EP1463841A2 - Verfahren zum nachweis von cytosin-methylierungsmustern durch exponentielle ligation hybridisierter sondenoligonukleotide (mla) - Google Patents

Verfahren zum nachweis von cytosin-methylierungsmustern durch exponentielle ligation hybridisierter sondenoligonukleotide (mla)

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Publication number
EP1463841A2
EP1463841A2 EP03704206A EP03704206A EP1463841A2 EP 1463841 A2 EP1463841 A2 EP 1463841A2 EP 03704206 A EP03704206 A EP 03704206A EP 03704206 A EP03704206 A EP 03704206A EP 1463841 A2 EP1463841 A2 EP 1463841A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
probe oligonucleotides
probe
examined
linked
Prior art date
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Ceased
Application number
EP03704206A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kurt Berlin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epigenomics AG filed Critical Epigenomics AG
Publication of EP1463841A2 publication Critical patent/EP1463841A2/de
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of cytosine methylation in DNA samples.
  • 5-Methylcytosine is the most common covalently modified base in the DNA of eukaryotic cells. For example, it plays a role in the regulation of transcription, in genetic imprinting and in tumorigenesis. The identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is therefore of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing, since 5-methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. In addition, in the case of PCR amplification, the epigenetic information which the 5-methylcytosins carry is completely lost.
  • a relatively new and the most frequently used method for the examination of DNA for 5-methyl-cytosine is based on the specific reaction of bisulfite with cytosine, which is subsequently se is converted into uracil, which corresponds to the thymidine in its base pairing behavior.
  • 5-methylcyto-sin is not modified under these conditions. This transforms the original DNA into methylcytosine, which is originally due to be
  • Hybridization behavior from cytosine can not be distinguished, now by "normal" molecular biological techniques as the only remaining cytosine can be detected, for example by amplification and hybridization or sequencing. All of these techniques are based on base pairing, which is now being fully exploited
  • Sensitivity is defined by a process that includes the DNA to be examined in an agarose matrix, thereby preventing the diffusion and renaturation of the DNA (bisulfite only reacts on single-stranded DNA) and replacing all precipitation and purification steps with rapid dialysis (Olek A , Oswald J, Walter J. A modified and proven method for bisulphate based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15; 24 (2): 5064-6).
  • Urea improves the efficiency of bisulfite treatment before sequencing 5-methylcytosine in genomic DNA (Paulin R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA. Urea improves efficiency of bisulphate-mediated sequencing of 5'-methylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 1998 Nov. 1; 26 (21): 5009-10).
  • Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5 'region of the pS2 gene andin its expression in human breast cancer cell lines. Genes. 1995 May 19; 157 (1-2): 261-4; WO 97 46705, WO 95 15373 and WO 45560.
  • methylation-sensitive PCR (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation Status of CpG islands. Proc Natl Acad Sei US A. Sep 3; 93 (18): 9821-6).
  • primers are used which either hybridize only to a sequence which results from the bisulfite treatment of a DNA which is unmethylated at the position in question, or conversely primers which only bind to a nucleic acid which is caused by the bisulfite -Treatment of a DNA unmethylated at the position in question arises. With these primers, amplicons can accordingly be generated, the detection of which in turn provides evidence of the presence of a methylated or unmethylated position in the sample to which the primers bind.
  • a newer method is also the detection of cytosine methylation by means of a Taqman PCR, which has become known as MethylLight (WO00 / 70090). With this method it is possible to check the methylation status of individual or fewer positions directly in the course of the PCR. assign, so that a subsequent analysis of the products is unnecessary.
  • Matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry is a very powerful development for the analysis of biomolecules (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct. 15; 60 (20): 2299-301).
  • An analyte is embedded in a light-absorbing matrix. The matrix is evaporated by a short laser pulse and the analyte molecule is thus transported unfragmented into the gas phase. The ionization of the analyte is achieved by collisions with matrix molecules.
  • An applied voltage accelerates the ions into a field-free flight tube. Due to their different masses, ions are accelerated to different extents. Smaller ions reach the detector earlier than larger ones.
  • MALDI-TOF spectroscopy is excellently suited for the analysis of peptides and proteins.
  • the analysis of nucleic acids is somewhat more difficult (Gut, IG and Beck, S. (1995), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends 1: 147-157.)
  • the sensitivity is about 100 times worse than for peptides and decreases disproportionately with increasing fragment size.
  • nucleic acids that have a backbone that is often negatively charged the ionization process through the matrix is much more inefficient.
  • Genomic DNA is obtained by standard methods from DNA from cell, tissue or other test samples. This standard methodology can be found in references such as Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989. Methods for amplifying DNA fragments are state of the art. The most frequently used method, the polymerase chain reaction (PCR), is mainly used to amplify discrete fragments of genomic DNA using two primers. The above-mentioned method for methylation detection, MSP, also uses this method. Other methods for the detection of methylation, which are based on bisulfite-treated DNA, also use PCR as an amplification method in order to overcome sensitivity problems.
  • PCR polymerase chain reaction
  • LCR ligase chain reaction
  • EP0320308 and EP0439182. The latter describes a combination of the LCR with a polymerase reaction.
  • both primers are selected so that they usually cover several methylable positions to be examined for their methylation status. Only when these mostly 3 or more positions have essentially the same methylation status (eg all methylated), does the primer hybridize to the position in question in the template and an amplification by means of PCR can take place. If both primers are selected in this way, it is possible to achieve very high sensitivity of the method. For example, 1 continuous methylated template can be detected in a background of 10,000 unmethylated templates, since the unmethylated templates are not amplified when appropriately specific primers are used.
  • a disadvantage of the method is its sequence dependency. It is necessary to find precisely those positions that are co-methylated in order to achieve the corresponding sensitivities. If the CpG positions are too far apart, very long primers are required, which in turn can be disadvantageous for the PCR itself and can also be disadvantageous for the sensitivity. The annealing temperature of such primers is then very high. It is also required to generate a methylation sensitive
  • MLA methylation-sensitive ligation and amplification
  • the present invention is therefore a method which overcomes disadvantages of the prior art in the area of methylation detection. It can be used for amplification and indirect detection of the methylation status of a group of CpG positions.
  • this can also be used for the selective amplification of a DNA to be examined with a certain methylation status in the presence of sequence-homologous background DNA with a different methylation status.
  • DNA to be examined and background DNA in the sense of this invention are to be explained using the example of the prior art (MSP).
  • the DNA to be examined as well as the nucleic acids otherwise present, hereinafter referred to as background DNA, are otherwise amplified equally, since the primers used are also not able to distinguish between DNA to be examined and background DNA.
  • One possibility to differentiate these DNAs arises from the different methylation pattern.
  • a common procedure is the methylation sitive PCR, short MSP (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation Status of CpG islands. Proc Natl Acad Sei US A.
  • the object is achieved by a method for the detection of cytosine methylation in DNA samples, the following steps being carried out: a) a genomic DNA sample is treated in such a way that the unmethylated cytosine bases are converted into uracil while the 5- Methylcytosine bases remain unchanged; b) the chemically treated DNA sample is amplified using at least 2 pairs of essentially complementary probe oligonucleotides and a ligase and c) the amplificates are analyzed and the presence of an amplificate indicates the methylation status in the DNA to be examined.
  • the DNA to be examined is preferred as the template to the sequence-homologous background DNA.
  • the analysis of further positions in the amplificate indicates the methylation status in the DNA to be examined.
  • step b) the probe oligonucleotides hybridize to a template when those covered by them
  • CpG positions in the genomic DNA sample (or the DNA to be investigated) were methylated and the same probe oligonucleotides hybridize to templates that were completely or partially unmethylated at these positions to a much lesser extent.
  • step b) the probe oligonucleotides hybridize to a template if the CpG positions covered by them in the genomic DNA sample (or the DNA to be examined) were unmethylated and the same probe oligonucleotides were present Hybridize templates that were fully or partially methylated at these positions to a much lesser extent.
  • step b) is carried out in detail as follows: a) the probe oligonucleotides which hybridized at adjacent positions on the template are linked to one another by ligation, b) the linked probe oligonucleotides are dehybridized, c) the probe oligonucleotides complementary to the linked probe oligonucleotides hybridize to the already linked probe oligonucleotides and are in turn linked by ligation, and d) the linked probe oligonucleotides serve as templates for further ligation steps, so that a further proliferation of the linked oligonucleotides he follows.
  • At least one of the probe oligonucleotides carries a phosphate group at the 5 'end.
  • At least one of the probe oligonucleotides is provided with a detectable label, in particular is provided with a label which can be detected by fluorescence. It is particularly preferred that at least two probe oligonucleotides are provided with labels, these changing their properties depending on their distance from one another. It is particularly preferred that the probe oligonucleotides carry at least one fluorescent label. It is further preferred that the probe molecules indicate the amplification either by an increase or a decrease in the fluorescence. In particular, it is preferred according to the invention that the increase or decrease in the fluorescence is also used directly for the analysis and a conclusion is drawn from the changed fluorescence signal that the DNA to be examined is methylated.
  • the background DNA prefferably present in a 100-fold concentration in comparison to the DNA to be examined. It is also preferred that the rear basic DNA is present in 1000-fold concentration compared to the DNA to be examined.
  • the DNA samples are obtained from serum or other body fluids of an individual. It is also preferred according to the invention that the DNA samples from cell lines, blood, sputum, stool, urine, serum, brain-spinal cord fluid, tissue embedded in paraffin, for example tissue from the eyes, intestine, kidney, brain, heart, prostate, lung , Breast or liver, histological slides and all possible combinations thereof.
  • the chemical treatment is carried out after embedding the DNA in agarose.
  • a reagent denaturing the DNA duplex and / or a radical scavenger is present during the chemical treatment.
  • the analysis step c) is carried out by means of hybridization on oligomer arrays, where 0-ligomeric nucleic acids or their hybridization properties can be molecules similar to PNAs.
  • the analysis in step c) is carried out by measuring the length of the amplified DNA to be examined, methods for measuring the length comprising gel electrophoresis, capillary gel electrophoresis, chromatography (e.g. HPLC), mass spectrometry and other suitable methods.
  • methods for measuring the length comprising gel electrophoresis, capillary gel electrophoresis, chromatography (e.g. HPLC), mass spectrometry and other suitable methods.
  • step c) is carried out by sequencing, with measurement Methods for sequencing include the Sanger method, Maxam-Gilbert method and other methods such as Sequencing by Hybridization (SBH).
  • the methylation status at the various CpG positions examined indicates the presence of a disease or another medical condition of the patient.
  • the amplified products are provided with a detectable label even for the detection. It is particularly preferred that the markings are fluorescent markings. It is also preferred that the markings are radionuclides. It is particularly preferred according to the invention that the markings are removable mass markings which are detected in a mass spectrometer. However, it is also particularly preferred that the amplified products as a whole are detected in the mass spectrometer and are therefore clearly characterized by their mass.
  • a blocker oligonucleotide in addition to the probe oligonucleotides, a blocker oligonucleotide is used, which preferably binds to the background DNA and hinders the hybridization of the probe oligonucleotides to the background DNA. It is particularly preferred that two complementary blocker oligonucleotides (or blocker PNAs, generally blocker molecules) are used. Furthermore, it is particularly preferred that the blocker molecules bind preferentially to template strands whose sequence corresponds to a methylated DNA after treatment according to step a). It is also preferred that the blocker molecules bind preferentially to template strands which in their sequence correspond to unmethylated DNA after treatment according to step a).
  • the blocker molecules preferably that the blocker molecules bind to several CpG positions in the template DNA or that the blocker molecules bind to several TpG or CpA positions in the template DNA. It is further preferred according to the invention that the blocker oligonucleotides are modified at their 3 'end and cannot be significantly degraded by a polymerase with nuclease activity.
  • a method is preferred, step b) being carried out in detail as follows: a) the probe oligonucleotides (probe) hybridize at positions on the template strand such that between the 3 'end of the first probe and the 5' end of the a gap of at least one base remains in the second probe, b) the 3 'end of the first probe is extended by a polymer reaction, in each case complementary nucleotides being incorporated into the template strand, c) the extended first probe is extended with the one second probe linked by ligation, d) the linked probe oligonucleotides are dehybridized, e) the probe oligonucleotides complementary to the linked probe oligonucleotides hybridize to the already linked probe oligonucleotides and are in turn linked by ligation and f) the linked probe oligonucleotides serve as templates for further ligation steps, so that another increase in the linked probe oligonucleotides.
  • a heat-stable ligase is used.
  • several sets of oligonucleotide probes are used for several groups of methylation positions and thus multiplexing the assay is achieved.
  • the present invention also relates to the use of a method according to the invention for diagnosing and / or predicting adverse events for patients or individuals, these adverse events belonging to at least one of the following categories: undesirable drug effects; Cancers; CNS malfunction, damage or illness; Symptoms of aggression or behavioral disorders; clinical, psychological and social consequences of brain damage; psychotic disorders and personality disorders; Dementia and / or associated syndromes; cardiovascular disease, malfunction and damage; Malfunction, damage or disease of the gastrointestinal tract; Malfunction, damage or disease of the respiratory system; Injury, inflammation, infection, immunity and / or convalescence; Malfunction, damage or illness of the body as a deviation in the development process; Malfunction, damage or disease of the skin, muscles, connective tissue or bones; endocrine and metabolic dysfunction, injury or illness; Headache or sexual malfunction. It is preferred to use a method according to the invention for differentiating cell types or tissues or for examining cell differentiation.
  • the present invention also relates to a kit consisting of a reagent containing bisulfite, labeled oligonucleotide probes, a preferably thermostable ligase and buffers and optionally instructions for carrying out an assay according to the invention.
  • the object of the invention to provide a sensitive method for methylation analysis which overcomes disadvantages of the prior art is achieved by creating a method for the detection of cytosine methylation in DNA samples by performing the following steps:
  • a genomic DNA sample is treated in such a way that the unmethylated cytosine bases are converted into uracil while the 5-methylcytosine bases remain unchanged,
  • the chemically treated DNA sample is amplified using at least 2 pairs of essentially complementary probe oligonucleotides and a ligase, and
  • Step the DNA to be examined is preferred over the background DNA as a template.
  • the analysis of further positions in the amplificate indicates the methylation status in the DNA to be examined.
  • the second step of the method is particularly preferably carried out as follows:
  • the probe oligonucleotides hybridize to the template if the CpG positions covered by them in the genomic DNA sample (or the DNA to be examined) were methylated and to templates which were completely or partially unmethylated at these positions, if the hybridization of the probe oligonucleotides takes place to a substantially lesser extent, b) the probe oligonucleotides which hybridized at adjacent positions on the template are linked to one another by ligation, c) the linked probe oligonucleotides are dehybridized, d) the probe oligonucleotides complementary to the linked probe oligonucleotides hybridize to the already linked probe oligonucleotides and are in turn linked by ligation and e) the linked probe oligonucleotides serve as a template for further ligation steps, so that the linked probe oligonucleotides are expanded exponentially.
  • the probe oligonucleotides hybridize to the template when the CpG positions covered by them in the genomic DNA sample (or the DNA to be investigated) were unmethylated and the templates were present in those positions which were wholly or partly methylated, the hybridization takes place the probe oligonucleotides take place to a much lesser extent, b) the probe oligonucleotides which hybridized at adjacent positions on the template are linked to one another by ligation, c) the linked probe oligonucleotides are dehybridized, d) the probe oligonucleotides complementary to the linked probe oligonucleotides hybridize to those already linked Probe oligonucleotides and are in turn linked by ligation and e) the linked probe oligonucleotides serve as a template for further ligation steps, so that the linked probe oligonucleotides are expanded exponentially.
  • the methylation-sensitive step is the neighboring methylation-sensitive (on the corresponding bisulfite-treated DNA) hybridization of two probe oligonucleotides in step a). Once ligation has taken place, these linked oligonucleotides are amplified exponentially.
  • one of the probe oligonucleotides should have a terminal phosphate group. Otherwise, this must be inserted in a separate phosphorylation step.
  • the DNA samples are obtained from serum or other body fluids of an individual.
  • DNA samples from cell lines, blood, sputum, stool, urine, serum, brain-spinal fluid, paraffin-embedded tissue for example tissue from the eyes, intestine, kidney, brain, Heart, prostate, lungs, chest or liver, histological slides and all possible combinations of these wins.
  • the degree of methylation at the various CpG positions examined indicates the presence of a disease or another medical condition of the patient.
  • reporter molecules indicate the amplification either by an increase or a decrease in the fluorescence. It is particularly advantageous that the increase or decrease in fluorescence is also used directly for the analysis and a conclusion is drawn from the fluorescence signal that the DNA to be analyzed is in a methylated state.
  • Fluorescence energy transfer can either stimulate one dye, provided it is in spatial proximity to the other and the other is excited, to fluoresce. On the other hand, it is also possible for one dye to suppress the fluorescence of the other if it is spatially adjacent to it (quenching). Both methods can be used to visualize the progress of the MLA. Analogously, the methods are used in PCR as Taqman or Lightcycler assays.
  • the background DNA is present in a 100-fold concentration in comparison to the DNA to be examined. It is further preferred that the background DNA is in 1000 times the concentration compared to the DNA to be examined.
  • oligomers can be nucleic acids or their hybridization properties can be molecules similar to PNAs (peptide nucleic acids).
  • the analysis or, if appropriate, the further analysis is carried out by measuring the length of the amplified linked probe oligonucleotides, methods for measuring the length comprising gel electrophoresis, capillary gel electrophoresis, chromatography (e.g. HPLC), mass spectrometry and other suitable methods.
  • methods for measuring the length comprising gel electrophoresis, capillary gel electrophoresis, chromatography (e.g. HPLC), mass spectrometry and other suitable methods.
  • the amplified products are provided with a detectable label even for the detection. It is also advantageous that the markings are fluorescent markings, and / or that the markings are radionuclides or / and that the markings are detachable mass markings that are detected in a mass spectrometer.
  • the amplificates carry markings such as biotin, for example, so that they can be selectively bound to solid phases.
  • an oligonucleotide probe labeled with biotin and a fluorescence-labeled oligonucleotide probe are linked to one another and the products are then bound to, for example, streptavidin.
  • a fluorescence signal of the bound species can therefore only be measured if a linkage has taken place. The fluorescence signal is in through the method given limits proportional to the number of ligations that took place.
  • the amplificates are detected overall in the mass spectrometer and are therefore clearly characterized by their mass.
  • Another object of the present invention is the use of a method according to the invention for the diagnosis and / or prognosis of adverse events for patients or individuals, these adverse events belonging to at least one of the following categories: undesirable drug effects; Cancers; CNS malfunction, damage or illness; Symptoms of aggression or behavioral disorders; clinical, psychological and social consequences of brain damage; psychotic disorders and personality disorders; Dementia and / or associated syndromes; cardiovascular disease, malfunction and damage; Malfunction, damage or disease of the gastrointestinal tract; Malfunction, damage or disease of the respiratory system; Injury, inflammation, infection, immunity and / or convalescence; Malfunction, damage or illness of the body as a deviation in the development process; Malfunction, damage or disease of the skin, muscles, connective tissue or bones; endocrine and metabolic dysfunction, injury or illness; Headache or sexual malfunction.
  • the present invention also relates to a kit consisting of a reagent containing bisulfite, labeled oligonucleotide probes, a preferably thermostatic bile ligase and buffers and optionally instructions for performing an assay according to the invention
  • the preferred method consists of several steps, which can be summarized as follows:
  • a DNA serum and / or other body fluids are removed from the patient and the DNA contained therein is isolated if necessary.
  • an amplifying ligation is now carried out, in which the DNA to be examined is preferably amplified, but not or only to a lesser extent the background DNA. In any case, the amplification takes place depending on whether a certain methylation status on at least one DNA fragment in the
  • Sample is present, such as, for example, preferably all methylp CpG positions in the positions bind to the probe oligonucleotides.
  • the amplified fragments are now identified and the methylation status in the genomic DNA sample is inferred. From this, it is preferably concluded that there is a disease or another medical condition of the patient.
  • the genomic DNA used in the method is preferably obtained from a DNA sample, sources of DNA e.g. B. cell lines, blood, sputum, stool, urine, serum, brain spinal fluid, paraffin-embedded tissue, for example tissue from the eyes, intestine, kidney, brain, heart, prostate, lungs, breast or liver, histological slides and all possible combinations here of include. Isolation of DNA from body fluids of an individual, such as sputum, serum, plasma, whole blood, urine or ejaculate, is particularly preferred.
  • sources of DNA e.g. B. cell lines, blood, sputum, stool, urine, serum, brain spinal fluid, paraffin-embedded tissue, for example tissue from the eyes, intestine, kidney, brain, heart, prostate, lungs, breast or liver, histological slides and all possible combinations here of include.
  • Isolation of DNA from body fluids of an individual such as sputum, serum, plasma, whole blood, urine or ejaculate, is particularly preferred.
  • the DNA is purified or concentrated prior to the bisulfite treatment in order to avoid disrupting the bisulfite reaction and / or the subsequent PCR due to an excessive level of impurities.
  • a PCR can be carried out from tissue after treatment, for example with Proteinase K, without further purification, and this also applies mutatis mutandis to the bisulfite treatment and subsequent PCR.
  • a bisulfite hydrogen sulfite, disulfite
  • sodium bisulfite ammonium bisulfite is less suitable.
  • the reaction is carried out according to a published variant, the embedding of the DNA in agarose is preferred in order to keep the DNA in a single-stranded state during the treatment, or else according to a new variant by treatment in the presence of a radical scavenger and a denaturing reagent, preferably one Oligeothylene glycol dialkyl ether or, for example, dioxane.
  • the reagents are either removed by washing in the case of the agarose method or a DNA purification method (prior art, precipitation or binding to a solid phase, membrane) or simply brought into a concentration range by dilution which PCR no longer significantly affected.
  • the methylation positions to be investigated are selected and suitable probe oligonucleotides are selected which selectively amplify the assays to be investigated. allow appropriate DNA.
  • the positions are selected either on the premise that they should differ as much as possible between the background DNA and the DNA to be investigated with regard to their methylation, or the presence of such methylation in a large part of the DNA samples already for a disease or suggests a certain other medical condition of an individual.
  • the methylation profiles of the sections of a gene in question are first determined both for the DNA to be examined from diseased individuals and for the background DNA from healthy individuals.
  • positions which have the greatest differences between the DNA to be examined and background DNA are selected as the positions to be examined.
  • Such positions are already known for a large number of genes, for example for GSTpi, for HIC-1 and MGMT (from Wronski MA, Harris LC, Tano K, Mitra S, Bigner DD, Brent TP. (1992) Cytosine methylation and suppression of 06 -methylguanine-DNA methyltransferase expression in human rhabdomyosarcoma cell lines and xenografts.
  • DNA (which then only occurs in diseased individuals) is present in ethyl form. If probe oligonucleotides are used in the MLA which preferentially bind to the sequence which is formed in the bisulfite treatment from unmethylated background DNA, a ligation product is only produced if at least a small amount of DNA to be examined is present at all ,
  • Detection techniques that are also suitable for the detection of the amplified products are hybridization on oligomer arrays and, for example, primer extension (mini-sequencing) reactions.
  • the hybridization to oligomer arrays can be used without further modification of protocols compared to the closest prior art (Olek A, Olek S, Walter J; WO 99/28498 AI).
  • the amplificate or the amplificates is particularly preferably fluorescent or radioactive or labeled with detachable mass tags, so that after the hybridization, the fragments bound to the two oligonucleotides of a pair can be detected and quantified using this label.
  • oligomers which do not bind at CpG positions to control the experiment. These bind to ligation products of non-methylation-sensitive probe oligonucleotides, which are used for quality control and / or quantification of the sample DNA.
  • a particularly preferred variant of the method is the use of Taqman or Lightcycler technology variants for real-time detection of the amplification.
  • This change in fluorescence during amplification which is dependent on the methylation status, can be achieved by numerous methods.
  • probe oligonucleotides can be used which specifically bind either to a sequence which has been produced by chemical treatment from a DNA unmethylated at the corresponding position, or correspondingly to a sequence which has been produced by chemical treatment from a DNA methylated at the corresponding position is.
  • these probes must hybridize adjacent to one another.
  • These probes are particularly preferably provided with two different fluorescent dyes, a quencher dye and a fluorescent dye serving as a marker.
  • the quencher dye and the fluorescent dye serving as a marker are brought into contact by ligation of the two probes. As a result, a decrease in the fluorescence of the marker dye is immediately visible.
  • Different fluorescent dyes with different emission wavelengths are preferred on several special which are used together with various quenching probes in order to differentiate between the probes and thus multiplexing.
  • two competing probe pairs with different dyes can preferably also be used, one again in the case of an unmethylated position in the DNA to be examined, the other vice versa
  • hybridization is preferred.
  • the ratio of the increase in fluorescence for the two dyes can then be used to infer the degree of methylation of the examined position.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • This method can also be used analogously for the MLA, except that in this case the two probes are linked after the ligation and no longer separate in the subsequent denaturation step.
  • a fluorescence-labeled probe is hybridized to the chemically treated DNA in question at a CpG position, and the binding of this probe in turn depends on whether the DNA to be examined was methylated or unmethylated at this position.
  • Immediately adjacent beard to this probe binds another probe with a different fluorescent dye. This binding is preferably in turn dependent on methylation if there is a further methylatable position in the relevant sequence section.
  • the DNA is now amplified during the amplification, which is why more and more fluorescence-labeled probes hybridize adjacent to the position in question and are linked to one another, provided that this has the required methylation state, and therefore an increasing FRET is measured.
  • each of the 0-ligonucleotide probes used hybridizes to a sequence which contained at least two CpG dinucleotides before the treatment according to step 1 of the method according to the invention. It is again particularly preferred to design the probes such that as many CG positions as possible are located in the sequence section to which the two oligonucleotide probes hybridize.
  • multiplexing is preferably carried out with a plurality of differently fluorescence-labeled probes.
  • one of the neighboring hybridizing probes each contains a specific label, such as a quencher dye, and the other, depending on the sequence, a different label specific to the respective sequence, such as a fluorescent dye.
  • a specific label such as a quencher dye
  • a different label specific to the respective sequence such as a fluorescent dye.
  • the main difference between the two methods is that a decrease in fluorescence is measured in one case and an increase in fluorescence in the other case during amplification.
  • At least one oligonucleotide probe is extended in addition to the ligation step, which further increases the specificity of the amplification method.
  • the oligonucleotide probes do not hybridize directly adjacent to one another, but at a short distance from one another, particularly preferably 1-10 bases.
  • This gap is filled by a polymerase reaction with nucleotides.
  • This extension by means of an additionally used polymerase can either be methylation-specific if there is a CpG dinucleotide at the position in question in the untreated DNA, or it can only increase the sequence specificity.
  • the extension is preferably carried out over either only one or a relatively small number of bases, particularly preferably between 1 and 10 bases.
  • the oligonucleotide probes directly adjoin the CG position to be examined.
  • One of the oligonucleotide probes particularly preferably overlaps with a base of the CG dinucleotide. It is again particularly preferred that there is only one methylatable position in the section between the oligonucleotide probes which is filled in by the primer extension.
  • An oligonucleotide probe with a known sequence of n nucleotides is therefore extended with a heat-resistant polymerase by at most the number of nucleotides that lie between the 3 'end of the first oligonucleotide probe and the 5' end of the second hybridized oligonucleotide probe.
  • At least one nucleotide preferably carries a detectable label. This detectable label can in turn particularly preferably interact with a further label which is bound to one of the oligonucleotide probes, so that the extent to which the labeled nukeotide is incorporated can be measured. This interaction is particularly preferred fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • either the first oligonucleotide probe and / or the second oligonucleotide probe bears a detectable label.
  • the type of extension preferably depends on the methylation status of at least one cytosine in the genomic DNA sample, or on any SNPs, point mutations or deletions, insertions and inversions that are present.
  • the nucleotides used are terminating and / or chain-extending nucleotides.
  • the terminating nucleotide is preferably a 2 ', 3' dideoxynucleotide and the chain-extending nucleotide is a 2 'deoxynucleotide. It is particularly preferred to incorporate a terminating nucleotide which also does not permit subsequent ligation if the methylation status typical of the background DNA was present in the respective template strand before the treatment in accordance with step 1 of the method.
  • a chain-extending nucleotide is incorporated if the methylation status typical of the DNA to be examined was present in the respective template strand before the treatment in accordance with step 1 of the method.
  • Nucleotides used but only a maximum of three nucleotides de, particularly preferably either the nucleotides dATP, dCTP and dTTP or the nucleotides dATP, dGTP and dTTP.
  • dUTP can be used instead of dTTP.
  • FIG. 3 A sequence example for the use of only three nucleotides is shown in FIG. 3.
  • At least one of the oligonucleotides is particularly preferably modified such that it cannot be extended by the polymerase at the 3 'end.
  • the 3 'end is particularly preferably functionalized with a phosphate group or 2' -3 'dideoxy modified.
  • the polymerase used has no or only a very low 5'-exonuclease activity.
  • the Stoffel fragment of Taq polymerase is therefore particularly preferably used.
  • At least one blocker oligonucleotide is used in addition to the oligonucleotide probes.
  • This blocker oligonucleotide preferably binds to the background DNA and hinders the ligase reaction and / or primer extension in the case of an additional polymerase step.
  • a blocker oligonucleotide binds to positions which are also covered by one of the oligonucleotide probes.
  • a blocker oligonucleotide binds to positions which are partially covered by the first oligonucleotide probe and partially by the second oligonucleotide probe.
  • a blocker oligonucleotide binds among other things at the position at which a ligation of the hybridized probe oligonucleotides could otherwise take place.
  • blocker oligonucleotides bind to the positions between the two hybridized oligonucleotide probes, which could otherwise be filled in by extending the first probe by means of a polymerase reaction.
  • blocker oligonucleotides When using blocker oligonucleotides, it is particularly preferred that they are present in such a modified manner that they cannot be extended by the polymerase at the 3 'end.
  • the 3 'end is particularly preferably functionalized with a phosphate group or 2' -3'-dideoxy-modified.
  • PNA peptide nucleic acids
  • other nucleic acid analogs as blocker molecules is also particularly preferred.
  • the blockers cannot be substantially degraded by the 5 'exonuclease activity of a polymerase that may be used.
  • the 5 'ends of the blockers can be modified or, particularly preferably, one or more phosphorothioate bridges can be present towards the 5' ends of the block oligonucleotide.
  • the probe oligonucleotides are particularly preferably phosphorylated prior to their use in the MLA or are phosphorylated directly by conventional oligonucleotide synthesis at the 5 'end. Phosphorylation of the probes is particularly preferably carried out using polynucleotide kinase and ATP. Phosphorylation is only required for the second oligonucleotide probe.
  • a method for the detection of cytosine methylation in DNA samples is particularly preferred, in which the following steps are carried out: 1. A genomic DNA sample is treated in such a way that the unmethylated cytosine bases are converted into uracil while the 5- Methylcytosine bases remain unchanged,
  • the chemically treated DNA sample is amplified using at least 2 pairs of essentially complementary probe oligonucleotides and a ligase, and
  • the sample DNA is obtained from serum or other body fluids of an individual. It is also preferred that the sample DNA from cell lines, blood, sputum, stool, urine, serum, brain spinal cord fluid, tissue embedded in paraffin, for example tissue from the eyes, intestine, kidney, brain, heart, prostate, lung , Breast or liver, histological slides and all possible combinations thereof.
  • a Taqman assay is particularly preferably carried out for the analysis. It is also preferred to perform a LightCycler assay (as described above).
  • the oligonucleotides used in addition to the primers particularly preferably do not have a 3 ′ OH function.
  • the reporter oligonucleotides particularly preferably carry at least one fluorescent label.
  • the reporter molecules indicate the amplification either by an increase or a decrease in the fluorescence and that the increase or decrease in the fluorescence is also used directly for analysis and a methylation state of the DNA to be analyzed is inferred from the fluorescence signal.
  • a method in which the further analysis is carried out by measuring the length of the amplified DNA to be examined is also particularly preferred, methods for measuring the length comprising gel electrophoresis, capillary gel electrophoresis, chromatography (e.g. HPLC), mass spectrometry and other suitable methods.
  • a method in which the further analysis is carried out by sequencing is also particularly preferred, methods for sequencing comprising the Sanger method, Maxam-Gilbert method and other methods such as Sequencing by Hybridization (SBH).
  • SBH Sequencing by Hybridization
  • a method is preferred in which the sequencing (according to Sanger) is carried out for each or a small group of CpG positions, each with a separate primer oligonucleotide and the extension of the primers is only one or a few bases, and from the type of primer extension to the Methylation congestion of the relevant positions in the DNA to be examined is closed.
  • the degree of methylation at the various examined CpG positions is used to infer the presence of a disease or another medical condition of the patient.
  • the amplificates themselves are also particularly preferably provided with a detectable label for the detection.
  • These labels are preferably fluorescent labels, radionuclides or removable mass labels, which are detected in a mass spectrometer.
  • a method variant is also preferred, the amplificates being detected overall in the mass spectrometer and thus being uniquely characterized by their mass.
  • Another object of the present invention is the use of one of the methods described for the diagnosis and / or prognosis of adverse events for patients or individuals, these adverse events belonging to at least one of the following categories: adverse drug effects; Cancers; CNS malfunction, damage or illness; Symptoms of aggression or behavioral disorders; clinical, psychological and social consequences of brain damage; psychotic disorders and personality disorders; Dementia and / or associated syndromes; cardiovascular disease, malfunction and damage; Malfunction
  • Damage or disease of the gastrointestinal tract Malfunction, damage or disease of the respiratory system; Injury, inflammation, infection, immunity and / or convalescence; Malfunction, damage or illness of the body as a deviation in the development process; Skin malfunction, damage or disease, the muscles, connective tissue or bones; endocrine and metabolic dysfunction, injury or illness; Headache or sexual malfunction.
  • methylated DNA human genomic DNA was treated with S-adenosyl methion and the CpG methylase (Sssl, New England Biolabs) according to the manufacturer's instructions.
  • S-adenosyl methion and the CpG methylase (Sssl, New England Biolabs) according to the manufacturer's instructions.
  • the preparation of unmethylated DNA as a reference was not necessary for the following examples, since the positions in question are consistently unmethylated in commercially available human DNA (Promega).
  • the bisulfite treatment was carried out according to the published agarose method (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphate based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC
  • Methylated and untreated DNA was used in equal amounts (approx. 700 ng) in two different bisulfite reactions, but carried out analogously.
  • the probe oligonucleotides GGCGTTTTTTTGCGG (SEQ-ID.2) and TCGACGTTCGGGGT (SEQ-ID: 3) as well as the complementary probe oligonucleotides CCGCAAAAAAACGCC (SEQ-ID: 4) and ACCCCGAACGTCGA (SEQ-ID.5) were used, whereby the 3 and SEQ-ID: 4 were previously phosphorylated at the 5 'end by means of polynucleotide kinase. Conditions as described in WO 94/08047 (40 cycles) were used for the ligation.
  • the ligation products were detected using polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the MLA reaction is shown schematically in FIG. 1. After treatment with bisulfite, the DNA is single-stranded (1) and allows one of the appropriate ones
  • Hybridization conditions the hybridization of the probes when the CG positions were methylated before the bisulfite reaction (2).
  • the probe oligonucleotides are ligated (3).
  • the double strand formed is now denatured in the next step, so that the ligated probes can in turn also serve as a template (4).
  • the complementary probe oligonucleotides (5) hybridize to this and a new ligation takes place (6). After denaturing, the complementary single strand is again available as a template and steps (2) to (7) can be repeated several times until sufficient ligation product has been formed.
  • Example 3 Example 3:
  • a blocker for the background DNA as described above can also be used. If the experiment is carried out analogously to Example 2, TGTGGTTGATGTTTG (SEQ ID: 6) can be used as a blocker. This block preferably binds when the background DNA was completely unmethylated in this area. Under these conditions it is possible to detect methylated templates at a ratio of 1: 100 to 1: 1000 depending on the total DNA concentration, without risking false positive results for the completely unmethylated control DNA.
  • FIG. 1 The use of a blocker oligonucleotide is shown in FIG. The same binds to the template DNA (1) and prevents the hybridization of the oligonucleotide probes. This means that only the template strand is retained after dehybridization; ligation does not take place.
  • the blocker oligonucleotide cannot hybridize.
  • the hybridization of the probe oligonucleotides and their ligation are essentially unimpeded (2a).
  • a ligation product is formed (3a).
  • the sequence GGGCGTTTTTTTGCGGTCGACGTTCGGGGTGTA (SEQ ID: 1) (after bisulfite treatment) was examined. This se- The result is when the methylation positions in question were methylated in the DNA sample.
  • the Sssl and bisulfite treated DNA sample of Example 1 was used.
  • the ligation products were again detected by means of polyacrylamide gel electrophoresis.
  • dGTP dGTP
  • dCTP ddATP
  • ligation can no longer take place.
  • the ligase / polymerase reaction is shown schematically in FIG. 3.
  • the DNA is single-stranded (1) and allows the probes to hybridize under the appropriate hybridization conditions if the CG positions were methylated before the bisulfite reaction (2).
  • the gap between the probes is filled in a polymerase reaction and subsequently the probes are ligated (3).
  • the double strand formed is now denatured in the next step, so that the ligated probes can in turn also serve as a template (4).
  • the complementary probe oligonucleotides (5) hybridize to this and a new ligation takes place (6).
  • the complementary single strand is again available as a template and steps (2) to (7) can be repeated several times until sufficient ligation product has been formed.

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben, das aus den folgenden Schritten besteht: Zuerst wird eine genomische DNA-Probe, welche zu untersuchende DNA und Hintergrund-DNA umfasst, chemisch derart behandelt, dass alle nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen unverändert bleiben. Dann wird die chemisch behandelte DNA-Probe unter Verwendung von mindestens 2 Primeroligonukleotiden sowie einer Polymerase amplifiziert, wobei die zu untersuchende DNA gegenüber der Hintergrund-DNA als Templat bevorzugt wird und im letzten Schritt werden die Amplifikate analysiert und aus dem Vorliegen eines Amplifikates und/oder aus der Analyse weiterer Positionen auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA geschlossen.

Description

Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern durch exponentielle Ligation hybridisierter
Sondenoligonukleotide (MLA)
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben.
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebe- nen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Seguenzierung identifiziert werden, da 5-Methyl- cytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcyto- sine tragen, vollständig verloren.
Eine relativ neu und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methyl- cytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydroly- se in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcyto- sin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein
Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällung- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and im- proved method for bisulphate based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15; 24 (2 ): 5064-6) . Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersu- chung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylie- rungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Ü- bersichtsartikel entnommen werden: Rein T, DePamphilis ML, Zorbas H. Identifying 5-methylcytosine and related modi- fications in DNA genomes. Nucleic Acids Res. 1998 May 15;26(10) :2255-64. Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lieh C, Buiting K, Dörfler W, Hor- sthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic me- thylation differences at the SNRPN locus . Eur J Hum Ge- net. 1997 Mar-Apr; 5 (2) : 94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifi- ziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet . 1997 Nov. ; 17 (3) : 275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive Single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) . Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15;25 (12) : 2529-31, WO-Patent 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation as- say. Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25 (12) : 2532-4 ) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).
Harnstoff verbessert die Effizienz der Bisulfit- Behandlung vor der Sequenzierung von 5-Methylcytosin in genomischer DNA (Paulin R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA. Urea improves efficiency of bisulphate-mediated sequencing of 5 ' -methylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 1998 Nov. 1; 26 (21) : 5009-10) .
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bi- sulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind:
Grigg G, Clark S. sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioassays. 1994 Jun. ; 16 ( 6) : 431-6, 431;
Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Dörfler W. Imprinted segments in the human genome : different DNA methylation patterns in the Prader- Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet . 1997 Mar;6(3) : 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol fort bisulphate genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb. 25; 22 (4) : 695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic se- quencing indicates a correlation between DNA hypomethyla- tion in the 5' region of the pS2 gene andin its expres- sion in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(l-2) :261-4; WO 97 46705, WO 95 15373 und WO 45560.
Ein weiteres bekanntes Verfahren ist die sogenannte me- thylierungssensitive PCR (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation Status of CpG is- lands. Proc Natl Acad Sei U S A. Sep 3; 93 (18 ): 9821-6) . Für dieses Verfahren werden Primer verwendet, die entweder nur an eine Sequenz hybridisieren, die durch die Bisulfit-Behandlung einer an der betreffenden Position un- methylierten DNA entsteht, oder aber umgekehrt Primer, welche nur an eine Nukleinsäure bindet, die durch die Bi- sulfit-Behandlung einer an der betreffenden Position un- methylierten DNA entsteht. Mit diesen Primer können demnach Amplifikate erzeugt werden, deren Detektion wiederum Hinweise auf das Vorliegen einer methylierten oder un- methylierten Position in der Probe liefern, an welche die Primer binden.
Ein neueres Verfahren ist auch der Nachweis von Cytosin- Methylierung mittels einer Taqman PCR, das als Methyl- Light bekannt geworden ist (WO00/70090) . Mit diesem Ver- fahren ist es möglich, den Methylierungsstatus einzelner oder weniger Positionen direkt im Verlauf der PCR nach- zuweisen, so dass sich eine nachfolgende Analyse der Produkte erübrigt.
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Ka- ras M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of pro- teins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct. 15; 60 (20) : 2299-301) . Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleu- nigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.
MALDI-TOF Spektroskopie eignet sich ausgezeichnet zur A- nalyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Inno- vations and Future Trends 1: 147-157.) Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zeil-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989. Verfahren zur Amplifikation von DNA Fragmenten sind Stand der Technik. Die am häufigsten verwendete Methode, die Polymerasekettenreaktion PCR) , wird vornehmlich zur Amplifikation diskreter Fragmente genomischer DNA unter Verwendung zweier Primer verwendet. Das oben erwähnte Verfahren zur Methylierungsdetektion, MSP, bedient sich ebenfalls dieser Methode. Auch andere Methoden zum Methy- lierungsnachweis, die auf Bisulfit-behandelter DNA auf- bauen, bedienen sich der PCR als Amplifikationsmethode um Sensitivitätsprobleme zu überwinden.
Eine weitere bekannte Methode zur exponentiellen Amplifikation von Fragmenten ist die Ligase-Kettenreaktion (LCR) . Diese Methode ist weniger zur Amplifikation von genomischen Abschnitten geeignet, sehr gut aber für bei- pielsweise die Mutationsdetektion. Eine Ligation findet nur statt, wenn zwei Sonden unmittelbar benachbart an das Templat hybridisieren und keine Basenfehlpaarung dort be- steht, wo diese Sonden aneinander angrenzen. Wie die PCR kann die LCR als exponentielle Amplifikation mittels beispielsweise einer thermostabilen Ligase ausgeführt werden (siehe z.B. WO 94/08047). Wie die PCR ist auch die LCR multiplexierbar . Weitere wesentliche Patente hinsichtlich LCR sind
EP0320308 und EP0439182. In letzterem ist einer Kombination der LCR mit einer Polymerasereaktion beschrieben.
Es sind demnach bislang vielerlei Verfahren zur Methylie- rungsanalyse Stand der Technik. Die vorliegende Erfindung soll jedoch besonders vorteilhaft eine der LCR ähnliche Amplifikationstechnik zur Detektion insbesondere einer kleinen Gruppe von CpG Positionen mit gleichem Methylie- rungsstatus kombinieren. In einer Methylierungssensitiven PCR werden beide Primer so ausgewählt, dass sie zumeist mehrere methylierbare, auf ihren Methylierungsstatus hin zu untersuchende Positionen überdecken. Nur dann, wenn diese zumeist 3 oder mehr Positionen einen im wesentlichen gleichen Methylierungsstatus aufweisen (z.B. alle methyliert) , erfolgt eine Hybridisierung des Primers an die betreffende Position im Templat und eine Amplifikation mittels PCR kann stattfinden. Werden beide Primer derart ausgewählt, so ist es möglich, sehr hohe Sensitivitäten der Methode zu erreichen. So können beispielsweise 1 durchgehende aufmethy- liertes Templat in einem Hintergrund von 10.000 unmethy- lierten Templaten nachgewiesen werden, da die unmethy- lierten Template bei Verwendung entsprechend spezifischer Primer nicht amplifiziert werden.
Ein Nachteil der Methode ist jedoch auch gerade ihre Sequenzabhängigkeit. Es ist erforderlich, eben auch genau solche Positionen zu finden, die co-methyliert vorliegen, um entsprechende Sensitivitäten zu erreichen. Sind die CpG Positionen zu weit voneinander entfernt, so sind sehr lange Primer erforderlich, was wiederum für die PCR an sich ungünstig sein kann und auch nachteilig für die Sen- sitivität sein kann. Auch liegt die Annealingtemperatur von solchen Primern dann sehr hoch. Auch ist es erforder- lieh, für die Generierung eines methylierungssensitiven
PCR Produktes eine weitere Gruppe von co-methylierten Positionen zu finden, für den entsprechenden Reverse- Primer. Dies ist nicht in allen Fällen möglich. Trotzdem sollten zwei Primer methylierungsspezifisch binden, da sonst eine hinreichende Sensitivität nicht zu erreichen ist .
Daher ist es sinnvoll, eine möglichst hohe Spezifität der Bindung zweier Sonden oder Primer in bereits einer zusammenhängenden Gruppe von Methylierungspositionen zu errei- chen. Dies ist mit der hier vorgestellten Methylierungssensitiven Ligation und Amplifikation (MLA) zu erreichen. Von einer LCR unterscheidet sie sich insofern, als die Spezi- fität nicht wesentlich durch den Ligationsschritt selbst beeinflusst wird, wie dies in der Punktmutationsanalyse der Fall ist. Bei der MLA findet eine Ligation im wesentlichen dann statt, wenn die beiden eingesetzten Oligo- nukleotidsonden (oder Primer) benachbart hybridisieren. Sie hybridisieren dann, wenn der Methylierungsstatus in der genomischen Probe für beide Sondenpositionen entweder methyliert oder unmethyliert vorlag.
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich also im ein Verfahren, welches Nachteile des Stand der Technik im Bereich der Methylierungsdetektion überwindet. Es kann zur Amplifikation und für den indirekten Nachweis des Methylierungsstatus einer Gruppe von CpG Positionen verwendet werden.
Dies kann insbesondere auch zur selektiven Amplifikation einer zu untersuchenden DNA mit einem bestimmten Methylierungsstatus bei Anwesenheit von sequenzhomologer Hintergrund-DNA mit einem anderen Methylierungsstatus eingesetzt werden.
Vorweg sollen die Begriffe zu untersuchende DNA sowie Hintergund DNA im Sinne dieser Erfindung am Beipiel des Standes der Technik (MSP) erläutert werden. Die zu untersuchende DNA sowie die ansonsten vorhandenen, im folgenden Hintergrund-DNA genannten Nukleinsäuren, werden ansonsten gleichermaßen amplifiziert, da die verwendeten Primer auch nicht in der Lage sind, zwischen zu untersuchender DNA und Hintergrund-DNA zu unterscheiden. Eine Möglichkeit zur Unterscheidung dieser DNAs ergibt sich jedoch durch das unterschiedliche Methylierungs- muster. Ein gängiges Verfahren ist die methylierungssen- sitive PCR, kurz MSP (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation Status of CpG islands. Proc Natl Acad Sei U S A. Sep 3; 93 (18) : 9821-6) . Dieses Verfahren besteht aus mehreren Teilschritten. Zunächst wird eine dem Stand der Technik entsprechende Bisulfit- Behandlung durchgeführt, welche wiederum dazu führt, dass alle Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die methylierten Cytosinbasen (5-Methylcytosin) unverän- dert bleiben. Im nächsten Schritt verwendet man nun Primer, welche vollständig komplementär zu einer methylierten, mit Bisulfit umgewandelten DNA sind, nicht jedoch zu einer entsprechenden DNA welche ursprünglich nicht methy- liert vorlag. Das führt bei der Durchführung einer PCR mit einem solchen Primer dazu, dass ausschließlich die ursprünglich methylierte DNA amplifiziert wird. Entsprechend ist es möglich, einen Primer zu verwenden, der im Gegenzug nur die unmethylierte DNA amplifiziert. Auf diese Art und Weise können, wenn zu analysierende DNA sowie Hintergrund DNA zugegen sind, ausschließlich die zu untersuchenden DNA Fragmente selektiv erzeugt werden, sofern sich diese hinsichtlich ihres Methylierungsstatus in einer CpG Position von der Hintergrund DNA unterscheiden.
Stand der Technik ist es nun, aus dem Nachweis eines solchen zu untersuchenden DNA-Moleküls auf den Methylie- rungszustand oder das Vorliegen einer zu untersuchenden DNA rückzuschließen, was wiederum eine Diagnose beispielsweise einer Tumorerkrankung in Patienten prinzi- piell erlaubt, da es bekannt ist, das beispielsweise die Serum DNA-Konzentration sich in Tumorpatienten zum Teil drastisch erhöht. Nur die von den Tumoren stammende DNA soll dann neben der Hintergrund-DNA nachgewiesen werden. Prinzipiell vergleichbar ist die Analyse von DNA in ande- ren Körperflüssigkeiten. Stand der Technik ist wiederum ein von Epigenomics entwickeltes Verfahren, welches zu untersuchende DNA und Hintergrund-DNA nach Bisulfit-Behandlung gleichermaßen amplifiziert und dann die im Fragment enthaltenen ehema- ligen CpG Positionen durch Hybridisierungstechniken untersucht, alternativ mittels MiniSequenzierung oder anderen gängigen Verfahren. Dies hat den Vorteil, dass man ein quantitatives Bild bezüglich der untersuchten Methy- lierungspositionen erhält, d. h. es erfolgt die Bestim- mung des Methylierungsgrades einer Vielzahl von Positionen, was z. B. bei soliden Tumoren eine sehr genau Klassifizierung ermöglicht. Der Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass sie in den Fällen, in denen die Hintergrund- DNA stark überwiegt, keine genau Aussage liefern kann, da diese ja genau wie die zu untersuchende DNA amplifiziert wird und beide im Gemisch analysiert werden. Dieses Problem existiert nicht bei der Analyse von soliden Tumoren, wo man das zu untersuchende Material gezielt auswählen kann, es kann jedoch die Analyse von beispielsweise Se- rum-DNA erschweren.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zu schaffen, welches die Nachteile des Standes der Technik überwindet.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben gelöst, wobei man die folgenden Schritte ausführt: a) man behandelt eine genomische DNA-Probe derart, dass die nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen unverändert bleiben; b) man amplifiziert die chemisch behandelte DNA-Probe unter Verwendung von mindestens 2 Paaren von im wesentli- chen komplementären Sondenoligonukleotiden sowie einer Ligase und c) man analysiert die Amplifikate und schließt aus dem Vorliegen eines Amplifikates auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA.
Dabei ist es bevorzugt, dass im zweiten Schritt die zu untersuchende DNA gegenüber der sequenzhomologen Hintergrund-DNA als Templat bevorzugt wird.
Es ist ferner bevorzugt, dass man aus der Analyse weite- rer Positionen in dem Amplifikat auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA schliesst.
Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren, wobei in Schritt b) die Sondenolignukleotide dann an ein Templat hybridisieren, wenn die von diesen abgedeckten
CpG Positionen in der genomischen DNA-Probe (bzw. der zu untersuchenden DNA) methyliert vorlagen und wobei die gleichen Sondenolignukleotide an Template, die an diesen Positionen ganz oder teilweise unmethyliert vorlagen, in wesentlich geringerem Maße hybridisieren.
Ganz besonders bevorzugt ist es, wobei in Schritt b) die Sondenolignukleotide dann an ein Templat hybridisieren, wenn die von diesen abgedeckten CpG Positionen in der ge- nomischen DNA-Probe (bzw. der zu untersuchenden DNA) unmethyliert vorlagen und wobei die gleichen Sondenolignukleotide an Template, die an diesen Positionen ganz oder teilweise methyliert vorlagen, in wesentlich geringerem Maße hybridisieren.
Es ist ferner besonders bevorzugt, dass Schritt b) im Detail wie folgt ausgeführt wird: a) die Sondenoligonukleotide, welche an benachbarten Positionen auf dem Templat hybridisierten, werden durch Ligation miteinander verknüpft, b) die verknüpften Sondenoligonukleotide werden dehybridisiert, c) die zu den verknüpften Sondenoligonukleotiden komplementären Sondenoligonukleotide hybridisieren an die bereits verknüpften Sondenoligonukleotide und werden durch Ligation ihrerseits verknüpft und d) die verknüpften Sondenoligonukleotide dienen als Template für weitere Ligationsschritte, so dass eine weitere Vermehrung der verknüpften Sondenoligonukleotide er- folgt.
Es ist auch erfindungsgemäß bevorzugt, dass zumindest eines des Sondenoligonukleotide am 5 '-Ende eine Phosphatgruppe trägt.
Weiterhin ist bevorzugt, dass zumindest eines der Sondenolignukleotide mit einer nachweisbaren Markierung versehen ist, insbesondere mit einer durch Fluoreszenz nachweisbaren Markierung versehen ist. Dabei ist es besonders bevorzugt, dass mindestens zwei Sondenoligonukleotide mit Markierungen versehen sind, wobei diese ihre Eigenschaften in Abhängigkeit von ihrem Abstand zueinander ändern. Insbesondere bevorzugt ist dabei, dass die Sondenoligonukleotide mindestens eine Fluoreszenzmarkierung tragen. Bevorzugt ist dabei ferner, dass die Sondenmoleküle die Amplifikation entweder durch eine Zunahme oder eine Abnahme der Fluoreszenz anzeigen. Insbesondere ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Zunahme oder Abnahme der Fluoreszenz auch direkt zur Analyse verwendet und aus dem veränderten Fluorenzenzsignal auf einen Methylie- rungszustand der zu untersuchenden DNA schließt.
Besonders bevorzugt ist es, dass die Hintergrund-DNA in 100 facher Konzentration im Vergleich zur zu untersuchen- den DNA vorliegt. Bevorzugt it ferner, dass die Hinter- grund-DNA in 1000 facher Konzentration im Vergleich zur zu untersuchenden DNA vorliegt.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch, dass man die Proben DNA aus Serum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Individuums gewinnt. Erfindungsgemäß ist auch bevorzugt, dass man die Proben DNA aus Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Objektträgern und allen möglichen Kombinationen hiervon gewinnt.
Bevorzugt ist erfindungsgemäß ferner ein Verfahren, bei dem man Schritt a) mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt. Dabei ist bevorzugt, dass die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA in Agarose erfolgt. Dabei ist erfindungsgemäß weiterhin bevorzugt, dass bei der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex de- naturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger zugegen ist .
Es ist ferner bevorzugt, dass die Analyse Schritt c) mittels Hybridisierung an Oligomer-Arrays erfolgt, wobei 0- ligomere Nukleinsäuren oder in ihren Hybridisierungsei- genschaften ähnliche Moleküle wie PNAs sein können.
Bevorzugt ist erfindungsgemäß auch, dass die Analyse in Schritt c) mittels Längenmessung der amplifizierten zu untersuchenden DNA erfolgt, wobei Methoden zur Längenmessung Gelelektrophorese, Kapillargelelektrophorese, Chromatographie (z.B. HPLC) , Massenspektrometrie und andere geeignete Methoden umfassen.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Analyse gemäß Schritt c) mittels Sequenzierung erfolgt, wobei Me- thoden zur Sequenzierung die Sanger-Methode, Maxam- Gilbert-Methode und andere Methoden wie Sequencing by Hybridisation (SBH) umfassen.
Bevorzugt ist ferner, dass man aus dem Methylierungstatus an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten schließt.
Erfindungsgemäß ist bevorzugt, dass die Amplifikate selbst für die Detektion mit einer nachweisbaren Markierung versehen sind. Besonders bevorzugt ist dabei, dass die Markierungen Fluoreszenzmarkierungen sind. Bevorzugt ist dabei auch, dass die Markierungen Radionuklide sind. Ganz besonders ist erfindungsgemäß dabei bevorzugt, dass die Markierungen ablösbare Massenmarkierungen sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden. Insbeon- dere bevorzugt ist aber auch, dass die Amplifikate insgesamt im Massenspektrometer nachgewiesen werden und somit durch ihre Masse eindeutig charakterisiert sind.
Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass zusätzlich zu den Sondenolignukleotiden ein Blockeroligonukleotid eingesetzt wird, welches bevorzugt an die Hintergrund-DNA bindet und die Hybridisierung der Sondenolignukleotide an die Hintergrund-DNA behindert. Dabei ist besonders bevorzugt, dass zwei zueinander komplementäre Blockeroligonukleotide (oder Blocker-PNAs, allgemein Blockermoleküle) verwendet werden. Weiterhin ist insbeondere bevorzugt, dass die Blockermoleküle bevorzugt an Templatstränge binden, die in ihrer Sequenz einer methyliert vorliegenden DNA nach Behandlung gemäß Schritt a) entsprechen. Dabei ist auch bevorzugt, dass die Blockermoleküle bevorzugt an Templatstränge binden, die in ihrer Sequenz einer unmethyliert vorliegenden DNA nach Behandlung gemäß Schritt a) entsprechen. Insbeondere ist erfindungsgemäß auch bevorzugt, dass die Blockermoleküle vorzugt, dass die Blockermoleküle an mehrere CpG Positionen in der Templat-DNA binden oder auch dass die Blockermoleküle an mehrere TpG oder CpA Positionen in der Templat-DNA binden. Dabei ist erfindungsgemäß weiterhin bevorzugt, dass die Blockeroligonukleotide an ihrem 3'- Ende modififiziert sind und von einer Polymerase mit Nukleaseaktivität nicht wesentlich abgebaut werden können.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Verfahren, wobei Schritt b) im Detail wie folgt ausgeführt wird: a) die Sondenoligonukleotide (Sonde) , hybridisieren derart an Positionen auf dem Templatstrang, dass zwischen dem 3 '-Ende der ersten Sonde und dem 5 '-Ende der zweiten Sonde eine Lücke von mindestens einer Base verbleibt, b) das 3 '-Ende der ersten Sonde wird durch eine Polyme- rasereaktion verlängert, wobei zu dem Templatstrang jeweils komplementäre Nukleotide eingebaut werden, c) die verlängerte erste Sonde wird mit der verlänger- ten zweiten Sonde durch Ligation verknüpft, d) die verknüpften Sondenoligonukleotide werden dehybridisiert, e) die zu den verknüpften Sondenoligonukleotiden komplementären Sondenoligonukleotide hybridisieren an die bereits verknüpften Sondenoligonukleotide und werden durch Ligation ihrerseits verknüpft und f) die verknüpften Sondenoligonukleotide dienen als Template für weitere Ligationsschritte, so dass eine weitere Vermehrung der verknüpften Sondenoligonukleotide er- folgt. Dabei ist bevorzugt, dass auch Schritt e) analog den Schritten a) - c) ausgeführt wird. Bevorzugt ist dabei, dass eine hitzestabile Polymerase verwendet wird.
Insbeondere ist erfindungsgemäß auch bevorzugt, dass eine hitzestabile Ligase verwendet wird. Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass mehrere Sätze von Oligonukleotidsonden für mehrere Gruppen von Methylierungspositionen eingesetzt werden und damit eine Multiplexieurng des Assay erreicht wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse min- destens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS- Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psycho- tische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung o- der Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verlet- zung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion. Bevorzugt ist dabei die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen Reagenz, markierten Oligonukleotidsonden, einer bevorzugt thermostabilen Ligase und Puffern sowie optional einer Anleitung zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Assays. Die erfindungsgemässe Aufgabe, ein sensitives Verfahren zur Methylierungsanalyse bereitzustellen, welches Nachteile des Standes der Technik überwindet, wird dadurch gelöst, dass ein Verfahren zum Nachweis von Cyto- sin-Methylierung in DNA-Proben geschaffen wird bei dem dass man die folgenden Schritte ausführt:
1. Man behandelt eine genomische DNA-Probe derart, dass die nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen unverändert bleiben,
2. man amplifiziert die chemisch behandelte DNA-Probe unter Verwendung von mindestens 2 Paaren von im wesentlichen komplementären Sondenoligonukleotiden sowie einer Ligase, und
3. man analysiert die Amplifikate und schließt aus dem Vorliegen eines Amplifikates auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA.
Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass im zweiten
Schritt die zu untersuchende DNA gegenüber der Hintergrund-DNA als Templat bevorzugt wird.
Weiterhin ist es erfindungsgemäss bevorzugt, dass man aus der Analyse weiterer Positionen in dem Amplifikat auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA schliesst .
Der 2. Schritt des Verfahrens wird besonders bevorzugt wie folgt ausgeführt:
a) die Sondenolignukleotide hybridisieren an das Templat dann, wenn die von diesen abgedeckten CpG Positionen in der genomischen DNA-Probe (bzw. der zu untersuchenden DNA) methyliert vorlagen und an Templaten, die an diesen Positionen ganz oder teilweise unmethyliert vorlagen, findet die Hybridisierung der Sondenoligonukleotide in wesentlich geringerem Maße statt, b) die Sondenoligonukleotide, welche an benachbarten Positionen auf dem Templat hybridisierten, werden durch Li- gation miteinander verknüpft, c) die verknüpften Sondenoligonukleotide werden dehybridisiert, d) die zu den verknüpften Sondenoligonukleotiden komplementären Sondenoligonukleotide hybridisieren an die be- reits verknüpften Sondenoligonukleotide und werden durch Ligation ihrerseits verknüpft und e) die verknüpften Sondenoligonukleotide dienen als Template für weitere Ligationsschritte, so dass eine ex- ponentielle Vermehrung der verknüpften Sondenoligonukleo- tide erfolgt.
Ebenfalls ist es bevorzugt, den 2. Verfahrensschritt wie folgt auszuführen:
a) die Sondenolignukleotide hybridisieren an das Templat dann, wenn die von diesen abgedeckten CpG Positionen in der genomischen DNA-Probe (bzw. der zu untersuchenden DNA) unmethyliert vorlagen und an Templaten, die an diesen Positionen ganz oder teilweise methyliert vorlagen, findet die Hybridisierung der Sondenoligonukleotide in wesentlich geringerem Maße statt, b) die Sondenoligonukleotide, welche an benachbarten Positionen auf dem Templat hybridisierten, werden durch Ligation miteinander verknüpft, c) die verknüpften Sondenoligonukleotide werden dehybridisiert, d) die zu den verknüpften Sondenoligonukleotiden komplementären Sondenoligonukleotide hybridisieren an die bereits verknüpften Sondenoligonukleotide und werden durch Ligation ihrerseits verknüpft und e) die verknüpften Sondenoligonukleotide dienen als Template für weitere Ligationsschritte, so dass eine ex- ponentielle Vermehrung der verknüpften Sondenoligonukleotide erfolgt.
Zusammenfassend ist zu betonen, dass der methylierungs- sensitive Schritt die benachbarte methylierungssensitive (auf der entsprechenden Bisulfit-behandelten DNA) Hybridisierung zweier Sondenoligonukleotide im Schritt a) ist. Hat eine Ligation stattgefunden, so erfolgt eine exponen- tielle Amplifikation dieser verknüpften Oligonukleotide .
Damit diese Ligation stattfinden kann, sollte eines der Sondenoligonukleotide (eines in jedem im wesentlichen komplementären Paar) eine endständige Phosphatgruppe tragen. Ansonsten muss diese in einem separaten Phosphory- lierungsschritt eingefügt werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass man die Proben DNA aus Serum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Individuums gewinnt.
Es ist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Proben DNA aus Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Se- rum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbet- tete Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histo- logischen Objektträgern und allen möglichen Kombinationen hiervon gewinnt.
Weiterhin ist bevorzugt, dass man aus dem Methylie- rungsgrad an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten schließt. Es ist ganz besonders erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die chemische Behandlung mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt. Bevorzugt ist es auch, dass die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA in Agaro- se erfolgt. Es ist auch und weiterhin bevorzugt, dass bei der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger zugegen ist.
Ferner ist es auch bevorzugt, dass Reportermoleküle die Amplifikation entweder durch eine Zunahme oder eine Abnahme der Fluoreszenz anzeigen. Dabei ist es besonders vorteilhaft, dass man die Zunahme oder Abnahme der Fluoreszenz auch direkt zur Analyse verwendet und aus dem Fluorenzenzsignal auf einen Methylierungszustand der zu analysierenden DNA schließt.
Dies kann wiederum auf verschiedenen, dem Fachmann bekannten Wegen erreicht werden. Zum einen ist es möglich, die benachbart bindenden Sondenoligonukleotide mit ver- schiedenen Fluoreszenzfarbstoffen zu versehen.
Durch Fluoreszenzenergietransfer (FRET) kann entweder der eine Farbstoff, sofern er sich in räumlicher Nähe zu dem anderen befindet und der andere angeregt wird, zu Fluo- reszenz angeregt werden. Auch ist es andererseits möglich, dass ein Farbstoff die Fluoreszenz des anderen unterdrückt, wenn er zu diesem räumlich benachbart ist (Quenching) . Beide Methoden können zur Sichtbarmachung des Fortschritts der MLA eingesetzt werden. Sinngemäss werden die Methoden bei der PCR als Taqman oder Lightcyc- ler-Assays eingesetzt.
Bevorzugt ist es erfindungsgemäß ferner, dass die Hintergrund-DNA in 100 facher Konzentration im Vergleich zur zu untersuchenden DNA vorliegt. Weiterhin ist bevorzugt, dass die Hintergrund-DNA in 1000 facher Konzentration im Vergleich zur zu untersuchenden DNA vorliegt.
Bevorzugt ist es ferner, dass die Analyse, oder gegebe- nenfalls die weitere Analyse mittels Hybridisierung an Oligomer-Arrays erfolgt, wobei Oligomere Nukleinsäuren oder in ihren Hybridisierungseigenschaften ähnliche Moleküle wie PNAs (Peptide Nucleic Acids) sein können.
Auch ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Analyse, oder gegebenenfalls die weitere Analyse durch Längenmessung der amplifizierten verknüpften Sondenoligonukleotide erfolgt, wobei Methoden zur Längenmessung Gelelektrophorese, Kapillargelelektrophorese, Chromatographie (z.B. HPLC) , Massenspektrometrie und andere geeignete Methoden umfassen.
Vorteilhaft ist es, dass die Amplifikate selbst für die Detektion mit einer nachweisbaren Markierung versehen sind. Weiterhin vorteilhaft ist es, dass die Markierungen Fluoreszenzmarkierungen sind, oder/und dass die Markierungen Radionuklide sind oder/und dass die Markierungen ablösbare Massenmarkierungen sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
Weiterhin ist es bevorzugt, dass die Amplifikate Markierungen wie beipielsweise Biotin tragen, so dass sie selektiv an Festphasen gebunden werden können. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden eine mit Biotin markierte Oligonukleotidsonde sowie eine fluoreszenzmarkierte Oligonucleotidsonde miteinander verknüpft und anschliessend die Produkte an beispielsweise Streptavidin gebunden. Ein Fluoreszenzsignal der gebundenen Spezies kann demnach nur gemessen werden, wenn eine Verknüpfung stattfand. Das Fluoreszenzsignal ist in durch die Methode gegebenen Grenzen proportional zu der Anzahl der stattgefundenen Ligationen.
Erfindungsgemäß ist es auch, dass die Amplifikate insge- samt im Massenspektrometer nachgewiesen werden und somit durch ihre Masse eindeutig charakterisiert sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Ag- gressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungspro- zess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
Vorteilhaft ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen Reagenz, markierten Oligonukleotidsonden, einer bevorzugt thermosta- bilen Ligase und Puffern sowie optional einer Anleitung zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Assays
Das bevorzugte Verfahren besteht aus mehreren Schritten, die sich wie folgt zusammenfassen lassen:
Zuerst werden dem Patienten eine DNA Serum und/oder andere Körperflüssigkeiten entnommen und die darin befindliche DNA wenn erforderlich isoliert. Anschliessend wird im eine chemische Behandlung, bevorzugt mit einem Bisulfit (=Hydrogensulfit, Disulfit) durchgeführt, wobei beispielsweise alle nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, die methylierten Cytosinbasen (5- Methylcytosin) jedoch unverändert bleiben. Im zweiten Verfahrensschritt wird nun eine amplifizierende Ligation durchgeführt, bei der bevorzugt die zu untersuchende DNA amplifiziert wird, nicht aber oder nur in geringerem Maße die Hintergrund-DNA. In jedem Fall erfolgt die Amplifikation aber in Abhängigkeit davon, ob ein bestimmter Methy- lierungsstatus auf zumindest einem DNA Fragment in der
Probe vorliegt, wie beispielsweise bevorzugt alle CpG Positionen aufmethyliert in den Positionen an die Sondenoligonukleotide binden. Im folgenden, dritten Schritt werden nun die amplifizierten Fragmente identifiziert und auf den Methylierungsstatus in der genomischen DNA-Probe geschlossen. Bevorzugt wird daraus auf das Vorliegen einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten geschlossen.
Bevorzugt wird die in dem Verfahren eingesetzte genomische DNA aus einer DNA-Probe erhalten, wobei Quellen für DNA z. B. Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologi- sche Objektträger und alle möglichen Kombinationen hier- von umfassen. Besonders bevorzugt ist die Isolierung von DNA aus Körperflüssigkeiten eines Individuums, wie Spu- tum, Serum, Plasma, Vollblut, Urin oder Ejakulat.
Es erfolgt in einigen Fällen vor der Bisulfit-Behandlung eine Aufreinigung oder Aufkonzentration der DNA, um eine Störung der Bisulfit-Reaktion und/oder der nachfolgenden PCR durch ein zu hohes Maß an Verunreinigungen zu vermeiden. Es ist jedoch bekannt, dass beipielsweise eine PCR aus Gewebe nach Behandlung beispielsweise mit Proteinase K ohne weitere Aufreinigung erfolgen kann, und dies gilt sinngemäß auch für die Bisulfit-Behandlung und nachfolgende PCR.
Die chemische Behandlung wird bevorzugt durch Behandlung mit einem Bisulfit (=Hydrogensulfit, Disulfit) , wiederum bevorzugt Natriumbisulfit (weniger geeignet ist Ammoniumbisulfit) durchgeführt. Entweder erfolgt die Reaktion nach einer publizierten Variante, bevorzugt ist hier die Einbettung der DNA in Agarose, um die DNA während der Behandlung in einzelsträngigen Zustand zu halten, oder aber nach einer neuen Variante durch Behandlung in Gegenwart eines Radikalfängers und eines denaturierenden Reagenzes, bevorzugt ein Oligeothylenglykoldialkylether oder bei- pielsweise Dioxan. Vor der PCR Reaktion werden die Reagenzien entweder durch Waschen im Falle der Agarosemetho- de oder einem DNA-Aufreinigungsverfahren (Stand der Technik, Fällung oder Bindung an eine Festphase, Membran) entfernt oder aber einfach durch Verdünnung in einen Kon- zentrationsbereich gebracht, der die PCR nicht mehr signifikant beeinflusst.
Wesentlich für den zweiten Verfahrensschritt ist es nun, dass die zu untersuchenden Methylierungspositionen ausge- wählt werden und geeignete Sondenoligonukleotide gewählt werden, die die selektive Amplifikation der zu untersu- chenden DNA erlauben. Die Auswahl der Positionen erfolgt entweder nach der Prämisse, dass sie sich zwischen Hintergrund-DNA und zu untersuchender DNA hinsichtlich ihrer Methylierung so sehr wie möglich unterscheiden sollten, oder aber das Vorliegen einer solchen Methylierung in einem großen Teil der Proben DNA bereits auf eine Erkrankung oder einen bestimmten anderen medizinischen Zustand eines Individuums schließen lässt. Dazu werden zunächst die Methylierungsprofile der jeweils in Frage kommenden Abschnitte eines Gens sowohl für die zu untersuchende DNA aus erkrankten Individuen als auch für die Hintergrund- DNA aus gesunden Individuen bestimmt. Diejenigen Positionen, die die größten Unterschiede zwischen zu untersuchender DNA und Hintergrund-DNA (beispielsweise im Serum) aufweisen, werden als zu untersuchende Positionen ausgewählt. Solche Positionen sind für eine Vielzahl von Genen bereits bekannt, beipielsweise für GSTpi, für HIC-1 und MGMT (von Wronski MA, Harris LC, Tano K, Mitra S, Bigner DD, Brent TP. (1992) Cytosine methylation and suppression of 06-methylguanine-DNA methyltransferase expression in human rhabdomyosarcoma cell lines and xenografts. Oncol Res. ; 4 (4-5) : 167-74; Esteller M, Toyota M, Sanchez- Cespedes M, Capeila G, Peinado MA, Watkins DN, Issa JP, Sidransky D, Baylin SB, Herman JG. (2000) , Inactivation of the DNA repair gene 06-methylguanine-DNA methyltrans- ferase by promoter hypermethylation is associated with G to A mutations in K-ras in colorectal tumorigenesis . Can- cer Res. May 1; 60 ( 9) : 2368-71) .
Es ist offensichtlich, dass auch in diesem Fall das Entstehen eines Amplifikates von hinreichender Aussagekraft sein kann, sofern man, wie auch bei der MSP, die Situation vorliegen hat, dass die Gruppe von CpG-Positionen praktisch zu 100% beispielsweise in der Hintergrund-DNA unmethyliert vorliegt, jedoch in der zu untersuchenden
DNA (die dann nur in erkrankten Individuen auftritt) me- thyliert vorliegt. Verwendet man nun in der MLA Sondenoligonukleotide, die bevorzugt an die Sequenz binden, welche in der Bisulfit-Behandlung aus nicht methylierter Hintergrund-DNA entsteht, so entsteht nur dann ein Liga- tionsprodukt, wenn wenigstens eine geringe Menge an zu untersuchender DNA überhaupt vorhanden ist.
Wiederum besonders bevorzugt ist es, das Verfahren für mehrere Methylierungspositionen gleichzeitig in einem An- satz multiplexiert auszuführen. In diesem Fall werden beispielsweise bevorzugt 4 verschiedene Gruppen von CpG Positionen auf ihre Methylierung hin untersucht. Handelsübliche Geräte für die Realtime-PCR (z.B. ABI Prism) können 4 Fluoreszenzfarbstoffe unterscheiden und eignen sich damit sehr gut für die Durchführung 4fach multiplexierter MLA assays.
Im einfachsten Fall werden nun die entstandenen Amplifikate direkt nachgewiesen. Dazu kommen alle möglichen be- kannten molekularbiologischen Verfahren in Frage, wie Gelelektrophorese, Sequenzierung, Flüssigchromatographie oder Hybridisierungen.
Detektionstechniken, die sich ebenfalls für den Nachweis der Amplifikate eignen, sind die Hybridisierung an Oligo- merarrays und beispielsweise Primer-Extension (MiniSe- quenzierung) Reaktionen. Die Hybridisierung an Oligome- rarrays kann ohne weitere Veränderung von Protokollen gegenüber dem nächstliegenden Stand der Technik verwendet werden (Olek A, Olek S, Walter J; WO 99/28498 AI). Besonders bevorzugt ist in diesem Fall das Amplifikat oder die Amplifikate fluoreszent oder radioaktiv oder mit ablösbaren Massentags markiert, so dass sich nach der Hybridisierung die an die beiden Oligonukleotide eines Paares gebundenen Fragmente anhand dieser Markierung nachweisen und Quantifizieren lassen. Auf einem solchen Oligomer- Array lassen sich eine Vielzahl von Amplifikaten gleichzeitig nachweisen, so dass ein solches Verfahren sich vornehmlich für die Analyse hochgradig multiplexierter MLAs eignen dürfte. Es ist sinnvoll und bevorzugt, dass der Array auch nicht an CpG Positionen bindende Oligomere zur Kontrolle des Experimentes enthält. Diese binden an Ligationsprodukte nicht methylierungssensitiver Sondenolignukleotide, die zur Qualitätskontrolle und/oder Quantifizierung der Proben DNA dienen.
Eine besonders bevorzugte Variante des Verfahrens ist jedoch die Verwendung von Taqman oder Lightcycler- Technologievarianten zur Real-time Detektion der Amplifikation. Diese vom Methylierungsstatus abhängige Fluores- zenzänderung während der Amplifikation kann durch zahlreiche Methoden erzielt werden. Zum einen können Sondenoligonukleotide verwendet werden, die spezifisch entweder an eine Sequenz binden, die durch chemische Behandlung aus einer an der entsprechenden Position unmethylierten DNA hervorgegangen ist, oder aber entsprechend an einer Sequenz, die durch chemische Behandlung aus einer an der entsprechenden Position methylierten DNA hervorgegangen ist. Für die Ligation müssen diese Sonden, wie oben ausgeführt, zueinander angrenzend hybridisieren. Diese Son- den sind besonders bevorzugt mit zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen versehen, einem Quencherfarbstoff und einem als Marker dienenden Fluoreszenzfarbstoff. Findet nun eine MLA-Reaktion mit der zu untersuchenden DNA als Templat statt, werden der Quencherfarbstoff und der als Marker dienende Fluoreszenzfarbstoff durch Ligation der beiden Sonden miteinander in Kontakt gebracht. Dadurch wird eine Abnahme der Fluoreszenz des Markerfarbstoffs unmittelbar sichtbar.
Bevorzugt werden verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen an mehreren Son- den zusammen mit verschiedenen Quenchersonden eingesetzt, um eine Unterscheidbarkeit der Sonden und damit eine Mul- tiplexierung zu erreichen.
Ist eine genauere Quantifizierung des Methylierungsgrades einer Methylierungsposition wünschenswert, so können bevorzugt auch zwei mit einander konkurrierende Sondenpaare mit unterschiedlichen Farbstoffen eingesetzt werden, wobei eine wiederum im Fall einer unmethylierten Position in der zu untersuchenden DNA, die andere umgekehrt im
Falle einer methylierten Position bevorzugt hybridisiert. Aus dem Verhältnis der Fluoreszenzzunahmen für die beiden Farbstoffe lässt sich dann wiederum auf den Methylie- rungsgrad der untersuchten Position schließen.
Ein grundsätzlich anderes Verfahren, bei dem jedoch auch während der PCR eine Fluoreszenzänderung erfolgt, ist gegenwärtig als LightCyclertm Technologie bekannt. Dabei wird ausgenutzt, das ein Fluoreszenz Resonanz Energie- transfer (FRET) zwischen zwei Farbstoffen nur erfolgen kann, wenn diese sich in unmittelbarer Nähe, das heißt 1- 5 Nukleotide voneinander entfernt befinden. Nur dann kann der zweite Farbstoff von der Emission des ersten Farbstoffes angeregt werden und dann seinerseits Licht einer anderen Wellenlänge emittieren, das dann detektiert wird. Dieses Verfahren lässt sich analog auch für die MLA anwenden, nur dass in diesem Fall die beiden Sonden nach der Ligation verknüpft sind und sich in dem nachfolgenden Denaturierungsschritt nicht mehr trennen.
Im vorliegenden Fall der Methylierungsanalyse erfolgt eine Hybridisierung einer fluoreszenzmarkierten Sonde an die betreffende chemisch behandelte DNA an einer CpG- Position, und die Bindung dieser Sonde hängt wiederum da- von ab, ob die zu untersuchende DNA an dieser Position methyliert oder unmethyliert vorlag. Unmittelbar benach- bart zu dieser Sonde bindet eine weitere Sonde mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff. Diese Bindung erfolgt bevorzugt wiederum methylierungsabhängig, wenn in dem betreffenden Sequenzabschnitt eine weitere methylierbare Position vorliegt. Während der Amplifikation wird nun die DNA vermehrt, weshalb immer mehr fluoreszenzmarkierte Sonden benachbart an die betreffende Position hybridisieren und dabei mit einander verknüpft werden, sofern diese den dafür erforderlichen Methylierungszustand aufwies, und daher sich ein zunehmender FRET gemessen wird.
Besonders bevorzugt hybridisiert jede der verwendeten 0- ligonukleotidsonden an eine Sequenz, die vor der Behandlung gemäss Schritt 1 des erfindungsgemässen Verfahrens zumindest zwei CpG Dinukleotide enthielt. Wiederum besonders bevorzugt ist es, das Design der Sonden derart auszuführen, dass möglichst viele solcher CG Positionen in dem Sequenzabschnitt liegen, an den die beiden Oligonukleotidsonden hybridisieren.
Auch bei diesem Verfahren erfolgt bevorzugt eine Mul- tiplexierung mit mehreren verschieden fluoreszenzmarkierten Sonden. Dabei ist es wiederum besonders bevorzugt, dass eine der benachbart hybridisierenden Sonden jeweils eine bestimmte Markierung enthält, wie zum Beispiel einen Quencherfarbstoff, und die andere je nach Sequenz einen andere, für die jeweilige Sequenz spezifische Markierung, wie beipielsweise einen Fluoreszenzfarbstoff. So ist es beipielsweise möglich und bevorzugt, dass in einem mul- tiplexierten Assay nur ein Quencherfarbstoff zum Einsatz kommt, jedoch vier verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe.
Es ist möglich, zwei Fluorezenzfarbstoffe zu verwenden, wobei der eine die Fluoreszenz des anderen anregen kann, oder aber einen Fluoreszenzfarbstoff und einen Quencher- farbstoff, welcher die Fluoreszenz des anderen Farbstoffes entsprechend auslöschen kann.
Beide Verfahren unterscheiden sich im Ergebnis hauptsäch- lieh darin, dass in einem Fall eine Abnahme, im anderen Fall eine Zunahme der Fluoreszenz während der Amplifikation gemessen wird.
In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Ver- fahrens findet zusätzlich zu dem Ligationsschritt eine Verlängerung zumindest einer Oligonukleotidsonde statt, was die Spezifität des Amplifikationsverfahrens weiter erhöht. In diesem Fall hybridisieren die Oligonukleotidsonden nicht unmittelbar benachbart, sondern in einem ge- ringen Abstand von besonders bevorzugt 1-10 Basen voneinander entfernt. Diese Lücke wird durch eine Polymerase- reaktion mit Nukleotiden ausgefüllt. Diese Verlängerung mittels einer zusätzlich eingesetzten Polymerase kann entweder methylierungsspezifisch erfolgen, wenn in der noch nicht behandelten DNA an der betreffenden Position ein CpG Dinukleotid vorliegt, oder lediglich die Se- quenzspezifität erhöhen. Die Verlängerung erfolgt bevorzugt über entweder nur eine oder eine relativ geringe Anzahl von Basen, besonders bevorzugt zwischen 1 und 10 Ba- sen. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens grenzen die Oligonukleotidsonden unmittelbar an die zu untersuchende CG Position an. Besonders bevorzugt ü- berlappt eine der Oligonukleotidsonden mit einer Base des CG Dinukleotids . Wiederum besonders bevorzugt ist es, dass in dem Abschnitt zwischen den Oligonukleotidsonden, der durch die Primerverlängerung ausgefüllt wird, sich nur eine methylierbare Position befindet.
Eine Oligonukleotidsonde mit bekannter Sequenz von n Nuc- leotiden wird also mit einer hitzebeständigen Polymerase um höchstens die Anzahl von Nukleotiden verlängert, die zwischen dem 3 ' -Ende der ersten Oligonukleotidsonde und dem 5 '-Ende der zweiten hybridisierten Oligonukleotidsonde liegen. Bevorzugt trägt dabei zumindest ein Nukleotid eine nachweisbare Markierung. Diese nachweisbare Markie- rung kann wiederum besonders bevorzugt mit einer weiteren Markierung, die an eine der Oligonukleotidsonden gebunden ist, wechselwirken, so dass das Ausmaß des Einbaus des markierten Nukeotids gemessen werden kann. Diese Wechselwirkung ist besonders bevorzugt Fluoreszenz Resonanz- Energietransfer (FRET) . In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens trägt daher entweder die erste Oligonukleotidsonde des und/oder die zweite Oligonukleotidsonde eine nachweisbare Markierung. Die Art der Verlängerung hängt dabei bevorzugt vom Methylierungsstatus mindestens eines Cytosins in der genomischen DNA-Probe ab, oder aber von eventuell vorhandenen SNPs, Punktmutationen oder Deletionen, Insertionen und Inversionen.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens sind die eingesetzten Nukleotide terminierende und/oder kettenverlängernde Nukleotide. Dabei ist das terminierende Nukleotid bevorzugt ein 2 ' , 3 ' -Didesoxynukleotid und das kettenverlängernde Nukleotid ein 2 ' -Desoxynukleotid. Dabei wird besonders bevorzugt das ein terminierendes Nukleotid ein- gebaut, welches auch keine nachfolgende Ligation erlaubt, wenn der für die Hintergrund-DNA typische Methylierungsstatus in dem jeweiligen Templatstrang vor der Behandlung gemäss Schritt 1 des Verfahrens vorlag. Ein kettenverlängerndes Nukleotid wird hingegen dann eingebaut, wenn der für die zu untersuchende DNA typische Methylierungsstatus in dem jeweiligen Templatstrang vor der Behandlung gemäss Schritt 1 des Verfahrens vorlag.
In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Ver- fahrens werden für die Amplifikation nicht alle vier
Nukleotide eingesetzt, sondern nur maximal drei Nukleoti- de, besonders bevorzugt entweder die Nukleotide dATP, dCTP und dTTP oder die Nukleotide dATP, dGTP und dTTP. Alternativ kann statt dTTP jeweils dUTP eingesetzt werden.
Ein Sequenzbeispiel für den Einsatz nur dreier Nukleotide ist in Figur 3 dargestellt.
Besonders bevorzugt ist bei der Kombination der Ligase- reaktion mit einem Polymeraseschritt mindestens eines der Oligonukleotide derart modifiziert, dass es am 3 '-Ende von der Polymerase nicht verlängert werden kann. Das 3'- Ende liegt besonders bevorzugt mit einer Phosphatgruppe funktionalisiert oder 2 ' -3 '-Didesoxy-modifiziert vor.
Besonders bevorzugt ist es wiederum, dass die eingesetzte Polymerase keine oder nur eine sehr geringe 5'- Exonukleaseaktvivität aufweist. Besonders bevorzugt wird daher das Stoffel-Fragment der Taq-Polymerase verwendet.
In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird zusätzlich zu den Oligonucleotidsonden mindestens ein Blocker-Oligonukleotid eingesetzt. Dieses Blocker-Oligonukleotid bindet bevorzugt an die Hinter- grund-DNA und behindert die Ligasereaktion und/oder Pri- merverlängerung im Falle eines zusätzlichen Polymera- seschrittes .
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens bindet ein Blocker-Oligonukleotid an Positionen, die auch von einem der Oligonukleotidsonden abgedeckt werden. In einer wiederum besonders bevorzugten Variante des Verfahrens bindet ein Blocker-Oligonukleotid an Positionen, die teilweise von der ersten Oligonukleotidsonde und und teilweise von der zweiten Oligonukleotidsonde abgedeckt werden. In diesem Fall bindet ein Blocker-Oligonukleotid unter anderem an die Position, an der sonst einer Ligation der hybridisierten Sondenoligonukleotide stattfinden könnte.
In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Verfahrens binden Blocker-Oligonukleotide an die Positionen zwischen den beiden hybridisierten Oligonukleotidsonden, die ansonsten durch die Verlängerung der ersten Sonde mittels einer Polymerasereaktion ausgefüllt werden könn- te.
Besonders bevorzugt ist es bei dem Einsatz von Blocker- Oligonukleotiden dass diese derart modifiziert vorliegen, dass sie am 3 ' -Ende von der Polymerase nicht verlängert werden können. Das 3 '-Ende liegt besonders bevorzugt mit einer Phosphatgruppe funktionalisiert oder 2 '-3'- Didesoxy-modififiziert vor. Besonders bevorzugt ist auch der analoge Einsatz von PNA (Peptide Nucleic Acids) oder anderen Nuleinsäureanaloga als Blockermoleküle.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass die Blocker durch die 5 ' -Exonukleaseaktivität einer eventuell eingesetzten Polymerase nicht wesentlich abgebaut werden können. Dazu können beipielsweise die 5 '-Enden der Blocker modififi- ziert vorliegen oder aber besonders bevorzugt eine oder mehrere Phosphorothioatbrücken zum 5 '-Ende des Blockero- ligonukleotids hin vorliegen.
Besonders bevorzugt werden die Sondenoligonukleotide vor ihrem Einsatz in der MLA phosphoryliert oder direkt mittels herkömmlicher Oligonukleotidsynthese am 5 '-Ende phosphoryliert hergestellt. Besonders bevorzugt erfolgt die Phosphorylierung der Sonden mittels Polynukleotid Ki- nase und ATP. Die Phosphorylierung ist nur für die zweite Oligonukleotidsonde jeweils erforderlich. Zusammenfassend ist ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben besonders bevorzugt, bei welchem die folgenden Schritte ausgeführt werden: 1. Man behandelt eine genomische DNA-Probe derart, dass die nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen unverändert bleiben,
2. man amplifiziert die chemisch behandelte DNA-Probe un- ter Verwendung von mindestens 2 Paaren von im wesentlichen komplementären Sondenoligonukleotiden sowie einer Ligase, und
3. man analysiert die Amplifikate und schließt aus dem Vorliegen eines Amplifikates auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA.
In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird die Proben-DNA aus Serum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Individuums gewonnen. Ebenfalls bevorzugt ist es, dass die Proben-DNA aus Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Objektträgern und allen möglichen Kombinationen hiervon gewonnen wird.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird die chemische Behandlung mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit) durchgeführt. Bevorzugt ist es, die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA in Agarose durchzuführen. Auch ist es bevorzugt, dass bei der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger zugegen ist. Besonders bevorzugt wird für die Analyse ein Taqman-Assay durchgeführt. Ebenso ist es bevorzugt, einen LightCycler Assay (wie oben beschrieben) durchzuführen.
Besonders bevorzugt verfügen die zusätzlich zu den Primern verwendeten Oligonukleotide nicht über eine 3 ' -OH Funktion. Zudem tragen die Reporteroligonukleotide besonders bevorzugt mindestens eine Fluoreszenzmarkierung.
Es ist besonders bevorzugt, dass die Reportermoleküle die Amplifikation entweder durch eine Zunahme oder eine Abnahme der Fluoreszenz anzeigen und dass die Zunahme oder Abnahme der Fluoreszenz auch direkt zur Analyse verwendet wird und aus dem Fluorenzenzsignal auf einen Methylie- rungszustand der zu analysierenden DNA geschlossen wird.
Besonders bevorzugt ist auch ein Verfahren, bei dem die weitere Analyse durch Längenmessung der amplifizierten zu untersuchenden DNA erfolgt, wobei Methoden zur Längenmes- sung Gelelektrophorese, Kapillargelelektrophorese, Chromatographie (z.B. HPLC) , Massenspektrometrie und andere geeignete Methoden umfassen.
Besonders bevorzugt ist auch ein Verfahren, bei dem die weitere Analyse durch Sequenzierung erfolgt, wobei Methoden zur Sequenzierung die Sanger-Methode, Maxam-Gilbert- Methode und andere Methoden wie Sequencing by Hybridisation (SBH) umfassen. Wiederum bevorzugt ist ein Verfahren, wobei die Sequenzierung (nach Sanger) für jede oder eine kleine Gruppe von CpG Positionen mit jeweils einem separaten Primeroligonukleotid ausgeführt wird und die Verlängerung der Primer nur eine oder einige wenige Basen ausmacht, und aus der Art der Primerverlängerung auf den Methylierungsstaus der betreffenden Positionen in der zu untersuchenden DNA geschlossen wird. In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird aus dem Methylierungsgrad an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten ge- schlössen.
Besonders bevorzugt sind auch die Amplifikate selbst für die Detektion mit einer nachweisbaren Markierung versehen. Bei diesen Markierungen handelt es sich bevorzugt um Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Massenmarkierungen, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
Auch bevorzugt ist eine Verfahrensvariante, wobei die Amplifikate insgesamt im Massenspektrometer nachgewiesen werden und somit durch ihre Masse eindeutig charakterisiert sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines der beschriebenen Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankun- gen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion,
Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
Zudem bevorzugt ist die Verwendung eines der beschriebenen Verfahren zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1:
Herstellung von nicht- und aufmethylierter DNA und Bi- sulphit-Behandlung
Für die Herstellung aufmethylierter DNA wurden humane genomische DNA mit S-Adenosylmethion und der CpG Methylase (Sssl, New England Biolabs) nach Angaben des Herstellers behandelt. Die Herstellung nicht methylierter DNA als Referenz war für die nachfolgenden Beispiele nicht erfor- derlich, da die betreffenden Positionen in kommerziell erhältlicher humaner DNA (Promega) durchweg unmethyliert vorliegen. Die Bisulfit Behandlung wurde gemäss der publizierten Agarose Methode (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphate based cytosi- ne methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC
15;24 (24) : 5064-6) durchgeführt. Aufmethylierte und unbe- handelte DNA wurde in gleichen Mengen (etwa 700 ng) in jeweils zwei verschiedenen, jedoch analog durchgeführten Bisulfitreaktionen eingesetzt.
Beispiel 2
Die Sequenz GGGCGTTTTTTTGCGGTCGACGTTCGGGGTGTA (SEQ-ID.l) (nach Bisulfit-Behandlung) wurde mittels MLA untersucht. Diese Sequenz liegt vor, wenn die betreffenden Methylierungspositionen in der DNA-Probe methyliert vorlagen. Es wurde die mit Sssl und mit Bisulfit behandelte DNA-Probe des Beispiels 1 verwendet. Die Sondenoligonukleotide GGCGTTTTTTTGCGG (SEQ-ID.2) und TCGACGTTCGGGGT (SEQ-ID:3) sowie die dazu komplementären Sondenoligonukleotide CCGCAAAAAAACGCC (SEQ-ID:4) und ACCCCGAACGTCGA (SEQ-ID.5) wurden verwendet, wobei die SEQ-ID:3 und SEQ-ID:4 jeweils mittels Polynucleotid Kinase zuvor am 5 '-Ende phosphoryliert wurden. Für die Ligation wurden Bedingungen wie in WO 94/08047 beschrieben verwendet (40 Cyclen) .
Die Ligationsprodukte wurden mittels Polyacrylamid- gelelektrophorese nachgewiesen.
Ein Kontrollexperiment mit nicht aufmethylierter Kon- troll-DNA gemäß Beispiel 1 ergab hingegen kein nachweisbares Produkt.
Die MLA-Reaktion ist schematisch in Figur 1 dargestellt. Nach der Behandlung mit Bisulfit liegt die DNA ein- zelsträngig vor (1) und erlaubt unter den geeigneten
Hybridisierungsbedingungen das Hybridisieren der Sonden dann, wenn die CG Positionen vor der Bisulfitreaktion methyliert vorlagen (2) . Die Sondenolignukleotide werden ligiert (3) . Der gebildete Doppelstrang wird nun im nächsten Schritt denaturiert, so dass auch die ligierten Sonden wiederum als Templat dienen können (4) . An dieses hybridisieren nun die komplementären Sondenolignukleotide (5) und eine erneute Ligation findet statt (6) . Nach dem Denaturieren steht der wiederum komplementäre Einzel- sträng erneut als Templat zur Verfügung und die Schritte (2) bis (7) können sich mehrfach wiederholen, bis ausreichend Ligationsprodukt gebildet wurde. Beispiel 3 :
MLA unter Verwendung eines Blocker-Oligonukleotids
Werden größere Mengen an Hintergrund-DNA vermutet die zu falsch positiven Ergebnissen beitragen kann, so kann zusätzlich ein Blocker für die Hintergrund DNA wie oben beschrieben eingesetzt werden. Wird das Experiment analog zu Beispiel 2 ausgeführt, so kann als Blocker TGTGGTTGATGTTTG (SEQ-ID:6) verwendet werden. Dieser Blo- cker bindet bevorzugt dann, wenn die Hintergrund-DNA in diesem Bereich vollständig unmethyliert vorlag. Unter diesen Bedingungen ist es möglich, noch bei einem Verhältnis von 1:100 bis 1:1000 je nach DNA Gesamtkonzentration aufmethylierte Template nachzuweisen, ohne falsch positive Ergebnisse für die vollständig unmethylierte Kontroll-DNA zu riskieren.
In Figur 2 ist der Einsatz eines Blockeroligonukleotids dargestellt. Selbiges bindet an die Templat-DNA (1) und verhindert die Hybridisierung der Oligonukleotidsonden. Damit bleibt nach Dehybridisierung nur der Templatstrang erhalten, eine Ligation findet nicht statt.
Wird ein Templatstrang eingesetzt, welcher aufmethylier- ter DNA enspricht (la) , so kann keine Hybridisierung des Blockeroligonukleotids stattfinden. Die Hybridisation der Sondenolignukleotide sowie deren Ligation verläuft im wesentlichen ungehindert (2a) . Es entsteht ein Ligati- onsprodukt (3a) .
Beispiel 4:
Verwendung eines MLA-Assays mit zusätzlicher Polymerase- reaktion
Die Sequenz GGGCGTTTTTTTGCGGTCGACGTTCGGGGTGTA (SEQ-ID:1) (nach Bisulfit-Behandlung) wurde untersucht. Diese Se- quenz liegt vor, wenn die betreffenden Methylierungspositionen in der DNA-Probe methyliert vorlagen. Es wurde die mit Sssl und mit Bisulfit behandelte DNA-Probe des Beispiels 1 verwendet. Die Sondenoligonukleotide GGGGCGTTTTTTTGCGG (SEQ-ID.7) und TCGACGTTCGGGGT (SEQ-
ID:3) sowie die dazu komplementären Sondenoligonukleotide CAAAAAAACGCCCC (SEQ-ID:8) und ACCCCGAACGTCGA (SEQ-ID:5) wurden verwendet, wobei alle Sondenoligonukleotide jeweils mittels Polynucleotid Kinase zuvor am 5 ' -Ende phosphoryliert wurden. Zusätzlich wurden Taq Polymerase (Amplitaq) und Nukleotide Für die Ligation wurden Bedingungen wie in WO 94/08047 und EP0439182 beschrieben verwendet .
Wiederum wurden die Ligationsprodukte mittels Polyacryla- mid-gelelektrophorese nachgewiesen.
Ein Kontrollexperiment mit nicht aufmethylierter Kontroll-DNA gemäß Beispiel 1 ergab hingegen kein nachweis- bares Produkt.
In einer Variante des Verfahren ist es nun möglich, nicht alle Nukleotide einzusetzen. Beipielsweise können im obigen Beipiel nur dGTP, dCTP und ddATP als Nukleotide ein- gesetzt werden. Das ddATP wird nur eingebaut, wenn unbeabsichtigt ein nicht methyliertes Fragment als Templat in der Polymerasereaktion zum Einsatz kommt. In diesem Fall kann jedoch, da es als Terminator dient, keine Ligation mehr stattfinden.
Die Ligase/Polymerasereaktion ist schematisch in Figur 3 dargestellt. Nach der Behandlung mit Bisulfit liegt die DNA einzelsträngig vor (1) und erlaubt unter den geeigneten Hybridisierungsbedingungen das Hybridisieren der Son- den dann, wenn die CG Positionen vor der Bisulfitreaktion methyliert vorlagen (2) . Die Lücke zwischen den Sonden wird in einer Polymerasereaktion aufgefüllt und nachfolgend werden die Sonden ligiert (3) . Der gebildete Doppelstrang wird nun im nächsten Schritt denaturiert, so dass auch die ligierten Sonden wiederum als Templat dienen können (4). An dieses hybridisieren nun die komplementären Sondenolignukleotide (5) und eine erneute Ligation findet statt (6) . Nach dem Denaturieren steht der wiederum komplementäre Einzelstrang erneut als Templat zur Verfügung und die Schritte (2) bis (7) können sich mehrfach wiederholen, bis ausreichend Ligationsprodukt gebildet wurde .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben, dadurch gekennzeichnet, dass man die folgenden Schritte ausführt: a) man behandelt eine genomische DNA-Probe derart, dass die nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen unverändert bleiben; b) man amplifiziert die chemisch behandelte DNA-Probe unter Verwendung von mindestens 2 Paaren von im wesentlichen komplementären Sondenoligonukleotiden sowie einer Ligase und c) man analysiert die Amplifikate und schließt aus dem Vorliegen eines Amplifikates auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im zweiten Schritt die zu untersuchende DNA gegenüber der sequenzhomologen Hintergrund-DNA als Templat bevorzugt wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man aus der Analyse weiterer Positionen in dem Amplifikat auf den Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA schliesst.
4. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei in Schritt b) des Anspruchs 1 die Sondenolignukleotide dann an ein Templat hybridisieren, wenn die von diesen abgedeckten CpG Positionen in der genomischen DNA-Probe (bzw. der zu untersuchenden DNA) methyliert vorlagen und wobei die gleichen Sondeno- lignukleotide an Template, die an diesen Positionen ganz oder teilweise un ethyliert vorlagen, in wesentlich geringerem Maße hybridisieren.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei in Schritt b) des Anspruchs 1 die Sondenolignukleotide dann an ein Templat hybridisieren, wenn die von diesen abgedeckten CpG Positionen in der genomischen DNA- robe (bzw. der zu untersuchenden DNA) unmethyliert vorlagen und wobei die gleichen Sondeno- lignukleotide an Template, die an diesen Positionen ganz oder teilweise methyliert vorlagen, in wesentlich geringerem Maße hybridisieren.
6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt b) des Anspruchs 1 im Detail wie folgt ausgeführt wird: a) die Sondenoligonukleotide, welche an benachbarten Positionen auf dem Templat hybridisierten, werden durch Ligation miteinander verknüpft, b) die verknüpften Sondenoligonukleotide werden dehybridisiert, c) die zu den verknüpften Sondenoligonukleotiden komplementären Sondenoligonukleotide hybridisieren an die bereits verknüpften Sondenoligonukleotide und werden durch Ligation ihrerseits verknüpft und d) die verknüpften Sondenoligonukleotide dienen als Template für weitere Ligationsschritte, so dass eine weitere Vermehrung der verknüpften Sondenoligonukleotide erfolgt.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eines des Sondenoligonukleotide am 5 '-Ende eine Phosphatgruppe trägt .
8. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eines der Sondenolignukleotide mit einer durch Fluoreszenz nachweisbaren Markierung versehen ist.
9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der Sondenoligonukleotide mit einer nachweisbaren Markierung versehen ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Sondenoligonukleotide mit Markierungen versehen sind, wobei diese ihre Eigenschaften in Abhängigkeit von ihrem Abstand zuein- ander ändern.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenoligonukleotide mindestens eine Fluoreszenzmarkierung tragen.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenmoleküle die Amplifikation entweder durch eine Zunahme oder eine Abnahme der Fluoreszenz anzeigen.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zunahme oder Abnahme der Fluoreszenz auch direkt zur Analyse verwendet und aus dem veränderten Fluorenzenzsignal auf einen Methylierungs- zustand der zu untersuchenden DNA schließt.
14. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hintergrund-DNA in 100 facher Konzentration im Vergleich zur zu untersu- chenden DNA vorliegt.
15. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hintergrund-DNA in 1000 facher Konzentration im Vergleich zur zu untersuchenden DNA vorliegt.
16. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Proben DNA aus Serum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Individuums gewinnt .
17. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Proben DNA aus Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Serum, Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetem Ge- webe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere,
Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histo- logischen Objektträgern und allen möglichen Kombinationen hiervon gewinnt.
18. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man Schritt a) des Anspruchs 1 mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA in Agarose erfolgt .
20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass bei der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger zugegen ist .
21. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse gemäß Anspruch lc) mittels Hybridisierung an Oligomer-Arrays erfolgt, wobei Oligomere Nukleinsäuren oder in ihren Hybridisierungseigenschaften ähnliche Moleküle wie PNAs sein können.
22. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse gemäß Anspruch lc) mittels Längenmessung der amplifizierten zu untersuchenden DNA erfolgt, wobei Methoden zur Längenmessung Gelelektrophorese, Kapillargele- lektrophorese, Chromatographie (z.B. HPLC) , Mas- senspektrometrie und andere geeignete Methoden umfassen.
23. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse gemäß Anspruch lc) mittels Sequenzierung erfolgt, wobei Methoden zur Sequenzierung die Sanger-Methode, Maxam- Gilbert-Methode und andere Methoden wie Sequencing by Hybridisation (SBH) umfassen.
24. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem Methylie- rungstatus an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten schließt.
25. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate selbst für die Detektion mit einer nachweisbaren Markierung versehen sind.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen Fluoreszenzmarkierungen sind.
27. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen Radionuklide sind.
28. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen ablösbare Massenmarkierungen sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
29. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate insgesamt im Massenspektrometer nachgewiesen werden und somit durch ihre Masse eindeutig charakterisiert sind.
30. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zu den Sonde- nolignukleotiden ein Blockeroligonukleotid eingesetzt wird, welches bevorzugt an die Hintergrund-DNA bindet und die Hybridisierung der Sondenolignukleotide an die Hintergrund-DNA behindert.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass zwei zueinander komplementäre Blockeroligonukle- otide (oder Blocker-PNAs, allgemein Blockermoleküle) verwendet werden.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Blockermoleküle bevorzugt an Templatstränge binden, die in ihrer Sequenz einer methyliert vorliegenden DNA nach Behandlung gemäß Anspruch la) ent- sprechen.
33. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Blockermoleküle bevorzugt an Templatstränge binden, die in ihrer Sequenz einer unmethyliert vor- liegenden DNA nach Behandlung gemäß Anspruch la) entsprechen.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Blockermoleküle an mehrere CpG Positionen in der Templat-DNA binden.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33 dadurch gekennzeichnet, dass die Blockermoleküle an mehrere TpG oder CpA Positionen in der Templat-DNA binden.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Blockeroligonukleotide an ihrem 3 '-Ende odififiziert sind und von einer Polymerase mit Nukleaseaktivität nicht wesentlich abgebaut werden können.
37. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt b) des Anspruchs 1 im Detail wie folgt ausgeführt wird: a) die Sondenoligonukleotide (Sonde) , hybridisie- ren derart an Positionen auf dem Templatstrang, dass zwischen dem 3 '-Ende der ersten Sonde und dem 5 '-Ende der zweiten Sonde eine Lücke von mindestens einer Base verbleibt, b) das 3 '-Ende der ersten Sonde wird durch eine Polymerasereaktion verlängert, wobei zu dem
Templatstrang jeweils komplementäre Nukleotide eingebaut werden, c) die verlängerte erste Sonde wird mit der verlängerten zweiten Sonde durch Ligation verknüpft, d) die verknüpften Sondenoligonukleotide werden dehybridisiert , e) die zu den verknüpften Sondenoligonukleotiden komplementären Sondenoligonukleotide hybridisieren an die bereits verknüpften Sondenoligonukleotide und werden durch Ligation ihrerseits verknüpft und f) die verknüpften Sondenoligonukleotide dienen als Template für weitere Ligationsschritte, so dass eine weitere Vermehrung der verknüpften Sondenoligonukleotide erfolgt.
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass auch Schritt e) des Anspruchs 37 analog den Schritten a) - c) ausgeführt wird.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 oder 38, da- durch gekennzeichnet, dass eine hitzestabile Polymerase verwendet wird.
40. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine hitzestabile Ligase verwendet wird.
41. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Sätze von Oligonukleotidsonden für mehrere Gruppen von Methylie- rungspositionen eingesetzt werden und damit eine Mul- tiplexieurng des Assay erreicht wird.
42. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS- Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressions- Symptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastroin- testinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehl- funktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabo- lische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
43. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Unterscheidung von Zelltypen o- der Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
44. Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen Reagenz, markierten Oligonukleotidsonden, einer bevorzugt thermostabilen Ligase und Puffern sowie optional einer Anleitung zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Assays.
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