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Gebiet der Erfindung
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Die nach den methodischen Entwicklungen
der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen
sind die Gene selbst, die Übersetzung
dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im
Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet
wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten
Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung
der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem
veränderten
Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Nukleinsäuren,
Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose und/oder
der Therapie von Erkrankungen, die mit den genetischen und/oder
epigenetischen Parametern von Genen, die mit der Signaltransduktion
assoziiert sind und insbesondere deren Methylierungsstatus in Zusammenhang
stehen.
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Stand der Technik
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Eukaryotic Zellen existieren in einem
sozialen Kontext und als solche benötigen sie ein System, das eine
interzelluläre
Kommunikation ermöglicht.
Moleküle,
wie zum Beispiel Hormone, Wachstumsfaktoren und Neurotransmitter
werden als Transmitter in der Zellsignalisierung verwendet. These
Signale ermöglichen
die Einstellung von Faktoren, wie zum Beispiel Metabolismus, Wachstum,
Zellteilung und Apoptose die für
die Teilnahme der Zelle an einer sozial Umwelt essentiell sind.
Die Signaltransduktion kann als die Bewegung von solchen Signalen
von außerhalb
der Zelle zu innerhalb der Zelle definiert werden. Die Signaltransmission
kann einfach sein, wie im Fall der Azetylcholin-Rezeptoren, die
die Bewegung von Signalen durch Ionenkanäle auf der Plasmamembran-Oberfläche ermöglichen.
Alternativ, können
die Signaleauf eine kompliziertere Weise durch ein intrazelluläre Signalkaskade
mittels Protein-Phosphorylierung, (die Addition und Entfernung von Phosphatgruppen
durch Proteinkinasen und Proteinphosphatasen) übertragen werden. Das System
hat einen hohen Grad an Spezifität
entwickelt, wobei die Kinasen und Phosphatasen des Systems im Hinblick
auf ihre Substrate außerordentlich
präzise
sind. Die an der Zellmembran erhaltenen Signale stimulieren die
Aktivität eines
Signal integrierenden Komplexes, der dann mit dem Substrat interagiert,
was schließlich
zu einer phänotypischen
Antwort führt.
Weiterhin gibt es neue Hinweise, daß Proteinkinasen und Proteinphosphatasen
mit moderat präziser
schneller Signaltransduktion zusammenarbeiten, die durch Feedback
reguliert wird.
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Signalrezeptoren können in
drei Klassen eingeteilt werden. Die erste Klasse besteht aus Rezeptoren, die
die Plasmamembran durchspannen und die eine intrinsische enzymatische
Aktivität
aufzuweisen, wie zum Beispiel Tyrosinkinasen und Guanylatcyklasen.
Die zweite Gruppe besteht aus Rezeptoren, die an GTP-bindende und
hydrolysierende Proteins gekoppelt ist, wie zum Beispiel Odorant-Rezeptoren
und einige Hormonrezeptoren. Die dritte Gruppe umfaßt intrazelluläre Rezeptoren,
die die Gentranskription nach der Ligandenbindung direkt beeinflussen.
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Unterbrechungen in Zellsignal-Übertragungswegen
werden mit vielen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht, einschließlich Krebs,
Immunerkrankungen und entzündlichen
Erkrankungen. Daher ist die Aufklärung von Zellsignal-Übertragungswegen
von erheblicher Richtigkeit. Die Signalübertragungswege sind augenblicklich
weit davon entfernt, vollständig
verstanden zu werden. Jedoch hat dies nicht die Verwendung von Signaltransduktion
als eine Wirkstoff-Auffindungsplattform behindert, alle großen pharmazeutischen
Firmen verfolgen im Augenblick aktive Wirkstoff-Auffindungsprogramme,
basierend auf der Signaltransduktion.
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5-Methylcytosin ist die häufigste
kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryontischer Zellen. Sie spielt
beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim
genetischen Imprinting und in der Tumorgenese.
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Die aberrante DNA Methylierung innerhalb
von CpG Inseln ist in menschlichen malignen Erkrankungen verbreitet
und führt
zur Einstellung oder Überexpression
eines breiten Spektrums von Genen (Jones, P.A. Cancer Res 65:2463-2467,
1996). Von der abnormalen Methylierung wurde auch gezeigt, daß sie in
CpG reichen regulatorischen Elementen in intronischen und kodierenden
Teilen von Genen für
bestimmte Tumore auftritt (Chan, M.F., et al., Curr Top Microbiol
Immunol 249:75-86,2000). Unter der Verwendung von Restriktions-Landmark
genomischem Scanning, waren Costello und Mitarbeiter in der Lage
zu zeigen, daß die
Me thylierungsmuster für
den Tumortyp spezifisch sind (Costello, J. F., et al., Nat Genet
24:132-138, 2000).
Hoch charakteristische DNA Methylierungsmuster konnten auch für Brustkrebs
Zellinien gezeigt werden (Huang, T. H.-M., et al., Hum Mol Genet
8:459-470, 1999). Die Genom-weitere Ermittlung des Methylierungsstatus
stellt einen molekularen Fingerprint von Krebsgeweben dar.
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Die Identifizierung von 5-Methylcytosin
als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem
Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung
identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten
aufweist wie Cytosin. Darüber
hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information,
welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
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Eine relativ neue und die mittlerweile
am häufigsten
angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin
beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das
nach anschließender
alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem
Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin
wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird
die ursprüngliche
DNA so umgewandelt, daß Methylcytosin,
welches ursprünglich
durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden
werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische
Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation
und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann.
Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll
ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit
betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA
in einer Agarose-Matrix
einschließt,
dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur
an einzelsträngiger
DNA) verhindert und alle Fällungs-
und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald
J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based
cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6).
Mit dieser Methode können
einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode
veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen
bis etwa 3000 Basenpaare Länge
untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen
Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch
dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen
zuverlässig
analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix
verloren.
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Eine Übersicht über die weiteren bekannten
Möglichkeiten,
5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel
entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic
Acids Res. 1998, 26, 2255.
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Die Bisulfit-Technik wird bisher
bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler
W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman
and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences
at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8) nur in
der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines
bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder
komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny
of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6)
oder einzelne Cytosin-Positionen durch
eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones
PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites
using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE).
Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31, WO 95/00669) oder
einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative
DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4)
nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben
worden (Olek et al., WO 99/28498).
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Weitere Publikationen, die sich mit
der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei
einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine
residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431; Zeschnigk
M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted
segments in the human genome: different DNA methylation patterns
in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the
genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95;
Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis
on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic
sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6; Martin V,
Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates
a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2
gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995
May 19;157(1-2):261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO 97/45560.
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Eine Übersicht über den Stand der Technik in
der Oligomer Array Herstellung läßt sich
aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics
(Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort
zitierten Literatur entnehmen.
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Für
die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte
Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist
das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen
Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt
beispielsweise über
ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen
anderen, kommerziell erhältlich.
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Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie
(MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse
von Biomolekülen
(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins
with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988
Oct 15;60(20):2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende
Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix
verdampft und das Analytmolekül
so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird
die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt
die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen
Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen
erreichen den Detektor früher
als größere.
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MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich
ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse
von Nukleinsäuren
ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations
and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit
etwa 100 mal schlechter als für
Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die
ein vielfach negativ geladenes Rückgrat
haben, ist der Ionisationsprozeß durch
die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie
spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption
von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrizes gefunden worden,
die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile
einige ansprechende Matrizes, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied
nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert
werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, daß sie einem
Peptid ähnlicher wird.
Phosphorothioatnukleinsäuren,
bei denen die gewöhnlichen
Phosphate des Rückgrats
durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache
Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG,
Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by
mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73).
Die Kopplung eines „charge
tags" an diese modifizierte
DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen
Betrag, wie er für
Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse
gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate
stark erschweren.
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Genomische DNA wird durch Standardmethoden
aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen.
Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und
Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
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Beschreibung
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Es ist die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, die chemisch modifizierte DNA von Genen zur Verfügung zu
stellen, die mit der Signaltransduktion assoziiert sind, sowie Oligonukleotide
und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen
sowie ein Verfahren bereitzustellen, welches sich zur Diagnose und/oder
der Therapie von genetischen und epigenetischen Parametern von Genen,
die mit der Signaltransduktion assoziiert sind, besonders eignet.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß genetische und epigenetische
Parameter und insbesondere die Cytosin-Methylierungsmuster von Genen,
die mit der Signaltransduktion assoziiert sind, zur Diagnose und/oder
der Therapie von mit der Signaltransduktion assoziierten Erkrankungen
besonders eignen.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch
das zur Verfügung
stellen einer Nukleinsäure,
die eine mindestens 18 Basen lange Sequenz der chemisch vorbehandelten
DNA von Genen, die mit der Signaltransduktion assoziiert sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 388 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder Sequenzen der chemisch vorbehandelten DNA von Genen gemäß Tabelle
1 und dazu komplementären
Sequenzen enthält,
gelöst.
In der Tabelle sind nach den aufgelisteten Gen-Bezeichnungen die
jeweiligen Datenbanknummern (Zugangsnummern) angegeben, die die
dazugehörigen
Gensequenzen als einmalig definieren. GenBank am National Institute
of Health wurde als die zu Grunde liegende Datenbank unter der Internet
Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov verwendet.
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Die chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte
bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von genetischen
und epigenetische Parametern gebracht werden.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer zur Detektion
des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA,
umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von
mindestens 13 Nukleotiden gelöst,
die an eine chemisch vorbehandelte DNA von Genen, die mit der Signaltransduktion
assoziiert sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 388 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder Sequenzen der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die
mit der Signaltransduktion assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in
Tabelle 1 und dazu komplementären
Sequenzen aufgelisteten Gene hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligomersonden
stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung
der genetischen und epigenetischen Parameter von Genen, die mit
der Signaltransduktion assoziiert sind, erst ermöglichen. Bevorzugterweise umfaßt die Basensequenz
der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die Sonden können auch
in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders
bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind
erfindungsgemäße Oligonukleotide,
bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5. – 9. Nukleotid
vom 5'-Ende des
13-mers ist, im Falle von PNA-Oligomeren ist es bevorzugt, daß das Cytosin
des CpG Dinukleotids das 4. – 6.
Nukleotid vom 5'-Ende
des 9-mers ist.
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Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise
in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide
eine der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 388 und dazu
komplementären
Sequenzen und/oder Sequenzen der chemisch vorbehandelten DNA von
Genen, die mit der Signaltransduktion assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 und dazu komplementären Sequenzen aufgelisteten
Gene mindestens ein Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das
für jedes
der CpG Dinukleotide aus einer der Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 388
und dazu komplementären
Sequenzen und/oder Sequenzen der chemisch vorbehandelten DNA von
Genen, die mit der Signaltransduktion assoziiert sind gemäß einer der
Sequenzen der in Tabelle 1 und dazu komplementären Sequenzen aufgelisteten
Gene mindestens ein Oligomer umfaßt.
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Darüber hinaus stellt die Erfindung
ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als
sogenannte „Primer-Oligonukleotide" zur Amplifikation
von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 388 und
dazu komplementären
Sequenzen und/oder Sequenzen der chemisch vorbehandelten DNA von
Genen, die mit der Signaltransduktion assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene und dazu komplementären Sequenzen
oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.
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Im Falle der erfindungsgemäßen Sets
von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, daß mindestens ein Oligonukleotid
an eine Festphase gebunden ist.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin einen Satz von mindestens 10 n (Oligonukleotiden und/oder
PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes
in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No. 1 bis Seq.
ID No. 388 und dazu komplementären
Sequenzen und/oder Sequenzen der chemisch vorbehandelten DNA von
Genen gemäß Tabelle
1 und dazu komplementären
Sequenzen) dienen. Mit diesen Sonden ist die Diagnose und/oder Therapie
von genetischen und epigenetischen Parametern von Genen möglich, die
mit der Signaltransduktion assoziiert sind. Das Set von Oligomeren
kann auch zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs)
in der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 388 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder Sequenzen der chemisch vorbehandelten DNA von Genen gemäß Tabelle
1 und dazu komplementären
Sequenzen verwendet werden.
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Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß eine von
der Erfindung zur Verfügung
gestellte Anordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder
PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine Festphase
gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen Oligonukleotid-
und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein,
daß es
auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen
Gitters angeordnet ist. Bevorzugterweise besteht die Festphasenoberfläche aus
Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel,
Silber oder Gold. Möglich
sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel
Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial
fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit der Signaltransduktion
assoziierten Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung
an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von
solchen Arrays sind zum Beispiel aus der
US 5,744,305 mittels Festphasenchemie
und photolabilen Schutzgruppen bekannt.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
betrifft einen DNA-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit der Signaltransduktion
assoziierten Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung umfaßt.
DNA-Chips sind zum Beispiel aus der
US
5,837,832 bekannt.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden
Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens
zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18
Basenpaaren langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen
(Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 388 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder Sequenzen der chemisch vorbehandelten DNA von Genen gemäß Tabelle
1 und dazu komplementären
Sequenzen), Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren sowie einer
Anleitung zur Durchführung
und Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann. Ein Kit
im Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten
Bestandteile enthalten.
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Die vorliegende Erfindung stellt
weiterhin ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder
epigenetischen Parametern von Genen, die mit der Signaltransduktion
assoziiert sind durch Analyse von Cytosin-Methylierungen und Single
Nucleotide Polymorphismen zur Verfügung, das folgende Schritte
umfaßt:
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In einem ersten Verfahrensschritt
wird eine genomische DNA-Probe derart chemisch behandelt, daß an der
5'-Position unmethylierte
Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten
her dem Cytosin unähnliche
Base umgewandelt werden. Dies wird im folgenden unter „chemischer
Vorbehandlung" verstanden.
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Die zu analysierende genomische DNA
wird bevorzugt aus den üblichen
Quellen für
DNA erhalten, wie Zellen oder Zellbestandteilen, zum Beispiel Zellinien,
Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit,
in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen,
Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische
Objektträger
oder Kombinationen davon.
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Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene
Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit)
und anschließender
alkalischer Hydrolyse angewendet, die zu einer Umwandlung nicht
methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom
Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.
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Aus dieser chemisch vorbehandelten
genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von
erfindungsgemäßen Primer-Oligonukleotiden
und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert.
Aus statistischen und praktikablen Erwägungen werden bevorzugterweise
mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100 – 2000 Basenpaare
lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten kann simultan
in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird
die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens umfaßt
der Satz von Primer-Oligonukleotiden mindestens
zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch
zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang
(Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 388 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder Sequenzen der chemisch vorbehandelten DNA von Genen gemäß Tabelle
1 und dazu komplementären
Sequenzen) aufgelisteten Basensequenzen sind. Die Primer-Oligonukleotide
sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß sie kein CpG Dinukleotid
enthalten.
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Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß bei der
Amplifikation mindestens ein Primer-Oligonukleotid an eine Festphase gebunden
ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen
können
auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen
Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt
aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer,
Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien,
wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.
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Die mittels der Amplifikation erhaltenen
Fragmente können
eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt
sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden
oder ablösbaren
Molekülfragmenten
mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen
werden können,
wobei bevorzugt ist, daß die
erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer
eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Der
Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations
Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie
(ESI) durchgeführt
und visualisiert werden.
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Die im zweiten Verfahrensschritt
erhaltenen Amplifikate werden anschließend an einen Satz von Oligonukleotiden
und/oder PNA- Sonden der oder an ein Array hybridisiert. Die Hybridisierung
erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der
Hybridisierung verwendete Satz besteht bevorzugterweise aus mindestens
10 Oligonukleotid oder PNA-Oligomer
Sonden. Die Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an
einer Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht
hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die besagten
Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer
Länge von
13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt
der im Anhang aufgeführten
Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das
Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13-mers aus betrachtet.
Für jedes
CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besagten PNA-Oligomere
umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von
9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt
der im Anhang aufgeführten
Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das
Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9-mers
aus gesehen. Für
jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.
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Im vierten Verfahrensschritt entfernt
man die nicht hybridisierten Amplifikate.
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Im letzten Verfahrensschritt detektiert
man die hybridisierten Amplifikate. Dabei ist bevorzugt, daß an den
Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase,
an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar
sind.
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Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß die Markierungen
der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente
mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen
werden können.
Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu
den Amplifikaten komplementäre
Sonden im Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion
mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie
(MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführen und
visualisieren kann.
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Zur besseren Detektierbarkeit im
Massenspektrometer können
die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung
aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren zur Ermittlung
von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von Genen, die
mit der Signaltransduktion assoziiert sind, verwendet.
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Die Oligomere gemäß der vorliegenden Erfindung
oder Arrays davon, sowie ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung
sind für
die Verwendung zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen,
die mit der Signaltransduktion assoziiert sind, durch Analyse von
Methylierungsmustern von Genen, die mit der Signaltransduktion assoziiert
sind, vorgesehen. Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird das Verfahren bevorzugterweise für die Diagnose und/oder Therapie
von wichtigen genetischen und/oder epigenetische Parametern innerhalb von
Genen, die mit der Signaltransduktion assoziiert sind.
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Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
wird zum Beispiel für
die Diagnose und/oder Therapie von soliden Tumoren und Krebs verwendet.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der
vorliegenden Erfindung der Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 388 und dazu
komplementären
Sequenzen und/oder Sequenzen einer chemisch vorbehandelten DNA von
Genen gemäß Tabelle
1 und dazu komplementären
Sequenzen können für die Diagnose
und/oder Therapie von genetischen und/oder epigenetischen Parametern
von Genen, die mit der Signaltransduktion assoziiert sind, verwendet
werden.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums und/oder
Therapeutikums für
die Diagnose und/oder Therapie von Krankheiten, die mit der Signaltransduktion assoziiert
sind, durch Analyse von Methylierungsmustern von Genen, die mit
der Signaltransduktion assoziiert sind, wobei das Diagnostikum und/oder
Therapeutikum dadurch gekennzeichnet ist, das mindestens eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung
zuseiner Herstellung verwendet wird, gegebenenfalls zusammen mit
geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung betrifft ein Diagnostikum und/oder Therapeutikum für Krankheiten,
die mit der Signaltransduktion assoziiert sind, durch Analyse von
Methylierungsmustern von Genen, die mit der Signaltransduktion assoziiert
sind, wobei das Diagnostikum und/oder Therapeutikum dadurch gekennzeichnet
ist, das es mindestens eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung, gegebenenfalls
zusammen mit geeigneten Zusatz- und
Hilfsstoffen enthält.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten
oder Individuen, bei dem die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden
genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb von Genen,
die mit der Signaltransduktion assoziiert sind mit einem anderen
Satz genetischen und/oder epigenetischen Parameter verglichen werden
können
und die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose
nachteiliger Ereignisse für
Patienten oder Individuen dienen.
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Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden
Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur
eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz
im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen.
Als "stringente
Hybridisierungsbedingungen" sind
diejenigen Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung
bei 60°C
in 2.5 x SSC Puffer durchgeführt
wird, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer niedrigen Puffer
Konzentration, und stabil bleibt.
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Mit dem Begriff "funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen
bezeichnet, die komplementär
zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit
der Referenzsequenz hybridisieren und eine zu dem entsprechenden
erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche
Aktivität
aufweisen.
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"Genetische
Parameter" im Sinne
dieser Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von Genen, die
mit der Signaltransduktion assoziiert sind und zu deren Regulation
weiterhin erforderlicher Sequenzen. Insbesondere sind als Mutationen
Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und
besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnen.
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"Epigenetische
Parameter" im Sinne
dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin-Methylierungen und weitere chemische
Modifikationen von DNA-Basen von Genen, die mit der Signaltransduktion
assoziiert sind und zu deren Regulation weiterhin erforderliche
Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise die
Acetylierung von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren
nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung
korreliert.
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Die vorliegende Erfindung soll nun
im folgenden anhand der Sequenzen und Beispiele unter Bezug auf
die beigefügte
Figur weiter verdeutlicht werden, ohne hierauf eingeschränkt zu werden.
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1
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1 zeigte
die Hybridisierung von Fluoreszenz-markierten Amplifikaten an ein
Oberflächen-gebundenes
Oligonukleotid. Probe I stammt von einer Astrocytom Tumorprobe und
Probe II stammt von einer Oligodendrogliom Grad II Tumorprobe. Die
Fluoreszenz an einem Punkt zeigt die Hybridisierung des Amplifikats
an. Die Hybridisierung an ein CG Oligonukleotid zeigt an, daß die Methylierung
an der Cytosin-Position analysiert wird, die Hybridisierung an ein
TG Oligonukleotid zeigt an, daß keine
Methylierung an der Cytosin-Position analysiert wird. Es kann gesehen
werden, daß Probe
I ein höheres
Ausmaß an
Methylierung aufweist, als Probe II.
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Seq ID No. 1 bis Seq ID
No. 388
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Sequenzen, die ungerade Sequenznummern
haben (z.B., Seq. ID No. 1, 3, 5,...) zeigen in jedem Fall Sequenzen
der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von verschiedenen Genen,
die mit der Signaltransduktion assoziiert sind. Sequenzen, die gerade
Sequenznummern aufweisen (z.B., Seq. ID No. 2, 4, 6,...) zeigen
in jedem Fall Sequenzen der chemisch vorbehandelten genomischen
DNAs von verschiedenen Genen, die mit der Signaltransduktion assoziiert
sind, die komplementär
zu den voranstehenden Sequenzen sind (z.B., die komplementäre Sequenz
zu Seq. ID No. 1 ist Seq. ID No. 2, die komplementäre Sequenz
zu Seq. ID No. 3 ist Seq. ID No. 4, usw.).
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Seq. ID No. 389 bis Seq.
ID No. 392
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sSeq. ID No. 389 bis Seq. ID No.
392 zeigen spezifische Oligonukleotid-Sequenzen, wie in Beispiel
1 verwendet.
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Das folgende Beispiel betrifft ein
Fragment eines Gens, das mit der Signaltransduktion assoziiert ist, in
diesem Fall AR, worin eine spezifische CG-Position auf ihren Methylierungsstatus
hin analysiert wird.
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Beispiel 1: Methylierungsanalyse
in dem mit der Signaltransduktion assoziierten Gen AR
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Das folgende Beispiel betrifft ein
Fragment des Gens AR, worin eine spezifische CG-Position auf ihren Methylierungsstatus
hin analysiert wird.
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Im ersten Schritt wird eine genomische
Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit)
derart behandelt, daß alle
nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden,
daß eine
hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht,
während
die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben.
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Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet,
so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt.
Zudem müssen
ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein.
Eine anschließende
alkalische Hydrolyse führt
dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in
Uracil. Die chemisch umgewandelte DNA dient dann dazu, methylierte
Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man
die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung. Bevorzugt wird anschließend eine
Desulfonierung der DNA bei alkalischem pH-Wert durchgeführt. Im dritten
Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polymerasekettenreaktion,
bevorzugt mit einer hitzebeständigen
DNA-Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens AR
analysiert. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden
GTAGTAGTAGTAGTAAGAGA (Seq. ID No. 389) und ACCCCCTAAATAATTATCCT
(Seq. ID No. 390) ein definiertes Fragment der Länge 460 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat
dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenes
Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert,
beispielsweise TGTTATTTCGAGAGAGGT (Seq. ID No. 391), wobei sich
das nachzuweisende Cytosin an Position 157 des Amplifikats befindet.
Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5
fluoreszenzmarkierten Primer-Oligonukleotiden, die für die Amplifikation
verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser
Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer
Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid.
Somit kann der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden
Cytosins über
das Hybridisierungsprodukt abgeleitet werden.
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Um den Methylierungsstatus der Position
zu überprüfen, wird
eine Probe des Amplifikats weiterhin an ein anderes Oligonukleotid
hybridisiert, das vorher an eine feste Phase gebunden wurde. Dieses
Oligonukleotid ist identisch zu dem Oligonukleotid, das vorher benutzt
wurde, um den Methylierungsstatus der Probe zu analysieren, mit
der Ausnahme der fraglichen Position. An der zu analysierenden Position
umfaßt
das Oligonukleotid eine Thymin-Base, im Gegensatz zu einer Cytosin-Base
d.h. die Sequenz TGTTATTTTGAGAGAGGT (Seq. ID No. 392). Daher findet
die Hybridisierungsreaktion nur statt, falls ein nicht-methyliertes
Cytosin an der zu analysierenden Positionen vorhanden ist.
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Beispiel 2: Diagnose von
mit der Signaltransduktion assoziierten Erkrankungen
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Um einen Bezug der Methylierungsmuster
zu einer der mit der Signaltransduktion assoziierten Erkrankungen
herzustellen, bedarf es zunächst
der Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster
einer Gruppe von erkrankten und einer Gruppe von gesunden Personen.
Diese Untersuchungen werden zum Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die
so erhaltenen Ergebnisse werden in einer Datenbank abgespeichert
und die CpG Dinukleotide identifiziert, die zwischen den beiden
Gruppen unterschiedlich methyliert sind. Dies kann durch Bestimmung
einzelner CpG Methylierungsraten erfolgen, wie dies z. B. durch
Sequenzieren relativ ungenau oder aber durch eine Methylierungs-sensitive „Primer-Extension-Reaktion" sehr genau möglich ist. Auch
gleichzeitige Analyse des gesamten Methylierungsstatus ist möglich, und
die Muster können
z.B. mittels Clustering-Analysen, die z.B. durch einen Rechner durchgeführt werden
können,
verglichen werden.
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Nachfolgend ist es möglich, untersuchte
Patienten einer bestimmten Therapiegruppe zuzuordnen und diese Patienten
gezielt mit einer individualisierten Therapie zu behandeln.
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Beispiel 2 kann zum Beispiel für Krebs
und solide Tumore durchgeführt
werden:
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Tabelle 1
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Auflistung von bevorzugten Genen
gemäß der vorliegenden
Erfindung, die mit der Signaltransduktion assoziiert sind.
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