5-Methylcytosin ist die häufigste
kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie
spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription,
beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung
von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist
daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch
nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin
das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus
geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information,
welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlerweile
am häufigsten
angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin
beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das
nach anschließender
alkalischer Hydroly se in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem
Basenpaarungsverhalten dem Thymin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen
unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche
DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch
sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden
kann, jetzt durch "normale" molekularbiologische
Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation
und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann.
Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll
ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit
betrifft, wird durch ein Verfahren zur Bisulfit-Behandlung definiert,
welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch
die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an
einzelsträngiger
DNA) verhindert und alle Fällungs-
und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald
J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based
cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15; 24
(24): 5064-6). Mit dieser Methode kann die DNA einzelner Zellen
behandelt werden, was das Potential der Methode veranschaulicht.
Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare
Länge behandelt,
eine globale Behandlung von Zellen auf Tausenden von möglichen
Regionen ist nicht möglich.
Außerdem
kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen
Probenmengen zuverlässig
umwandeln. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten,
5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel
entnommen werden: Rein T, DePamphilis ML, Zorbas H. Identifying
5-methylcytosine and related modifications in DNA genomes. Nucleic
Acids Res. 1998 May 15; 26 (10): 2255–64.
Die Bisulfit-Technik wird bisher
bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Dörfler W,
Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman
and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences
at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr; 5 (2): 94–8) nur
in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische
Stücke
eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert
und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation
ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov.; 17
(3): 275–6)
oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine "Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA.
Rapid quantitation of methylation differences at specific sites
using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE).
Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25 (12): 2529–31, WO-Patent 9500669) oder
einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative
DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25 (12):
2532–4)
nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben
worden (Olek et al., WO 99 28498).
Harnstoff verbessert die Effizienz
der Bisulfit-Behandlung
vor der Sequenzierung von 5-Methyhcytosin in genomischer DNA (Paulin
R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA. Urea improves efficiency of bisulphite-mediated
sequencing of 5'-methylcytosine
in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 1998 Nov. 1; 26 (21): 5009–10).
Weitere Publikationen, die sich mit
der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei
einzelnen Genen befassen, sind:
Grigg G, Clark S. sequencing
5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioassays. 1994 Jun.;
l6 (6): 431–6,
431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B,
Dörfler
W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation
patterns in the Prader-Willi/Angelman
syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum
Mol Genet. 1997 Mar; 6 (3): 387–95;
Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis
on individual chromosomes: improved protocol fort bisulphate genomic
sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb. 25; 22 (4): 695–6; Martin
v, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing
indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2
gene andin its expression in human breast cancer cell lines. Gene.
1995 May 19; 157 (1-2): 261–4;
WO 97 46705, WO 95 15373 und WO 45560.
Ein weiteres bekanntes Verfahren
ist die sogenannte methylierungssensitive PCR (Herman JG, Graff
JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific
PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc
Natl Acad Sci USA. Sep 3; 93 (18): 9821–6). Für dieses Verfahren werden Primer
verwendet, die entweder nur an eine Sequenz hybridisieren, die durch
die Bisulfit-Behandlung einer an der betreffenden Position unmethylierten
DNA entsteht, oder aber umgekehrt Primer, welche nur an eine Nukleinsäure binden,
die durch die Bisulfit-Behandlung einer an der betreffenden Position
methylierten DNA entsteht. Mit diesen Primern können demnach Amplifikate erzeugt
werden, deren Detektion wiederum Hinweise auf das Vorliegen einer
methylierten oder unmethylierten Position in der Probe liefern,
an welche die Primer binden.
Ein neueres Verfahren ist auch der
Nachweis von Cytosin-Methylierung
mittels einer Taqman® PCR, das als MethyLight
bekannt geworden ist (WO00/70090). Mit diesem Verfahren ist es möglich, den
Methylierungsstatus einzelner oder weniger Positionen direkt im
Verlauf der PCR nachzuwei sen, so dass sich eine nachfolgende Analyse
der Produkte erübrigt.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der
Oligomer Array Herstellung lässt
sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature
Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999),
der dort zitierten Literatur und dem US-Patent 5994065 über Methoden
zur Herstellung von festen Trägern
für Zielmoleküle wie Oligonukleotide
bei vermindertem nichtspezifischen Hintergrundsignal entnehmen.
Für
die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenz-markierte
Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist
das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen
Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt
beispielsweise über
ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen
anderen, kommerziell erhältlich.
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie
(MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse
von Biomolekülen
(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of Proteins
with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988
Oct. 1560 (20): 2299–301).
Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch
einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert
in die Gasphase befördert.
Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird
die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt
die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Ruf Grund ihrer verschiedenen
Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere
Ionen erreichen den Detektor früher
als größere.
MALDI-TOF Spektroskopie eignet sich
ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse
von Nukleinsäuren
ist etwas schwieriger (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), DNA and Matrix
Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular
Biology: Current Innovations and Future Trends 1: 147–157.) Für Nukleinsäuren ist
die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide
und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die
ein vielfach negativ geladenes Rückgrat
haben, ist der Ionisationsprozeß durch
die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektroskopie
spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption
von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden,
die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile
einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied
nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden,
indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher
wird. Phosphorothioatnukleinsäuren,
bei denen die gewöhnlichen
Phosphate des Rückgrats
durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache
Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut, I. G.
und Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA alkylation and
detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367–1373).
Die Kopplung eines "charge
tags" an diese modifizierte
DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen
Betrag, wie er für
Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von "charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse
gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark
erschweren.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden
aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen.
Diese Standardmethodik findet sich
in Referenzen wie Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 1989, p 9.16–9.19.
Es sind demnach bislang vielerlei
Verfahren zur Methylierungsanalyse Stand der Technik. Die vorliegende
Erfindung soll jedoch das Problem lösen, dass die gängigen Verfahren
nicht in der Lage sind, eine in einer Körperflüssigkeit oder Serum befindliche
zu untersuchende DNA gezielt zu amplifizieren, wenn zugleich andere,
sequenzhomologe DNA-Abschnitte anderen Ursprungs zugegen sind.
Die zu untersuchende DNA sowie die
ansonsten vorhandenen, im folgenden Hintergrund-DNA genannten Nukleinsäuren, werden
in aller Regel gleichermaßen
amplifiziert, da die verwendeten Primer auch nicht in der Lage sind,
zwischen zu untersuchender DNA und Hintergrund-DNA zu unterscheiden.
Eine Möglichkeit
zur Unterscheidung dieser DNAs ergibt sich jedoch durch das unterschiedliche
Methylierungsmuster. Ein gängiges
Verfahren ist die methylierungssensitive PCR, kurz MSP (Herman JG,
Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific
PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG Islands. Proc
Natl Acad Sci USA. Sep 3; 93 (18): 9821–6). Dieses Verfahren besteht
aus mehreren Teilschritten. Zunächst
wird eine dem Stand der Technik entsprechende Bisulfit-Behandlung
durchgeführt,
welche wiederum dazu führt,
dass alle Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die
methylierten Cytosinbasen (5-Methylcytosin)
unverändert
bleiben. Im nächsten
Schritt verwendet man nun Primer, welche vollständig komplementär zu einer
methylierten, mit Bisulfit umgewandelten DNA sind, nicht jedoch
zu einer entsprechenden DNA welche ursprünglich nicht methyliert vorlag.
Das führt
bei der Durchführung
einer PCR mit einem solchen Primer dazu, dass ausschließlich die
ursprünglich
methylierte DNA amplifiziert wird. Entsprechend ist es möglich, einen
Primer zu verwenden, der im Gegenzug nur die unmethylierte DNA amplifiziert.
Auf diese Art und Weise können, wenn
zu analysierende DNA sowie Hintergrund DNA zugegen sind, ausschließlich die
zu untersuchenden DNA Fragmente selektiv erzeugt werden, sofern
sich diese hinsichtlich ihres Methylierungsstatus in einer CpG Position
von der Hintergrund DNA unterscheiden. Stand der Technik ist es
nun, aus dem Nachweis eines solchen zu untersuchenden DNA-Moleküls auf den
Methylierungszustand oder das Vorliegen einer zu untersuchenden
DNA rückzuschließen, was
wiederum eine Diagnose beispielsweise einer Tumorerkrankung in Patienten
prinzipiell erlaubt, da es bekannt ist, dass beispielsweise die
Serum DNA-Konzentration sich in Tumorpatienten zum Teil drastisch erhöht. Nur
die von den Tumoren stammende DNA soll dann neben der Hintergrund-DNA
nachgewiesen werden. Prinzipiell vergleichbar ist die Analyse von DNA
in anderen Körperflüssigkeiten.
Das hier geschilderte Verfahren,
was als der nächstliegende
Stand der Technik zu betrachten ist, hat jedoch einige Nachteile.
Es ist beispielsweise nicht möglich,
aus der Nachweisbarkeit eines amplifizierten Fragmentes zu untersuchender
DNA auf die im Serum vorhandene Menge zu schließen. Schon geringste Mengen
solcher DNA reichen aus, um ein positives Resultat zu erzielen,
was zum einen ein Vorteil ist, sich aber auch sehr nachteilig auswirken kann,
wenn man zum Beispiel den Effekt einer Tumorresektion auf die Serum
DNA beurteilen will. Die größte Schwierigkeit
ist jedoch, dass es viele CpG-Positionen gibt, welche sich hinsichtlich
ihres Methylierungszustandes in der zu untersuchenden DNA und der
Hintergrund-DNA nur graduell unterscheiden. Es ist offensichtlich,
dass das existierenden MSP Verfahren nur dann durchgeführt werden kann,
wenn man weiß,
dass sich die Hintergund-DNA von der zu untersuchenden DNA in der
betreffenden CpG Po sition definitiv und zu 100 unterscheidet, will man
nicht falsche positive Ergebnisse riskieren. Ist es dagegen in einem
Tumorgewebe typisch, dass in z. B. 95% der Tumorzellen eine bestimmte
Position methyliert vorliegt, in der ansonsten vorhandenen Hintergrund-DNA
jedoch nur maximal 5% methyliert vorliegen, so ist es mit der MSP
Methode nicht möglich, aussagekräftige Ergebnisse
zu produzieren, da eine Quantifizierung der Templat-DNA mittels
PCR prinzipiell nicht oder nur mit erhöhtem Aufwand möglich ist. Zudem
liegt dieser Erfindung die Erkenntnis zugrunde, dass es oft Muster
von Methylierungszuständen in
einem DNA-Fragment sind, die typisch für einen bestimmten Typ von
Zellen, zum Beispiel einer Tumorzelle, sind.
Stand der Technik ist wiederum ein
von Epigenomics entwickeltes Verfahren, welches zu untersuchende
DNA und Hintergrund-DNA nach Bisulfit-Behandlung gleichermaßen amplifiziert
und dann die im Fragment enthaltenen ehemaligen CpG Positionen durch
Hybridisierungstechniken untersucht, alternativ mittels Mini-Sequenzierung
oder anderen gängigen
Verfahren. Dies hat den Vorteil, dass man ein quantitatives Bild
bezüglich
der untersuchten Methylierungspositionen erhält, d.h. es erfolgt die Bestimmung
des Methylierungsgrades einer Vielzahl von Positionen, was z. B.
bei soliden Tumoren eine sehr genaue Klassifizierung ermöglicht.
Der Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass sie in den Fällen, in denen
die Hintergrund-DNA
stark überwiegt,
keine genaue Aussage liefern kann, da diese ja genau wie die zu
untersuchende DNA amplifiziert wird und beide im Gemisch analysiert
werden. Dieses Problem existiert nicht bei der Analyse von soliden
Tumoren, wo man das zu untersuchende Material gezielt auswählen kann,
es kann jedoch die Analyse von beispielsweise Serum-DNA erschweren.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist
es nun, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden
und die Vorteile beider Verfahren für die Detektion von Körperflüssigkeiten
und Serum zu kombinieren. Dabei liegt ein besonderer Schwerpunkt
auf dem bislang nicht gelösten
Problem des Nachweises geringer Mengen nicht-methylierter DNA in
Anwesenheit einer vergleichsweise großen Menge an Hintergrund-DNA.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass
ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben
geschaffen wird, bei dem man die folgenden Schritte ausführt: man
behandelt eine genomische DNA-Probe, welche zu untersuchende DNA und
Hintergrund-DNA umfasst, chemisch derart, dass alle nicht methylierten
Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen
unverändert
bleiben, man amplifiziert die chemisch behandelte DNA-Probe unter
Verwendung von mindestens 2 Primeroligonukleotiden sowie einer Polymerase
und eines Nukleotidgemisches, dessen Zusammensetzung zu einer Bevorzugung
der zu untersuchenden DNA gegenüber
der Hintergrund-DNA als Templat führt und man analysiert die
Amplifikate und schließt
aus dem Vorliegen oder der Produktmenge eines Amplifikates auf den
Methylierungsstatus in der zu untersuchenden DNA.
In einer besonders bevorzugten Variante
des erfindungsgemäßen Verfahrens
enthält
des Nukleotidgemisch nur 2'-Desoxy-Guanosintriphosphat (dGTP),
2'-Desoxy-Adenosintriphosphat
(dATP) und 2'-Desoxy-Thymidintriphosphat
(dTTP): Es ist jedoch ebenfalls bevorzugt, dass das Nukleotidgemisch
zudem eine verhältnismäßig geringe
Konzentration an 2'-Desoxy-Cytidintriphosphat
(dCTP) enthält.
Besonders bevorzugt ist die dCTP Anfangskonzentration dann bei der
Amplifika tion höchstens
halb so hoch ist wie die durchschnittliche Anfangskonzentration
der anderen drei Nukleotide.
In einer ebenfalls besonders bevorzugten Verfahrensvariante
enthält
das Nukleotidgemisch nur 2'-Desoxy-Cytidintriphosphat
(dCTP), 2'-Desoxy-Adenosintriphosphat
(dATP) und 2'-Desoxy-Thymidintriphosphat
(dTTP). Es ist jedoch ebenfalls bevorzugt, dass das Nukleotidgemisch
zudem eine verhältnismäßig geringe
Konzentration an 2'-Desoxy-Guanosintriphosphat
(dGTP) enthält.
Besonders bevorzugt ist die dGTP Anfangskonzentration dann bei der
Amplifikation höchstens
halb so hoch wie die durchschnittliche Anfangskonzentration der
anderen drei Nukleotide.
In einer besonders bevorzugten Variante
des Verfahrens wird anstelle von 2'-Desoxy-thymidintriphosphat 2'-Desoxy-uridintriphosphat eingesetzt.
In einer weiteren besonders bevorzugten
Variante des Verfahrens werden zusätzlich terminierende Didesoxynukleotide
eingesetzt.
Es ist zudem besonders bevorzugt,
dass die Denaturierungstemperatur in der PCR-Amplifikation unter
90°C 1iegt.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass man
die Proben DNA aus Serum, Plasma, Urin, Sputum oder anderen Körperflüssigkeiten
eines Individuums gewinnt.
Es ist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, dass
man die Proben DNA aus Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Serum,
Plasma, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit,
in Paraffin eingebettetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen,
Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Le ber, histologischen
Objektträgern
und allen möglichen
Kombinationen hiervon gewinnt.
Es ist ganz besonders erfindungsgemäß bevorzugt,
dass man die chemische Behandlung mit einem Bisulfit (= Disulfit,
Hydrogensulfit) durchführt. Bevorzugt
ist es auch, dass die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA
in Agarose erfolgt. Es ist auch und weiterhin bevorzugt, dass bei
der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz
und/oder ein Radikalfänger
zugegen ist.
Bevorzugt ist es, dass man die Amplifikation im
zweiten Schritt in Gegenwart mindestens eines weiteren Oligonukleotids
oder eines PNA-Oligomers durchführt,
welches an ein 5'-CG-3'-Dinukleotid oder ein
5'-TG-3'-Dinukleotid oder
ein 5'-CA-3'-Dinukleotid bindet,
wobei das weitere Oligonukleotid oder PNA-Oligomer bevorzugt an
die Hintergrund-DNA bindet und deren Amplifikation beeinträchtigt.
Besonders bevorzugt ist es, dass
diese Bindungsstelle des weiteren Oligonukleotids oder PNA-Oligomers
mit den Bindungstellen der Primer auf der Hintergund-DNA überlappt
und das weitere Oligonukleotid das Binden mindestens eines Primeroligonukleotids
an die Hintergrund-DNA behindert.
Es ist wiederum besonders bevorzugt,
dass mindestens zwei weitere Oligonukleotide oder PNA-Oligomere
eingesetzt werden, wobei deren Bindungsstelle wiederum jeweils mit
der Bindungsstelle eines Primers an die Hintergund-DNA überlappt
und die weiteren Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere das Binden beider Primeroligonukleotide
an die Hintergrund-DNA behindern.
Zudem ist es besonders bevorzugt,
dass jeweils eines der weiteren Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere
das Bin den des Forward-Primers behindert während das jeweils andere das
Binden des Reverse-Primers behindert.
Besonders bevorzugt ist es, dass
die weiteren Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere in mindestens
der fünffachen
Konzentration im Vergleich zu den Primeroligonuleotide vorliegen.
Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass
man die chemisch behandelte DNA-Probe im zweiten Schritt unter Verwendung
von mindestens 2 Primeroligonukleotiden und einem weiteren Oligonukleotid,
welches an ein 5''-CG-3''-Dinukleotid
oder ein 5''-TG-3''-Dinukleotid oder ein 5''-CA-3''-Dinukleotid hybridisiert, und mindestens
einem Reporteroligonukleotid, welches an ein 5'-CG-3''-Dinukleotid
oder ein 5''-TG-3''-Dinukleotid oder ein 5''-CA-3''-Dinukleotid hybridisiert,
sowie einer Polymerase amplifiziert; wobei das weitere Oligonukleotid
bevorzugt an die Hintergrund-DNA bindet und deren Amplifikation
beeinträchtigt,
und wobei das Reporteroligonukleotid bevorzugt an die zu untersuchende
DNA bindet und deren Amplifikation anzeigt. Dabei ist es vorteilhaft, dass
man zusätzlich
zu dem Reporteroligonukleotid ein weiteres mit einem Fluoreszenzfarbstoff
markiertes Oligomer verwendet, welches unmittelbar benachbart zu
dem Reporteroligonukleotid hybridisiert und sich diese Hybridisierung
mittels Fluoreszenz Resonanz Energietransfer nachweisen lässt. Weiterhin
vorteilhaft ist es, dass ein Taqman®-Assay
durchgeführt
wird. Bevorzugt ist es auch, dass ein Lightcycler® Assay
durchgeführt
wird. Bevorzugt ist es auch, dass ein Assay unter Verwendung von
Molecular Beacons durchgeführt
wird.
In einer weiteren besonders bevorzugten Verfahrensvariante
binden die weiteren Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere an die Hintergrund-DNA und
behindern damit die vollständige
Primeroligonukleotid-Verlängerung
in der Polymerasereaktion. Dabei ist es wiederum besonders bevorzugt,
dass die verwendete Polymerase keine 5''-3''-Exonuklease-aktivität aufweist.
Eine weitere bevorzugte Variante ist es, dass die weiteren Oligonukleotide
am 5''-Ende modifiziert vorliegen und damit
von einer Polymerase mit 5''-3''-Exonuklease-aktivität nicht signifikant abgebaut
werden können.
In einer besonders bevorzugten Variante
unterscheiden die Primer selbst zwischen zu untersuchender DNA und
Hintergrund-DNA. In einer wiederum besonders bevorzugten Verfahrensvariante
liegt die Hintergrund DNA methyliert vor, und die zu untersuchende
DNA liegt unmethyliert vor, jeweils an Positionen, an die mindestens
ein Primer für
die Amplifikation bindet, wobei der oder die Primer bevorzugt an
die zu untersuchende DNA binden.
Sollen die Primer die zu untersuchende
DNA bevorzugt amplifizieren, so enthalten diese also bevorzugt TG
oder respektive CA Sequenzen an Positionen, die vor der Bisulfit
Behandlung CG Sequenzen entsprachen. Dadurch amplifizieren die Primer keine
ehemals methylierten, noch CG-haltigen
Sequenzen und damit unter diesem Bedingungen Idealerweise keine
Hintergrund DNA. Dies verstärkt
den durch das Nukleotidgemisch hervorgerufenen Effekt der Bevorzugung
der nicht methylierten zu untersuchenden DNA in der Amplifikation.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist es,
dass man in der Amplifikation zusätzlich mindestens ein Reporteroligonukleotid
verwendet, dessen Fluoreszenzeigenschaften sich in Folge der Amplifikation
verändern.
In einer wiederum besonders bevorzugten Variante des Verfahrens
führt man
einen Tagman®-Assay
oder ein LightCycler®-Assay oder einen Assay
unter Verwendung von Molecular Beacons durch.
Es ist ferner erfindungsgemäß bevorzugt, dass
die zusätzlich
zu den Primern verwendeten Oligonukleotide nicht über eine
3'-OH Funktion verfügen. Weiterhin
ist bevorzugt, dass die Reporteroligonukleotide mindestens eine
Fluoreszenzmarkierung tragen. Ferner ist auch bevorzugt, dass die
Reportermoleküle
die Amplifikation entweder durch eine Zunahme oder eine Abnahme
der Fluoreszenz anzeigen. Dabei ist es besonders vorteilhaft, dass
man die Zunahme oder Abnahme der Fluoreszenz auch direkt zur Analyse
verwendet und aus dem Fluoreszenzsignal auf einen Methylierungszustand
der zu analysierenden DNA schließt.
Bevorzugt ist es erfindungsgemäß ferner, dass
die Hintergrund-DNA in 100 facher Konzentration im Vergleich zur
zu untersuchenden DNA vorliegt. Weiterhin ist bevorzugt, dass die
Hintergrund-DNA in 1000 facher Konzentration im Vergleich zur zu
untersuchenden DNA vorliegt.
Weiterhin ist bevorzugt, dass man
aus dem Methylierungsgrad an den verschiedenen untersuchten CpG-Positionen auf das
Vorliegen einer Erkrankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des
Patienten schließt.
Vorteilhaft ist es, dass die Amplifikate
selbst für
die Detektion mit einer nachweisbaren Markierung versehen sind.
Weiterhin vorteilhaft ist es, dass die Markierungen Fluoreszenzmarkierungen
sind oder/und dass die Markierungen Radionuklide sind oder/und dass
die Markierungen ablösbare
Massenmarkierungen sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen
werden.
Bevorzugt ist ferner, dass bei der
Amplifikation einer der Primer an eine Festphase gebunden ist.
Erfindungsgemäß ist es auch, dass die Amplifikate
insgesamt im Massenspektrometer nachgewiesen werden und somit durch
ihre Masse eindeutig charakterisiert sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose
und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen,
wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden
Kategorien angehören:
unerwünschte
Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder
Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische
und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und
Persönlichkeitsstörungen;
Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit,
Fehlfunktion und Schädigung;
Fehlfunktion, Schädigung oder
Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder
Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder
Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als
Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit
der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine
und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen
oder sexuelle Fehlfunktion.
Bevorzugt ist auch die Verwendung
eines erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der
Zelldifferenzierung.
Bevorzugt ist auch die Verwendung
eines erfindungsgemässen
Verfahrens zur Klassifizierung von Patienten in Untergruppen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist auch ein Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen Reagenz,
Primern für
die Amplifikation und einem Nukleotidgemisch, das entweder nur 2'-Desoxy-Guanosintriphosphat
(dGTP), 2'-Desoxy-Adenosintriphosphat
(dATP) und 2'-Desoxy-Thymidintriphosphat
(dTTP) enthält,
aber kein dCTP, oder nur eine verhältnismäßig geringe Konzentration an 2'-Desoxy-Cytidintriphosphat (dCTP) enthält. Besonders
bevorzugt ist die Konzentration an dCTP höchstens halb so hoch wie die
durchschnittliche Konzentration der anderen drei Nukleotide.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist auch ein Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen Reagenz,
Primern für
die Amplifikation und einem Nukleotidgemisch, das entweder nur 2'-Desoxy-Cytidintriphosphat
(dCTP), 2'-Desoxy-Adenosintriphosphat
(dATP) und 2'-Desoxy-Thymidintriphosphat
(dTTP) enthält,
aber kein dGTP, oder nur eine verhältnismäßig geringe Konzentration an
2'-Desoxy-Guanosintriphosphat
(dGTP). Besonders bevorzugt ist die Konzentration an dGTP höchstens
halb so hoch wie die durchschnittliche Konzentration der anderen
drei Nukleotide.
Die vorliegende Erfindung beschreibt
somit ein Verfahren zur Detektion des Methylierungszustandes genomischer
DNA Proben. Im Gegensatz zu bislang bekannten Verfahren wird der
Methylierungsgrad eines Satzes von CpG Positionen in einer ausgewählten Untergruppe
von DNA-Fragmenten z. B. in Serum, Plasma, Urin oder Sputum bestimmt,
so dass eine Analyse auch in Gegenwart eines Überschusses an diagnostisch
nicht relevanter Hintergrund-DNA möglich ist. Insbesondere gelingt
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
der selektive Nachweis von nicht methylierter, zu untersuchender DNA
in Gegenwart eines Überschusses
an diagnostisch nicht relevanter, methylierter Hintergrund-DNA.
Dies konnte mit vergleichbaren Verfahren bislang
nicht gezeigt werden.
Dabei besteht das bevorzugte Verfahren wiederum
aus mehreren Schritten, die sich wie folgt zusammenfassen lassen:
Zuerst
werden dem Patienten Serum und/oder andere Körperflüssigkeiten entnommen und die.
darin befindliche DNA soweit erforderlich isoliert. Anschließend wird
im zweiten Schritt eine chemische Behandlung, bevorzugt mit einem
Bisulfit (= Hydrogensulfit, Disulfit) durchgeführt, wobei beispielsweise alle nicht
methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, die methylierten
Cytosinbasen (5-Methylcytosin) jedoch unverändert bleiben. Im dritten Verfahrensschritt
wird nun eine Amplifikation durchgeführt, bei der bevorzugt die
zu untersuchende DNA amplifiziert wird, nicht aber oder nur in geringerem Maße die Hintergrund-DNA.
Dabei führt
ein besonders angepasstes Nukleotidgemisch, wie oben beschrieben,
zu der Bevorzugung der zu untersuchenden DNA in der Amplifikation,
oder trägt
zumindest dazu bei. Besonders bevorzugt wird auch die Denaturierungstemperatur
so angepasst, dass bevorzugt die ursprünglich nicht methylierte DNA
aufgeschmolzen wird, die ursprünglich
methylierte DNA jedoch doppelsträngig
verbleibt. Im folgenden, vierten Schritt werden nun die amplifizierten
Fragmente detektiert. Es ist auch möglich, sie weiter im Detail
auf Ihre Methylierungssignatur hin zu analysieren und den Methylierungsgrad
mehrerer ehemaliger CpG Positionen in den Amplifikaten zu bestimmen.
Im fünften
Verfahrensschritt wird aus dem Methylierungsgrad an den verschiedenen
untersuchten CpG Positionen oder aus dem Vorliegen eines Amplifikates
oder aus der gebildeten Menge dieses Amplifikates allein auf das
Vorliegen einer Erkrankung oder eines anderen medizinischen Zustandes
des Patienten geschlossen.
Der erste Schritt des Verfahrens,
die Gewinnung von Proben, erfolgt bevorzugt durch Entnahme von Köperflüssigkeiten
wie z. B. Sputum, Urin, Plasma oder aber Serum, jedoch ist es offenkundig
dass das Verfahren mit vielerlei Proben aus unterschiedlichen Quellen
durchführbar
ist, die hier ohne Anspruch auf Vollständigkeit aufgeführt sind.
Bevorzugt wird die in dem Verfahren
eingesetzte genomische DNA aus einer DNA-Probe erhalten, wobei Quellen
für DNA
z. B. Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit,
in Paraffin eingebettetes. Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen,
Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische
Objektträger
und alle möglichen
Kombinationen hiervon umfassen.
Es erfolgt in einigen Fällen vor
der Bisulfit-Behandlung eine Aufreinigung oder Aufkonzentration
der DNA, um eine Störung
der Bisulfit-Reaktion und/oder der nachfolgenden PCR durch ein zu
hohes Maß an
Verunreinigungen zu vermeiden. Es ist jedoch bekannt, dass beispielsweise
eine PCR aus Gewebe nach Behandlung beispielsweise mit Proteinase
K ohne weitere Aufreinigung erfolgen kann, und dies gilt sinngemäß auch für die Bisulfit-Behandlung und
nachfolgende PCR.
Die chemische Behandlung wird bevorzugt durch
Behandlung mit einem Bisulfit (= Hydrogensulfit, Disulfit), wiederum
bevorzugt Natriumbisulfit (weniger geeignet ist Ammoniumbisulfit)
durchgeführt. Entweder
erfolgt die Reaktion nach einer publizierten Variante, bevorzugt
ist hier die Einbettung der DNA in Agarose, um die DNA während der
Be handlung in einzelsträngigen
Zustand zu halten, oder aber nach einer neuen Variante durch Behandlung
in Gegenwart eines Radikalfängers
und eines denaturierenden Reagenzes, bevorzugt ein Oligeothylenglykoldialkylether
oder beispielsweise Dioxan. Vor der PCR Reaktion werden die Reagenzien
entweder durch Waschen im Falle der Agarosemethode oder einem DNA-Aufreinigungsverfahren
(Stand der Technik, Fällung
oder Bindung an eine Festphase, Membran) entfernt oder aber einfach
durch Verdünnung
in einen Konzentrationsbereich gebracht, der die PCR nicht mehr
signifikant beeinflusst.
Im dritten Schritt des Verfahrens
wird eine Amplifikation der bisulfit-behandelten DNA durchgeführt. Die
Amplifikationsmethode bevorzugt dabei die zu untersuchende DNA im
Vergleich zur Hintergrund-DNA. Dabei wird durch Variation der Nukleotidkonzentration
in der PCR eine solche Bevorzugung erreicht. Schon bei gleicher
Konzentration aller 4 Nukleotide in der PCR kann es zu einer ungleichen Amplifikation
ehemals methylierter und unmethylierter DNA kommen. Auch wenn in
einer PCR-Reaktion diese Bevorzugung in einem Amplifikationszyklus
gering ausfällt,
so kann sich nach den üblichen
30–40 Zyklen
dennoch ein erheblicher Bias hinsichtlich der Amplifikationseffizienz
ergeben. Grundlegende Idee der vorliegenden Erfindung ist es nun,
sich diesen im allgemeinen unerwünschten
Effekt zunutze zu machen, indem man eine Bevorzugung der zu untersuchenden
DNA im Vergleich zur Hintergrund DNA durch Adaption der PCR-Bedingungen
verschärft: Das
erfindungsgemäße Verfahren
eignet sich dabei besonders für
die bevorzugte Amplifikation nicht methylierter DNA gegenüber methylierter
Hintergrund-DNA. Insbesondere die relative Konzentration der Nukleotide
zueinander soll hier geändert
werden, um einen solchen Bias zugunsten der ursprünglich nicht
methylierten DNA zu erreichen. Wird nicht methylierte DNA mit Bisulfit
behandelt, so ergibt sich nach der Amplifi kation ein Fragment, das
sehr viel weniger CG Basenpaare enthalten kann als ein Fragment,
dass aus einer entsprechenden methylierten DNA erzeugt wurde. Eine
Bevorzugung der nicht methylierten DNA wird also in der vorliegenden
Erfindung dadurch erreicht, dass der PCR-Reaktion wesentlich weniger
dCTP und/oder dGTP zugesetzt wird als dATP und dGTP. Dadurch dass
die dCTP und dGTP Nukleotide also limitierend werden in der PCR,
wird die an C und G ärmere
zu untersuchende DNA gegenüber
der Hintergrund-DNA bevorzugt.
Analog kann auch auf anderem Wege
eine Bevorzugung der zu untersuchenden DNA durch Veränderung
der Nukleotidzusammensetzung erreicht werden. So können z.B.
terminierende Nukleotidtriphosphate, wie beispielsweise Dideoxyderivate, in
geringen Konzentrationen eingesetzt werden. Selbige führen durch
Abbruch der Kettenverlängerung
in der Polymerasereaktion zu einer verminderten Amplifikationseffizienz,
aber wiederum wird die Hintergrund-DNA in der Amplifikation dadurch
stärker
beeinträchtigt
als die nicht methylierte zu untersuchende DNA, wenn beispielsweise
ddCTP oder ddGTP als Terminatoren ausgewählt werden.
Eine weitere Adaption der PCR-Bedingungen
kann durch die Veränderung
der Denaturierungstemperatur erfolgen. Eine niedrigere Denaturierungstemperatur
begünstigt
wiederum die ursprünglich
nicht methylierte DNA, da diese bei sonst gleicher Sequenz weniger
C/G Basenpaare enthält.
Die ursprünglich
methylierte DNA wird daher unter diesen Bedingungen nur unvollständig aufgeschmolzen und
steht im folgenden Amplifikationszyklus nicht als Templat zur Verfügung.
Besonders bevorzugt werden die Änderung der
Denaturieungstemperatur und die oben beschriebenen Änderungen
in der Nukleotidzusammensetzung kombiniert eingesetzt, um schließlich eine
Amplifikation der Hintergrund DNA über mehrere Zyklen praktisch
vollständig
zu unterdrücken.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch bevorzugt
in Kombination mit einer geeigneten Methode (wie z.B. MSP) und dazu
passenden Methylierungspositionen verwendet werden, die auch ansonsten
die selektive Amplifikation der zu untersuchenden DNA erlauben.
Die Auswahl der betreffenden CpG Positionen erfolgt dabei nach der
Prämisse, dass
sie sich zwischen Hintergrund-DNA und zu untersuchender DNA hinsichtlich
ihrer Methylierung so sehr wie möglich
unterscheiden sollten. Dazu werden bevorzugt zunächst die Methylierungsprofile
der jeweils in Frage kommenden Abschnitte eines Gens sowohl für die zu
untersuchenden Tumore als auch für
die Hintergrund-DNA aus gesunden Individuen bestimmt. Diejenigen
Positionen, die die größten Unterschiede
zwischen Tumor DNA und Hintergrund-DNA (beispielsweise im Serum)
aufweisen, werden als Methylierungspositionen ausgewählt, die von
genannten Methoden unterschieden werden sollen. Solche Positionen
sind für
eine Vielzahl von Genen bereits bekannt, beispielsweise für GSTpi,
für HIC-1
und MGMT (von Wronski MA, Harris LC, Tano K, Mitra S, Bigner DD,
Brent TP. (1992) Cytosine methylation and suppression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase
expression in human rhabdomyosarcoma cell lines and xenografts.
Oncol Res.; 4 (4-5): 167–74;
Esteller M, Toyota M, Sanchez-Cespedes
M, Capella G, Peinado MA, Watkins DN, Issa JP, Sidransky D, Baylin
SB, Herman JG. (2000), Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase
by promoter hypermethylation is associated with G to A mutations
in K-ras in colorectal tumorigenesis. Cancer Res. May 1; 60 (9): 2368–71).
Nach der selektiven Amplifikation
der zu untersuchenden DNA können
nun bevorzugt, nach an sich bekannten Verfahren, der Methylierungsstatus mehrerer
weiterer CpG-Positionen
bestimmt werden. Dabei ist der Bias der Amplifikation zu berücksichtigen,
es kann in diesem Falle also in erster Linie um eine Bestätigung des
Ergebnisses aus der Amplifikation gehen.
Es ist jedoch offensichtlich, dass
auch in diesem Fall das Entstehen eines PCR Fragmentes selbst im
Einzelfall von hinreichender Aussagekraft sein kann, sofern man,
wie auch bei der MSP, die Situation vorliegen hat, dass die bereits
in der Amplifikation untersuchte Position praktisch zu 100 beispielsweise
in der Hintergrund-DNA un- methyliert vorliegt, jedoch in der zu
untersuchenden DNA aufmethyliert vorliegt. Dies kann im Einzelfall
bereits hinreichend für
eine Diagnose sein.
Bevorzugt ist es, dass in einer PCR-Reaktion mehrere
Fragmente gleichzeitig erzeugt werden, d.h. dass eine Multiplex-PCR
durchgeführt
wird. Bei deren Design muss darauf geachtet werden, dass nicht nur
die Primer, sondern auch eventuell weitere eingesetzte Oligonukleotide
nicht zueinander komplementär
sein dürfen.
Jedoch hat man bei bisulfit-behandelter DNA den Vorteil, dass aufgrund
des unterschiedlichen G- und C-Gehaltes der beiden DNA-Stränge ein
Forward-Primer niemals auch als Reverse-Primer fungieren kann, was die Multiplexierung
erleichtert.
Im einfachsten Fall werden nun die
entstandenen Fragmente nachgewiesen. Dazu kommen alle möglichen
bekannten molekularbiologischen Verfahren in Frage, wie Gelelektrophorese,
Sequenzierung, Flüssigchromatographie
oder Hybridisierungen. Dies wäre
auch zur Qualitätskontrolle
der vorangehenden Verfahrensschritte denkbar. Wie oben ausgeführt, ist jedoch
die nachfolgende Analyse des Methlylierungsgrades weiterer CpG-Positionen
besonders bevorzugt.
Detektionstechniken, die sich dafür besonders
eignen, sind die Hybridisierung an Oligomerarrays und beispielsweise
Primer-Extension (MiniSequenzierung) Reaktionen.
Die Hybridisierung an Oligomerarrays
kann ohne weitere Veränderung
von Protokollen gegenüber
dem nächstliegenden
Stand der Technik verwendet werden (Olek A, Olek S, Walter J; WO-Patent 9928498).
Jedoch ist es bevorzugt, die Amplifikate an einen Array von Oligomeren
zu hybridisieren, der aus Paaren von an einer Festphase immobilisierten
Oligonukleotiden besteht, von denen eines jeweils stark bevorzugt
an einen ein ursprünglich
unmethyliertes CpG enthaltenden DNA-Abschnitt hybridisiert und das
andere wiederum stark bevorzugt an den entsprechenden Abschnitt,
in dem ursprünglich
ein methyliertes CpG enthalten war, jeweils vor der Bisulfit-Behandlung
und Amplifikation. Besonders bevorzugt ist in diesem Fall das Amplifikat
oder die Amplifikate fluoreszent oder radioaktiv oder mit ablösbaren Massentags
markiert, so dass sich nach der Hybridisierung die an die beiden
Oligonukleotide eines Paares gebundenen Fragmente anhand dieser
Markierung nachweisen und quantifizieren lassen. Man erhält ein Intensitätsverhältnis, aus
dem man beispielsweise nach Eichung des Experimentes mit vollständig methylierter
und unmethylierter DNA den Methylierungsgrad an der jeweiligen CpG-Position
bestimmen kann, wobei hier wiederum der Bias in der Amplifikation
zu berücksichtigen
ist. Auf einem solchen Oligomer-Array lässt sich eine Vielzahl von
Fragmenten gleichzeitig nachweisen. Es ist sinnvoll und bevorzugt,
dass der Array auch Oligomere zur Kontrolle des Experimentes enthält, da so
beispielsweise das Verhältnis
der in die Analyse eingehenden zu untersuchenden DNA zur Hintergrund-DNA
bestimmt werden kann.
Primerextensionsreaktionen können ebenfalls
an auf einer Festphase immobilisierten Oligonukleotide ausgeführt werden.
Obgleich nicht zwingend erforderlich, ist die Immobilisierung dieser
Primer bevorzugt, da in der Regel eine Vielzahl von CpG-Positionen
aus mehreren Amplifikaten untersucht werden soll und dies auf einer
Festphase, also an einem Oligomerarrays, bedeutend leichter und
in einem Experiment durchführbar
ist. Es ist besonders bevorzugt, dass die Primer sich unmittelbar
neben einer zu untersuchenden CpG-Position befinden und dass die Verlängerung
nur um ein Nukleotid erfolgt. Es ist besonders bevorzugt, dass lediglich
Didesoxythymidin und Didesoxycytidin als Nukleotide zugesetzt werden und
dass diese jeweils mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff
markiert sind, wobei allerdings auch andere, unterscheidbare Markierungen
wie Massentags denkbar und bevorzugt sind. Nach einer Bisulfit-Behandlung
und Amplifikation liegen ehemalige methylierte CG als CG und nicht
methylierte CG nunmehr als TG vor. Die Primerextensionsreaktion führt daher
entweder zum Einbau eines Didesoxycytidins oder Didesoxythymidins.
Aus dem Verhältnis der
für diese
beiden Terminatoren jeweils detektierten Fluoreszenzmarkierungen
lässt sich
auf die Methylierung der jeweiligen Position schließen. Es
ist auch möglich
und bevorzugt, in diesem Fall die Primerextension mit Desoxycytidin
und Desoxythymidin durchzuführen,
wenn man kein Guaninderivat zugibt und demzufolge bei einer TG oder
CG Sequenz bereits nach einer Base die Primerextension ohnehin endet.
Zudem ist es ebenfalls bevorzugt, die Analyse auf dem Gegenstrang
durch Unterscheidung von CA und CG analog durchzuführen, dann
entsprechend mit Didesoxy-ATP und Didesoxy-GTP oder deren Derivaten.
Die Auswahl der Positionen und die der Terminatoren und Nukleotide
in der Primerverlängerungsreaktion
muss mit der Auswahl der Nukleotide und Reaktionsbedingungen in
der erfindungsgemäßen Amplifikation
abgestimmt werden. Die sinnvollen und sinnlosen Kombinationen werden
für den
Fachmann offensichtlich sein.
Eine besonders bevorzugte Variante
des Verfahrens ist die Analyse von CpG-Positionen durch Verwendung
von Taqman® oder
Lightcycler®-Technologievarianten
unmittelbar während
der Amplifikation. Dabei werden zusätzlich zu den Oligonukleotiden, die
für die
Amplifikation der zu untersuchenden DNA sorgen, weitere fluoreszenzmarkierte
Oligonukleotide zugesetzt, und die Änderung der Fluoreszenz während der
PCR-Reaktion gemessen. Dabei erhält man überwiegend,
weil ja hauptsächlich
die zu untersuchende DNA amplifiziert wird, auch aus dieser Fluoreszenzänderung
unmittelbar Information über
den Methylierungsstatus verschiedener CpG Positionen. Da verschiedene
Oligonukleotide bevorzugt jeweils mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen
versehen werden, ist auch eine Unterscheidung der Fluoreszenzänderung
während
der PCR getrennt für
verschiedene Positionen und Fragmente möglich.
Diese damit vom Methylierungsstatus
abhängige
Fluoreszenzänderung
kann durch zahlreiche Methoden erzielt werden, von denen hier beispielhaft
zwei aufgeführt
werden sollen.
Zum einen können bevorzugt Oligonukleotid Sonden
verwendet werden, die spezifisch entweder an eine Sequenz binden,
die durch chemische Behandlung aus einer an der entsprechenden Position unmethylierten
DNA hervorgegangen ist, oder aber entsprechend an einer Sequenz,
die durch chemische Behandlung aus einer an der entsprechenden Position
methylierten DNA hervorgegangen ist. Diese Sonden sind besonders
bevorzugt mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen versehen, einem Quencherfarbstoff
und einem als Marker dienenden Fluoreszenzfarbstoff. Beide sind
mit der gleichen Oligonukleotidsonde verknüpft. Findet nun eine PCR-Reaktion mit der
zu untersuchenden DNA als Templat statt, so wird die PCR Reaktion
diesmal durch die fluoreszent markierte Oligomersonde blockiert.
Da diese jedoch nicht gegen die Nukleaseaktivität der Polymerase resistent
ist, findet ein Abbau der an die Templat-DNA gebundenen Sonde während der
PCR-Reaktion statt, der mit der Bindungseffizienz der Sonde an das Templat
korreliert, da die nicht gebundene Sonde von der Polymerase nicht
abgebaut wird. Der Abbau der Sonde wird nun dadurch, dass dabei
der Quencherfarbstoff und der als Marker dienende Fluoreszenzfarbstoff
voneinander getrennt werden, durch eine Zunahme der Fluoreszenz
des Markerfarbstoffs unmittelbar sichtbar. Im Prinzip handelt es
sich hierbei um eine Variante des sogenannten Taqman® Assays.
Was man demnach misst, ist das Entstehen eines
PCR Produktes aus der zu untersuchenden DNA, jedoch nur dann wenn
die untersuchte Position auch in dem Methylierungszustand vorliegt,
den die Sonde durch Hybridisieren an die chemisch behandelte DNA
detektieren kann. Eine Gegenprobe mit einer Sonde, die entsprechend
an die betreffende CpG-Position im anderen Methylierungszustand
binden würde,
ist daher zweckmäßig und
bevorzugt.
Bevorzugt werden verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe
mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen an mehreren Sonden zusammen
mit dem Quencher eingesetzt, um eine Unterscheidbarkeit der Sonden
und damit eine Multiplexierung zu erreichen.
Auch bei einem solchen Assay werden
an die betreffende CpG-Position bindende Oligonukleotide eingesetzt,
die eine signifikante Amplifikation der Hintergrund-DNA verhindern.
In
DE
101 12 515.1 wird ein entsprechendes Verfahren zum Nachweis
von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität offenbart,
bei dem eine chemisch behandelte DNA-Probe in einer Weise amplifiziert
wird, dass die zu untersuchende DNA gegenüber der Hintergrund-DNA als
Templat bevorzugt wird. Aus dem Vorliegen eines Amplifikats schließt man auf
den Methylierungszustand in der zu untersuchenden DNA.
Die Amplifikation der zu untersuchenden DNA
kann auch derart analysiert werden, dass man die gleiche Position
auch mit einer Sonde wie oben beschrieben untersucht und die Amplifikation
demnach durch eine an die betreffende CpG-Position bindende Sonde
nachweist. In diesem Fall ist es besonders bevorzugt, dass das nicht
abbaubare Oligonukleotid selektiv an die Hintergrund-DNA bindet,
während
die fluoreszenzmarkierte Sonde an die zu untersuchende DNA bindet.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens weisen dabei
die Sonde und das nicht abbaubare Oligonukleotid bis auf bevorzugt
eine, nicht aber mehr als zwei Nukleobasen die gleiche Sequenz auf.
Bevorzugt ist es auch, dass mit einer
Sonde mehrere Positionen gleichzeitig auf ihren Methylierungsgrad
untersucht werden können.
Ist eine genauere Quantifizierung
des Methylierungsgrades einer Position wünschenswert, so können bevorzugt
auch zwei mit einander konkurrierende Sonden mit unterschiedlichen
Farbstoffen eingesetzt werden, wobei eine wiederum im Fall einer unmethylierten
Position in der zu untersuchenden DNA, die andere umgekehrt im Falle
einer methylierten Position bevorzugt bindet. Aus dem Verhältnis der
Fluoreszenzzunahmen für
die beiden Farbstoffe lässt
sich dann wiederum auf den Methylierungszustand der untersuchten
Position schließen,
aber auch auf die erfolgreiche Durchführung der für die zu untersuchende DNA
spezifischen Amplifikation.
Ein grundsätzlich anderes Verfahren, bei dem
jedoch auch während
der PCR eine Fluoreszenzänderung
erfolgt, ist gegenwärtig
als LightCycler® Technologie
bekannt. Dabei wird ausgenutzt, dass ein Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen
zwei Farbstoffen nur erfolgen kann, wenn diese sich in unmittelbarer
Nähe, das
heißt
1–5 Nukleotide
voneinander entfernt befinden. Nur dann kann der zweite Farbstoff
von der Emission des ersten Farbstoffes angeregt werden und dann
seinerseits Licht einer anderen Wellenlänge emittieren, das dann detektiert
wird.
Im vorliegenden Fall der Methylierungsanalyse
erfolgt eine Hybridisierung einer fluoreszenzmarkierten Sonde an
die betreffende chemisch behandelte DNA an eine CpG- Position, und die
Bindung dieser Sonde hängt
wiederum davon ab, ob die zu untersuchende DNA an dieser Position
vor der Bisulfit-Behandlung methyliert oder unmethyliert vorlag.
Unmittelbar benachbart zu dieser Sonde bindet eine weitere Sonde
mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff. Diese Bindung erfolgt bevorzugt
wiederum methylierungsabhängig,
wenn in dem betreffenden Sequenzabschnitt eine weitere methylierbare
Position vorliegt. Während
der Amplifikation wird nun die DNA vermehrt, weshalb immer mehr
fluoreszenzmarkierte Sonden benachbart an die betreffende Position
binden, sofern diese den dafür
erforderlichen Methylierungszustand aufwies, und daher ein zunehmender
FRET gemessen wird.
Auch bei diesem Verfahren erfolgt
bevorzugt eine Multiplexierung mit mehreren verschieden fluoreszenzmarkierten
Sonden.
Zusammenfassend ist ein Verfahren
zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben besonders bevorzugt,
bei welchem die folgenden Schritte ausgeführt werden: Zuerst wird eine
genomische DNA-Probe, welche zu untersuchende DNA und Hintergrund-DNA
umfasst, chemisch derart behandelt, dass alle nicht methylierten
Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen
unverändert
bleiben, dann wird die chemisch behandelte DNA-Probe unter Verwendung von mindestens
2 Primeroligonukleotiden sowie einer Polymerase amplifiziert, wobei
die zu untersuchende DNA gegenüber
der Hintergrund-DNA als Templat bevorzugt wird und im nächsten Schritt
werden die Amplifikate analysiert und aus dem Vorliegen eines Amplifikates
und/oder aus der Analyse weiterer Positionen auf den Methylierungsstatus
in der zu untersuchenden DNA geschlossen.
In einer besonders bevorzugten Variante
des erfindungsgemäßen enthält des Nukleotidgemisch nur
2'-Desoxy-Guanosintriphosphat
(dGTP), 2'-Desoxy-Adenosintriphosphat
(dATP) und 2'-Desoxy-Thymidintriphosphat
(dTTP). Es ist jedoch ebenfalls bevorzugt, dass das Nukleotidgemisch
zudem eine verhältnismäßig geringe
Konzentration an 2'-Desoxy-Cytidintriphosphat
(dCTP) enthält.
Besonders bevorzugt ist die dCTP Anfangskonzentration dann bei der
Amplifikation höchstens
halb so hoch ist wie die durchschnittliche Anfangskonzentration
der anderen drei Nukleotide.
In einer ebenfalls besonders bevorzugten Verfahrensvariante
enthält
das Nukleotidgemisch nur 2'-Desoxy-Cytidintriphosphat
(dCTP), 2'-Desoxy-Adenosintriphosphat
(dATP) und 2'-Desoxy-Thymidintriphosphat
(dTTP). Es ist jedoch ebenfalls bevorzugt, dass das Nukleotidgemisch
zudem eine verhältnismäßig geringe
Konzentration an 2'-Desoxy-Guanosintriphosphat
(dGTP) enthält.
Besonders bevorzugt ist die die dGTP Anfangskonzentration dann bei
der Amplifikation höchstens
halb so hoch wie die durchschnittliche Anfangskonzentration der anderen
drei Nukleotide.
In einer weiteren, besonders bevorzugten Variante
des Verfahrens wird die Denaturierungstemperatur in der PCR so verändert, dass
die zu untersuchende DNA aufgeschmolzen wird, nicht aber die Hintergrund-DNA.
In Nucleic Acids Res. (1996) 24 (24)
5021–5 wird
eine Methode beschrieben, bei der während eines Amplifikationsschrittes
die Temperatur zur Auftrennung einer DNA in Enzelstränge unterhalb
der für die
Denaturierung einer genomischen DNA erforderlichen Temperatur gehalten
wird. Dadurch kann die Denaturierung der genomischen DNA ver hindert werden,
was eine selektive Amplifikation ermöglicht.
In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante
erfolgt die Analyse oder die weitere Analyse mittels Hybridisierung
an Oligomer-Arrays, wobei Oligomere Nukleinsäuren oder in ihren Hybridisierungseigenschaften ähnliche
Moleküle
wie PNAs sein können.
Bevorzugt hybridisieren die Oligomere über einen 12–22 Basen
langen Abschnitt an die zu analysierende DNA und umfassen ein CG,
TG oder CA Dinukleotid. Mit dieser Methode wird bevorzugt der Methylierungsstatus
von mehr als 20 Methylierungspositionen der zu untersuchenden DNA
in einem Experiment nachgewiesen, besonders bevorzugt sind es mehr
als 60 Methylierungspositionen.
Besonders bevorzugt ist auch ein
Verfahren, bei dem die weitere Analyse durch Längenmessung der amplifizierten
zu untersuchenden DNA erfolgt, wobei Methoden zur Längenmessung
Gelelektrophorese, Kapillargelelektrophorese, Chromatographie (z.B.
HPLC), Massenspektrometrie und andere geeignete Methoden umfassen.
Besonders bevorzugt ist auch ein
Verfahren, bei dem die weitere Analyse durch Sequenzierung erfolgt,
wobei Methoden zur Sequenzierung die Sanger-Methode, Maxam-Gilbert-Methode und andere Methoden
wie Sequencing by Hybridisation (SBH) umfassen. Wiederum bevorzugt
ist ein Verfahren, wobei die Sequenzierung (nach Sanger) für jede oder eine
kleine Gruppe von CpG Positionen mit jeweils einem separaten Primeroligonukleotid
ausgeführt wird
und die Verlängerung
der Primer nur eine oder einige wenige Basen ausmacht, und aus der
Art der Primerverlängerung
auf den Methylierungsstatus der betreffenden Positionen in der zu
untersuchenden DNA geschlossen wird.
In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante
wird aus dem Methylierungsgrad an den verschiedenen untersuchten
CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkrankung oder eines anderen
medizinischen Zustandes des Patienten geschlossen.
Besonders bevorzugt sind auch die
Amplifikate selbst für
die Detektion mit einer nachweisbaren Markierung versehen. Bei diesen
Markierungen handelt es sich bevorzugt um Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide
oder ablösbare
Massenmarkierungen, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
Weiterhin ist ein Verfahren bevorzugt,
bei dem bei der Amplifikation einer der Primer an eine Festphase
gebunden ist.
Auch bevorzugt ist eine Verfahrensvariante, wobei
die Amplifikate insgesamt im Massenspektrometer nachgewiesen werden
und somit durch ihre Masse eindeutig charakterisiert sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist die Verwendung eines der beschriebenen Verfahren zur Diagnose
und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei
diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien
angehören:
unerwünschte
Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder
Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische
und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und
Persönlichkeitsstörungen;
Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit,
Fehlfunktion und Schädigung;
Fehlfunktion, Schädigung oder
Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder
Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder
Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als
Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit
der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine
und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen
oder sexuelle Fehlfunktion.
Zudem bevorzugt ist die Verwendung
eines der beschriebenen Verfahren zur Unterscheidung von Zelltypen
oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist ein Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen Reagenz, Primern
und einem Nukleotidgemisch zur Herstellung der Amplifikate, sowie
optional einer Anleitung zur Durchführung zumindest einer der beschriebenen
Verfahrensvarianten.
Dabei besteht der Kit zumindest aus
drei Reagenzien, dem Bisulfit-Reagenz, dem Nukleotidgemisch sowie
den Primern, die einzeln oder als Gemisch enthalten sein können.
Das Nukeotidgemisch umfasst bevorzugt
nur 2'-Desoxy-Guanosintriphosphat
(dGTP), 2'-Desoxy-Adenosintriphosphat
(dATP) und 2'-Desoxy-Thymidintriphosphat
(dTTP). Es ist jedoch ebenfalls bevorzugt, dass das Nukleotidgemisch
zudem eine verhältnismäßig geringe
Konzentration an 2'-Desoxy-Cytidintriphosphat
(dCTP) enthält.
Besonders bevorzugt ist die dCTP Konzentration höchstens halb so hoch ist wie
die durchschnittliche Konzentration der anderen drei Nukleotide.
Das Nukleotidgemisch umfasst ebenfalls
bevorzugt nur 2'-Desoxy-Cytidintriphosphat
(dCTP), 2'-Desoxy-Adenosintriphosphat
(dATP) und 2'-Desoxy-Thymidintriphosphat
(dTTP). Es ist jedoch ebenfalls bevorzugt, dass das Nukleotidgemisch
zudem eine verhältnismäßig geringe
Konzentration an 2'-Desoxy-Guanosintriphosphat
(dGTP) enthält.
Besonders bevorzugt ist die die dGTP Konzentration höchstens
halb so hoch wie die durchschnittliche Konzentration der anderen
drei Nukleotide.
Das Nukleotidgemisch kann auch Didesoxynukleotide
enthalten. Zudem kann der Kit Pufferkomponenten für die Amplifikation
und/oder die Bisulfitreaktion enthalten.