Melanoma, gastrointestinal
TIMP3
Rotura de la matriz celular De útero, de mama, de colon, cerebral, renal
TP53
Pérdida de control del ciclo celular; menor apoptosis De colon, de próstata, de mama, de vesícula biliar, de conducto biliar
BCL2
Pérdida de control del ciclo celular; menor apoptosis Linfoma, de mama
OBCAM
Pérdida de control del ciclo celular De ovarios
GATA4
Silenciación transcripcional de los genes cadena abajo Colorrectal, gástrico, de ovarios
GATA5
Silenciación transcripcional de los genes cadena abajo Colorrectal, gástrico, de ovarios
HIC1
Pérdida de control del ciclo celular Epitelio, linfoma, sarcoma
Abreviaturas: APC, poliposis adenomatosa del colon; BRCA1, cáncer de mama 1; DAPK, proteína quinasa asociada con la muerte; E-cad, caderina epitelial; GSTP1 glutatión S-transferasa 11; MLH1, homólogo MutL 1, MGMT, O (6)-metilguanina-ADN metiltransferasa; p15, p15INK4b; p16, p16INK4; p73, p73; Rb, retinoblastoma; RASSF1a, Ras Familia 1A del dominio de asociación; VHL, von Hippel-Lindau; ATM, ataxia telangiectasia mutada; CDKN2, inhibidor de quinasa dependiente de ciclina; FHIT, tríada de histidina frágil; MSH2, homólogo mutS 2; NF1/2, neurofibromina 1/2; PTCH, homólogo parcheado; PTEN, homólogo de fosfatasa y tensina; SMAD4, homólogo 4 de madres en contra del decapentaplégico 4; SMARCA3/B1, relacionado con SWI/SNF, asociado a la matriz, regulador de cromatina dependiente de actina, miembro 3 de la subfamilia A/miembro 1 de la subfamilia B; STK11, serina/treonina quinasa 11; TIMP3, inhibidor tisular de la metaloproteinasa 3; BcI2mB-call CLL/linfoma 2; OBCAM, molécula de adhesión celular de unión a opioide; GATA, factor de transcripción de la globina; HIC1, hipermetilado en cáncer.
En algunas realizaciones, la metilación de la muestra del mismo individuo se determina en un periodo de tiempo, por ejemplo días, semanas, meses o años. La determinación de los cambios en la metilación puede ser útil para proporcionar diagnósticos, pronósticos, selección de terapia y monitorización de la progresión para varias enfermedades; y, en el caso del cáncer, tipado y estadificación del tumor. Aunque los procedimientos de la invención también proporcionan la detección de acontecimientos de metilación específicos, los presentes procedimientos son particularmente notables porque no están limitados por una predicción o expectativa de que el estado de metilación de un nucleótido concreto es determinativo de un fenotipo. En los casos en los que la densidad de la metilación (en lugar de la presencia o ausencia de un nucleótido metilado concreto) modula la expresión génica y en los que la densidad de metilación de un locus refleja la progresión de la enfermedad a lo largo de un continuo, los presentes procedimientos son particularmente útiles.
Se pueden diseñar cebadores de amplificación para amplificar loci asociados con un fenotipo o enfermedad concretos.
Si se desea, se pueden usar procedimientos de ADN multiplex para amplificar múltiples dianas de la misma muestra. Las dianas adicionales pueden representar controles (p. ej., de un locus de estado de metilación conocido) o loci adicionales asociados con un fenotipo o enfermedad.
Los procedimientos de la invención se pueden usar para identificar nuevos loci asociados con un fenotipo de enfermedad, tal como cáncer, o para validar dicha asociación.
F. Ejemplos de procedimientos de determinar la metilación relativa en un locus
Como se ha descrito anteriormente se dispone de una serie de posibilidades para determinar la cantidad relativa de metilación en un locus genético de interés. Por ejemplo, se pueden realizar digestiones parciales o completas, se pueden usar enzimas de restricción sensibles a metilación o dependientes de metilación, se puede emplear tratamiento con bisulfito sódico etc. Sin pretender limitar la invención a una serie concreta de etapas, las posibilidades siguientes se ejemplifican adicionalmente.
Una muestra de ADN se puede digerir (parcialmente o completamente) con McrBC o con otra enzima de restricción dependiente de metilo y, después, un locus se amplifica usando amplificación cuantitativa del ADN (p. ej., PCR, amplificación en círculo rodante y otros procedimientos conocidos para los expertos en la técnica). Los perfiles cinéticos resultantes de las reacciones de amplificación se comparan con los derivados de una muestra de ADN control tratada de forma similar. Los perfiles cinéticos de las reacciones de amplificación se pueden obtener mediante numerosos medios conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen monitorización de la reacción de fluorescencia de TaqMan™, Molecular Beacons™, incorporación SYBRGREENTM, sondas Scorpion™, sondas LUX™ y otros.
La muestra de ADN se puede dividir en porciones iguales y una porción se trata con la enzima de restricción dependiente de metilación y la otra no. Las dos porciones se amplifican y comparan para determinar la cantidad relativa de metilación en el locus.
La muestra de ADN se puede dividir en porciones iguales, en las que cada porción se somete a una cantidad diferentes de digestión parcial con McrBC o con otra enzima de restricción dependiente de metilación. La cantidad de locus intacto en las diversas porciones (p. ej., medido mediante amplificación cuantitativa del ADN) se puede comparar con una población control (bien procedente de la misma muestra que representa ADN sin cortar o porciones equivalentes de otra muestra de ADN). En los casos en los que las porciones equivalentes proceden de una segunda muestra de ADN, la segunda muestra puede tener un número previsto o conocido de nucleótidos metilados (o al menos secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción metiladas) o, como alternativa, el número de secuencias de reconocimiento metiladas pueden ser desconocidas. En el último caso, la muestra control procederá, a menudo, una muestra de relevancia biológica, por ejemplo de un tejido enfermo o normal, etc.
La muestra de ADN puede digerirse parcialmente con una o más enzimas de restricción sensibles a metilación y, después, amplificarse para identificar loci intactos. En estos casos, los controles son similares a los usados para las digestiones con enzimas de restricción dependientes de metilación descritos anteriormente. Los controles no tratados no están digeridos y todas las muestras de ADN control tratadas se digieren con enzimas de restricción sensibles a metilación.
Una muestra se puede separar en al menos dos porciones. La primera porción se digiere con una enzima de una de las tres posibles clases de sensibilización por metilación (es decir, sensibles a metilación, insensibles a metilación y dependientes de metilación). Cada porción adicional se digiere con la pareja isoesquizomérica de una clase de enzima de sensibilización por metilación diferente de la enzima usada para digerir la primera porción. A continuación, los loci intactos se amplifican y cuantifican. La metilación relativa en el locus se puede determinar comparando entre sí los resultados obtenidos de dos cualquiera de las reacciones, con o sin comparación con una porción no digerida. En el caso en el que se usan enzimas insensibles a metilación, la porción deberá sufrir una digestión parcial.
La muestra de ADN se puede tratar con un agente que modifica la citosina no metilada, pero deja sin modificar la citosina metilada, por ejemplo bisulfito sódico. La muestra se separa en porciones iguales y una porción se trata con la enzima de restricción dependiente de metilación (p. ej., McrBC). El tratamiento con bisulfito sódico no modifica los sitios de reconocimiento de McrBC porque el bisulfito sódico modifica la citosina no metilada y el sitio de reconocimiento de cada hemi-sitio de McrB es una base purina seguida de una citosina metilada. Las muestras de porciones tanto cortadas como sin cortar se amplifican después usando al menos un cebador que distinga entre nucleótidos metilados y no metilados. Las porciones amplificadas se comparan después para determinar la metilación relativa. Ciertas tecnologías de amplificación cuantitativa emplean una o más sondas de detección que son distintas de los cebadores para amplificación. Estas sondas de detección también se pueden diseñar para discriminar entre ADN metilado convertido y no metilado. Las sondas de detección se pueden usar en combinación con una enzima de restricción dependiente de metilación (p. ej., McrBC). Por ejemplo, las sondas de detección se pueden usar para cuantificar la densidad de metilación dentro de un locus comparando los perfiles de amplificación cinética entre una muestra convertida tratada con McrBC y una muestra convertida que no se trató con McrBC.
Como alternativa, la muestra se puede dividir en porciones iguales y una porción se digiere (parcial o completamente) con una enzima de restricción dependiente de metilación (p. ej., McrBC).Después, ambas porciones se tratan con bisulfito sódico y se analizan mediante amplificación cuantitativa usando un cebador que distinga entre nucleótidos metilados convertidos y no metilados. Los productos de amplificación se comparan entre sí además de con un patrón para determinar la densidad de metilación relativa.
La muestra de ADN se puede dividir en porciones iguales y una porción se trata con una o más enzimas de restricción sensibles a metilación. Después, la porción digerida se subdivide adicionalmente y una subdivisión se digiere con una enzima de restricción dependiente de metilación (p. ej., McrBC). A continuación, las diversas porciones y subporciones se amplifican y comparan. Tras la digestión, las porciones y subporciones pueden tratarse opcionalmente con bisulfito sódico y amplificarse usando al menos un cebador que distinga entre nucleótidos metilados y no metilados.
La muestra de ADN se puede dividir en cuatro porciones: una primera porción se deja sin tratar, una segunda porción se pone en contacto con una enzima de restricción sensible a metilación (en la que las secuencias intactas están metiladas), una tercera porción se pone en contacto con una enzima de restricción dependiente de metilación (en la que las secuencias intactas no están metiladas) y una cuarta porción se pone en contacto con una enzima de restricción sensible a metilación y una enzima de restricción dependiente de metilación en las que una de las enzimas de restricción de la cuarta porción se pone en contacto con la muestra en condiciones tales que permiten que al menos algunas copias de potenciales sitios de escisión de enzimas de restricción en el locus permanezcan sin escindir (p. ej., en condiciones de digestión parcial y/o usando McrBC). Si se desea, una quinta porción de la muestra se puede analizar tras el tratamiento con un isoesquizómero insensible a metilación de una enzima de restricción dependiente de metilación o sensible a metilación usada en otra porción, de modo que se controlan las digestiones incompletas y/o las mutaciones en la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción. Además de la digestión, las porciones y subporciones pueden tratarse opcionalmente con bisulfito sódico y amplificarse usando al menos un cebador que distinga entre nucleótidos metilados convertidos y no metilados.
VIII. Kits
Se pueden usar kits para realizar los procedimientos de la presente invención. Por ejemplo, los kits pueden comprender, por ejemplo, una enzima de restricción dependiente de metilación o una enzima de restricción sensible a metilación, una molécula de ADN control que comprende un número predeterminado de nucleótidos metilados y uno o dos cebadores oligonucleotídicos control diferentes que hibridan con la molécula de ADN control. En algunos casos, los kits comprenden una pluralidad de moléculas de ADN que comprenden diferentes números predeterminados de nucleótidos metilados para permitir al usuario comparar la amplificación de una muestra con varios ADN que comprenden un número conocido de nucleótidos metilados.
Los kits a menudo contendrán instrucciones escritas para usar los kits. Los kits también pueden comprender reactivos suficientes para soportar la actividad de la enzima de restricción. Los kits también pueden incluid una ADN polimerasa termoestable.
En algunos casos, los kits comprenden uno o más cebadores oligonucleotídicos diana diferentes que hibridan con una región predeterminada de ADN genómico humano. Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, los cebadores pueden permitir la amplificación de los loci asociados con el desarrollo o pronóstico de la enfermedad.
Los kits pueden comprender una o más sondas oligonucleotídicas marcadas de forma detectable para monitorizar la amplificación de polinucleótidos diana.
Los kits pueden comprender al menos un cebador oligonucleotídico diana que distingue entre ADN no metilado modificado y ADN metilado en ADN genómico humano. Normalmente, estos kits también incluyen un resto fluorescente que permite adquirir el perfil cinético de cualquier reacción de amplificación en tiempo real.
Los kits pueden comprender al menos un cebador oligonucleotídico diana que distingue entre ADN no metilado modificado y ADN metilado en ADN genómico humano. Asimismo, normalmente estos kits incluyen un agente que modifica la citosina no metilada.
Los kits pueden comprender una sonda de ARN, un agente de unión (p. ej., un anticuerpo o un mimético de anticuerpo) que se une específicamente a complejos de ARN-ADN, reactivos de detección y enzimas de restricción sensibles a metilación y/o dependientes de metilación.
Ejemplos
Ejemplo 1: Comparación para identificar metilación en un locus
El ejemplo siguiente ilustra cómo se puede usar los procedimientos de la invención para determinar el número de copias metiladas de un locus, el número de copias no metiladas de un locus, el número de copias hemimetiladas de un locus, el número de copias mutadas de un locus y el número de copias totales de un locus en una población de ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos se aíslan de una muestra y se dividen en porciones, cada una de las cuales contiene todas las secuencias presentes en la muestra. Este ejemplo usa el sitio de restricción para Sau3A I para fines ilustrativos y monitoriza la metilación de 6mA. Un experto en la técnica apreciará que se pueden seleccionar diferentes enzimas para monitorizar la metilación de citosina.
Cualquier sitio de restricción dado tiene tres posibles estados: (1) hemimetilado; (2) metilado; (3) no metilado; y
(4) mutado.
1.
G*ATC = hemimetilado ("hemi") CTAG
2.
G*ATC = metilado ("met”) CTA*G
3.
GATC = no metilado ("no met") CTAG
4.
GTIC = mutado ("mut") CAAG
Sau3A I es una enzima de restricción insensible a metilación que corta cuando un residuo de adenosina metilada está en su sitio de reconocimiento. Dpn I es una enzima de restricción dependiente de metilación que solo corta cuando un residuo de adenosina metilada está en o cerca de su sitio de reconocimiento en ambas hebras. Mbo I es una enzima sensible a metilación que no corta cuando un residuo de adenosina metilada está en su sitio de reconocimiento y también es el esquizómero de Sau3A I. Los sitios hemimetilados se cortan con Sau3A I, pero no con Dpn I o Mbo I; los sitios metilados se cortan con Dpn I y Sau3A I, pero no con Mbo I; y los sitios no metilados se cortan con Sau3A I y Mbo I, pero no con Dpn I.
A. PCR cuantitativa de una primera porción de ácidos nucleicos sin tratar o ácidos nucleicos tratados de forma simulada, de la muestra da el número total de copias del locus en la muestra, que equivale a:
(1) hemi + (2) met + (3) no met + (4) mut
B: Cortar una segunda porción de ácidos nucleicos con la enzima de restricción sensible a metilación Mbo I, seguido de PCR cuantitativa, conduce a la amplificación de las copias metiladas del locus en la muestra, lo que equivale a:
(1) hemi + (2) met + (4) mut.
C: Cortar una tercera porción de ácidos nucleicos cortados con la enzima de restricción dependiente de metilación Dpn I, seguido de PCR cuantitativa, conduce a la amplificación de las copias no metiladas en la muestra, lo que equivale a:
(1)
hemi + (3) no met + (4) mut.
D.
Cortar una cuarta porción de ácidos nucleicos con la enzima de restricción sensible a metilación Mbo I y la enzima de restricción dependiente de metilación Dpn I, seguido de PCR cuantitativa, conduce a la amplificación de las copias hemimetiladas en la muestra, lo que equivale a:
(1)
hemi + (4) mut.
E: Cortar una quinta porción de ácidos nucleicos cortados con Sau3A I, una enzima de restricción insensible a metilación que es un isoesquizómero de la enzima de restricción dependiente de metilación (Dpn I), seguido de PCR cuantitativa, conduce a la amplificación de copias mutantes en la muestra, es decir copias que son complementarias a los cebadores de PCR pero que no contienen sitios de restricción hemimetilados, metilados o no metilados, que equivale a:
(4)
mut.
F.
Una comparación de los resultados de A y B conduce al número de loci no metilados en la muestra:
No met = A[hemi + met + no met + mut] - B[hemi + met + mut].
G. Una comparación de los resultados de A y C conduce al número de copias metiladas en la muestra:
Met = A[hemi + met + no met + mut] - C[hemi + no met + mut].
H. Comparación de los resultados de A, B y C conduce al número de copias hemimetiladas y de copias no metiladas en la muestra:
Hemi + no met = C[hemi + no met + mut] - (A[hemi + met + no met + mut] - B[hemi + met + mut]).
Hemi + no met =B[hemi + met + mut] -(A[hemi + met + no met + mut] - B[hemi + no met + mut])
I. Una comparación de los resultados de A y D conduce al número de copias metiladas y no metiladas en la muestra:
Met + no met = A[hemi + met + no met + mut] -D[hemi + mut].
J. Una comparación de los resultados de D y E conduce al número de copias hemimetiladas en la muestra:
Hemi = D[hemi + mut] -E[mut].
K. Una comparación de los resultados de E y D con B o C conduce al número de copias metiladas o no metiladas en la muestra, respectivamente:
Met = B[hemi + met + mut] -E[mut] -(D[hemi + mut] -E[mut])
No met = C[hemi + no met + mut] -E[mut] – ((D[hemi + mun-E[mut]).
ANTECEDENTES Ejemplo 2: Demostración de la sensibilidad de detección
Se obtuvo ADN placentario masculino humano y se metiló in vitro usando M.Sssl, que metila las citosinas (5mC) cuando las citosinas van seguidas de guanosina (es decir, motivos GC). Después, el ADN metilado in vitro resultante se mezcló en ADN placentario masculino no metilado a proporciones conocidas, de modo que se produce un conjunto de mezclas, en la que cada una de ellas comprende un porcentaje diferente de copias totales que están metiladas.
Las diversas mezclas se dividieron después en tres porciones: Una porción diferida con HhaI, una enzima de restricción sensible a metilación que es sensible a 5mC y que tiene la secuencia de reconocimiento GCGC, en la que los nucleótidos subrayados están sin metilar;
y una porción digerida con HhaI y McrBC. McrBC es una enzima de restricción dependiente de metilación que escinde en la proximidad de su secuencia de reconocimiento metilada. Las secuencias digeridas se amplificaron después usando cebadores específicos de una región cadena arriba del gen CDKN2A (p16) en el genoma humano [gen Ensembl ID Nº ENSG00000147889]. Se determinó que esta región estaba no metilada en ADN placentario masculino humano que no se ha metilado in vitro. Las secuencias de los cebadores fueron:
Cebador directo 5'-CGGGGACGCGAGCAGCACCAGAAT-3' (SEC ID Nº 2), Cenador inverso 5' CGCCCCCACCCCCACCACCAT -3' (SEC ID Nº 3)
y se usaron condiciones de PCR estándar:
1 ciclo [a 95 ºC durante 3 minutos] Seguido de 49 ciclos a [95 ºC durante 30 s, 65 ºC durante 15 segundos y 68 ºC durante 15 segundos, una lectura de placas (68 ºC) y, después, otra lectura de placas a 83 ºC]. La segunda lectura de placas a 83 ºC se realizó para eliminar la contribución de la fluorescencia de los dímeros cebadores al perfil de reacción.
Se realizó una curva de fusión, que mide la fluorescencia como una función de la temperatura, entre 80 ºC y 95 ºC al final de los ciclos y se determinó la especificidad del producto.
El locus de interés tiene una longitud de 181bp y tiene una temperatura de fusión de aproximadamente 89 ºC. La acumulación de producto de amplificación se determinó usando el pigmento intercalante, SYBR Green™ Dynamo Kit de MJ Research, que emite fluorescencia cuando se une a ácidos nucleicos bicatenarios y las reacciones se ciclaron y se monitorizó la intensidad de fluorescencia usando la máquina de PCR en tiempo real MJ Opticon II.
A partir de un análisis paralelo de una curva estándar de dilución patrón se determinó empíricamente un umbral al cual se podría detectar la señal de los productos de amplificación por encima del fondo El umbral se ajustó para maximizar el ajuste de la curva de regresión (Ct vs log [ADN]), de acuerdo con los protocolos de determinación de umbrales de ciclo estándar con los que están familiarizados los expertos en la técnica, tales como los descritos en, por ejemplo, Fortin y col., Anal. Biochem. 289: 281-288 (2001). Una vez establecido, se fijó el umbral y con el software (MJ Research Opticon II Monitor V2.02) se calculó el Ct. Como cabía esperar, los umbrales del ciclo derivados aumentaron a diluciones mayores de ADN metilado a no metilado (Figura 2). También mostrado en la Figura 2, el cambio (o “desplazamiento”) en el umbral de ciclo (LCt) entre el ADN no cortado y el ADN tratado con HhaI correspondía con el esperado (E) para las diluciones, lo que demuestra que el desplazamiento del umbral del ciclo se puede usar para predecir de forma precisa la proporción relativa de las copias que están metiladas en la muestra con respecto al número de copias totales en la muestra.
La Figura 2 también ilustra que la adición de HhaI (una enzima de restricción sensible a metilación) y McrBC (una enzima de restricción dependiente de metilación) altera adicionalmente el Ct en comparación con las muestras tratadas con HhaI sola. La degradación del número de copias intactas u el desplazamiento resultante del Ct a un valor Ct más alto tras el tratamiento con la enzima de restricción dependiente de metilación y la enzima de restricción sensible a mutilación confirma también la evaluación de que las copias intactas presentes tras el tratamiento con la enzima de restricción sensible a metilación sola están, en efecto, metiladas. En otras palabras, esta doble digestión proporciona un control frente a la posibilidad de que no se añadiera HhaI, que fuera inactiva, que fuera parcialmente activa o, por otro lado, que no realizara una digestión completa. La adición de la enzima de restricción dependiente de metilación y su capacidad para destruir moldes metilados confirma los resultados observados tras el tratamiento solo con la enzima de restricción sensible a metilación y proporciona un control interno para evaluar que la reacción con la enzima de restricción sensible a metilación ha finalizado del todo.
La Figura 3 representa el perfil cinético de cuatro porciones a tres diluciones de AND metilado-ADN no metilado. En cada una de las tres diluciones se digirieron las cuatro porciones primero con la enzima de restricción sensible a metilación HhaI. Las primeras dos porciones de cada dilución se digirieron con McrBC y las segundas dos porciones de cada dilución no se trataron con independencia de McrBC. Todas las porciones se amplificaron en condiciones idénticas y se midieron las intensidades de fluorescencia. Se pueden efectuar tres observaciones. En primer lugar, las reacciones por duplicado tienen valores de Ct casi idénticos, lo que demuestra que los ensayos son altamente reproducibles. En segundo lugar, la disminución del cambio en el umbral del ciclo entre las porciones tratadas y no tratadas como una función del incremento de la dilución de las copias metiladas muestra que a medida que las copias de genes metilados son más raras, la diferencia entre los valores de Ct observados entre la porción tratada con McrBC y la no tratada es menor. Esto sugiere que las reacciones con Hha y Hha +McrBC convergerán y que, en algún punto, no se podrá monitorizar la densidad de metilación ni se podrá identificar la presencia o ausencia de copias metiladas. Una extinción teórica de la detección se producirá a un valor de ACt de cero. Usando un análisis de regresión, los autores resolvieron la función de extinción en su sistema y encontraron que la dilución en la que LCt = 0 es 1:20.000, copias metiladas-copias no metiladas respectivamente. Este análisis de regresión se detalla en la figura 5.
La Figura 3 muestra el perfil cinético de una serie de porciones diluidas todas a 1:2.000 copias metiladas-copias no metiladas, respectivamente. Aunque LA fluorescencia global obtenida de las reacciones a 1:2.000 no es ideal, se puede ver una diferencia entre las reacciones con Hhal y con Hhal/McrBC. Obsérvese que la digestión con McrBC destruye la acumulación de la fluorescencia y la curva del punto de fusión en la Figura 4 muestra un pico específico a 89 ºC, que es la temperatura de fusión prevista para el amplicón específico de 181 pb. Aquí, los autores observan claramente simplemente 1,4 equivalentes celulares de ADN metilado diluido en un total de 2.762 equivalentes celulares de ADN.
Como se muestra en la Figura 5, se detectaron 1,4 equivalentes celulares (EC) de un total de 2764 EC en el tubo que tiene un total de 20 ng de ADN genómico. Cada equivalente celular tiene aproximadamente 7,9 pg de ADN genómico/por célula. Por tanto, si se usan 50 ng de ADN genómico, una copia metilada en presencia de 10.000 copias no metiladas deberá poder detectarse. Este principio se ilustra en la Figura 5. La Figura 6 proporciona un despliegue de este análisis. Obsérvese que este límite de detección puede disminuirse más (i) usando una sonda optimizada basada en FRET, en lugar de un pigmento intercalante, para detectar los productos amplificados, (ii) optimizando adicionalmente el diseño del cebador de PCR o (iii) optimizando adicionalmente las condiciones de reacción de la PCR.
Ejemplo básico 3: Construcción de un conjunto de muestras patrón de metilación de ADN
Un conjunto de muestras patrón se genera de varias formas. Por ejemplo, una metilasa (p. ej., M.Sssl u otras metilasas tales como M.Hhal, M.Alul) se aplica in vitro a una serie de muestras de ADN para producir un conjunto patrón de ADN que se sabe que tienen densidades de metilación crecientes. Este conjunto patrón se genera obteniendo primero una muestra de secuencia conocida (p. ej., el locus de interés). Después, la muestra se divide en una serie de muestras y cada muestra en la serie se trata con la metilasa escogida en presencia de magnesio y de un modo que tenga como resultado mayores densidades de metilación de las muestras en la serie.
Una reacción de metilación parcial se refiere a poner en contacto ADN con una mezcla de una o más metilasas en las condiciones de reacción adecuadas de un modo tal que la metilasa modifica (p. ej., aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %) pero no todos los posibles sitios de reconocimiento para metilasa para cada enzima en la mezcla de metilasas. Una secuencia de ADN se metila parcialmente tratando ADN con una metilasa activa durante un periodo de tiempo más corto de lo necesario para conseguir una metilación completa y, después, finalizando la reacción, o en otras condiciones de reacción alteradas que permitan la cantidad deseada de metilación parcial.
Las densidades de metilación de cada muestra en la serie se miden secuenciando una muestra estadísticamente significativa de clones de una porción tratada con bisulfito de cada miembro de la serie en el conjunto, identificando las citosinas convertidas dentro de cada clon y calculando la densidad media de metilación para cada reacción dentro del conjunto de muestras de metilación. Con el fin de conseguir una densidad de metilación parcial en un fragmento dado, la metilasa actúa de un modo estocástico y no de un modo progresivo. Para MSssl, esto se consigue realizando la reacción en presencia de magnesio, ya que MSssl metila el AND de un modo progresivo en ausencia de magnesio, aunque en presencia de magnesio, la enzima metila CpGs de un modo estocástico, no progresivo.
Ejemplo básico 4: Determinación cuantitativa de la metilación relativa de un locus de interés entre un tejido y otro tejido con amplificación cuantitativa
El ADN se recoge de dos fuentes: una población de ensayo (enferma) y una población control (normal).
Cada población de fragmentos de ADN se presenta de forma similar a varias digestiones parciales o completas con la enzima McrBC.
La McrBC reconoce dos sitios de RMC, cada uno un medio sitio, que está dentro de 20 a 4.000 bases con una separación óptima de los medios sitios de 50-103 pb y, después, corta el fragmento de ADN en ocasiones en 3’ de ambos medios sitios, en ocasiones en 3’ del medio sitio más en 5’ de los medios sitios más en 3’ y, en ocasiones en 5' de ambos medios sitios.
Después, se amplifica el ADN digerido en cada población y la cantidad del locus amplificado se mide como función del número del ciclo. Cuanto mayor es el número de medios sitios metilados en el locus de interés en un fragmento de ADN dado dentro de la población estudiada, mayor es la probabilidad de que McrBC corte entre los cebadores de PCR y, por tanto, será necesario un número mayor de ciclos de amplificación para alcanzar la concentración idéntica del locus amplificado por PCR.
Para determinar si el locus de interés en la población de ensayo está más o menos metilado que el locus de interés dentro de la población control, una curva de concentración del ADN amplificado de la población de ensayo se compara con la curva de concentración del ADN amplificado de la población control. Las curvas de concentración reflejan la cantidad de ADN intacto como una función de la cantidad de digestión en una serie de diferentes digestiones parciales.
Ejemplo básico 5: Medición de la densidad de metilación en un locus de interés dentro de un tejido con amplificación cuantitativa
Se obtiene el ADN de una única fuente y se divide en dos poblaciones. La primera población de ADN se digiere completamente con la enzima McrBC, mientras que la población restante no se trata. Como alternativa, la primera población se digiere con una mezcla de una o más enzimas de restricción sensibles a metilación (p. ej., Hpall, Hhal,
o Acil, etc.), mientras que la segunda población de ADN no se trata.
A continuación, se amplifica el ADN digerido en la primera población y se mide la cantidad del locus amplificado como una función del número de ciclo. Cuando mayor es el número de medios sitios metilados en el locus de interés en un fragmento de ADN dado dentro de la población estudiada, mayor es la probabilidad de que McrBC corte entre los cebadores de PCR y, por tanto, será necesario un mayor número de ciclos de amplificación para conseguir la concentración idéntica del locus de PCR amplificado. Como alternativa, cuando se usa una mezcla de enzimas de restricción sensibles a metilación, cuanto mayor es el número de sitios de restricción metilados en el locus de interés en un fragmento de ADN dado dentro de la población estudiada, menor es la probabilidad de que la mezcla de enzimas sensibles a metilación corte entre los cebadores de PCR. Por tanto, será necesario un número menor de ciclos de amplificación para alcanzar la concentración del locus amplificado por PCR.
Para determinar si el locus de interés dentro de la primera población está metilado se realiza una comparación entre la cinética de los perfiles de reacción de la amplificación a partir de las poblaciones tratadas y no tratadas. Como alternativa, para determinar la densidad de metilación dentro del tejido en el locus de interés, la cinética de los perfiles de la reacción de amplificación se compara con la obtenida a partir de un conjunto de muestras de metilación generadas, es decir una curva de metilación estándar.
Ejemplo básico 6: Medición de la densidad de metilación en un locus de interés dentro de un tejido con análisis de punto final por amplificación
Se obtiene el ADN de una única fuente y se divide en dos series de dos o más porciones.
Esta serie se expone a una cantidad creciente de digestión parcial mediante una enzima de restricción dependiente de metilación, tal como McrBC. La primera porción de fragmentos de ADN no se trata, la segunda porción se digiere ligeramente con McrBC y las siguientes poblaciones se digieren más completamente (pero no totalmente) con McrBC. El intervalo de digestiones parciales se obtiene mediante la manipulación de las condiciones de reacción, tales como la titulación de las cantidades de enzima, los tiempos de digestión, las temperaturas, los reactantes, los tampones u otros componentes requeridos.
A continuación, se amplifica el ADN de la serie de porciones y se mide la cantidad del loci amplificados por PCR tras un número fijo de ciclos. Cuanto mayor es el número de medios sitios metilados en el locus de interés en un fragmento de ADN dado dentro de la porción tratada con McrBC, mayor es la probabilidad de que McrBC corte los fragmentos de la primera parte entre los cebadores de PCR y mayor es el número necesario de ciclos de amplificación para detectar cierta concentración del locus amplificado por PCR en la primera porción.
Para determinar si el locus de interés dentro de la población de ensayo está más o menos metilado, se comparan los resultados obtenidos de la serie de porciones y del análisis paralelo del conjunto de muestras estándar (véase el ejemplo 3).
Ejemplo básico 7: Cuantificación de la metilación usando parejas de isoesquizómeros de sensibilización a metilación y PCR cuantitativa
El ADN se recoge de dos fuentes: una población de ensayo (enferma) y una población control (normal). Cada población se divide en grupos de dos o más porciones. Cada grupo se expone a una cantidad creciente de digestión parcial mediante una enzima de restricción sensible a metilación (p. ej., Hpall, Mbol (A)). La primera porción de fragmentos de ADN no se trata, la segunda porción se digiere ligeramente con la enzima de restricción sensible a metilación y las siguientes poblaciones se digieren más completamente (pero no totalmente) con la enzima. El intervalo de digestiones parciales se obtiene mediante la manipulación de las condiciones de reacción, tales como la titulación de las cantidades de enzima, los tiempos de digestión, las temperaturas, los reactantes, los tampones u otros componentes requeridos.
El segundo grupo de porciones se digiere de forma similar con una pareja de isoesquizómeros de una clase de sensibilización a metilación diferente de la enzima usada para tratar el primer grupo de porciones (p. ej., Mspl y Sau3AI (A), respectivamente). Como alternativa, el segundo grupo de porciones permanece sin tratar.
A continuación, se amplifican todas las porciones de los grupos y se obtiene el perfil de reacción cinético de cada amplificación. Como alternativa, se usa el análisis de punto final tras un número fijo de ciclos.
Para determinar si el locus de interés dentro de la población de ensayo está más o menos metilado se realiza una comparación entre los perfiles de reacción cinética entre los grupos (grupo frente a grupo). Adicionalmente, para determinar si el locus de interés entre los dos tejidos está más o menos metilado se realiza una comparación entre los perfiles de reacción cinética entre las poblaciones (grupos enfermos frente a grupos normales).
Ejemplo básico 8: Cuantificación de la densidad de metilación de un locus de interés usando una mezcla de enzimas sensibles a metilación
Se obtiene el ADN de una única fuente y se divide en dos grupos de dos o más porciones. Como alternativa, el ADN se recoge de dos fuentes: Una población de ensayo (enfermos) y una población control (normal) y se divide en grupos de dos o más porciones uniformes.
Los grupos de porciones uniformes se tratan con un número fijo de unidades de una mezcla de una o más enzimas de restricción sensibles a metilación (p. ej., Hpall, Hhal o Acil) para varias cantidades de tiempo.
A continuación, se amplifican todas las porciones de los grupos y se obtiene el perfil de reacción cinético de cada amplificación. Como alternativa, se usa el análisis de punto final tras un número fijo de ciclos.
Para determinar si el locus de interés dentro de la población de ensayo está más o menos metilado se realiza una comparación entre los perfiles de reacción cinética entre los grupos (grupo frente a grupo). Adicionalmente, para determinar si el locus de interés entre los dos tejidos está más o menos metilado se realiza una comparación entre los perfiles de reacción cinética entre las poblaciones (grupos enfermos frente a grupos normales). Por último, se puede determinar la cantidad global de metilación comparando estos resultados con los obtenidos del conjunto de muestras estándar (véase el Ejemplo 3).
Ejemplo básico 9: Cuantificación De la densidad de metilación de una población pequeña de alelos metilados en presencia de una población grande de alelos no metilados
Se obtiene el ADN de una única fuente y se divide en dos porciones. Como alternativa, el ADN se recoge de dos fuentes: una población de ensayo (enfermos) y una población control (normal) y cada población se divide en dos porciones.
Para discriminar entre alelos metilados y no metilados, una porción de cada población se trata con bisulfito sódico, que convierte los residuos de citosina no metilada en uracilo, dejando los residuos de citosina metilada sin convertir. La porción tratada con bisulfito se divide en dos subporciones iguales. Como alternativa, una porción de cada población se digiere con una mezcla de una o más enzimas de restricción sensibles a metilación (p. ej., Hpall, Hhal,
o Acil, etc.), mientras que la segunda porción no se trata. La porción digerida se divide de forma similar en dos subporciones iguales.
Una de las subporciones tratada con bisulfito se digiere completamente con la enzima McrBC, mientras que la subporción restante no se trata. Como alternativa, una de las subporciones tratada con la enzima de restricción sensible a metilación se digiere completamente con la enzima McrBC, mientras que la subporción restante no se trata.
Uno o ambos cebadores de amplificación están diseñados para simular la secuencia convertida con bisulfito que solapa al menos un residuo de citosina metilada. De este modo, solo los fragmentos que pertenecen a la subpoblación de fragmentos que estaban metilados en el cebador de la población de ensayo tienen el potencial de poder amplificarse, mientras que los fragmentos en la subpoblación de fragmentos que permanecen sin mutilar en el locus de interés no se amplificarán. Como alternativa, si se usan enzimas sensibles a metilación para discriminar entre alelos metilados y no metilados, se usan los cebadores diseñaos para la secuencia nativa y solo los alelos metilados en los sitios de reconocimiento permanecen intactos y se amplificarán.
A continuación, se amplifica el ADN de las porciones tratadas con McrBC y no tratadas con McrBC, junto con los controles relevantes y la cantidad de loci amplificados por PCR se mide como una función del número de ciclos.
Para determinar si el locus de interés dentro de la primera población está metilado se realiza una comparación entre la cinética de los perfiles de reacción de la amplificación a partir de las poblaciones tratadas y no tratadas. Para determinar la densidad de metilación dentro del tejido en el locus de interés, la cinética de los perfiles de la reacción de amplificación se compara con la obtenida a partir de un conjunto de muestras de metilación generadas, es decir una curva de metilación estándar.
Como alternativa, este Ejemplo también se podría realizar invirtiendo el orden de la conversión con bisulfito sódico y las etapas de digestión con McrBC descritas con anterioridad (es decir, la digestión con McrBC tiene lugar antes de la conversión con bisulfito sódico).
En otra alternativa, la digestión parcial usando McrBC se usa en una subporción o en una serie de subporciones, en lugar de la digestión completa.
Ejemplo básico 10: Detección de la densidad de metilación
Este ejemplo demuestra la determinación de la densidad media de metilación (es decir, el número medio de nucleótidos metilados) dentro de un locus. Como se indica en la Figura 7, es probable que en muchas enfermedades la metilación de uno o más loci pase por una progresión de mayor densidad de metilación correspondiente a la progresión de la enfermedad. Las técnicas de detección de metilación descritas anteriormente implican detectar la presencia o ausencia de metilación en uno o más nucleótidos concretos, pero no proporcionan análisis de la densidad en un locus. Por el contrario, la presente invención proporciona procedimientos para detectar el número medio de acontecimientos de metilación en un locus.
Como se ilustra en las Figuras 12-13, los procedimientos que detectan la metilación en sólo secuencias cortas específicas (normalmente usando hibridación con cebador o sonda) pueden perderse cambios en la metilación (véase la Figura 12) que los presentes procedimientos de detección de densidad de metilación (que analizan la metilación relativa en todo el locus) pueden detectar (véase la Figura 13).
Este descubrimiento funciona tratando un locus con una enzima de restricción dependiente de metilación o sensible a metilación en condiciones tales que al menos algunas copias de potenciales sitios de escisión por enzimas de restricción en el locus permanezcan sin escindir. Aunque estas condiciones se pueden alcanzar permitiendo la digestión parcial de una muestra, el reconocimiento concreto y la actividad de corte de McrBC permite opciones adicionales.
Como se ha tratado anteriormente, cuando se encuentran dos complejos de McrBC se produce restricción, normalmente en 32 pb de ambos medios sitios (es decir, en una de cuatro regiones). Véase la Figura 8. La restricción no se produce en los medios sitios que están más cerca que 20 pb.
Dado que McrBC corta aleatorianente en 5’ o en 3’ del par de medios sitios reconocidos, la probabilidad de cortar en un locus (abarcado por los cebadores en la PCR) es función del número de medios sitios metilados presentes en o cerca del locus. Para una concentración fija de enzima y tiempo de incubación, cuando más sitios de metilación hay en un locus, mayor será la probabilidad de que McrBC corte en el locus (o entre los cebadores en el caso de PCR). No obstante, en circunstancias ideales y con un número suficiente de copias de ADN, la probabilidad de que McrBC corte cada copia de un locus es baja porque, en ocasiones, cortará a una distancia fuera del locus, de modo que deja el locus intacto. Por tanto, el número de loci intactos es inversamente proporcional al número medio de nucleótidos metilados dentro del locus. El número de loci intactos es inversamente proporcional al valor de Ct para la muestra. Por tanto, el valor de Ct es proporcional al número medio de nucleótidos metilados dentro de un locus. Por tanto, la comparación del valor de Ct de ADN tratado con McrBC amplificado comparado con el valor de Ct de ADN no tratado amplificado permite la determinación de la densidad de metilación del locus.
Dos alícuotas de ADN de BAC que contiene el locus p16 se metilaron in vitro a densidades diferentes. La primera alícuota se metiló densamente con M.sssI. Hay 20 sitios para la metilasa M.sssI dentro del amplicón de PCR, 11 de los cuales son también medios sitios para McrBC. La primera alícuota se metiló densamente con M.HhaI. Hay cuatro sitios para la metilasa M.HhaI dentro del amplicón de PCR, todos ellos son también medios sitios para McrBC. Dentro del amplicón para PCR hay también 4 sitios de restricción para HhaI. Todos estos cuatro sitios de restricción HhaI son sitios de metilasa para Msssl and M.Hhal, de forma que el tratamiento completo con cualquier metilasa protegerá a los cuatro sitios HhaI de la restricción. Se usó un número diferente de unidades de McrBC durante un periodo de tiempo establecido (cuatro horas) para generar una serie de digestiones progresivamente más parciales para identificar una cantidad de enzima para permitir distinguir mejor los resultados de ADN metilado escasamente y densamente. Como se muestra en las Figuras 9 y 10, los valores de Ct fueron proporcionales a la concentración de McrBC usada en las secuencias metiladas tanto escasamente como densamente. La Figura 11 demuestra resultados de la titulación de diferentes cantidades de McrBC para potenciar la resolución entre secuencias metiladas escasamente y densamente, para distinguir entre las dos. En la Figura 11, “1 x" equivale a 0,8 unidades de McrBC.
La diana metilada densamente tienen 2,75 veces más medios sitios para McrBC metilados que la diana escasamente metilada (11/4= 2,75). Por tanto, tras tratamiento con McrBC y la posterior amplificación, los inventores esperan ver una diferencia entre el Ct de las reacciones de aproximadamente 1,46, porque 2LCt=2,75. Los inventores han observado que LCt (escaso -denso a 1x McrBC) era de 1,51 ± 0,05. Por tanto, la densidad de metilación de un locus se determinó usando este procedimiento.
Ejemplo 11: Determinación de la densidad de metilación
Este ejemplo demuestra la capacidad de las enzimas de restricción dependientes de metilación y sensibles a metilación para distinguir diferentes densidades de metilación en un locus.
Se amplificó una porción de 703 pb del promotor de p16. La porción se metiló in Vitro en un curso de tiempo con MSssl en condiciones que estimulan la metilación estocástica. La porción se ilustra en la Figura 14. A partir de la reacción grande de metilación a diferentes puntos de tiempo se retiraron volúmenes fijos (20 !l) y las reacciones de metilación se pararon con calor (65 ºC). Los inventores detuvieron una reacción antes de que empezara (T= 1 es o minutos de metilación, es decir el control no mutilad); T= 2 se detuvo a los 2 minutos; T= 4 se detuvo a los 5 minutos; y T= 4 se detuvo a los 60 minutos, tiempo en el cual se debería haber metilado completamente el producto de la PCR en la reacción.
Las reacciones se purificaron y cada amplicón se diluyó después más de 1 millón de veces en tampón TE y se volvió a añadir al genoma humano a una proporción que debería aproximarse a un equilibrio de copias normal (es decir, dos copias por 7,9 picogramos). El genoma humano usado fue homocigoto para una deleción del gen p16. La línea celular de deleción es CRL-2610. Esto nos permitió añadir una cantidad fija al genoma humano (es decir, control de la complejidad del genoma en la reacción de los inventores).
Las muestras de ADN se escindieron con AciI (una enzima de restricción sensible a metilación), McrBC (una enzima de restricción dependiente de metilación) o con ambas como digestión doble, y se amplificó la porción. Los amplicones se detectaron con el sistema de PCR en tiempo real con MS_p16(207) SYBR verde. Veinte nanogramos del ADN entrante (genoma + amplicón) equivalen a 2764 equivalentes celulares/por reacción de PCR. Cada conjunto de cuatro digestos se llevó a un volumen en sales de restricción con BSA y GTP de modo que se pudieran dividir en cuatro tubos ( 4 !g). Cada uno de los cuatro tubos de digestión ( 1 !g) tenía un volumen total de 100 !l de modo que se pudieran añadir 2 !l a las reacciones de PCR, añadiendo de ese modo 20 ng de ADN. Se permitió que progresaran las digestiones durante cuatro horas y se detuvieron con calor durante 20 minutos. Condiciones de la PCR:
El cebador directo fue CAGGGCGTCGCCAGGAGGAGGTCTGTGATI (SEC ID Nº 4) El cebador inverso fue GGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTIACGG (SEC ID Nº 5) Tampón Dynamo MJ qPCR, hibridación a 65 ºC, dos ciclos de PCR (95 ºC, 65 ºC, 20 s), 49 ciclos y se monitorizó
con un sistema de PCR cuantitativa MJ opticon II.
Los inventores postularon la hipótesis de que si la tecnología monitoriza la densidad:
a) La escisión de McrBC deberá demostrar un LCt mayor para cada muestra en una progresión de 0 LCt para T=1, hasta un LCt máximo a T=4 (60 minutos) b) Las reacciones con Aci I deberían demostrar la relación contraria. c) Los digestos dobles y tratados de forma simulada deberían ser puntos de referencia fijos.
Como se ilustra en l Figura 15, los inventores observaron las tendencias indicadas anteriormente. La curva de McrBC se mueve al contrario que la curva de AciI y el movimiento es proporcional con el contenido de metilación creciente en el locus. Los digestos dobles y no tratados indican los límites del campo de ensayo. El sistema resuelve la diferencia entre cada una de las reacciones a lo largo del curso del tiempo, de modo que cada representación gráfica que muestra las diversas reacciones de tiempo controlado es diferente. El punto en el cual el perfil cruza con la línea discontinua del umbral indica el punto en el que se compara la información.
Otro modo de visualizar los datos es representando el cambio en los valores umbral del ciclo (LCt). Véase la Figura
16. La Figura 16 muestra el valor de LCt para los tratados con McrBC en comparación con los no tratados en cada punto de tiempo en la reacción de metilación parcial y el correspondiente valor de LCt para los digestos de Aci I (Aci I comparado con los no tratados). Como está previsto, las líneas de LCt de McrBC y Aci I proporcionan un patrón inverso de intersección. El gráfico Aci I muestra una forma maciza porque sus lados cortados son fijos, mientras que McrBC muestra una distribución continua lisa, que refleja su capacidad para cortar más o menos aleatoriamente tras el reconocimiento del sitio. La frecuencia de corte es proporcionar al cambio previsto en la ocupación de la metilación en base al curso del tiempo. Se indican las barras de error asociadas con las mediciones en tiempo real. Si no se visualizan, están dentro del punto de datos.
Ejemplo 12: Monitorización de la metilación del ADN de una secuencia diana presente en múltiples localizaciones en el genoma
Este ejemplo demuestra la capacidad de la presente tecnología para determinar la metilación de una secuencia diana que está presente en un genoma más de una vez (es decir, más de una copia) usando un ensayo que monitoriza una secuencia repetida en el clúster del gen de kafirina en Sorgum bicolor.
A partir de la secuencia disponible públicamente de un clon de BAC AF527808 de Sorghum bicolor se indicaron once genes de kafirina. Los cebadores para PCR se diseñaron para amplificar un amplicón de 247 pb de los 11 genes de kafirina (las secuencias del cebador estaban conservadas en las 11).
El cebador directo fue 5' CTCCTIGCGCTCCTIGCTCTTIC 3' (SEC ID Nº 6) El cebador inverso fue 5' GCTGCGCTGCGATGGTCTGT 3' (SEC ID Nº 7)
El ADN genómico del sorgo aislado de la hoja de la plántula se dividió en 6 porciones iguales. Las seis porciones se trataron del siguiente modo: i) sin tratar (tratadas simuladamente), ii) digeridas con HhaI, iii) digeridas con McrBC, iv) digeridas con HhaI y McrBC, v) digeridas con PstI y vi) digeridas con PstI y McrBC. Alícuotas de igual volumen de las seis porciones se amplificaron usando los cebadores para PCR anteriores del siguiente modo: Los parámetros de ciclado de PCR en tiempo real SYBR verde fueron 95 ºC durante 3 minutos, seguido de 50 ciclos de 2 etapas de de PCR a 95 ºC durante 30 s, 56 ºC durante 30 s con el Dynamo Kit de MJ Research (Boston, MA). Los inventores usaron una temperatura baja (70 ºC) y una lectura de placas a temperatura alta (82 ºC). La entrada de ADN genómico fue 10 ng por reacción de PCR. El umbral se fijó usando un control estándar de dilución patrón.
Los perfiles cinéticos para las 6 reacciones de PCR se representan en la Figura 18. El inserto en la Figura 18 representa la curva estándar de dilución patrón usada para fijar el umbral del ciclo para el experimento. Cada conjunto de 6 digestiones se realizó tres veces y cada una de las 18 digestiones tenía cuatro duplicados de PCR. Se determinó que las reacciones de PCR eran altamente reproducibles. En la Figura 18, la cinética de la reacción de amplificación por PCR para cada una de las seis digestiones se representa con diferentes colores: Rojo= tratadas simuladamente, Azul= digeridas con McrBC, Naranja= digeridas con HhaI y Verde= digestión doble con HhaI + McrBC, Rosa= PstI y Azure= digestión doble Pstl + McrBC. Se realizaron comparaciones entre los umbrales del ciclo de las seis digestiones amplificadas y se determinó la densidad de metilación de CNG y CG en la secuencia diana repetida.
En los 11 genes de kafirina, todos los sitios de PstI en la secuencia diana repetida estaban metilados (en CNG) y la digestión con Pstl se bloqueó dado que la muestra tratada con Pstl (rosa) tiene el miembro umbral del ciclo (Ct) que la muestra tratada de forma simulada (rojo). Este resultado está avalado por la muestra digerida con McrBC (azul), que tiene un CT significativamente mayor que el ADN control digerido de forma simulada (rojo), que además demuestra que la metilación en CNG existe porque McrBC pudo cortar, de modo que se redujo el número de copias intactas de la secuencia diana. Todos, o casi todos, los sitios de PstI están metilados por la doble digestión con PstI
+ McrBC (azul claro) tiene el mismo Ct que McrBC solo (azul). Obsérvese que la digestión con McrBC con y sin PstI da el mismo Ct, mientras que HhaI con McrBC (verde) da un Ct mayor de media; lo que sugiere que no todos los sitios HhaI estaban metilados y que HhaI podía reducir el número de copias intactas de la secuencia diana. Estos resultados indican que cada secuencia diana tiene una metilación en CNG alta que cubre todos los sitios PstI, mientras que algunos, pero no todos, los sitios HhaI están metilados, lo que indica metilación parcial en CG de los sitios HhaI en la secuencia diana. La especificidad de cada reacción se confirmó usando análisis de la curva de fusión.
Para los genes de kafirina, la diferencia media en Ct entre las digestiones sencilla con McrBC y doble con HhaI + McrBC es 2,46 ciclos (22,08 ± 0,34 HhaI + McrBC – 19,62 ± 0,19 McrBC).Los inventores compararon los umbrales del ciclo del ADN genómico que se habían sometido a varios tratamientos y dedujeron la ocupación de metilación a través de los cambios en el Ct mediados por los tratamientos. El Ct de cualquier locus es una función del número de copias presente dentro del tubo de ensayo. Cada uno de los once genes se rompió en piezas de 1,5 kb que se alinearon para crear un conjunto de kafirina consenso (Figura 17). La secuencia consenso de kafirina se analizó y se seleccionaron los cebadores de PCR que amplifican un amplicón de 247 pb (véase anteriormente).
En lo que respecta a la metilación en CG, la muestra digerida con HhaI (naranja) tiene el mismo Ct que el control tratado simuladamente (rojo); no obstante, la digestión doble con HhaI + McrBC (verde) tiene un Ct que es 2,46 veces mayor que el tratado con McrBC solo (azul), lo que indica que algunos sitios de HhaI no deben modificarse. Una diferencia en el umbral de ciclo de 2,46 indica que hay 22,46, o aproximadamente 5,5, veces menos ADN en la muestra sometida a doble digestión con Hhal+McrBC. Esto sugiere que 2 de 11 genes de kafirina tienen algunos sitios Hhal no metilados.
Para confirmar de forma independiente la presencia de metilación en la secuencia diana repetida se generó 1x secuencia de disparo del genoma del sorgo filtrado por metilo (véase la publicación de patente de EE.UU. nº 20010046669), Bedell y coI., PLOS en prensa). El 95 % de los genes en el genoma del sorgo se determinó que estaba representado en el conjunto de secuencia filtrada por metilo. No obstante, en el clúster del gen de kafirina, sólo 2 de 11 genes del clon BAC AF527808 estaban representados en el conjunto de secuencia filtrada por metilo, lo que sugiere que la mayoría de ellos puede estar metilada y, por tanto, están subrepresentados en la secuencia filtrada por metilo. Diez de los genes están distribuidos en tándem en un clúster y comparten una media de 99,1 % de identidad de secuencia, aunque el gen número once se localiza a 45 kb y está más divergente (76,2 % de identidad de media). Se seleccionó una región de 247 pb para la PCR cerca del extremo 5’ por su cercana identidad en los 11 genes y por el elevado contenido en CG y CNG (véase la Figura 17). La confirmación independiente de la metilación en la secuencia diana coincidió con la determinación de la metilación realizada mediante análisis de la cinética de reacción del ADN digerido amplificado.
Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar la invención, pero no limitan su alcance. Otras variantes de la invención serán evidentes para un experto en la técnica y están abarcadas dentro de las reivindicaciones adjuntas. Los ejemplos de fondo no describen procedimientos que cumplen todos los requisitos de la invención reivindicada.

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de detectar la presencia de metilación en un locus dentro de una población de ácidos nucleicos, comprendiendo el procedimiento:
    (a)
    dividir la población de ácidos nucleicos en al menos cuatro porciones;
    (b)
    poniendo en contacto la primera porción con una enzima de restricción sensible a la metilación para obtener una población que comprende copias no metiladas fragmentadas del locus y copias metiladas intactas del locus:
    (c)
    amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la primera porción;
    (d)
    poner en contacto una segunda porción con una enzima de restricción dependiente de metilación para obtener una población que comprende copias metiladas fragmentadas del locus y copias no metiladas intactas del locus;
    (e)
    amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la segunda porción;
    (f)
    determinar la presencia de metilación en el locus comparando el número de copias intactas del locus en la primera porción y una serie de copias intactas del locus en la segunda porción;
    (g)
    amplificar cuantitativamente una tercera porción de los ácidos nucleicos, amplificando de este modo las copias intactas totales del locus en la población; y
    (k)
    comparar el número de copias intactas totales del locus con el número de copias intactas del locus en la primera porción y/o de copias intactas del locus en la segunda porción;
    (i)
    poner en contacto una cuarta porción de los ácidos nucleicos con una enzima de restricción dependiente de metilación y una enzima de restricción sensible a la metilación;
    (j)
    amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la cuarta porción; y
    (k)
    determinar la presencia de metilación en el locus comparando el número de copias intactas del locus en la cuarta porción con el número de copias intactas totales del locus en la tercera porción y/o copias intactas del locus en la primera porción y/o copias intactas del locus en la segunda porción.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende:
    poner en contacto una quinta porción de los ácidos nucleicos con una enzima de restricción insensible a la
    metilación; amplificar cuantitativamente las copias intactas del locus en la quinta porción para obtener una población de ácidos nucleicos que comprende una mutación en el locus; y
    determinar la presencia de una mutación en el locus comparando el número de copias intactas del locus en la quinta porción con el número de copias intactas totales del locus en la cuarta porción y/o las copias intactas del locus en la tercera porción y/o copias intactas del locus en la primera porción y/o las copias intactas del locus en la segunda porción.
  3. 3.
    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha amplificación cuantitativa es PCR cuantitativa o amplificación lineal cuantitativa.
  4. 4.
    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha amplificación cuantitativa comprende monitorizar el número de copias del locus durante la amplificación.
  5. 5.
    El procedimiento de la reivindicación 4 en el que el número de copias se monitoriza en tiempo real.
  6. 6.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que
    los ácidos nucleico se ponen en contacto con un agente que modifica las citosinas no metiladas antes de la etapa de
    amplificación; y Las copias intactas del locus se amplifican con un par de cebadores oligonucleotídicos que comprenden al menos un dejador que distingue entre ADN metilado modificado y no metilado.
  7. 7.
    El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el agente es bisulfito sódico.
  8. 8.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la metilación está en la posición N4 de una citosina dentro del locus.
  9. 9.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la enzima de restricción sensible a metilación no corta cuando una citosina dentro de la secuencia de reconocimiento está metilada en la posición C5.
  10. 10.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la enzima de restricción dependiente de metilación es McrBC.
  11. 11.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la presencia de metilación en el locus se compara entre al menos dos muestras de ácido nucleico.
  12. 12.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la presencia de metilación en dos o más loci se determina
    5 mediante amplificación cuantitativa de las copias de ADN intacto en los dos loci diferentes de una primera porción en contacto con una enzima de restricción dependiente de metilación; mediante amplificación cuantitativa del ADN intacto como los dos loci de una segunda porción en contacto con una enzima de restricción sensible a metilación; y mediante comparación de las cantidades de los productos amplificados para los dos loci.
    10 13. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende añadir marcadores de secuencia a los extremos de una población de ácidos nucleicos antes de dividir la población de ácidos nucleicos en porciones iguales, en el que:
    la etapa (c) comprende amplificar cuantitativamente las copias metiladas intactas restantes del locus en la primera
    15 porción con cebadores que inician amplificación a partir de los marcadores de secuencia; y la etapa (e) comprende cuantificar las copias no metiladas intactas restantes del locus en la segunda porción con cebadores que inician la amplificación a partir de los marcadores de secuencia.
ES04796072T 2003-10-21 2004-10-21 Fragmentación enzimática diferencial Active ES2383970T3 (es)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51342603P 2003-10-21 2003-10-21
US513426P 2003-10-21
US56172104P 2004-04-12 2004-04-12
US56156304P 2004-04-12 2004-04-12
US561563P 2004-04-12
US561721P 2004-04-12
PCT/US2004/035012 WO2005042704A2 (en) 2003-10-21 2004-10-21 Differential enzymatic fragmentation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2383970T3 true ES2383970T3 (es) 2012-06-27

Family

ID=34527938

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES04796072T Active ES2383970T3 (es) 2003-10-21 2004-10-21 Fragmentación enzimática diferencial
ES04796212T Active ES2382780T3 (es) 2003-10-21 2004-10-21 Procedimientos para la determinación cuantitativa de la densidad de metilación en un locus de ADN

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES04796212T Active ES2382780T3 (es) 2003-10-21 2004-10-21 Procedimientos para la determinación cuantitativa de la densidad de metilación en un locus de ADN

Country Status (8)

Country Link
US (4) US7901880B2 (es)
EP (4) EP2292795B1 (es)
JP (2) JP4887154B2 (es)
AT (2) ATE553218T1 (es)
AU (2) AU2004286235B2 (es)
CA (2) CA2542526C (es)
ES (2) ES2383970T3 (es)
WO (2) WO2005040399A2 (es)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003298733B2 (en) * 2002-11-27 2009-06-18 Agena Bioscience, Inc. Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery
AU2004235331B2 (en) * 2003-04-25 2008-12-18 Sequenom, Inc. Fragmentation-based methods and systems for De Novo sequencing
WO2005024068A2 (en) 2003-09-05 2005-03-17 Sequenom, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
AU2004286235B2 (en) * 2003-10-21 2011-05-12 Orion Genomics Llc Differential enzymatic fragmentation
US7459274B2 (en) * 2004-03-02 2008-12-02 Orion Genomics Llc Differential enzymatic fragmentation by whole genome amplification
US7608394B2 (en) * 2004-03-26 2009-10-27 Sequenom, Inc. Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation
WO2005098050A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Sequenom, Inc. Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis
DE602004030430D1 (de) * 2004-06-23 2011-01-20 Epigenomics Ag Verfahren zur Quantifizierung von methylierter DNS
CN101072882A (zh) * 2004-09-10 2007-11-14 塞昆纳姆股份有限公司 用于核酸长程序列分析的方法
US7820385B2 (en) * 2006-03-22 2010-10-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Method for retaining methylation pattern in globally amplified DNA
US7754428B2 (en) * 2006-05-03 2010-07-13 The Chinese University Of Hong Kong Fetal methylation markers
WO2008008501A2 (en) * 2006-07-14 2008-01-17 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Reverse restriction fragment length polymorphism assay and uses thereof
TWI335354B (en) * 2006-09-27 2011-01-01 Univ Hong Kong Chinese Methods for the detection of the degree of the methylation of a target dna and kits
ATE535621T1 (de) * 2006-10-18 2011-12-15 Epigenomics Ag Molekül zur bereitstellung eines standards zur quantitativen analyse des methylierungsstatus einer nukleinsäure
JP2008136404A (ja) * 2006-11-30 2008-06-19 Sysmex Corp Ｄｎａメチル化検出における非メチル化シトシン変換処理後のｄｎａ量の確認方法
US8206927B2 (en) * 2007-01-23 2012-06-26 Sequenom, Inc. Method for accurate assessment of DNA quality after bisulfite treatment
WO2008129428A2 (en) * 2007-04-19 2008-10-30 Molecular Detection Inc. Methods, compositions and kits for detection and analysis of antibiotic-resistant bacteria
US20090181391A1 (en) * 2007-11-01 2009-07-16 Zymo Research Corporation Methods for analysis of dna methylation percentage
CA2717320A1 (en) * 2008-03-11 2009-09-17 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
US20090253121A1 (en) * 2008-04-04 2009-10-08 Micah Halpern Method for amt-rflp dna fingerprinting
CN102089444A (zh) 2008-05-14 2011-06-08 德玛泰克国际公司 利用核酸分析方法来诊断黑素瘤和太阳能雀斑
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
WO2010104737A1 (en) * 2009-03-09 2010-09-16 New England Biolabs, Inc. Engineering a novel methylation-specific restriction endonuclease
US9458503B2 (en) 2009-07-02 2016-10-04 Nucleix Methods for distinguishing between natural and artificial DNA samples
JP2013511991A (ja) * 2009-11-25 2013-04-11 クアンタライフ， インコーポレイテッド 遺伝子材料を検出する方法および組成物
US9752187B2 (en) 2009-12-11 2017-09-05 Nucleix Categorization of DNA samples
NO2510124T3 (es) * 2009-12-11 2017-12-23
WO2011101728A2 (en) 2010-02-19 2011-08-25 Nucleix Identification of source of dna samples
ES2577017T3 (es) 2009-12-22 2016-07-12 Sequenom, Inc. Procedimientos y kits para identificar la aneuploidia
GB201003036D0 (en) * 2010-02-23 2010-04-07 Fermentas Uab Restriction endonucleases and their applications
US20130065233A1 (en) 2010-03-03 2013-03-14 Zymo Research Corporation Detection of dna methylation
WO2011112845A2 (en) * 2010-03-11 2011-09-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions related to a multi-methylation assay to predict patient outcome
EP2561097A2 (en) * 2010-04-20 2013-02-27 Nucleix Methylation profiling of dna samples
US20130316339A1 (en) * 2010-09-01 2013-11-28 Orion Genomics Llc Detection of nucleic acid sequences adjacent to repeated sequences
EP2673380B1 (en) 2011-02-09 2018-12-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Analysis of nucleic acids
EP3378954B1 (en) 2011-04-29 2021-02-17 Sequenom, Inc. Quantification of a minority nucleic acid species
US11021703B2 (en) 2012-02-16 2021-06-01 Cornell University Methods and kit for characterizing the modified base status of a transcriptome
EP4155401A1 (en) 2012-03-02 2023-03-29 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CA2872867C (en) 2012-05-11 2020-09-15 Clinical Genomics Pty Ltd Diagnostic gene marker panel for colorectal cancer
WO2013170314A1 (en) 2012-05-18 2013-11-21 Clinical Genomics Pty. Ltd. A method of screening for colorectal cancer
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
CA2878979C (en) 2012-07-13 2021-09-14 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
WO2014071281A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 The Johns Hopkins University Dna methylation biomarkers of post-partum depression risk
EP2971100A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
WO2014160199A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 Cornell University Method for relative quantification of changes in dna methylation, using combined nuclease, ligation, and polymerase reactions
CA2918054C (en) 2013-07-11 2022-12-13 The Johns Hopkins University A dna methylation and genotype specific biomarker of suicide attempt and/or suicide ideation
EP3029148B1 (en) * 2013-07-30 2018-06-27 BGI Genomics Co., Limited Method for determining nucleic acid composition of nucleic acid mixture
US20160208334A1 (en) * 2013-09-30 2016-07-21 Us Biomarkers, Inc. Biomarkers for detection of colorectal cancer
US11365447B2 (en) 2014-03-13 2022-06-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CN106471008B (zh) 2014-05-02 2021-04-09 马来西亚棕榈油协会 棕榈Mantle表型检测
CN104268441B (zh) * 2014-09-23 2017-04-12 中国科学院海洋研究所 一种基于生物信息学获得双dna限制性内切酶组合的方法
WO2016057485A1 (en) 2014-10-06 2016-04-14 The Johns Hopkins University A dna methylation and genotype specific biomarker for predicting post-traumatic stress disorder
AU2015336938B2 (en) * 2014-10-20 2022-01-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genome methylation analysis
US9984201B2 (en) 2015-01-18 2018-05-29 Youhealth Biotech, Limited Method and system for determining cancer status
EP3262191B2 (en) 2015-02-24 2023-06-14 Zymo Research Corporation Assays to determine dna methylation and dna methylation markers of cancer
US9476100B1 (en) 2015-07-06 2016-10-25 Nucleix Ltd. Methods for diagnosing bladder cancer
US10913986B2 (en) 2016-02-01 2021-02-09 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Method of identifying important methylome features and use thereof
US10202650B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Youhealth Biotech, Limited Methods for monitoring ELOVL2, KLF14 and PENK gene expression following treatment with vitamin C
CN107847515B (zh) 2016-07-06 2021-01-29 优美佳生物技术有限公司 实体瘤甲基化标志物及其用途
EP3481941A4 (en) 2016-07-06 2020-04-15 Youhealth Biotech, Limited BREAST AND OVARY CANCER METHYLATION MARKERS AND USES THEREOF
US10093986B2 (en) 2016-07-06 2018-10-09 Youhealth Biotech, Limited Leukemia methylation markers and uses thereof
CN106701939A (zh) * 2016-12-22 2017-05-24 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种胞嘧啶甲基化挖掘的方法
BR112019018272A2 (pt) 2017-03-02 2020-07-28 Youhealth Oncotech, Limited marcadores metilação para diagnosticar hepatocelular carcinoma e câncer
CA3060553A1 (en) * 2017-04-19 2018-10-25 Singlera Genomics, Inc. Compositions and methods for detection of genomic variance and dna methylation status
KR102601593B1 (ko) 2017-04-19 2023-11-13 싱글레라 제노믹스, 인코포레이티드 라이브러리 제작 및 서열 분석을 위한 조성물 및 방법
WO2018237327A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Triact Therapeutics, Inc. METHODS OF TREATING GLIOBLASTOMA
WO2019067991A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Triact Therapeutics, Inc. INIPARIB FORMULATIONS AND USES THEREOF
EP3752645A4 (en) 2018-02-14 2022-04-13 Dermtech, Inc. NEW GENE CLASSIFIERS AND THEIR USES IN NON-MELANOMA SKIN CANCERS
US11702653B2 (en) 2018-05-21 2023-07-18 Battelle Memorial Institute Control compositions and methods for sequencing
US20200131566A1 (en) * 2018-10-31 2020-04-30 Guardant Health, Inc. Methods, compositions and systems for calibrating epigenetic partitioning assays
IL265451B (en) * 2019-03-18 2020-01-30 Frumkin Dan Methods and systems for the detection of methylation changes in DNA samples
US11578373B2 (en) 2019-03-26 2023-02-14 Dermtech, Inc. Gene classifiers and uses thereof in skin cancers
EP4010473A4 (en) * 2019-08-09 2023-07-12 Battelle Memorial Institute COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING METHYLATED DNA
US11427874B1 (en) 2019-08-26 2022-08-30 Epi One Inc. Methods and systems for detection of prostate cancer by DNA methylation analysis
KR20220096382A (ko) * 2020-12-31 2022-07-07 주식회사 시선바이오머티리얼스 비메틸화 특이적 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법 및 검출 키트
CN113981046A (zh) * 2021-11-05 2022-01-28 朱运峰 一种基于定量pcr技术dna甲基化检测方法及其试剂盒
WO2023175434A1 (en) * 2022-03-15 2023-09-21 Diagenode S.A. Detection of methylation status of a dna sample
WO2024044578A1 (en) 2022-08-22 2024-02-29 University Of Virginia Dna methylation biomarkers of premenstrual dysphoric disorder and perimenopausal depression
WO2024059649A1 (en) 2022-09-13 2024-03-21 The Saban Research Institute; Children's Hospital Los Angeles Dna methylation signature of retinoblastoma

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4517288A (en) 1981-01-23 1985-05-14 American Hospital Supply Corp. Solid phase system for ligand assay
US4732847A (en) 1981-06-09 1988-03-22 University Of Hawaii Monoclonal antibodies for DNA-RNA hybrid complexes and their uses
ZA853756B (en) 1984-06-01 1986-01-29 Miles Lab Nucleic acid hybridization assay employing immobilized rna probes
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
CA1291031C (en) 1985-12-23 1991-10-22 Nikolaas C.J. De Jaeger Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances
DE3803275A1 (de) 1988-02-04 1989-08-17 Dornier Medizintechnik Piezoelektrische stosswellenquelle
US5118801A (en) 1988-09-30 1992-06-02 The Public Health Research Institute Nucleic acid process containing improved molecular switch
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US6033854A (en) 1991-12-16 2000-03-07 Biotronics Corporation Quantitative PCR using blocking oligonucleotides
US5405760A (en) 1992-04-30 1995-04-11 New England Biolabs, Inc. Process for producing recombinant McrBC endonuclease and cleavage of methylated DNA
WO1995006137A1 (en) 1993-08-27 1995-03-02 Australian Red Cross Society Detection of genes
US5552277A (en) 1994-07-19 1996-09-03 The Johns Hopkins University School Of Medicine Genetic diagnosis of prostate cancer
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US5871917A (en) 1996-05-31 1999-02-16 North Shore University Hospital Research Corp. Identification of differentially methylated and mutated nucleic acids
US6017704A (en) 1996-06-03 2000-01-25 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids
US5786146A (en) 1996-06-03 1998-07-28 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids
US6117635A (en) 1996-07-16 2000-09-12 Intergen Company Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
US5912147A (en) 1996-10-22 1999-06-15 Health Research, Inc. Rapid means of quantitating genomic instability
US6686151B1 (en) 1998-02-06 2004-02-03 Digene Corporation Immunological detection of RNA:DNA hybrids on microarrays
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US7700324B1 (en) 1998-11-03 2010-04-20 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methylated CpG island amplification (MCA)
AU2965500A (en) * 1999-01-15 2000-08-01 Gene Logic, Inc. Immobilized nucleic acid hybridization reagent and method
GB9901072D0 (en) 1999-01-19 1999-03-10 Imp Cancer Res Tech Methods for detecting changes to a macromolecular component of a cell
US6605432B1 (en) 1999-02-05 2003-08-12 Curators Of The University Of Missouri High-throughput methods for detecting DNA methylation
US20010046669A1 (en) 1999-02-24 2001-11-29 Mccobmie William R. Genetically filtered shotgun sequencing of complex eukaryotic genomes
US6331393B1 (en) 1999-05-14 2001-12-18 University Of Southern California Process for high-throughput DNA methylation analysis
US6180349B1 (en) 1999-05-18 2001-01-30 The Regents Of The University Of California Quantitative PCR method to enumerate DNA copy number
US6403319B1 (en) * 1999-08-13 2002-06-11 Yale University Analysis of sequence tags with hairpin primers
WO2001068807A2 (en) 2000-03-16 2001-09-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center Identification of in vivo dna binding loci of chromatin proteins using a tethered nucleotide modification enzyme
WO2001075172A1 (en) 2000-03-31 2001-10-11 University Of Southern California Epigenetic sequences for esophageal adenocarcinoma
EP1276865B1 (en) * 2000-04-28 2014-05-21 Sangamo BioSciences, Inc. Methods for binding an exogenous molecule to cellular chromatin
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
CA2412609C (en) 2000-06-23 2010-09-07 The University Of Chicago Methods for isolating centromere dna
US7300751B2 (en) 2000-06-30 2007-11-27 Syngenta Participations Ag Method for identification of genetic markers
US6498013B1 (en) 2000-07-28 2002-12-24 The Johns Hopkins University Serial analysis of transcript expression using MmeI and long tags
ATE347619T1 (de) 2000-08-25 2006-12-15 Lovelace Respiratory Res Inst VERFAHREN ZUR KREBSDETEKTION MITTELS VERSCHACHTELTER (ßNESTEDß) METHYLIERUNGSSPEZIFISCHER PCR
KR100870486B1 (ko) 2000-09-01 2008-12-11 에피제노믹스 아게 게놈 디엔에이 시료의 서열 콘택스트 5'-씨피쥐-3'에서 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법
AU2002233988A1 (en) 2000-11-08 2002-05-21 University Of Southern California Assay for the detection and quantitation of hemimethylation
US6756200B2 (en) 2001-01-26 2004-06-29 The Johns Hopkins University School Of Medicine Aberrantly methylated genes as markers of breast malignancy
US6777187B2 (en) 2001-05-02 2004-08-17 Rubicon Genomics, Inc. Genome walking by selective amplification of nick-translate DNA library and amplification from complex mixtures of templates
DE10128508A1 (de) 2001-06-14 2003-02-06 Epigenomics Ag Verfahren und Nukleinsäuren für die Differenzierung von Prostata-Tumoren
US20040197791A1 (en) 2001-06-29 2004-10-07 Makarov Vladimir L. Methods of using nick translate libraries for snp analysis
WO2003023065A1 (en) 2001-09-06 2003-03-20 Syngenta Participations Ag Dna methylation patterns
WO2003025215A1 (en) 2001-09-14 2003-03-27 The University Of Queensland Detection of dna methylation
AU2002341891A1 (en) 2001-09-26 2003-04-07 Epigenx Pharmaceuticals, Inc. Assays for dna methylation changes
US20030099997A1 (en) 2001-10-24 2003-05-29 Bestor Timothy H. Method for gene identification based on differential DNA methylation
DE10154318A1 (de) 2001-10-26 2003-05-15 Epigenomics Ag Verfahren zur Analyse genomischer Methylierungsmuster
AU2002359436A1 (en) 2001-11-13 2003-06-23 Rubicon Genomics Inc. Dna amplification and sequencing using dna molecules generated by random fragmentation
US6960436B2 (en) 2002-02-06 2005-11-01 Epigenomics Ag Quantitative methylation detection in DNA samples
US20040038254A1 (en) 2002-03-08 2004-02-26 Risa Peoples Compositions and methods for detecting nucleic acid methylation
US20030175828A1 (en) 2002-03-15 2003-09-18 Lazar James G. Signal amplification by Hybrid Capture
EP1487999B1 (en) 2002-03-15 2006-12-27 Epigenomics AG Discovery and diagnostic methods using 5-methylcytosine dna glycosylase
JP4384603B2 (ja) * 2002-06-26 2009-12-16 コールド スプリング ハーバー ラボラトリー メチル化プロファイルを測定するための方法および組成物
WO2004031402A2 (en) 2002-10-02 2004-04-15 Northwestern University Methylation profile of cancer
US20040209299A1 (en) 2003-03-07 2004-10-21 Rubicon Genomics, Inc. In vitro DNA immortalization and whole genome amplification using libraries generated from randomly fragmented DNA
AU2004286235B2 (en) 2003-10-21 2011-05-12 Orion Genomics Llc Differential enzymatic fragmentation
US7459274B2 (en) 2004-03-02 2008-12-02 Orion Genomics Llc Differential enzymatic fragmentation by whole genome amplification

Also Published As

Publication number Publication date
US20050158739A1 (en) 2005-07-21
EP1689887A2 (en) 2006-08-16
WO2005040399A3 (en) 2005-07-21
WO2005040399A2 (en) 2005-05-06
ATE550438T1 (de) 2012-04-15
CA2542542C (en) 2015-09-15
US20100240064A1 (en) 2010-09-23
CA2542542A1 (en) 2005-05-12
JP2007512806A (ja) 2007-05-24
WO2005042704A3 (en) 2005-06-30
EP1682677A2 (en) 2006-07-26
WO2005042704A2 (en) 2005-05-12
EP1689887A4 (en) 2007-12-19
CA2542526A1 (en) 2005-05-06
US20120100535A1 (en) 2012-04-26
US7901880B2 (en) 2011-03-08
JP4887154B2 (ja) 2012-02-29
EP2339024B1 (en) 2014-12-31
AU2004286235B2 (en) 2011-05-12
JP2007522795A (ja) 2007-08-16
CA2542526C (en) 2014-05-13
AU2004286235A1 (en) 2005-05-12
EP2339024A1 (en) 2011-06-29
JP4917891B2 (ja) 2012-04-18
EP2292795A2 (en) 2011-03-09
AU2004284456A1 (en) 2005-05-06
US8361719B2 (en) 2013-01-29
EP1682677A4 (en) 2007-12-19
EP2292795B1 (en) 2015-01-07
US8163485B2 (en) 2012-04-24
AU2004284456B2 (en) 2012-04-19
US20050153316A1 (en) 2005-07-14
US7910296B2 (en) 2011-03-22
EP1682677B1 (en) 2012-04-11
EP2292795A3 (en) 2011-06-08
ATE553218T1 (de) 2012-04-15
ES2382780T3 (es) 2012-06-13
EP1689887B1 (en) 2012-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2383970T3 (es) Fragmentación enzimática diferencial
Derks et al. Methylation‐specific PCR unraveled
Lorente et al. Detection of methylation in promoter sequences by melting curve analysis-based semiquantitative real time PCR
ES2344147T3 (es) Amplicon cpg y protocolo de matrices.
KR20030084975A (ko) 시토신 메틸화 패턴의 탐지를 위한 고민감 방법
JP2005514035A (ja) ハイブリダイゼーションしたプローブオリゴヌクレオチド（ｍｌａ）の指数的ライゲーションによるシトシン−メチル化パターンの検出方法
Akey et al. Assaying DNA methylation based on high-throughput melting curve approaches
Du et al. Hypomethylated DSCR4 is a placenta‐derived epigenetic marker for trisomy 21
Krygier et al. A simple modification to improve the accuracy of methylation-sensitive restriction enzyme quantitative polymerase chain reaction
Hattori et al. Analysis of DNA methylation in tissues exposed to inflammation
JP5116939B2 (ja) 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法
JP5116938B2 (ja) 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法
JP2005087050A (ja) 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法
CN115851957A (zh) 一种用于肺腺癌辅助诊断的甲基化位点标志物及其应用
Fraga et al. Use of PCR for DNA methylation analyses