Die
nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie
gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung
dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im
Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet
wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten
Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung
der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem
veränderten
Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
5-Methylcytosin
ist die häufigste
kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt
beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim
genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung
von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist
daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch
nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin
das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus
geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information,
welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
Eine
relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode
zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen
Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer
Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten
dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen
Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche
DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch
sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden
kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische
Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation
und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann.
Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll
ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit
betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende
DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und
Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA)
verhindert und alle Fällung-
und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald
J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based
cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15;24(24):5064-6).
Mit dieser Methode können
einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode
veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen
bis etwa 3000 Basenpaare Länge
untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von
möglichen
Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch
dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen
zuverlässig
analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix
verloren.
Eine Übersicht über die
weiteren bekannten Möglichkeiten,
5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel
entnommen werden: Rein T, DePamphilis ML, Zorbas H. Identifying
5-methylcytosine and related modi fications in DNA genomes. Nucleic
Acids Res. 1998 May 15;26(10):2255-64.
Die
Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk
M, Lich C, Buiting K, Dörfler
W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman
and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences
at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8) nur
in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische
Stücke
eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert
und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation
ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov.;17(3):275-6)
oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones
PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites
using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE).
Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15;25(12):2529-31, WO-Patent 9500669)
oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and
quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun.
15;25(12):2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch
Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).
Harnstoff
verbessert die Effizienz der Bisulfit-Behandlung vor der Sequenzierung von
5-Methylcytosin in genomischer DNA (Paulin R, Grigg GW, Davey MW,
Piper AA. Urea improves efficiency of bisulphate-mediated sequencing
of 5'-methylcytosine
in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 1998 Nov. 1;26(21):5009-10).
Weitere
Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum
Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind:
Grigg
G, Clark S. sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA.
Bioassays. 1994 Jun.;16(6):431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich
B, Buiting K, Horsthemke B, Dörfler
W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation
patterns in the Prader-Willi/Angelman
syndrome region as determined by the genomic sequencing method.
Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP,
Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes:
improved protocol fort bisulphate genomic sequencing. Nucleic Acids
Res. 1994 Feb. 25;22(4):695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X,
Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between
DNA hypomethylation in the 5' region
of the pS2 gene andin its expression in human breast cancer cell
lines. Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4; WO 97 46705, WO 95 15373
und WO 45560.
Ein
weiteres bekanntes Verfahren ist die sogenannte methylierungssensitive
PCR (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996),
Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status
of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA. Sep 3;93(18):9821-6). Für dieses
Verfahren werden Primer verwendet, die entweder nur an eine Sequenz
hybridisieren, die durch die Bisulfit-Behandlung einer an der betreffenden
Position unmethylierten DNA entsteht, oder aber umgekehrt Primer,
welche nur an eine Nukleinsäure
bindet, die durch die Bisulfit-Behandlung einer an der betreffenden
Position unmethylierten DNA entsteht. Mit diesen Primer können demnach
Amplifikate erzeugt werden, deren Detektion wiederum Hinweise auf
das Vorliegen einer methylierten oder unmethylierten Position in
der Probe liefern, an welche die Primer binden.
Ein
neueres Verfahren ist auch der Nachweis von Cytosin-Methylierung mittels
einer Taqman PCR, das als Methyl- Light
bekannt geworden ist (WO00/70090). Mit diesem Verfahren ist es möglich, den
Methylierungsstatus einzelner oder weniger Positionen direkt im
Verlauf der PCR nachzuweisen, so dass sich eine nachfolgende Analyse
der Produkte erübrigt.
Stand
der Technik ist wiederum ein von Epigenomics entwickeltes Verfahren,
welches zu untersuchende DNA und Hintergrund-DNA nach Bisulfit-Behandlung
gleichermaßen
amplifiziert und dann die im Fragment enthaltenen ehemaligen CpG
Positionen durch Hybridisierungstechniken untersucht, alternativ
mittels MiniSequenzierung oder anderen gängigen Verfahren. Dies hat
den Vorteil, dass man ein quantitatives Bild bezüglich der untersuchten Methylierungspositionen
erhält,
d. h. es erfolgt die Bestimmung des Methylierungsgrades einer Vielzahl
von Positionen, was z. B. bei soliden Tumoren eine sehr genau Klassifizierung
ermöglicht.
Für die Markierung
von Amplifikaten sind vielfach fluoresziert markierte Primeroligonukleotid
e verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist
das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-Ende des jeweiligen Primers. Die Farbstoffe
Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Matrix-assistierte
Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie
(MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse
von Biomolekülen
(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins
with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988
Oct. 15160(20):2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende
Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix
verdampft und das Analytmolekül
so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird
die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt
die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen
Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen
erreichen den Detektor früher
als größere.
MALDI-TOF
Spektroskopie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden
und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger
(Gut, I. G. und Beck, S. (1995), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Innovations
and Future Trends 1: 147-157.) Für
Nukleinsäuren
ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide
und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die
ein vielfach negativ geladenes Rückgrat
haben, ist der Ionisationsprozeß durch
die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektroskopie
spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption
von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden,
die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile
einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied
nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert
werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem
Peptid ähnlicher
wird. Phosphorothioatnukleinsäuren,
bei denen die gewöhnlichen
Phosphate des Rückgrats
durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache
Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut, I.
G. und Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA alkylation
and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373).
Die Kopplung eines „charge
tags" an diese modifizierte
DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen
Betrag, wie er für
Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse
gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate
stark erschweren.
Genomische
DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder
sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet
sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 1989.
Nach
der Erfindung der PCR sind in den folgenden Jahren zahlreiche Varianten
bekannt geworden, die diese Technik zur Amplifikation der DNA verfeinern.
Insbesondere ist hier die Multiplexierung der PCR (Multiplex-PCR)
zu erwähnen,
wobei man mehr als 2 spezifische Primer einsetzt und dabei in einem
Reaktionsgefäß eine Vielzahl
von verschiedenen, spezifische n Amplifikation erzeugen kann. Besonders
interessant ist auch die sogenannte Nested PCR, welche unter anderem
zum Nachweis besonders geringer DNA Mengen verwendet wird. Diese
Art der PCR besteht aus zwei aufeinanderfolgenden Amplifikationen,
wobei die Primer der zweiten Amplifikation innerhalb des ersten
Amplifikates liegen und nicht mit den Primern der ersten Amplifikation
identisch sind. Dadurch wird eine besondere Spezifität erreicht,
da die Primer der zweiten Amplifikation nur dann funktionieren,
wenn in der ersten Amplifikation das beabsichtigte Fragment erzeugt
wurde. Dagegen ist die die Vermehrung etwaiger Nebenprodukte der
ersten Amplifikation in der zweiten so gut wie ausgeschlossen.
Deng,
D.J. et al., Chinese Journal of Cancer Research, (2000), 12/3 (171
+ 191),5, beschreiben die Bisulfit-Behandlung zweier genomischer
Proben aus Krebszellen, deren PCR Amplifikation und die vergleichende
denaturierende HPLC (DHPLC) der PCR Produkte der beiden Proben.
DE 198 53 398 C1 beschreibt u.
a. den Einsatz der Massenspektrometrie zur Analyse des Molekulargewichts
von DNA-Fragmenten. Huber, C. G. et al, J. Biochem. Biophys. Methods
47 (2001) 5-19, beschreibt ferner die Auftrennung von Einzelsträngen eines
PCR-Produktes und den Nachweis einer G-T-Transversion bei 75°C.
Es
sind demnach bislang vielerlei Verfahren zur Methylierungsanalyse
Stand der Technik. Die meisten dieser Verfahren erlauben die Analyse
von einzelnen Positionen im Genom, einige, wie zum Beipiel Hybridisierungstechniken
an Oligomer Arrays, erlauben die Analyse einer Vielzahl 5 von Positionen
gleichzeitig. Der experimentelle Aufwand dieser Verfahren ist jedoch
vergleichsweise hoch. Die vorliegende Erfindung soll ein Verfahren
bereitstellen, das es nach den Bisulfit Behandlung und Amplifikation
mit in molekularbiologischen Laboratorien verbreiteter Intrumentierung
wie Kapillargelelektrophorese oder HPLC erlaubt, eine direkte Methylierungsanalyse
in dem gesamten Fragment ohne weitere Schritte durchzuführen. Die
Methode verzichtet dabei auf die Analyse bestimmter Einzelpositionen,
sondern analysiert das Ausmaß der
Methylierung in dem untersuchten Fragment.
Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass sich die Basenzusammensetzung
der DNA in der Bisulfit-Behandlung
und in der nachfolgenden Amplifikation auf charakteristische Weise ändert und
dass sich allein daraus ein Analyseverfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung ableiten
lässt.
Wird eine genomische DNA Probe mit Bisulfit behandelt, so werden
alle nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt und in
der nachfolgenden Amplifikation in Thymin. Demzufolge nimmt die
Anzahl der Cytosinbasen grundsätzlich
ab, und zwar umso mehr, je geringer der Methylierungsgrad des betreffenden
amplifizierten Abschnittes der DNA-Probe ist. Entsprechend nimmt
die Anzahl der Thyminbasen zu, je geringer der Methylierungsgrad
ist. In dem in der Amplifikation gebildeten komplementären Gegenstrang
ist es umgekehrt so, dass je geringer der Methylierungsgrad in der
DNA Probe war, umso mehr Adenin eingebaut wurde. Umgekehrt enthält der Gegenstrang
umso mehr Guanin, je höher
der Methylierungsgrad der DNA-Probe war.
Dies
führt nun
zu dem Effekt, dass sich die Molmasse der beiden in der Amplifikation
gebildeten komplementären
Stränge
umso mehr unterscheidet, je geringer der Methylierungsgrad in dem
amplifizierten Abschnitt der genomischen DNA-Probe ist. Eine Umwandlung
des Cytosins in dem einen Strang in letztlich Thymidin führt zu einer
Erhö hung
der Masse um jeweils 15 Da, während
auf dem komplementären
Strang sich dadurch, dass entsprechend Guanin durch Adenin ersetzt
wird, eine Verringerung der Molekülmasse um 16 Da ergibt. Daraus
folgt, dass sich aus der Umwandlung jedes zusätzlichen Cytosins in letzlich
Thymin eine zusätzliche
Massendifferenz von 31 Da zwischen den beiden komplementären Strängen des
Amplifikates ergibt.
Die
vorliegende Erfindung nutzt nun mehrere Verfahren, um diese Massendifferenz
aufzuzeigen und daraus unmittelbar Information über den Methylierungszustand
des untersuchten Abschnittes der genomischen DNA Probe abzuleiten.
Zusätzlich zu
der sich mit abnehmender Methylierung verändernden Molekülmasse der
Einzelstränge gibt
es noch weitere Effekte, der hier ausgenutzt werden können. Jede
Umwandlung von Cytosinbasen in Thymidin führt beispielsweise zu dem Verlust
einer Aminofunktion in dem jeweiligen Einzelstrang, während in
dem anderen Strang Guanin gegen Adenin auszutauschen ist und dabei
jedoch die Aminofunktion erhalten bleibt. Auch dadurch verändern sich
je nach gewähltem
Analyseverfahren die Eigenschaften der jeweiligen Einzelstränge zueinander
erheblich. In jedem Fall lässt
sich aber eine unmittelbare Abhängigkeit
dieser Eigenschaften vom Methylierungsgrad herstellen.
Zur
Analyse der Einzelstränge
lassen sich mehrere Verfahren nutzen, die hier beschrieben werden sollen.
Insbesondere ist denaturierende Gelelektrophorese, bevorzugt die
Kapillargelelektrophorese, zur Auftrennung der Einzelstränge geeignet
(siehe Beispiel 1). Normalerweise wird in der Gelelektrophorese,
wenn sie nicht denaturierend durchgeführt wird, die DNA im wesentlichen
in Abhängigkeit
von ihrer Länge
aufgetrennt. Dabei dienen DNA Fragmente bekannte Länge als
Standard. Bei denaturierender Gelelektrophorese hingegen erfolgt
oft auch eine Auftrennung in Abhängigkeit
von der Sequenz, wenn diese unterschiedliche Konformationen und
Sekundärstrukturen
des DNA-Einzelstranges bedingen. Eine der bekanntesten Techniken
in diesem Zusammenhang ist die SSCP.
Da
jedoch hier ein Methylierungsgrad innerhalb eines Fragmentes festzustellen
ist, dem eine Vielzahl möglicher
unterschiedlicher Sequenzen nach der Bisulfit-Behandlung gegenüberstehen,
eignen sich derartige Methoden nicht so gut, da man sehr viele verschiedene
Fälle unterscheiden
muss. Jedoch ist eine Anwendung der SSCP auch für Methylierungsanalyse in diesem
Sinne denkbar.
Der
besondere Vorteil dieser Erfindung im Hinblick auf die Gelelektrophorese
ist jedoch, dass sich die Basenzusammensetzung in der Bisulfit-behandelten
und amplifizierten DNA wesentlich von der genomischen unterscheidet,
und zwar umso mehr, je geringer ihr Methylierungsgrad ist. Diese
Unterschiede sind extrem genug, dass man sie, wie in Beispiel 1
gezeigt, auch unmittelbar zur Methylierungsanalyse verwenden kann,
da sich das Verhalten in der Kapillargelelektrophorese messbar in
Abhängigkeit
von der Sequenz ändert.
Besonders sinnvoll und bevorzugt ist es auch, den Abstand der Banden
für die
beiden jeweiligen Einzelstränge
des PCR-Produktes als Mass für
den Methylierungsgrad in der genomischen Probe zu verwenden.
Ähnliches
gilt auch für
die zwei Peaks einer denaturierenden HPLC, die analog ausgewertet
werden kann. Auf geeigneten Reversed-Phase Säulen, bevorzugt in Verbindung
mit Triethylammoniumacetat/Acetonitril Gradienten eluiert, lassen
sich die beiden Einzelstränge
ebenfalls auftrennen. Auch hier ist die Retentionszeit wiederum
unmittelbar abhängig
von der Basenzusammensetzung und damit letztlich von dem Methylierungsgrad
der genomischen DNA-Probe
in dem betreffenden Fragment.
Es
ist auch möglich
und bevorzugt, die HPLC bei einer Temperatur durchzuführen, in
der die DNA zumindest partiell noch doppelsträngig vorliegt. Die dabei gebildeten
Duplexes und Heteroduplexes können ebenfalls
in Abhängigkeit
von der Anzahl der Fehlpaarungen von der HPLC aufgetrennt werden.
Dies erlaubt es, ein Bild von der Homogenität der Methylierung zwischen
zwei Proben zu erzeugen. Es ist auch möglich und bevorzugt, Methylierung
auf diese Art unmittelbar zu messen, wenn ein bekanntes Referenzamplifikat
zugesetzt wird, das aus einer im Methylierungsmuster gut charakterisierten
und mit Bisulfit behandelten Probe gewonnen wurde. Die Peaks erlauben
in diesem Falle einen Rückschluss
auf die Ähnlichkeit
des Methylierungsmusters mit dem der Referenz-DNA.
Die
der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird dadurch gelöst, dass
ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben geschaffen
wird bei dem man die folgenden Schritte ausführt:
- a)
eine genomische DNA Probe wird chemisch, bevorzugt mit einem Bisulfit
(=Disulfit, Hydrogensulfit), derart behandelt, dass Cytosin in Uracil
umgewandelt wird, während
5-Methylcytosin
unverändert
bleibt,
- b) Abschnitte der Proben-DNA werden mit mindestens 2 Primern
in einer Polymerasereaktion, bevorzugt einer Polymerasekettenreaktion,
amplifiziert und
- c) die Fragmente werden hinsichtlich der Basenzusammensetzung
jeweils der beiden komplementären Stränge des
Amplifikates untersucht, wobei aus dem Unterschied im Molekulargewicht
der beiden Stränge auf
den Methylie rungsstatus in dem amplifizierten Abschnitt der genomischen
DNA-Probe geschlossen wird.
In
einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden der oder
die Unterschiede im Molekulargewicht der beiden Stränge durch
denaturierende Gelelektrophorese gemessen. Analog dem Molekulargewicht
kann die Bruttozusammensetzung der DNA in Bezug auf die Nukleobasen
A, C, T und G betrachtet werden. Im folgenden wird jedoch der Einfachheit
halber immer nur auf das Molekulargewicht Bezug genommen. In einer
wiederum besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird der
Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge durch Kapillargelelektrophorese
bestimmt.
In
einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird
der Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge durch
chomatographische Verfahren gemessen. Besonders bevorzugt handelt
es sich bei diesem chromatographischen Verfahren um denaturierende
Hochdruckflüssigkeits-chromatographie (HPLC).
Besonders
bevorzugt tragen zusätzlich
zum Molekulargewicht auch noch weitere Faktoren wie z. B. der unterschiedliche
Gesamtgehalt an Guanin, an Aminofunktionen oder Ketofunktionen der
beiden komplementären
Stränge
zu ihrem unterschiedlichen Verhalten in einer der oben erwähnten analytischen
Methoden bei.
Ebenfalls
ist es besonders bevorzugt, den Unterschied im Molekulargewicht
der beiden Stränge
durch Massenspektrometrie zu bestimmen. Da ausschliesslich die Massendifferenz
der beiden Stränge
bestimmt wird, erübrigt
sich hier eine Kalibrierung. Es ist jedoch offensichtlich, dass
es ebenfalls möglich
ist, die Massen der beiden Stränge
ge trennt zu bestimmen und nur eine Masse für die Methylierungsanalyse
heranzuziehen.
Besonders
bevorzugt ist auch eine Verfahrensvariante, bei der Referenz-DNA
bekannter Zusammensetzung und gleicher oder ähnlicher Länge bei der Analyse als externer
oder interner Standard verwendet wird. Wiederum besonders bevorzugt
handelt es sich bei dieser Referenz-DNA um Bisulfit-behandelte DNA
aus einer Referenzprobe mit bekanntem Methylierungsstatus handelt
oder aber um die ohne vorherige chemische Behandlung amplifizierte
genomische DNA mit gleicher oder ähnlicher Fragmentlänge wie
das jeweils analysierte Fragment.
In
einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens gewinnt man
die Proben DNA aus Serum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Individuums,
aus Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit,
in Paraffin einbettetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen,
Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen
Objektträgern
und allen möglichen
Kombinationen hiervon.
In
einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Verfahrens führt man
die chemische Behandlung mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit)
durch. Besonders bevorzugt erfolgt die chemische Behandlung nach
Einbetten der DNA in Agarose. Ebenfalls bevorzugt ist es, dass bei
der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz
und/oder ein Radikalfänger
zugegen ist.
In
einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird die Amplifikation
mehrerer Fragmente in einem Reaktionsgefäß in Form einer Multiplex-PCR
durchgeführt.
Die
in den Amplifikationen verwendeten Primer amplifizieren besonders
bevorzugt keine Fragmente aus nicht mit Bisulfit behandelter genomischer
DNA (oder nur in vernachlässigbarem
Ausmaß),
so dass sie für die
mit Bisulfit umgewandelte DNA spezifisch sind. Dies schützt vor
fehlerhaften Ergebnissen im Falle einer unvollständigen Umwandlungsreaktion
mit beispielsweise Natriumbisulfit.
In
einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens sind die Amplifikate
für die
Detektion mit mindestens einer nachweisbaren Markierung versehen,
die bevorzugt durch Markierung der Primer während der Amplifikation eingebracht
wird. Besonders bevorzugt sind die Markierungen Fluoreszenzmarkierungen
oder Radionuklide. Besonders bevorzugt werden die beiden Stränge der
Amplifikate getrennt und insgesamt im Massenspektrometer nachgewiesen
und somit durch ihre jeweilige Masse eindeutig charakterisiert.
Besonders
bevorzugt ist auch eine Verfahrensvariante bei der man aus dem Methylierungsgrad
an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen
einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten
schließt.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines der beschriebenen
Verfahrensvarianten zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger
Ereignisse für
Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens
einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen;
Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder
Verhaltensstörungen;
klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische
Störungen
und Persönlichkeitsstörungen;
Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskulä re Krankheit,
Fehlfunktion und Schädigung;
Fehlfunktion, Schädigung
oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder
Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder
Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als
Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder
Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen;
endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder
sexuelle Fehlfunktion.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines der beschriebenen
Verfahrensvarianten zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben
oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit, bestehend aus einem
Bisulfit enthaltenen Reagenz, Primern zur Herstellung der Amplifikate,
sowie optional einer Anleitung zur Durchführung eines Assays entsprechend
einer der beschriebenen Verfahrensvarianten.
