JP2005514035A - ハイブリダイゼーションしたプローブオリゴヌクレオチド(mla)の指数的ライゲーションによるシトシン−メチル化パターンの検出方法 - Google Patents
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Abstract
次の工程:a) ゲノムDNA試料を、メチル化されていないシトシン塩基がウラシルに変換されるが、5−メチルシトシン塩基は変化されないままとなるように処理する工程、b) 化学的に処理されたDNA試料を、少なくとも2対のほぼ相補的なプローブオリゴヌクレオチド並びにリガーゼを使用して増幅する工程、及びc) 増幅物を分析し、増幅物の存在から調査すべきDNA中のメチル化状態を推定する工程、を実施することを特徴とする、DNA試料中のシトシン−メチル化の検出方法。
Description
本発明はDNA試料中のシトシン−メチル化の検出方法に関する。
分子生物学において、ここ数年の方法論的発展により、よく研究される観察領域は遺伝子自体、この遺伝子からRNAへの転写及びこのRNAから生じるタンパク質である。個体が成長する過程で遺伝子がスイッチオンされ、所定の細胞及び組織中で所定の遺伝子の活性化及び阻害がコントロールされる場合に、遺伝子もしくはゲノムのメチル化の程度と特性とは相関することができる。その点で、病原性の状態は個々の遺伝子又はゲノムのメチル化パターンの変化の形で現れる。
5−メチルシトシンは真核細胞のDNA中で最も頻発する共有結合により修飾された塩基である。この塩基は、例えば転写の調節、遺伝的刷り込み及び腫瘍の発生において重要な役割を有する。従って、遺伝情報の構成要素として5−メチルシトシンを同定することは極めて重要である。しかしながら5−メチルシトシン−ポジションは配列決定によって同定することができない、それというのも5−メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対合挙動を示すためである。さらに、PCR増幅の際には、5−メチルシトシンが有している後生的情報は完全に失われてしまう。
5−メチルシトシンに関してDNAを調査するための、比較的新規でかつ現在のところ最も頻繁に使用されている方法は、重亜硫酸塩とシトシンとの特異的反応に基づき、このシトシンを引き続きアルカリ加水分解によりウラシルに変換し、これはその塩基対合挙動においてチミジンに対応する。5−メチルシトシンはそれに対してこの条件下で修飾されない。従って、当初のDNAは変換されて、本来はハイブリダイゼーション挙動においてシトシンとは異なることがないメチルシトシンが、「通常の」分子生物学的技術により唯一残留するシトシンとして、例えば増幅及びハイブリダイゼーション又は配列決定によって検出することができる。これらの全ての技術は塩基対合に基づき、この塩基対合はこの場合に十分に利用される。この感度に関する先行技術は、調査すべきDNAをアガロース−マトリックス中に封入するする方法により定義され、それによりDNA(重亜硫酸塩は一本鎖DNAとだけ反応する)の拡散及び再生が抑制され、全ての沈殿工程及び精製工程が迅速な透析に置き換えられる(Olek A,Oswald J,Walter J.著 A modified and improved method for bisulphate based cytosine methylation analysis.Nucleic Acids Res.1996 DEC 15;24(24):5064−6)。この方法を用いて個々の細胞を調査することができ、これはこの方法の能力を具体的に示している。もちろん、今までには約3000塩基対長までの個々の領域が調査されただけであり、数千もの可能なメチル分析に関する細胞のグローバルな調査は不可能である。もちろん、この方法もわずかな試料量からの極めて小さなフラグメントを分析できるだけである。これは、マトリックスによる拡散保護にもかかわらず失われてしまう。
5−メチルシトシンを検出する他の公知の方法の概要は、次の概要文献から推知することができる。Rein T,DePamphilis ML,Zorbas H.著 Identifying 5−methylcytosine and related modifications in DNA genomes.Nucleic Acids Res.1998 May 15;26(10):2255−64。
この重亜硫酸塩−技術は今までにわずかな例外(例えばZeschnigk M,Lich C,Buiting K,Doerfler W,Horsthemke B.著 A single−tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader−Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus.Eur J Hum Genet.1997 Mar−Apr;5(2):94−8)を除いて研究においてのみ使用されている。しかしながら、常に、公知の遺伝子の短い、特異的な部分を重亜硫酸塩−処理により増幅し、完全に配列決定するか(Olek A,Walter J.著 The pre−implantation ontogeny of the H19 methylation imprint.Nat Genet.1997 Nov.;17(3):275−6)又は個々のシトシン−ポジションを「プライマー−エクステンション−反応」(Gonzalgo ML,Jones PA,著 Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation−sensitive single nucleotide primer extension(Ms−SNuPE),Nucleic Acids Res.1997 Jun.15;25(12):2529−31,WO−Patent 9500669)により又は酵素切断(Xiong Z,Laird PW,著 COBRA:a sensitive and quantitative DNA methylation assay.Nucleic Acids Res.1997 Jun.15;25(12):2532−4)により検出する。さらに、ハイブリダイゼーションによる検出も記載されている(Olek et al.,WO 99 28498)。
尿素はゲノムDNA中の5−メチルシトシンの配列決定の前の重亜硫酸塩処理の効果を改善する(Paulin R,Grigg GW,Davey MW,Piper AA,著 Urea improves efficiency of bisulphate−mediated sequencing of 5’−methylcytosine in genomic DNA.Nucleic Acids Res.1998 Nov.1;26(21):5009−10)。
個々の遺伝子においてメチル化の検出を行うための重亜硫酸塩−技術の適用を研究した他の刊行物を次に挙げる。
Grigg G,Clark S.著 sequencing 5−methylcytosine residues in genomic DNA.Bioassays.1994 Jun.;16(6):431−6,431;Zeschnigk M,Schmitz B,Dittrich B,Buiting K,Horsthemke B,Doerfler W.著 Imprinted segments in the human genome:different DNA methylation patterns in the Prader−Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method.Hum Mol Genet.1997 Mar;6(3):387−95;Feil R,Charlton J,Bird AP,Walter J,Reik W.著 Methylation analysis on individual chromosomes:improved protocol fort bisulphate genomic sequencing.Nucleic Acids Res,1994 Feb.25;22(4):695−6;Martin V,Ribieras S,Song−Wang X,Rio MC,Dante R.著 Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5’region of the pS2 gene andin its expression in human breast cancer cell lines.Gene.1995 May 19;157(1−2):261−4;WO 97 46705,WO 95 15373及びWO 45560。
Grigg G,Clark S.著 sequencing 5−methylcytosine residues in genomic DNA.Bioassays.1994 Jun.;16(6):431−6,431;Zeschnigk M,Schmitz B,Dittrich B,Buiting K,Horsthemke B,Doerfler W.著 Imprinted segments in the human genome:different DNA methylation patterns in the Prader−Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method.Hum Mol Genet.1997 Mar;6(3):387−95;Feil R,Charlton J,Bird AP,Walter J,Reik W.著 Methylation analysis on individual chromosomes:improved protocol fort bisulphate genomic sequencing.Nucleic Acids Res,1994 Feb.25;22(4):695−6;Martin V,Ribieras S,Song−Wang X,Rio MC,Dante R.著 Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5’region of the pS2 gene andin its expression in human breast cancer cell lines.Gene.1995 May 19;157(1−2):261−4;WO 97 46705,WO 95 15373及びWO 45560。
他の公知の方法は、いわゆるメチル化感受性PCR(Herman JG,Graff JR,Myohanen S,Nelkin BD,Baylin SB,著(1996),Methylation−specific PCR:a novel PCR assay for methylation status of CpG islands,Proc Natl Acad Sci U S A.Sep 3;93(18):9821−6)である。この方法のために、該当するポジションでメチル化されていないDNAの重亜硫酸塩−処理により生じた配列にだけハイブリダイゼーションするプライマーか、又はその逆で該当するポジションでメチル化されていないDNAの重亜硫酸塩−処理により生じた核酸にだけ結合するプライマーが使用される。従って、このプライマーを用いて増幅物を製造することができ、この検出は試料中の、プライマーが結合しているメチル化されたポジション又はメチル化されていないポジションの存在に関する示唆を提供する。
より新規の方法は、Taqman PCRを用いたシトシン−メチル化の検出であり、この方法はメチル−ライト(Methyl−Light)として公知になっている(WO00/70090)。この方法を用いて、個々の又はわずかなポジションのメチル化状態をPCRの進行において直接検出して、引き続く生成物の分析を不要とすることが可能である。
マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析(MALDI−TOF)は、生物分子の分析のための極めて高性能の方法である(Karas M,Hillenkamp F.著 Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.Anal Chem.1988 Oct.15;60(20):2299−301)。アナライトは吸光性マトリックス中に埋め込まれる。短いレーザーパルスによってマトリックスは蒸発し、アナライト分子はフラグメント化されずに気相内へ運び出される。マトリックス分子の衝突により、アナライトのイオン化が達成される。印加された電圧がイオンを無電界の飛行管へ促進する。この多様な質量に基づき、イオンは多様に著しく促進される。小さなイオンは大きなイオンよりも早くに検出器に到達する。
MALDI−TOFスペクトル分析は、ペプチド及びタンパク質の分析のために特に優れている。核酸の分析はいくらか困難である(Gut,I.G.及びBeck,S.著(1995),DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry.Molecular Biology:Current Innovations and Future Trends 1:147−157)。核酸については、ペプチドに対するよりもほぼ100倍感度が悪く、フラグメントサイズが大きくなるにつれて過剰に比例して低下する。何重にも負に帯電した骨格を有する核酸に対して、マトリックスによるイオン化プロセスはほとんど効果がない。
ゲノムDNAは細胞試料、組織試料又はその他の試験試料のDNAから標準方法によって得ることができる。この標準方法は、Fritsch及びManiatis著,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1989のような参考文献に記載されている。
DNAフラグメントを増幅する方法は、先行技術である。最も頻繁に使用される方法(ポリメラーゼ連鎖反応、PCR)は、2つのプライマーを使用してゲノムDNAの離散したフラグメントの増幅のために使用される。メチル化検出(MSP)のための上記の方法は、同様にこの方法を使用する。重亜硫酸塩−処理したDNAに基づくメチル化検出のための他の方法も、感度の問題を克服するために増幅方法としてPCRを使用する。
フラグメントの指数的増幅のための他の方法は、リガーゼ連鎖反応(LCR)である。この方法は、ゲノム断片の増幅にはあまり適していないが、例えば突然変異検出に対しては極めて適している。鋳型に直接隣接する2つのプローブがハイブリダイゼーションし、かつこれらのプローブが相互に隣接する箇所では塩基対の欠失は生じない場合にだけ、ライゲーションが行われる。PCRと同様に、LCRは、例えば熱安定性のリガーゼを用いた指数的増幅として記載されている(例えばWO 94/08047参照)。PCRと同様にLCRもマルチプレックス化可能である。
LCRに関する他の基本的な特許はEP0320308及びEP0439182である。後者の特許では、LCRとポリメラーゼ反応との組み合わせが記載されている。
従って、今までにメチル化分析のための多くの方法が先行技術である。本発明は、しかしながら、同じメチル化状態のCpGポジションの小さなグループの検出のためにLCRに類似する増幅技術を特に有利に組み合わせる。
メチル化感受性PCRの場合に、2つのプライマーは、少なくとも複数のメチル化可能な、そのメチル化状態に基づいて調査すべきポジションをカバーするように選択される。次に、この少なくとも3つ又はそれ以上のポジションがほぼ同じメチル化状態を有する(例えば全てメチル化されている)場合には、鋳型中の該当するポジションへのプライマーのハイブリダイゼーションが行われ、PCRを用いた増幅を行うことができる。2つのプライマーがこのように選択される場合に、この方法の極めて高い感度を達成することが可能である。例えば1個のメチル化された鋳型を10000個のメチル化されていない鋳型のバックグラウンド中で検出することができる。それというのもメチル化されていない鋳型は相応して特異的なプライマーを使用した場合に増幅されないためである。
しかしながら、この方法の欠点は、まさにその配列依存性である。相応する感度を達成するためには同様にまさに共メチル化されて存在するようなポジションを見つけ出す必要がある。CpGポジションが相互に離れて遠すぎる場合には、極めて長いプライマーが必要であり、このことはPCR自体にとっても望ましくなく、かつ感度に対しても不利である。同様にこのようなプライマーのアニーリング温度は極めて高い。同様に、メチル化感受性PCR産物の作成のためには、相応するリバース−プライマーに対して共メチル化ポジションの他のグループを見つけ出す必要がある。これは全ての場合に可能とはならない。それにもかかわらず2つのプライマーがメチル化特異的に結合するのが好ましい。なぜならば十分な感度が達成できないためである。
従って、2つのプローブ又はプライマーの結合のできるだけ高い特異性を、既に関連するグループのメチル化ポジションにおいても達成することが好ましい。
これは、ここに記載されたメチル化感受性ライゲーション及び増幅(MLA)を用いて達成することができる。この方法は、点突然変異分析がこのケースであるが、特異性がライゲーション工程自体によってほとんど影響を受けない点でLCRとは異なっている。MLAにおいて、使用した2つのオリゴヌクレオチドプローブ(又はプライマー)が隣接してハイブリダイゼーションする場合には、ライゲーションが主に行われる。ゲノム試料中のメチル化状態が2つのプローブポジションに対してメチル化されて又はメチル化されていないで存在する場合に、これらはハイブリダイゼーションする。
本発明は、つまりメチル化検出の分野において先行技術の欠点を克服する方法でもある。この方法は、CpGポジションのグループのメチル化状態の間接的な検出のため及び増幅のために使用することができる。
この方法は、異なるメチル化状態を有する配列相同性のバックグラウンドDNAの存在で、所定のメチル化状態を有する調査すべきDNAの選択的な増幅のためにも使用することができる。
特に、調査すべきDNA並びにバックグラウンドDNAの概念は、本発明の場合に、先行技術(MSP)の例で説明する。調査すべきDNA並びにその他の存在する(以後バックグラウンドDNAとする)核酸は、通常では一様に増幅されてしまい、それというのも使用したプライマーが調査すべきDNAとバックグラウンドDNAとを区別することができないためである。これらのDNAの区別を可能にすることは、しかしながら異なるメチル化パターンによって生じる。慣用の方法は、メチル化感受性PCR(省略してMSP)(Herman JG,Graff JR,Myohanen S,Nelkin BD,Baylin SB,著(1996),Methylation−specific PCR:a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.Proc Natl Acad Sci U S A.Sep 3;93(18):9821−6)である。この方法は、複数の部分工程からなる。まず最初に、先行技術に相当する重亜硫酸塩処理を実施し、この処理は全てのシトシン塩基をウラシルに変換するが、メチル化されたシトシン塩基(5−メチルシトシン)は変化させない。次の工程で、メチル化され、重亜硫酸塩で変換されたDNAに対して完全に相補的であるが、当初のメチル化されていない相応するDNAとは相補的ではないプライマーだけを使用する。これにより、このようなプライマーを用いたPCRの実施の際に、当初からメチル化されたDNAだけが増幅されることになる。同様に、これとは反対に非メチル化されたDNAだけを増幅するプライマーを使用することもできる。このような様式及び方法で、分析すべきDNA並びにバックグラウンドDNAが存在している場合に、CpGポジションにおけるメチル化状態に関してバックグラウンドDNAとは異なる限り、調査すべきDNAフラグメントだけを選択的に生じさせることができる。
先行技術は、このような調査すべきDNA分子の検出からメチル化状態又は試験すべきDNAの存在を推測し、これは例えば患者の腫瘍疾患の診断が原理的に可能である、それというのも例えば血清のDNA濃度が腫瘍患者の場合に部分的に劇的に高まることが知られているためである。腫瘍に由来するDNAだけが、バックグラウンドDNAの他に検出される。原則的に他の体液中のDNA分析は比較可能である。
先行技術は、またエピゲノミクスから開発された方法であり、この方法は調査すべきDNAとバックグラウンドDNAとを重亜硫酸塩−処理により一様に増幅させ、次いでフラグメント中に含まれる基のCpGポジションをハイブリダイゼーション技術により、他にミニ配列決定又は他の慣用の方法により調査する。この方法は、調査すべきメチル化ポジションに関する定量的イメージを得るという利点がある、つまりこの方法は、多数のポジションのメチル化の程度の決定を行い、これは例えば固形腫瘍の場合に極めて正確な分類が可能である。しかしながらこの方法の欠点は、バックグラウンドDNAが著しく優勢である場合に、正確な結果が提供できないことである、それというのもバックグラウンドDNAも調査すべきDNAと同様に増幅されてしまい混合物中で両方を分析するためである。この問題は、調査すべき材料を適切に選択できる固形腫瘍の分析の場合に存在するのではなく、例えば血清−DNAの分析を困難にする。
従って、本発明の課題は、先行技術の欠点を克服する方法を提供することである。
前記の課題は、次の工程:
a) ゲノムDNA試料を、メチル化されていないシトシン塩基がウラシルに変換されるが、5−メチルシトシン塩基は変化されないままとなるように処理する工程、
b) 化学的に処理されたDNA試料を、少なくとも2対のほぼ相補的なプローブオリゴヌクレオチド並びにリガーゼを使用して増幅する工程、
c) 増幅物を分析し、増幅物の存在から調査すべきDNA中のメチル化状態を推定する工程、
を実施する、DNA試料中のシトシン−メチル化の検出方法により解決される。
a) ゲノムDNA試料を、メチル化されていないシトシン塩基がウラシルに変換されるが、5−メチルシトシン塩基は変化されないままとなるように処理する工程、
b) 化学的に処理されたDNA試料を、少なくとも2対のほぼ相補的なプローブオリゴヌクレオチド並びにリガーゼを使用して増幅する工程、
c) 増幅物を分析し、増幅物の存在から調査すべきDNA中のメチル化状態を推定する工程、
を実施する、DNA試料中のシトシン−メチル化の検出方法により解決される。
この場合に、第2の工程において調査すべきDNAが鋳型として配列相同性のバックグラウンドDNAと比較して優性であることが好ましい。
増幅物中の他のポジションの分析から調査すべきDNA中のメチル化状態を推定することがさらに好ましい。
工程b)において、プローブオリゴヌクレオチドによりカバーされたCpGポジションがゲノムDNA試料(もしくは調査すべきDNA)中にメチル化されて存在する場合に、プローブオリゴヌクレオチドは次いで鋳型とハイブリダイゼーションし、かつ同じプローブオリゴヌクレオチドは、このポジションで完全に又は部分的にメチル化されていないで存在する鋳型とほとんどわずかな程度しかハイブリダイゼーションしない、本発明による方法が特に好ましい。
工程b)において、プローブオリゴヌクレオチドによりカバーされたCpGポジションがゲノムDNA試料(もしくは調査すべきDNA)中にメチル化されていないで存在する場合に、プローブオリゴヌクレオチドは次いで鋳型とハイブリダイゼーションし、かつ同じプローブオリゴヌクレオチドは、このポジションで完全に又は部分的にメチル化されて存在する鋳型とほとんどわずかな程度しかハイブリダイゼーションしないのがさらに特に好ましい。
さらに、工程b)を詳細に次のように実施するのが特に好ましい。
a) 隣接するポジションで鋳型とハイブリダイゼーションするプローブオリゴヌクレオチドをライゲーションにより相互に連結させ、
b) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションし、
c) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドに相補的なプローブオリゴヌクレオチドを既に連結されたプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによりそれ自体連結させ、
d) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを、他のライゲーション工程のために鋳型として利用して、連結したプローブオリゴヌクレオチドをさらに増幅させる。
a) 隣接するポジションで鋳型とハイブリダイゼーションするプローブオリゴヌクレオチドをライゲーションにより相互に連結させ、
b) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションし、
c) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドに相補的なプローブオリゴヌクレオチドを既に連結されたプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによりそれ自体連結させ、
d) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを、他のライゲーション工程のために鋳型として利用して、連結したプローブオリゴヌクレオチドをさらに増幅させる。
本発明の場合には、プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが5’末端にリン酸基を有することが好ましい。
さらに、プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが検出可能な標識を有するのが好ましく、特に蛍光により検出可能な標識を備えているのが好ましい。この場合に、少なくとも2つのプローブオリゴヌクレオチドが標識を備えていて、この標識の特性がその相互の距離に依存して変化するのが特に好ましい。この場合に、プローブオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの蛍光標識を有することが特に好ましい。この場合、さらにプローブ分子が蛍光の増大又は減少によって増幅が示されることが好ましい。特に、蛍光の増加又は減少が分析のために直接使用され、かつ変化した蛍光シグナルから調査すべきDNAのメチル化状態を推定することが本発明の場合に好ましい。
バックグラウンドDNAが調査すべきDNAと比較して100倍の濃度で存在することが特に好ましい。バックグラウンドDNAが調査すべきDNAと比較して1000倍の濃度で存在することがさらに好ましい。
本発明の場合に、同様に、試料DNAを個体の血清又は他の体液から得ることが好ましい。本発明の場合に、同様に、試料DNAは、セルライン、血液、痰、便、尿、血清、脳脊髄液、パラフィン中に埋め込まれた組織、例えば目、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房又は肝臓の組織、組織学的対象キャリア及びこれらの全ての可能な組み合わせから得ることが好ましい。
本発明の場合に、さらに、工程a)を重亜硫酸塩(=二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩)を用いて実施するのが好ましい。この場合には、DNAをアガロース中へ埋め込んだ後に化学的処理を行うのが好ましい。この場合に、本発明によると、さらに化学的処理の際にDNA二本鎖を変性する試薬及び/又はラジカル捕捉剤を添加するのが好ましい。
さらに、工程c)での分析をオリゴマーアレイへのハイブリダイゼーションによって行い、その際に、オリゴマーは核酸又はそのハイブリダイゼーション特性において類似の分子、例えばPNAであることができるのが好ましい。
本発明の場合に、同様に、工程c)での分析を、増幅された調査すべきDNAの長さの測定により行うことも有利であり、その際に長さの測定のための方法は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー(例えばHPLC)、質量分析及び他の適当な方法を含める。
さらに、本発明の場合には工程c)による分析は配列決定によって行うのが有利であり、その際に、配列決定のための方法は、サンガー法、マキサム−ギルバート法及びハイブリダイゼーションによる配列決定(SBH)のような他の方法を含める。
さらに、調査された異なるCpGポジションでのメチル化状態から、疾患の存在又は患者の他の医学的状態を推定するのが好ましい。
本発明の場合に、増幅物自体は検出のために検出可能な標識を備えているのが好ましい。この場合、標識は蛍光標識であるのが特に好ましい。この場合、標識は放射性核種であるのも好ましい。この場合、本発明により、標識は分離可能な質量標識であり、この標識が質量スペクトル分析器において分析されるのが特に好ましい。増幅物は、同様に、全体として質量分析装置中で検出され、従ってその質量によって明らかに特性決定されていることが特に好ましい。
さらに、本発明の場合には、プローブオリゴヌクレオチドに対して付加的に、ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用し、このブロッカーオリゴヌクレオチドは好ましくはバックグラウンドDNAと結合し、プローブオリゴヌクレオチドとバックグラウンドDNAとのハイブリダイゼーションを阻害するのが好ましい。この場合に、2つの相互に相補的なブロッカーオリゴヌクレオチド(又はブロッカーPNA、一般にブロッカー分子)を使用することが特に好ましい。さらに、このブロッカー分子は好ましくは鋳型鎖と結合し、この鋳型鎖はその配列において工程a)の処理後のメチル化されて存在するDNAに一致することが特に好ましい。この場合に、このブロッカー分子は好ましくは鋳型鎖と結合し、この鋳型鎖はその配列において工程a)の処理後のメチル化されていないで存在するDNAに一致することも好ましい。特に、本発明の場合には、このブロッカー分子が鋳型DNA中の複数のCpGポジションと結合するか又はこのブロッカー分子が鋳型DNA中の複数のTpG又はCpAポジションと結合するようなブロッカー分子が好ましい。この場合に、本発明によるとさらに、ブロッカーオリゴヌクレオチドがその3末端で修飾されていて、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによりほとんど分解されることがないことが好ましい。
本発明の場合には、工程b)が詳細には次のように実施される方法が好ましい。
a) プローブオリゴヌクレオチド(プローブ)を、鋳型鎖のポジションに第1のプローブの3’末端と第2のプローブの5’末端との間に少なくとも1塩基の間隔が残るようにハイブリダイゼーションさせ、
b) 第1のプローブの3’末端がポリメラーゼ反応によって延長され、その際に鋳型鎖に対してそれぞれ相補的なヌクレオチドが組み立てられ、
c) 延長された第1のプローブが延長された第2のプローブとライゲーションによって連結され、
d) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションし、
e) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドに対して相補的なプローブオリゴヌクレオチドを、既に連結したプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによってそれ自体連結させ、かつ
f) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを他のライゲーション工程のための鋳型として利用して、連結したプローブオリゴヌクレオチドをさらに増加させる。この場合、工程e)は工程a)〜c)と同様に実施するのが好ましい。この場合に、熱安定性のポリメラーゼを使用するのが好ましい。
a) プローブオリゴヌクレオチド(プローブ)を、鋳型鎖のポジションに第1のプローブの3’末端と第2のプローブの5’末端との間に少なくとも1塩基の間隔が残るようにハイブリダイゼーションさせ、
b) 第1のプローブの3’末端がポリメラーゼ反応によって延長され、その際に鋳型鎖に対してそれぞれ相補的なヌクレオチドが組み立てられ、
c) 延長された第1のプローブが延長された第2のプローブとライゲーションによって連結され、
d) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションし、
e) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドに対して相補的なプローブオリゴヌクレオチドを、既に連結したプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによってそれ自体連結させ、かつ
f) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを他のライゲーション工程のための鋳型として利用して、連結したプローブオリゴヌクレオチドをさらに増加させる。この場合、工程e)は工程a)〜c)と同様に実施するのが好ましい。この場合に、熱安定性のポリメラーゼを使用するのが好ましい。
特に、本発明の場合には熱安定性リガーゼを使用するのも好ましい。
さらに、本発明の場合には、メチル化ポジションの複数のグループに対するオリゴヌクレオチドプローブの複数のセットを使用し、それによりアッセイのマルチプレックス化が達成されるのが好ましい。
本発明の対象は、患者又は個体にとって不利な事象の診断及び/又は予後のための本発明による方法の使用でもあり、その際にこの不利な事象とは、次のカテゴリーの少なくとも1つに属する。望ましくない医薬品の作用;腫瘍疾患;CNSの機能不全、障害又は疾患;攻撃性症状又は行動傷害;脳障害の臨床的な心理学的及び社会的予後;心理学的障害及び人格障害;痴呆及び/又は随伴症状;心臓血管の疾患、機能不全及び障害;胃腸管の機能不全、障害又は疾患;呼吸器系の機能不全、障害又は疾患;損傷、炎症、感染、免疫及び/又は回復;発育プロセスにおける偏差として身体の機能不全、障害又は疾患;皮膚、筋肉、結合組織又は骨の機能不全、障害又は疾患;内分泌及び代謝の機能障害、障害又は疾患;頭痛又は性的機能障害。この場合に、細胞タイプ又は組織の区別のため又は細胞分化の調査のために本発明による方法を使用するのが好ましい。
本発明の対象は、重亜硫酸塩を含有する試薬、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、好ましくは熱安定性のリガーゼ及び緩衝剤並びに場合により本発明によるアッセイの実施のための使用説明書からなるキットでもある。
先行技術の欠点を克服するメチル化分析のための敏感な方法を提供するという本発明による課題は、次の工程を実施してDNA試料中のシトシン−メチル化を検出する方法により解決される。
1.メチル化されていないシトシン塩基がウラシルへと変換されるが、5−メチルシトシン塩基は変化されないままであるように、ゲノムDNA試料を処理する工程、
2.化学的に処理されたDNA試料を、少なくとも2対のほぼ相補的なプローブオリゴヌクレオチド並びにリガーゼを使用して増幅する工程、及び
3.増幅物を分析し、増幅物の存在から調査すべきDNA中のメチル化状態を推定する工程。
1.メチル化されていないシトシン塩基がウラシルへと変換されるが、5−メチルシトシン塩基は変化されないままであるように、ゲノムDNA試料を処理する工程、
2.化学的に処理されたDNA試料を、少なくとも2対のほぼ相補的なプローブオリゴヌクレオチド並びにリガーゼを使用して増幅する工程、及び
3.増幅物を分析し、増幅物の存在から調査すべきDNA中のメチル化状態を推定する工程。
本発明の場合には、第2の工程において調査すべきDNAが鋳型としてバックグラウンドDNAと比較して優位であることが好ましい。
さらに、本発明の場合には、増幅物中の他のポジションの分析から調査すべきDNA中のメチル化状態を推定することが好ましい。
この方法の第2の工程は、次のように実施するのが特に好ましい。
a) プローブオリゴヌクレオチドを、ゲノムDNA試料(もしくは調査すべきDNA)中のこのプローブオリゴヌクレオチドによりカバーされたCpGポジションがメチル化されて存在している場合には、鋳型とハイブリダイゼーションさせ、このポジションが完全に又は部分的にメチル化されていないで存在する鋳型には、プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションはほとんどわずかな量で行われ、
b) 隣接するポジションで鋳型とハイブリダイゼーションするプローブオリゴヌクレオチドを、ライゲーションにより相互に連結し、
c) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションさせ、
d) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドと相補的なプローブオリゴヌクレオチドを、既に連結したプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによってそれ自体を連結させ、かつ
e) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを、他のライゲーション工程のための鋳型として使用して、連結されたプローブオリゴヌクレオチドの指数的増加を行う。
a) プローブオリゴヌクレオチドを、ゲノムDNA試料(もしくは調査すべきDNA)中のこのプローブオリゴヌクレオチドによりカバーされたCpGポジションがメチル化されて存在している場合には、鋳型とハイブリダイゼーションさせ、このポジションが完全に又は部分的にメチル化されていないで存在する鋳型には、プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションはほとんどわずかな量で行われ、
b) 隣接するポジションで鋳型とハイブリダイゼーションするプローブオリゴヌクレオチドを、ライゲーションにより相互に連結し、
c) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションさせ、
d) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドと相補的なプローブオリゴヌクレオチドを、既に連結したプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによってそれ自体を連結させ、かつ
e) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを、他のライゲーション工程のための鋳型として使用して、連結されたプローブオリゴヌクレオチドの指数的増加を行う。
同様に、この第2の方法工程を次のように実施するのも好ましい。
a) プローブオリゴヌクレオチドを、ゲノムDNA試料(もしくは調査すべきDNA)中のこのプローブオリゴヌクレオチドによりカバーされたCpGポジションがメチル化されていないで存在している場合には、鋳型とハイブリダイゼーションさせ、このポジションが完全に又は部分的にメチル化されて存在する鋳型には、プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションはほとんどわずかな量で行われ、
b) 隣接するポジションで鋳型とハイブリダイゼーションするプローブオリゴヌクレオチドを、ライゲーションにより相互に連結し、
c) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションさせ、
d) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドと相補的なプローブオリゴヌクレオチドを、既に連結したプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによってそれ自体を連結させ、かつ
e) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを、他のライゲーション工程のための鋳型として使用して、連結されたプローブオリゴヌクレオチドの指数的増加を行う。
a) プローブオリゴヌクレオチドを、ゲノムDNA試料(もしくは調査すべきDNA)中のこのプローブオリゴヌクレオチドによりカバーされたCpGポジションがメチル化されていないで存在している場合には、鋳型とハイブリダイゼーションさせ、このポジションが完全に又は部分的にメチル化されて存在する鋳型には、プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションはほとんどわずかな量で行われ、
b) 隣接するポジションで鋳型とハイブリダイゼーションするプローブオリゴヌクレオチドを、ライゲーションにより相互に連結し、
c) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションさせ、
d) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドと相補的なプローブオリゴヌクレオチドを、既に連結したプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによってそれ自体を連結させ、かつ
e) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを、他のライゲーション工程のための鋳型として使用して、連結されたプローブオリゴヌクレオチドの指数的増加を行う。
要約すると、メチル化に敏感な工程は、工程a)の2つのプローブオリゴヌクレオチドの隣接するメチル化に敏感な(相応する重亜硫酸塩処理されたDNAへの)ハイブリダイゼーションであることを強調することができる。ライゲーションが行われた場合には、この連結されたオリゴヌクレオチドの指数的増幅が行われる。
このライゲーションを行うことができるために、プローブオリゴヌクレオチドの一つ(それぞれのほとんど相補的なペアの一方)は末端のリン酸基を有しているのが好ましい。そうでない場合には、このリン酸基を個別のホスホリル化工程で挿入しなければならなくなる。
本発明の場合に、試料DNAを個体の血清又は他の体液から得ることが好ましい。
さらに、本発明の場合に、試料DNAは、セルライン、血液、痰、便、尿、血清、脳脊髄液、パラフィン中に埋め込まれた組織、例えば目、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房又は肝臓の組織、組織学的対象キャリア及びこれらの全ての可能な組み合わせから得ることが好ましい。
さらに、調査された異なるCpGポジションでのメチル化の程度から、疾患の存在又は患者の他の医学的状態を推定するのが好ましい。
本発明の場合に、化学的処理を重亜硫酸塩(=二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩)を用いて実施するのが特に好ましい。同様に、DNAをアガロース中へ埋め込んだ後に化学的処理を行うのが好ましい。同様に並びにさらに化学的処理の際にDNA二本鎖を変性する試薬及び/又はラジカル捕捉剤を添加するのが好ましい。
さらに、同様にプローブ分子が蛍光の増加又は減少によって増幅が示されることも好ましい。この場合に、特に、蛍光の増加又は減少が分析のために直接使用され、かつこの蛍光シグナルから調査すべきDNAのメチル化状態を推定することが好ましい。
これはまた、当業者に公知の多様な方法で達成することができる。一方で、隣接して結合するプローブオリゴヌクレオチドが多様な蛍光色素を備えていることができる。
蛍光エネルギー移動(FRET)により、一方の色素が他方の色素に対して空間的に近くに存在しかつ他方の色素が励起される場合には、一方の色素は励起されて蛍光することができる。同様に他方では、一方の色素が他方の色素に対して空間的に隣接している場合に、一方の色素が他方の色素の蛍光を抑制することも可能である(クエンチング)。2つの方法は、MLAの進行を視覚化するために使用することができる。この方法をPCRの際にTaqman又はLightcycler分析として使用するのが合理的である。
本発明の場合に、バックグラウンドDNAが調査すべきDNAと比較して100倍の濃度で存在することがさらに好ましい。バックグラウンドDNAが調査すべきDNAと比較して1000倍の濃度で存在することがさらに好ましい。
さらに、分析、又は場合によりオリゴマーアレイとのハイブリダイゼーションを用いた他の分析を行い、その際に、オリゴマーは核酸又はそのハイブリダイゼーション特性において類似の分子、例えばPNA(ペプチド核酸)であることができるのが好ましい。
同様に、本発明の場合に、分析、又は場合により他の分析を、増幅された調査すべきプローブオリゴヌクレオチドの長さの測定により行うことも有利であり、その際に長さの測定のための方法は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー(例えばHPLC)、質量分析及び他の適当な方法を含める。
増幅物自体は検出のために検出可能な標識を備えているのが好ましい。さらに、この標識は蛍光標識であるか又は/及びこの標識は放射性核種であるか又は/及びこの標識は分離可能な質量標識であり、これは質量スペクトル分析器において分析されるのが好ましい。
さらに、増幅体は標識、例えばビオチンを有し、そのためこの増幅体を選択的に固相と結合することができるのが好ましい。この方法の特に有利な実施態様の場合には、ビオチンで標識されたオリゴヌクレオチドプローブ並びに蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを相互に連結し、引き続きこの産物を例えばストレプトアビジンと結合させる。結合した種類の蛍光シグナルは、従って連結が行われた場合にだけ測定することができる。この蛍光シグナルは、方法によって限定された境界中で、ライゲーションが行われた数に対して比例する。
本発明の場合に、増幅物は、全体として質量分析装置中で分析され、従ってその質量によって明らかに特徴付けられていることも好ましい。
本発明の他の対象は、患者又は個体にとって不利な事象の診断及び/又は予後のための本発明による方法の使用でもあり、その際にこの不利な事象とは、次のカテゴリーの少なくとも1つに属する。好ましくない医薬品の作用;腫瘍疾患;CNSの機能不全、障害又は疾患;攻撃性症状又は行動傷害;脳障害の臨床的な心理学的及び社会的予後;心理学的障害及び人格障害;痴呆及び/又は随伴症状;心臓血管の疾患、機能不全及び障害;胃腸管の機能不全、障害又は疾患;呼吸器系の機能不全、障害又は疾患;損傷、炎症、感染、免疫及び/又は回復;発育プロセスにおける偏差として身体の機能不全、障害又は疾患;皮膚、筋肉、結合組織又は骨の機能不全、障害又は疾患;内分泌及び代謝の機能障害、障害又は疾患;頭痛又は性的機能障害。
同様に、細胞タイプ又は組織の区別のため又は細胞分化の調査のための本発明による方法の使用が好ましい。
本発明の対象は、重亜硫酸塩を含有する試薬、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、有利に熱安定性のリガーゼ及び緩衝剤並びに場合により本発明によるアッセイの実施のための使用説明書からなるキットでもある。
有利な方法は、次に要約されるような複数の工程からなる。
まず最初に、患者からDNA血清及び/又は他の体液を採取し、その中に存在するDNAを必要な場合に単離する。引き続き、化学処理を有利に重亜硫酸塩(=亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩)で実施し、その際に、例えばメチル化されていない全てのシトシン塩基はウラシルに変換され、メチル化されたシトシン塩基(5−メチルシトシン)は変化しないままである。第2の方法工程において、増幅するライゲーションを実施し、その際に好ましくは調査すべきDNAを増幅させるが、バックグラウンドDNAは増幅されないか又はわずかな程度で増幅されるだけである。全ての場合に、試料中の少なくとも1つのDNAフラグメント上に所定のメチル化状態が存在し、例えば好ましくは全てのCpGポジションがメチル化されて、そのポジションでプローブオリゴヌクレオチドと結合しているかどうかに依存して増幅が行われる。次の第3の工程では、増幅されたフラグメントが同定され、ゲノムDNA試料中のメチル化状態が推定される。好ましくは患者の疾患の存在又は他の医学的状態の存在が推定される。
まず最初に、患者からDNA血清及び/又は他の体液を採取し、その中に存在するDNAを必要な場合に単離する。引き続き、化学処理を有利に重亜硫酸塩(=亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩)で実施し、その際に、例えばメチル化されていない全てのシトシン塩基はウラシルに変換され、メチル化されたシトシン塩基(5−メチルシトシン)は変化しないままである。第2の方法工程において、増幅するライゲーションを実施し、その際に好ましくは調査すべきDNAを増幅させるが、バックグラウンドDNAは増幅されないか又はわずかな程度で増幅されるだけである。全ての場合に、試料中の少なくとも1つのDNAフラグメント上に所定のメチル化状態が存在し、例えば好ましくは全てのCpGポジションがメチル化されて、そのポジションでプローブオリゴヌクレオチドと結合しているかどうかに依存して増幅が行われる。次の第3の工程では、増幅されたフラグメントが同定され、ゲノムDNA試料中のメチル化状態が推定される。好ましくは患者の疾患の存在又は他の医学的状態の存在が推定される。
この方法において使用されるゲノムDNAは、DNA試料から得るのが好ましく、この場合、DNAの供給源は、例えばセルライン、血液、痰、便、尿、血清、脳脊髄液、パラフィン中に埋め込まれた組織、例えば目、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房又は肝臓の組織、組織学的対象キャリア及びこれらの全ての可能な組み合わせである。個体の体液、例えば痰、血清、血漿、完全血液、尿又は精液からDNAを単離することが特に好ましい。
いくつかの場合には、大量の不純物による重亜硫酸塩反応の障害及び/又は引き続くPCRの障害を抑制するために、重亜硫酸塩−処理の前に、DNAの精製又は濃縮が行われる。しかしながら、例えば組織から、例えばプロテイナーゼKを用いた処理の後に、さらに精製せずにPCRを行うことができ、かつこのことは重亜硫酸塩−処理及び引き続くPCRにとっても好ましい。ことは公知である。
この化学的処理は、有利に重亜硫酸塩(=亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩)を用いた処理により、また好ましくは亜硫酸水素ナトリウム(亜硫酸水素アンモニウムはあまり適していない)を用いた処理により実施する。DNAを処理の間に一本鎖状態で保持するために、公開されたバリエーション(この場合に有利にDNAをアガロース中に埋め込む)により反応を行うか、又は新規のバリエーションにより、ラジカル捕捉剤及び変性する試薬の存在で、有利にオリゴエチレングリコールジアルキルエーテル又は例えばジオキサンの存在で、処理することにより反応を行う。PCR反応の前に、この試薬はアガロース法又はDNA−精製法(先行技術、沈殿又は固相への析出、膜)の場合には洗浄により除去するか、又は簡単にPCRにはもはや十分に影響を及ぼさないような濃度範囲に希釈される。
第2の方法工程にとって重要なのは、調査すべきメチル化ポジションを選択し、かつ調査すべきDNAの選択的増幅が行える適当なプローブオリゴヌクレオチドを選択することである。このポジションの選択は、このポジションがバックグラウンドDNAと調査すべきDNAとの間でそのポジションのメチル化に関して可能な限り異なっているとの前提により行うか、又は試料DNAの大部分中のこのようなメチル化の存在が固体の疾患又は所定の他の医学的状態を推定させるという前提により行う。従って、まず最初に、遺伝子のそれぞれ挙げられた断片のメチル化プロフィールが、疾患のある個体からの調査すべきDNAに対して、並びに健康な個体からなるバックグラウンドDNAに対して決定される。調査すべきDNAとバックグラウンドDNAとの間の(例えば血清中での)最大の差異を有するポジションが、調査すべきポジションとして選択される。このようなポジションは、多くの遺伝子に対して、例えばGSTpi、HIC−1及びMGMTに対して既に公知である(Wronski MA,Harris LC,Tano K,Mitra S,Bigner DD,Brent TP著.(1992) Cytosine methylation and suppression of 06−methylguanine−DNA methyltransferase expression in human rhabdomyosarcoma cell lines and xenografts.Oncol Res.;4(4−5):167−74;Esteller M,Toyota M,Sanchez−Cespedes M,Capella G,Peinado MA,Watkins DN,Issa JP,Sidransky D,Baylin SB,Herman JG著.(2000),Inactivation of the DNA repair gene 06−methylguanine−DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is associated with G to A mutations in K−ras in colorectal tumorigenesis.Cancer Res.May 1;60(9):2368−71)。
この場合にも、例えばMSPの場合がこの状態であるが、CpGポジションのグループが実際に100%まで、例えばバックグラウンドDNA中でメチル化されていないで存在するが、調査すべきDNA(このDNAは疾患を有する個体においてだけ生じる)中ではメチル化されて存在する場合に、十分な表示力の増幅物が発生することができることが明らかである。MLAの場合には、有利に重亜硫酸塩処理においてメチル化されていないバックグラウンドDNAから生じる配列と結合するプローブオリゴヌクレオチドを使用する場合には、少なくとも少量の調査すべきDNAが一般に存在する場合にライゲーション産物が生じるだけである。
また、複数のメチル化ポジションのための方法が同時に1つのアッセイでマルチプレックス化されて実施されるのが特に好ましい。この場合に、例えば有利に4つの異なるグループのCpGポジションがそのメチル化について調査される。リアルタイムPCR(例えば、ABIプリズム)のための市販の装置は、4色の蛍光色素を区別でき、かつそれにより4重にマルチプレックス化されたMLAアッセイの実施のために極めて良好に適している。
最も簡単な場合には、生じた増幅物を直接検出するだけである。このために、可能な公知の全ての分子生物学的方法、例えばゲル電気泳動法、配列決定法、液体クロマトグラフィー法又はハイブリダイゼーション法が挙げられる。
同様に増幅物の検出のために適している検出技術は、オリゴマーアレイとのハイブリダイゼーション及び例えばプライマーエクステンション(ミニ配列決定)反応である。オリゴマーアレイとのハイブリダイゼーションは、プロトコルを最も近い先行技術と比べて更に変更することなしに使用することができる(Olek A,Olek S,Walter J;WO 99/28498A1)。この場合に、1種又は数種の増幅物は、蛍光又は放射性又は分離可能な質量タグにより標識されているのが特に有利であり、その結果、ハイブリダイゼーションの後に、ペアの双方のオリゴヌクレオチドに結合するフラグメントがこの標識によって検出され、かつ定量化される。このようなオリゴマーアレイを用いて多数の増幅物を同時に検出できるため、このような方法は特に高度にマルチプレックス化されたMLAのアッセイに適している。このアレイはCpGポジションに結合しないオリゴマーをこの試験の対照のために含んでいるのが合理的でありかつ好ましい。これは、メチル化感受性のプローブオリゴヌクレオチドのライゲーション産物に結合し、これは試料DNAの定性対照及び/又は定量化に利用される。
この方法の特に有利な実施態様は、しかしながら増幅物のリアルタイム検出のためのTaqman又はLightcyclerテクノロジーバリエーションの使用である。メチル化状態に依存する増幅の間の蛍光の変化は、多数の方法により達成することができる。一方で、化学的処理により相応するポジションがメチル化されていないDNAから生じた配列と特異的に結合するか、又は化学的処理により相応するポジションがメチル化されているDNAから生じた配列と特異的に結合するプローブオリゴヌクレオチドが使用される。ライゲーションのために、このプローブが、前記したように、相互に隣接してハイブリダイゼーションしなければならない。このプローブは、特に有利に2つの異なる蛍光染料、例えば消光色素とマーカーとして利用する蛍光色素とを備えている。鋳型としての調査すべきDNAとのMLA反応が行われる場合には、消光色素とマーカーとして利用する蛍光色素が2つのプローブのライゲーションにより接触する。それによりマーカー色素の蛍光の減少は直接可視になる。
プローブの識別及びそれによるマルチプレックス化を達成するために、複数のプローブの異なる発光波長を有する多様な蛍光色素を、多様な消光プローブと一緒に使用するのが好ましい。
メチル化の程度の正確な定量化が望ましい場合には、好ましくは異なる色素を有する2つの相互に競合するプローブペアを使用することができ、この場合、一方は調査すべきDNA中のメチル化されていないポジションの場合にハイブリダイゼーションし、他方は逆にメチル化されているポジションの場合に好ましくはハイブリダイゼーションする。2つの色素に対する蛍光の増加の割合から、調査されたポジションのメチル化の程度が推定される。
しかしながらPCRの間にも蛍光の変化が行われる基本的に他の方法は、現在ではLightCyclertm技術として公知である。この場合、2つの色素がすぐ近くで、つまり1−5ヌクレオチドで相互に離れて存在する場合に、2つの色素の間でだけ蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が行われることが利用される。第2の色素は第1の色素の発光によってだけ励起することができ、次いで他の波長のそれ自体の光が放射され、この光が次に検出される。この方法は、MLAについても同様に適用され、この場合に両方のプローブはライゲーションの後に連結され、引き続く変性工程でもはや分離されなくなる。
メチル化分析のこの場合に、蛍光標識されたプローブと該当する化学的処理されたDNAとCpGポジションでハイブリダイゼーションが行われ、かつこのプローブの結合はまた調査すべきDNAがこのポジションでメチル化されて存在するか又はメチル化されていないで存在するかどうかに依存する。このプローブと直接隣接して、他の蛍光色素を有する他のプローブが結合する。この結合は、該当する配列断片中に他のメチル化可能なポジションが存在する場合に、好ましくはメチル化に依存して行われる。増幅の間にDNAは増加し、そのために該当するポジションで次第に多くの蛍光標識されたプローブがハイブリダイゼーションし、その場合にこれが連結のために必要なメチル化状態を有する限り相互に連結し、従って増大するFRETが測定される。
特に好ましくは、使用したオリゴヌクレオチドのそれぞれが、本発明による方法の工程1の処理の前に少なくとも2つのCpGジヌクレオチドを含有する配列とハイブリダイゼーションする。また、プローブは、配列断片中に、できる限り多くの、両方のオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイゼーションするCGポジションを有するようにデザインされていることが特に好ましい。
この方法の場合でも、好ましくは多くの異なる蛍光標識されたプローブを用いてマルチプレックス化を行うのが好ましい。この場合に、また、隣接してハイブリダイゼーションするプローブの一方が、それぞれ所定の標識、例えば消光色素を有し、かつ他方がその配列に応じて他の、それぞれの配列に特異的な標識、例えば蛍光色素を有するのが特に好ましい。例えば、マルチプレックス化されたアッセイにおいて1つの消光色素だけを使用するが、しかし4つの異なる蛍光色素を使用することが可能であり、かつ好ましい。
2つの蛍光色素を使用し、その際に、一方は他方の蛍光を励起することができるか、又は1つの蛍光色素と1つの消光色素を使用し、この消光色素は他方の色素の蛍光を相応して消光できるようにすることができる。
2つの方法は、結果的に、増幅の間に、一方の場合では蛍光の減少が測定され、他方の場合には蛍光の増加が測定されることにより主に区別される。
本発明の他の特に好ましくは実施態様の場合には、ライゲーション工程に対して付加的に、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブの延長が行われ、これはこの増幅方法の特異性を更に高める。この方法の場合には、オリゴヌクレオチドプローブは直接隣接しておらず、特に好ましくは1〜10塩基のわずかな間隔で相互に離れている。この間隙は、ポリメラーゼ反応によりヌクレオチドで充填される。付加的に使用するポリメラーゼを用いたこの延長は、なお処理されていないDNA中で該当するポジションにCpGジヌクレオチドが存在する場合に、メチル化特異的に行うことができるか、又は単に配列特異性を高めることができる。この延長は、1つ又は比較的わずかな数の塩基を介して行うのが好ましく、特に1〜10塩基の間で行うのが好ましい。この方法の特に好ましい実施態様の場合には、オリゴヌクレオチドプローブは、調査すべきCGポジションに直接隣接する。オリゴヌクレオチドプローブの一方はCGジヌクレオチドの1つの塩基と重複するのが特に好ましい。また、プライマー延長により充填されるオリゴヌクレオチドプローブの間の断片中に、メチル化可能なポジションが1つだけ存在するのが特に好ましい。
n個のヌクレオチドの公知の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブは、つまり耐熱性ポリメラーゼによって、多くても、第1のオリゴヌクレオチドプローブの3’末端と第2のハイブリダイゼーションされたオリゴヌクレオチドプローブの5’末端との間に存在するヌクレオチドの数だけ延長される。この場合に、少なくとも1つのヌクレオチドが検出可能な標識を有するのが好ましい。この検出可能な標識は、また、オリゴヌクレオチドプローブの一方と結合している他の標識と相互作用し、その結果、標識されたヌクレオチドの組み込みの程度を測定できるのが特に好ましい。この相互作用は、特に好ましい蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)である。この方法の特に好ましくは実施態様の場合には、従って、第1のオリゴヌクレオチドプローブ及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプローブが検出可能な標識を有する。延長の種類は、この場合に好ましくはゲノムDNA試料中の少なくとも1つのシトシンのメチル化状態に依存するか、又は場合により存在するSNP、点突然変異又は欠失、挿入及び反転に依存する。
この方法の特に好ましい実施態様の場合には、使用されたヌクレオチドは終端化及び/又は鎖長延長するヌクレオチドである。この場合には、終端化するヌクレオチドは好ましくは2’,3’−ジデオキシヌクレオチドであり、かつ鎖長延長するヌクレオチドは2’−デオキシヌクレオチドである。この場合に、この方法の工程1による処理の前に、バックグラウンドDNAにとって典型的なメチル化状態がそれぞれの鋳型鎖中に存在する場合に、特に好ましくは、引き続くライゲーションが行われない終端化するヌクレオチドが組み込まれる。それに対して、この方法の工程1による処理の前に、それぞれの鋳型鎖中に調査すべきDNAに対して典型的なメチル化状態が存在する場合に、鎖長延長するヌクレオチドが組み込まれる。
この方法の他の特に好ましい実施態様の場合には、増幅のために4つの全てのヌクレオチドは使用されず、最大でも3つのヌクレオチド、特に好ましいヌクレオチドdATP、dCTP及びdTTP又はヌクレオチドdATP、dGTP及びdTTPだけが使用される。また、dTTPの代わりにそれぞれdUTPを使用することもできる。
3つだけのヌクレオチドを使用するための配列の例が、図3に図示されている。
ライゲーション反応とポリメラーゼ工程とを組み合わせる場合に、オリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、その3’末端がポリメラーゼにより延長されることがないように修飾されている。この3’末端は、リン酸基で官能化されて存在するか又は2’−3’ジデオキシ−修飾されて存在するのが特に好ましい。
また、使用されたポリメラーゼが5’−エキソヌクレアーゼ活性を示さないか又は極めてわずかな5’−エキソヌクレアーゼ活性しか示さないのが特に好ましい。従って、Taq−ポリメラーゼのStoffelフラグメントを使用するのが特に好ましい。
この方法の他の特に好ましい実施態様の場合には、オリゴヌクレオチドプローブに対して付加的に少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドを使用する。このブロッカーオリゴヌクレオチドは、好ましくはバックグラウンド−DNAと結合し、付加的なポリメラーゼ工程の場合にリガーゼ反応及び/又はプライマー延長を阻害する。
この方法の特に好ましい実施態様の場合には、ブロッカーオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドプローブの1つによってもカバーされているポジションと結合する。この方法の他の特に好ましい実施態様の場合には、ブロッカーオリゴヌクレオチドが、第1のオリゴヌクレオチドプローブにより部分的に及び第2のオリゴヌクレオチドプローブによって部分的にカバーされているポジションに結合する。この場合に、ブロッカーオリゴヌクレオチドは特に、ハイブリダイゼーションしたプローブオリゴヌクレオチドのライゲーションを行うことができるポジションと結合する。
この方法の他の特に好ましい実施態様の場合には、ブロッカーオリゴヌクレオチドが両方のハイブリダイゼーションしたオリゴヌクレオチドプローブの間のポジションに結合し、結合しない場合にはこのポジションはポリメラーゼ反応を用いた第1のプローブの延長により埋められてしまう。
ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用する場合に、このブロッカーオリゴヌクレオチドの3’末端がポリメラーゼによって延長されることがないように修飾されているのが特に好ましい。この3’末端は、リン酸基で官能化されて存在するか又は2’−3’ジデオキシ−修飾されて存在するのが特に好ましい。PNA(ペプチド核酸)又は他の核酸類似体のブロッカー分子としての同様の使用も特に好ましい。
同様に、このブロッカーは場合により使用されたポリメラーゼの5’−エキソンヌクレアーゼ活性によりほとんど分解されることがないのが好ましい。このために、例えばブロッカーの5’末端は修飾されて存在することができるか又は特に有利にブロッカーオリゴヌクレオチドの5’末端までの1つ又は複数のホスホロチオエート架橋が存在することができる。
プローブオリゴヌクレオチドをその使用の前にMLA中でホスホリル化するか又は直接慣用のオリゴヌクレオチド合成を用いて5’末端をホスホリル化して製造するのが特に好ましい。プローブのホスホリル化をポリヌクレオチドキナーゼ及びATPを用いて行うのが特に好ましい。このホスホリル化は第2のオリゴヌクレオチドのためだけにその都度必要である。
要約すると、次の工程を実施するDNA試料中のシトシン−メチル化を検出する方法が特に好ましい。
1.メチル化されていないシトシン塩基がウラシルへと変換されるが、5−メチルシトシン塩基は変化されないままであるように、ゲノムDNA試料を処理する工程、
2.化学的に処理されたDNA試料を、少なくとも2対のほぼ相補的なプローブオリゴヌクレオチド並びにリガーゼを使用して増幅する工程、及び
3.増幅物を分析し、増幅物の存在から調査すべきDNA中のメチル化状態を推定する工程。
1.メチル化されていないシトシン塩基がウラシルへと変換されるが、5−メチルシトシン塩基は変化されないままであるように、ゲノムDNA試料を処理する工程、
2.化学的に処理されたDNA試料を、少なくとも2対のほぼ相補的なプローブオリゴヌクレオチド並びにリガーゼを使用して増幅する工程、及び
3.増幅物を分析し、増幅物の存在から調査すべきDNA中のメチル化状態を推定する工程。
特に有利な方法の実施態様の場合には、試料−DNAを個体の血清又は他の体液から得る。同様に、試料DNAは、セルライン、血液、痰、便、尿、血清、脳脊髄液、パラフィン中に埋め込まれた組織、例えば目、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房又は肝臓の組織、組織学的対象キャリア及びこれらの全ての可能な組み合わせから得ることが好ましい。
この方法の特に有利な実施態様の場合には、化学的処理を重亜硫酸塩(=二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩)で実施する。DNAをアガロース中へ埋め込んだ後に化学的処理を実施するのが好ましい。同様に、化学的処理の際にDNA二本鎖を変性する試薬及び/又はラジカル捕捉剤を添加するのが好ましい。
分析のためにTaqmanアッセイを実施するのが特に好ましい。同様に、LightCyclerアッセイ(前記したように)を実施することも好ましい。
プライマーに対して付加的に使用されるオリゴヌクレオチドは3’−OH機能を提供しないのが特に好ましい。更に、レポーターオリゴヌクレオチドは少なくとも1つの蛍光標識を有するのが特に好ましい。
レポーター分子が蛍光の増加又は減少によって増幅を示し、かつ蛍光の増加又は減少を分析のためにも直接使用され、かつこの蛍光シグナルから分析すべきDNAのメチル化状態を推定することが特に好ましい。
同様に、他の分析を、増幅された調査すべきDNAの長さの測定により行うことも特に有利であり、その際に長さの測定のための方法は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー(例えばHPLC)、質量分析及び他の適当な方法を含める。
他の分析を配列決定によって行う方法も特に好ましく、その際に、配列決定のための方法は、サンガー法、マキサム−ギルバート法及びハイブリダイゼーションによる配列決定(SBH)のような他の方法を含める。更に、それぞれ別個のプライマーオリゴヌクレオチドを有するCpGポジションの全ての又は小さなグループについて配列決定(ザンガー法による)を実施し、このプライマーの延長は1塩基又は数塩基だけであり、かつプライマー延長の種類から調査すべきDNA中の該当するポジションのメチル化状態を推定する方法が好ましい。
特に有利な方法の実施態様の場合には、調査された異なるCpGポジションでのメチル化の程度から、疾患の存在又は患者の他の医学的状態が推定される。
増幅物自体は検出のために検出可能な標識を備えているのも特に好ましい。この標識は、有利に蛍光標識、放射性核種又は、質量スペクトル分析器において分析される分離可能な質量標識である。
増幅物は、同様に、全体として質量分析装置中で分析され、従ってその質量によって明らかに特性決定されている方法の実施態様も好ましい。
本発明の他の対象は、患者又は個体にとって不利な事象の診断及び/又は予後のための、前記の方法の使用でもあり、その際にこの不利な事象とは、次のカテゴリーの少なくとも1つに属する。不所望な医薬品の作用;腫瘍疾患;CNSの機能不全、障害又は疾患;攻撃性症状又は行動傷害;脳障害の臨床的な心理学的及び社会的予後;心理学的障害及び人格障害;痴呆及び/又は随伴症状;心臓血管の疾患、機能不全及び障害;胃腸管の機能不全、障害又は疾患、呼吸器系の機能不全、障害又は疾患;損傷、炎症、感染、免疫及び/又は回復;発育プロセスにおける偏差として身体の機能不全、障害又は疾患;皮膚、筋肉、結合組織又は骨の機能不全、障害又は疾患;内分泌及び代謝の機能障害、障害又は疾患;頭痛又は性的機能障害。
さらに、細胞タイプ又は組織の区別のため又は細胞分化の調査のための前記の方法の使用が好ましい。
次の実施例は本発明を詳説する。
メチル化されていない及びメチル化されたDNAの製造及び重亜硫酸塩−処理
メチル化されたDNAの製造のために、ヒトのゲノムDNAを、S−アデノシルメチオニン及びCpG−メチラーゼ(SssI,New England Biolabs)を用いて製造元の指示に従って処理した。対照としてのメチル化されていないDNAの製造は、次の実施例にとっては必要なかった、それというのも市販されているヒトDNA(Promega)において該当するポジションは例外なくメチル化されていないで存在しているためである。この重亜硫酸塩処理は、刊行物に記載されたアガロース法(Olek A,Oswald J,Walter J.著 A modified and improved method for bisulphate based cytosine methylation analysis.Nucleic Acids Res.1996 DEC 15;24(24):5064−6)によって実施した。メチル化されたDNA及びメチル化されていないDNAは同じ量で(約700ng)で、それぞれ2つの異なるが同様に実施した重亜硫酸塩−反応で使用した。
メチル化されたDNAの製造のために、ヒトのゲノムDNAを、S−アデノシルメチオニン及びCpG−メチラーゼ(SssI,New England Biolabs)を用いて製造元の指示に従って処理した。対照としてのメチル化されていないDNAの製造は、次の実施例にとっては必要なかった、それというのも市販されているヒトDNA(Promega)において該当するポジションは例外なくメチル化されていないで存在しているためである。この重亜硫酸塩処理は、刊行物に記載されたアガロース法(Olek A,Oswald J,Walter J.著 A modified and improved method for bisulphate based cytosine methylation analysis.Nucleic Acids Res.1996 DEC 15;24(24):5064−6)によって実施した。メチル化されたDNA及びメチル化されていないDNAは同じ量で(約700ng)で、それぞれ2つの異なるが同様に実施した重亜硫酸塩−反応で使用した。
配列GGGCGTTTTTTTGCGGTCGACGTTCGGGGTGTA(SEQ−ID:1)(重亜硫酸塩−処理後)をMLAにより調査した。該当するメチル化ポジションがDNA試料中にメチル化されて存在する場合に、この配列は存在した。実施例1からの、Sssl及び重亜硫酸塩で処理されたDNA試料を使用した。このプローブオリゴヌクレオチドのGGCGTTTTTTTGCGG(SEQ−ID:2)及びTCGACGTTCGGGGT(SEQ−ID:3)並びに、これと相補的なプローブオリゴヌクレオチドCCGCAAAAAAACGCC(SEQ−ID:4)及びACCCCGAACGTCGA(SEQ−ID:5)を使用し、その際、SEQ−ID:3及びSEQ−ID:4はポリヌクレオチドキナーゼを用いて予め5’末端がホスホリル化されている。ライゲーションのために、WO 94/08047記載されたと同様の条件を使用した(40サイクル)。
このライゲーション産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出した。
実施例1に従ったメチル化されていない対照DNAを用いた対照試験は、それに対して検出可能な産物は生じなかった。
このMLA反応は図1に概略的に図示されている。重亜硫酸塩を用いた処理の後に、このDNAは(1)の前では一本鎖であり、CGポジションが重亜硫酸塩反応の前にメチル化されて存在している場合に(2)、適当なハイブリダイゼーション条件下でプローブのハイブリダイゼーションが行われる。このプローブオリゴヌクレオチドがライゲーションされる(3)。生成された二本鎖は、次の工程で変性され、その結果、ライゲーションされたプローブも再び鋳型として利用することができる(4)。これに相補的なプローブオリゴヌクレオチド(5)をハイブリダイゼーションさせ、かつ新たにライゲーションを行う(6)。変性の後に、再び相補的一本鎖が新たに鋳型として使用され、工程(2)〜(7)は、十分なライゲーション産物が生成されるまで複数回繰り返される。
ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用したMLA
大量のバックグラウンドDNAが誤った陽性の結果を引き起こすことが想定できる場合には、さらにバックグラウンドDNAに対するブロッカーを前記したように使用することができる。実施例2と同様の試験を実施する場合に、ブロッカーとしてTGTGGTTGATGTTTG(SEQ−ID:6)を使用することができる。このブロッカーは、バックグラウンドDNAがこの領域内で完全にメチル化されていないで存在する場合に有利に結合する。この条件下で、DNA全濃度に応じて1:100〜1:1000の割合でなおメチル化された鋳型を検出することも可能であり、完全にメチル化されていない対照DNAに対する誤った陽性の結果が生じる危険はない。
大量のバックグラウンドDNAが誤った陽性の結果を引き起こすことが想定できる場合には、さらにバックグラウンドDNAに対するブロッカーを前記したように使用することができる。実施例2と同様の試験を実施する場合に、ブロッカーとしてTGTGGTTGATGTTTG(SEQ−ID:6)を使用することができる。このブロッカーは、バックグラウンドDNAがこの領域内で完全にメチル化されていないで存在する場合に有利に結合する。この条件下で、DNA全濃度に応じて1:100〜1:1000の割合でなおメチル化された鋳型を検出することも可能であり、完全にメチル化されていない対照DNAに対する誤った陽性の結果が生じる危険はない。
図2では、ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用が図示されている。それ自体が鋳型DNA(1)に結合し、オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを妨害する。従って、脱ハイブリダイゼーションの後に鋳型鎖だけが得られ、ライゲーションは行われない。
メチル化されたDNAに相当する鋳型鎖が使用される場合(1a)に、ブロッカーオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは行われることはない。プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション並びにこのライゲーションは、ほとんど妨害されずに進行する(2a)。ライゲーション産物(3a)が得られる。
付加的ポリメラーゼ反応を用いたMLAアッセイの使用
配列GGGCGTTTTTTTGCGGTCGACGTTCGGGGTGTA(SEQ−ID:1)(重亜硫酸塩−処理後)を調査した。該当するメチル化ポジションがDNA試料中にメチル化されて存在する場合に、この配列は存在した。実施例1からの、Sssl及び重亜硫酸塩で処理されたDNA試料を使用した。このプローブオリゴヌクレオチドのGGGGCGTTTTTTTGCGG(SEQ−ID:7)及びTCGACGTTCGGGGT(SEQ−ID:3)並びに、これと相補的なプローブオリゴヌクレオチドCAAAAAAACGCCCC(SEQ−ID:8)及びACCCCGAACGTCGA(SEQ−ID:5)を使用し、その際、全てのプローブオリゴヌクレオチドはそれぞれポリヌクレオチドキナーゼを用いて予め5’末端がホスホリル化されている。さらに、Taqポリメラーゼ(Amplitaq)及びヌクレオチドを添加した。ライゲーションのためにWO 94/08047及びEP0439182に記載されたと同様の条件を使用した。
配列GGGCGTTTTTTTGCGGTCGACGTTCGGGGTGTA(SEQ−ID:1)(重亜硫酸塩−処理後)を調査した。該当するメチル化ポジションがDNA試料中にメチル化されて存在する場合に、この配列は存在した。実施例1からの、Sssl及び重亜硫酸塩で処理されたDNA試料を使用した。このプローブオリゴヌクレオチドのGGGGCGTTTTTTTGCGG(SEQ−ID:7)及びTCGACGTTCGGGGT(SEQ−ID:3)並びに、これと相補的なプローブオリゴヌクレオチドCAAAAAAACGCCCC(SEQ−ID:8)及びACCCCGAACGTCGA(SEQ−ID:5)を使用し、その際、全てのプローブオリゴヌクレオチドはそれぞれポリヌクレオチドキナーゼを用いて予め5’末端がホスホリル化されている。さらに、Taqポリメラーゼ(Amplitaq)及びヌクレオチドを添加した。ライゲーションのためにWO 94/08047及びEP0439182に記載されたと同様の条件を使用した。
同様に、ライゲーション産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により検出した。
実施例1に従ったメチル化されていない対照DNAを用いた対照試験は、それに対して検出可能な産物は生じなかった。
この方法の実施態様において、ヌクレオチドの全部を使用しないことも可能である。例えば、上記の実施例において、dGTP、dCTP及びddATPだけをヌクレオチドとして使用することができる。このddATPは、意図的にではなくメチル化されていないフラグメントが鋳型としてポリメラーゼ反応において使用される場合にだけ組み込まれる。しかしながらこの場合でも、これはターミネーターとして利用されるために、ライゲーションはもはや行われない。
このリガーゼ/ポリメラーゼ反応は図3に概略的に図示されている。重亜硫酸塩を用いた処理の後に、このDNAは(1)の前では一本鎖であり、CGポジションが重亜硫酸塩反応の前にメチル化されて存在している場合に(2)、適当なハイブリダイゼーション条件下でプローブのハイブリダイゼーションが行われる。プローブの間の間隙は、ポリメラーゼ反応において埋められ、引き続きプローブがライゲーションされる(3)。生成された二本鎖は、次の工程で変性され、その結果、ライゲーションされたプローブも再び鋳型として利用することができる(4)。これに相補的なプローブオリゴヌクレオチド(5)をハイブリダイゼーションさせ、かつ新たにライゲーションを行う(6)。変性の後に、再び相補的一本鎖が新たに鋳型として使用され、工程(2)〜(7)は、十分なライゲーション産物が生成されるまで複数回繰り返される。
Claims (44)
- 次の工程:
a) ゲノムDNA試料を、メチル化されていないシトシン塩基がウラシルに変換されるが、5−メチルシトシン塩基は変化されないままとなるように処理する工程、
b) 化学的に処理されたDNA試料を、少なくとも2対のほぼ相補的なプローブオリゴヌクレオチド並びにリガーゼを使用して増幅する工程、及び
c) 増幅物を分析し、増幅物の存在から調査すべきDNA中のメチル化状態を推定する工程、
を実施することを特徴とする、DNA試料中のシトシン−メチル化の検出方法。 - 第2の工程において調査すべきDNAが鋳型として配列相同性のバックグラウンドDNAと比較して優性であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 増幅物中の他のポジションの分析から調査すべきDNA中のメチル化状態を推定することを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 請求項1の工程b)において、プローブオリゴヌクレオチドによりカバーされたCpGポジションがゲノムDNA試料(もしくは調査すべきDNA)中にメチル化されて存在する場合に、プローブオリゴヌクレオチドは次いで鋳型とハイブリダイゼーションし、かつ同じプローブオリゴヌクレオチドは、このポジションで完全に又は部分的にメチル化されていないで存在する鋳型とほとんどわずかな程度しかハイブリダイゼーションしない、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1の工程b)において、プローブオリゴヌクレオチドによりカバーされたCpGポジションがゲノムDNA試料(もしくは調査すべきDNA)中にメチル化されていないで存在する場合に、プローブオリゴヌクレオチドは次いで鋳型とハイブリダイゼーションし、かつ同じプローブオリゴヌクレオチドは、このポジションで完全に又は部分的にメチル化されて存在する鋳型とほとんどわずかな程度しかハイブリダイゼーションしない、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1の工程b)を詳細に次のように実施、すなわち、
a) 隣接するポジションで鋳型とハイブリダイゼーションするプローブオリゴヌクレオチドをライゲーションにより相互に連結させ、
b) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションし、
c) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドに相補的なプローブオリゴヌクレオチドを既に連結されたプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによりそれ自体連結させ、
d) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを、他のライゲーション工程のために鋳型として利用して、連結されたプローブオリゴヌクレオチドをさらに増幅させる、
ことを特徴とする、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。 - プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが5’末端にリン酸基を有することを特徴とする、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが蛍光により検出可能な標識を備えていることを特徴とする、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
- プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが検出可能な標識を備えていることを特徴とする、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも2つのプローブオリゴヌクレオチドが標識を備えていて、この標識の特性がその相互の距離に依存して変化することを特徴とする、請求項8又は9に記載の方法。
- プローブオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの蛍光標識を有することを特徴とする、請求項8から10のいずれか1項に記載の方法。
- プローブ分子は、蛍光の増加又は減少によって増幅を示すことを特徴とする、請求項8から11のいずれか1項に記載の方法。
- 蛍光の増加又は減少が分析のために直接使用され、かつ変化した蛍光シグナルから調査すべきDNAのメチル化状態を推定することを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- バックグラウンドDNAが調査すべきDNAと比較して100倍の濃度で存在することを特徴とする、請求項1から13のいずれか1項に記載の方法。
- バックグラウンドDNAが調査すべきDNAと比較して1000倍の濃度で存在することを特徴とする、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- 試料DNAを個体の血清又は他の体液から採取することを特徴とする、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。
- 試料DNAは、セルライン、血液、痰、便、尿、血清、脳脊髄液、パラフィン中に埋め込まれた組織、例えば目、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房又は肝臓の組織、組織学的対象キャリア及びこれらの全ての可能な組み合わせから得ることを特徴とする、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1の工程a)を、重亜硫酸塩(=二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩)を用いて実施することを特徴とする、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法。
- DNAをアガロースに埋め込んだ後に化学的処理を行うことを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 化学的処理の際にDNA二本鎖を変性する試薬及び/又はラジカル捕捉剤を添加することを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 請求項1の工程c)での分析をオリゴマーアレイへのハイブリダイゼーションによって行い、その際に、オリゴマーは核酸又はそのハイブリダイゼーション特性において類似の分子、例えばPNAであることができることを特徴とする、請求項1から20のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1の工程c)での分析を、増幅された調査すべきDNAの長さの測定により行い、その際に、長さの測定のための方法は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー(例えばHPLC)、質量分析及び他の適当な方法であることを特徴とする、請求項1から21のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1の工程c)による分析を配列決定によって行い、その際に、配列決定のための方法は、サンガー法、マキサム−ギルバート法及びハイブリダイゼーションによる配列決定(SBH)のような他の方法であることを特徴とする、請求項1から22のいずれか1項に記載の方法。
- 調査された異なるCpGポジションでのメチル化状態から、疾患の存在又は患者の他の医学的状態を推定することを特徴とする、請求項1から23のいずれか1項に記載の方法。
- 増幅物自体が検出のために検出可能な標識を備えていることを特徴とする、請求項1から24のいずれか1項に記載の方法。
- 標識が蛍光標識であることを特徴とする、請求項25に記載の方法。
- 標識が放射性核種であることを特徴とする、請求項25に記載の方法。
- 標識は分離可能な質量標識であり、この標識が質量スペクトル分析器において分析されることを特徴とする、請求項25に記載の方法。
- 増幅物は、全体として質量分析装置中で検出され、従ってその質量によって明らかに特性決定されていることを特徴とする、請求項25に記載の方法。
- プローブオリゴヌクレオチドに対して付加的に、ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用し、このブロッカーオリゴヌクレオチドは、好ましくはバックグラウンドDNAと結合し、プローブオリゴヌクレオチドとバックグラウンドDNAとのハイブリダイゼーションを阻害することを特徴とする、請求項1から29のいずれか1項に記載の方法。
- 2つの相互に相補的なブロッカーオリゴヌクレオチド(又はブロッカーPNA、一般にブロッカー分子)を使用することを特徴とする、請求項30に記載の方法。
- ブロッカー分子は、好ましくは鋳型鎖に結合し、この鋳型鎖はこの配列において、請求項1の工程a)による処理の後にメチル化されて存在するDNAに一致することを特徴とする、請求項31に記載の方法。
- ブロッカー分子は、好ましくは鋳型鎖に結合し、この鋳型鎖はこの配列において、請求項1の工程a)による処理の後にメチル化されていないで存在するDNAに一致することを特徴とする、請求項31に記載の方法。
- ブロッカー分子は鋳型DNA中の複数のCpGポジションに結合することを特徴とする、請求項31から33のいずれか1項に記載の方法。
- ブロッカー分子は鋳型DNA中の複数のTpG又はCpAポジションに結合することを特徴とする、請求項31から33のいずれか1項に記載の方法。
- ブロッカーオリゴヌクレオチドはその3末端で修飾されていて、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによりほとんど分解されることがないことを特徴とする、請求項31から35のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1の工程b)を詳細には次のように実施、すなわち、
a) プローブオリゴヌクレオチド(プローブ)を、鋳型鎖のポジションに第1のプローブの3’末端と第2のプローブの5’末端との間に少なくとも1塩基の間隙が残るようにハイブリダイゼーションさせ、
b) 第1のプローブの3’末端がポリメラーゼ反応によって延長され、その際に鋳型鎖に対してそれぞれ相補的なヌクレオチドが組み立てられ、
c) 延長された第1のプローブが延長された第2のプローブとライゲーションによって連結され、
d) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイゼーションし、
e) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドに対して相補的なプローブオリゴヌクレオチドを、既に連結したプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、かつライゲーションによってそれ自体連結させ、かつ
f) 連結されたプローブオリゴヌクレオチドを他のライゲーション工程のための鋳型として利用して、連結されたプローブオリゴヌクレオチドをさらに増加させる、
ことを特徴とする、請求項1から36のいずれか1項に記載の方法。 - 請求項37の工程e)も工程a)〜c)と同様に実施されることを特徴とする、請求項37に記載の方法。
- 熱安定性のポリメラーゼを使用することを特徴とする、請求項37又は38のいずれか1項に記載の方法。
- 熱安定性のリガーゼを使用することを特徴とする、請求項1から39のいずれか1項に記載の方法。
- メチル化ポジションの複数のグループに対するオリゴヌクレオチドプローブの複数のセットを使用し、それによりアッセイのマルチプレックス化が達成されることを特徴とする、請求項1から40のいずれか1項に記載の方法。
- 患者又は個体にとって不利な事象の診断及び/又は予後のための、請求項1から41のいずれか1項に記載の方法の使用において、この不利な事象とは、次のカテゴリー:不所望な医薬品の作用;腫瘍疾患;CNSの機能不全、障害又は疾患;攻撃性症状又は行動傷害;脳障害の臨床的な心理学的及び社会的予後;心理学的障害及び人格障害;痴呆及び/又は随伴症状;心臓血管の疾患、機能不全及び障害;胃腸管の機能不全、障害又は疾患;呼吸器系の機能不全、障害又は疾患;損傷、炎症、感染、免疫及び/又は回復;発育プロセスにおける偏差として身体の機能不全、障害又は疾患;皮膚、筋肉、結合組織又は骨の機能不全、障害又は疾患;内分泌及び代謝の機能障害、障害又は疾患;頭痛又は性的機能障害の少なくとも1つに属する、請求項1から41のいずれか1項に記載の方法の使用。
- 細胞タイプ又は組織の区別のため又は細胞分化の調査のための、請求項1から42のいずれか1項に記載の方法の使用。
- 重亜硫酸塩を含有する試薬、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、好ましくは熱安定性のリガーゼ及び緩衝剤並びに場合により本発明によるアッセイの実施のための使用説明書からなるキット。
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