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Gebiet der Erfindung
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Die nach den methodischen Entwicklungen
der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen
sind die Gene selbst, die Übersetzung
dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im
Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet
wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten
Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung
der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem
veränderten
Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Nukleinsäuren,
Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose und/oder
der Therapie von Erkrankungen, die mit den genetischen und/oder
epigenetischen Parametern von Genen, die mit der Entwicklung assoziiert
sind und insbesondere deren Methylierungsstatus in Zusammenhang
stehen.
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Stand der Technik
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Das geordnete Fortschreiten der Embryonalentwicklung
wird durch ein komplexes genetisches regulatorisches System kontrolliert.
Die anfängliche
Identifizierung von Schlüsselgenen,
die an der Entwicklung beteiligt sind, erfolgte in Modellorganismen,
wie zum Beispiel Drosophila. Dies wurde von der Identifizierung
von hoch konservierten menschlichen Homologen gefolgt, zum Beispiel
dem frizzled Gen und seinem menschlichen Homolog. Beispiele von
wichtigen Transkriptionsfaktoren, die an der Entwicklung beteiligt
sind, schließen die
Homeobox, MAD, PAX, EMX und MSX Genefamilien ein (siehe, z.B. Terzic
J, Saraga-Babic
M.. Expression pattern of PAX3 and PAX6 genes during human embryogenesis.
Int J Dev Biol 1999 Sep;43(6):501-8).
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Die an der Entwicklung beteiligten
Gene wurden mit einer großen
Vielzahl von Erkrankungen in Zusammenhang gebracht. Zum Beispiel
sind die Homeobox enthaltenden Gene (HOX) hauptsächlich an der normalen Entwicklung
beteiligt. Jedoch wurden die HOX Gene auch mit normaler erwachsener
zellulärer
Funktion und einem großen
Bereich von Erkrankungen, einschließlich Diabetes und Krebs, in
Zusammenhang gebracht ('Homeobox
genes in normal and malignant cells' Cillo C et. al. J Cell Physiol 2001
Aug;188(2):161-9. 'Homeobox
genes in leukemogenesis' Buske
C and Humphries RK Int J Hematol 2000 Jun;71(4):301-8. 'HOX genes in human
cancers.' Cillo
C Invasion Metastasis 1994-95;14(1-6):38-49). Andere mit der Entwicklung
zusammenhängende
Erkrankungen umfassen Apoptose-verwandte Erkrankungen (siehe, z.B.
Sano M, et al. Involvement of EAT/mcl-1, an anti-apoptotic bcl-2-related
gene, in murine embryogenesis and human development. Exp Cell Res
2000 Aug 25;259(1):127-39; Muller S, et al. Retention of imprinting
of the human apoptosis-related gene TSSC3 in human brain tumors.
Hum Mol Genet 2000 Mar 22;9(5):757-63), Syndrome, die mit kongenitalem
Herzversagen assoziiert sind (siehe, z.B. Gelb BD. Genetic basis
of syndromes associated with congenital heart disease. Curr Opin
Cardiol 2001 May;16(3):188-94)
Epilepsie (siehe, z.B. Doose H, Neubauer BA, Petersen B. The concept
of hereditary impairment of brain maturation. Epileptic Disord 2000;2
Suppl 1:545-9), Erkrankungen, die mit der Histon Deacetylierung
zusammenhängen
(siehe, z.B. El-Osta A, Wolffe AP. DNA methylation and histone deacetylation
in the control of gene expression: basic biochemistry to human development
and disease. Gene Expr 2000;9(1-2):63-75) Currarino-Syndrom (siehe,
z.B. Hagan DM, et al. Mutation analysis and embryonic expression
of the HLXB9 Currarino syndrome gene. Am J Hum Genet 2000 May;66(5):1504-15
Erratum in: Am J Hum Genet 2000 Sep;67(3):769), Erkrankungen, die
mit der Entwicklung des Gehirns zusammenhängen und „limb girdle" Muskeldystrophie
(Wnt7a und CAPN3, siehe, z.B. Fougerousse F, et al. Human-mouse
differences in the embryonic expression patterns of developmental
control genes and disease genes. Hum Mol Genet 2000 Jan 22;9(2):165-73;
Hum Mol Genet 2000 Mar 1;9(4):659), Zwergwuchs (siehe, z.B. Iwata
T, et al. Highly activated Fgfr3 with the K644M mutation causes
prolonged survival in severe dwarf mice. Hum Mol Genet 2001 Jun
1;10(12):1255-1264), und andere (siehe, z.B. Hanel ML, Wevrick R.
The role of genomic imprinting in human developmental disorders:
lessons from Prader-Willi syndrome. Clin Genet 2001 Mar;59(3):156-350).
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5-Methylcytosin ist die häufigste
kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryontischer Zellen. Sie spielt
beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim
genetischen Imprinting und in der Tumorgenese.
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Die Wichtigkeit der Methylierung
bei Entwicklunggenem wurde gut etabliert. Das fehlerhafte genomische
Imprinting (parenteraler Ursprung-spezifische Methylierung) führt zu abnormaler
Embryonalentwicklung. Zum Beispiel ist in Mäusen das IGF2 in Abhängigkeit
von dem parenteralen Ursprung des Allels verschieden methyliert.
Von dem Allel wird vermutet, daß es
während
der späten
Embryonalentwicklung relevant ist und das Wachstum reguliert. Die
aberrante Methylierung fuhrt zu schweren Abnormalitäten, wobei
der sich ergebende Fötus
nicht lebensfähig
ist, oder bei der Geburt stirbt. Weiterhin wurde von diesem Gen
gezeigt, daß es bei
der Entwicklung von menschlichem Krebs und Wachstumsstörungen,
wie zum Beispiel Beckwith-Wiedemann (Transactivation of Igf2 in
a mouse model of Beckwith-Wiedemann syndrome. Sun et. al. Nature
389, 809 – 815.
1997) signifikant ist.
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Die aberrante DNA Methylierung innerhalb
von CpG Inseln ist in menschlichen malignen Erkrankungen verbreitet,
was zu einer Einstellung oder Überexpression
eines breiten Spektrums von Genen (Jones, P.A. Cancer Res 65:2463-2467,
1996). Von der abnormalen Methylierung wurde auch gezeigt, daß sie in
CpG reichen regulatorischen Elementen in intronischen und kodierenden
Teilen von Genen für
bestimmte Tumore auftritt (Chan, M.F., et al., Curr Top Microbiol
Immunol 249:75-86,2000). Unter der Verwendung von Restriktions-Landmark
genomischem Scanning, waren Costello und Mitarbeiter in der Lage
zu zeigen, dass Methylierungsmuster Tumortyp-spezifisch sind (Costello,
J. F., et al., Nat Genet 24:132-138, 2000). Hoch charakteristische
DNA Methylierung Muster konnten auch für Brustkrebs Zellinien gezeigt
werden (Huang, T. H.-M., et al., Hum Mol Genet 8:459-470, 1999).
Die Genom-weite Ermittlung des Methylierungsstatus stellt einen
molekularen Fingerabdruck von Krebsgeweben dar.
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Die Identifizierung von 5-Methylcytosin
als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem
Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung
identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten
aufweist wie Cytosin. Darüber
hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information,
welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
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Eine relativ neue und die mittlerweile
am häufigsten
angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin
beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das
nach anschließender
alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem
Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin
wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird
die ursprüngliche
DNA so umgewandelt, daß Methylcytosin,
welches ursprünglich
durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden
werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische
Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation
und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann.
Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll
ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit
betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA
in einer Agarose-Matrix
einschließt,
dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur
an einzelsträngiger
DNA) verhindert und alle Fällungs-
und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald
J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based
cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6).
Mit dieser Methode können
einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode
veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen
bis etwa 3000 Basenpaare Länge
untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen
Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch
dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen
zuverlässig
analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix
verloren.
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Eine Übersicht über die weiteren bekannten
Möglichkeiten,
5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel
entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic
Acids Res. 1998, 26, 2255.
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Die Bisulfit-Technik wird bisher
bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler
W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman
and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences
at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;S(2):94-8) nur in
der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines
bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder
komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny
of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6)
oder einzelne Cytosin-Positionen durch
eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones
PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites
using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE).
Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31, WO 95/00669) oder
einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative
DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4)
nachgewiesen.
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Zudem ist auch der Nachweis durch
Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99/28498).
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Weitere Publikationen, die sich mit
der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei
einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine
residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431; Zeschnigk
M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted
segments in the human genome: different DNA methylation patterns
in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the
genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95;
Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis
on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic
sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6; Martin V,
Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates
a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2
gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995
May 19;157(1-2):261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO 97/45560.
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Eine Übersicht über den Stand der Technik in
der Oligomer Array Herstellung läßt sich
aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics
(Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort
zitierten Literatur entnehmen.
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Für
die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte
Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist
das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen
Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt
beispielsweise über
ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen
anderen, kommerziell erhältlich.
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Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie
(MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse
von Biomolekülen
(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins
with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988
Oct 15;60(20):2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende
Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix
verdampft und das Analytmolekül
so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird
die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt
die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen
Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen
erreichen den Detektor früher
als größere.
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MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich
ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse
von Nukleinsäuren
ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations
and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit
etwa 100 mal schlechter als für
Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die
ein vielfach negativ geladenes Rückgrat
haben, ist der Ionisationsprozeß durch
die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie
spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption
von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrizes gefunden worden,
die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile
einige ansprechende Matrizes, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied
nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert
werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, daß sie einem
Peptid ähnlicher wird.
Phosphorothioatnukleinsäuren,
bei denen die gewöhnlichen
Phosphate des Rückgrats
durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache
Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG,
Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by
mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73).
Die Kopplung eines „charge
tags" an diese modifizierte
DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen
Betrag, wie er für
Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse
gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate
stark erschweren.
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Genomische DNA wird durch Standardmethoden
aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen.
Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und
Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
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Beschreibung
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Es ist die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, die chemisch modifizierte DNA von Genen zur Verfügung zu
stellen, die mit der Entwicklung assoziiert sind, sowie Oligonukleotide
und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen
sowie ein Verfahren bereitzustellen, welches sich zur Diagnose und/oder
der Therapie von genetischen und epige netischen Parametern von Genen,
die mit der Entwicklung assoziiert sind und Erkrankungen, die mit
diesen Genen assoziiert sind, besonders eignet. Der Erfindung liegt die
Erkenntnis zugrunde, daß genetische
und epigenetische Parameter und insbesondere die Cytosin-Methylierungsmuster
von Genen, die mit der Entwicklung assoziiert sind, zur Diagnose
und/oder der Therapie von Erkrankungen besonders eignen.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch
das zur Verfügung
stellen einer Nukleinsäure,
die eine mindestens 18 Basen lange Sequenz der chemisch vorbehandelten
DNA von Genen, die mit der Entwicklung assoziiert sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 350 und dazu komplementären Sequenzen und/oder
der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Erkrankungen
assoziiert sind, die mit der Entwicklung assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen gemäß den Genen
gemäß Tabelle
1. In der Tabelle sind nach den aufgelisteten Gen-Bezeichnungen
die jeweiligen Datenbanknummern (Zugangsnummern) angegeben, die
die dazugehörigen
Gensequenzen als einmalig definieren. GenBank am National Institute
of Health wurde als die zu Grunde liegende Datenbank unter der Internet
Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov verwendet.
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Die chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte
bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von genetischen
und epigenetische Parametern gebracht werden.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer zur Detektion
des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA,
umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von
mindestens 13 Nukleotiden gelöst,
die an eine chemisch vorbehandelte DNA von Genen, die mit der Entwicklung
assoziiert sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 350 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Erkrankungen
assoziiert sind, die mit der Entwicklung assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene hybridisiert.
Die erfindungsgemäßen Oligomersonden
stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung
der genetischen und epigenetischen Parameter von Genen, die mit
der Entwicklung assoziiert sind, erst ermöglichen. Bevorzugterweise umfaßt die Basensequenz
der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die Sonden können auch
in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders
bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind
erfindungsgemäße Oligonukleotide,
bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5. – 9. Nukleotid
vom 5'-Ende des 13- mers ist, im Falle
von PNA-Oligomeren ist es bevorzugt, daß das Cytosin des CpG Dinukleotids
das 4. – 6. Nukleotid
vom 5'-Ende des
9-mers ist.
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Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise
in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide
eine der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 350 und dazu
komplementären
Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die
mit Erkrankungen assoziiert sind, die mit der Entwicklung assoziiert
sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene mindestens ein
Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das für jedes der CpG Dinukleotide
aus einer der Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 350 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Erkrankungen
assoziiert sind, die mit der Entwicklung assoziiert sind gemäß der in
Tabelle 1 aufgelisteten Gene mindestens ein Oligomer umfaßt.
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Darüber hinaus stellt die Erfindung
ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als
sogenannte „Primer-Oligonukleotide" zur Amplifikation
von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 350 und
dazu komplementären
Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die
mit Erkrankungen assoziiert sind, die mit der Entwicklung assoziiert
sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene oder Abschnitten
davon eingesetzt werden können.
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Im Falle der erfindungsgemäßen Sets
von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, daß mindestens ein Oligonukleotid
an eine Festphase gebunden ist. Es ist weiter bevorzugt, daß alle Oligonukleotide
eines Sets an eine Festphase gebunden sind.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin einen Satz von mindestens 10 n (Oligonukleotiden und/oder
PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes
in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No. 1 bis Seq.
ID No. 350 und dazu komplementären
Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die
mit Erkrankungen assoziiert sind, die mit der Entwicklung assoziiert
sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene) dienen. Mit diesen
Sonden ist die Diagnose und/oder Therapie von genetischen und epigenetischen
Parametern von Genen möglich,
die mit Der Entwicklung assoziiert sind. Das Set von Oligomeren
kann auch zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs)
in der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 350 und dazu komplementären Sequenzen und/oder
der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die die mit Erkrankungen
assoziiert sind, die mit der Entwicklung assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene verwendet werden.
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Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß eine von
der Erfindung zur Verfügung
gestellte Anordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder
PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine Festphase
gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen Oligonukleotid-
und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein,
daß es
auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen
Gitters angeordnet ist. Bevorzugterweise besteht die Festphasenoberfläche aus
Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel,
Silber oder Gold. Möglich
sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel
Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial
fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit Der Entwicklung
assoziierten Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung
an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von
solchen Arrays sind zum Beispiel aus der
US 5,744,305 mittels Festphasenchemie
und photolabilen Schutzgruppen bekannt.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
betrifft einen DNA-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit Der Entwicklung
assoziierten Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung umfaßt.
DNA-Chips sind zum Beispiel aus der
US
5,837,832 bekannt.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden
Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens
zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18
Basenpaaren langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen
(Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 350 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen die mit Erkrankungen
assoziiert sind, die mit der Entwicklung assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene), Oligonukleotiden
und/oder PNA-Oligomeren sowie einer Anleitung zur Durchführung und
Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann. Ein Kit im
Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten
Bestandteile enthalten.
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Die vorliegende Erfindung stellt
weiterhin ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder
epigenetischen Parametern von Genen, die mit Der Entwicklung assoziiert
sind durch Analyse von Cytosin-Methylierungen und Single Nucleotide
Polymorphismen zur Verfügung,
das folgende Schritte umfaßt:
In einem ersten Verfahrensschritt wird eine genomische DNA-Probe
derart chemisch behandelt, daß an
der 5'-Position unmethylierte
Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten
her dem Cytosin unähnliche
Base umgewandelt werden. Dies wird im folgenden unter „chemischer
Vorbehandlung" verstanden.
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Die zu analysierende genomische DNA
wird bevorzugt aus den üblichen
Quellen für
DNA erhalten, wie Zellen oder Zellbestandteilen, zum Beispiel Zellinien,
Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit,
in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen,
Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische
Objektträger
oder Kombinationen davon.
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Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene
Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit)
und anschließender
alkalischer Hydrolyse angewendet, die zu einer Umwandlung nicht
methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom
Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.
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Aus dieser chemisch vorbehandelten
genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von
erfindungsgemäßen Primer-Oligonukleotiden
und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert.
Aus statistischen und praktikablen Erwägungen werden bevorzugterweise
mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100 – 2000 Basenpaare
lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten kann simultan
in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird
die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens umfaßt
der Satz von Primer-Oligonukleotiden mindestens
zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch
zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang
(Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 350 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der che misch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Erkrankungen
assoziiert sind, die mit der Entwicklung assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene) aufgelisteten
Basensequenzen sind. Die Primer-Oligonukleotide sind vorzugsweise
dadurch gekennzeichnet, daß sie
kein CpG Dinukleotid enthalten.
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Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß bei der
Amplifikation mindestens ein Primer-Oligonukleotid an eine Festphase gebunden
ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen
können
auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen
Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt
aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer,
Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien,
wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.
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Die mittels der Amplifikation erhaltenen
Fragmente können
eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt
sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden
oder ablösbaren
Molekülfragmenten
mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen
werden können,
wobei bevorzugt ist, daß die
erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer
eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Der
Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations
Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie
(ESI) durchgeführt
und visualisiert werden.
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Die im zweiten Verfahrensschritt
erhaltenen Amplifikate werden anschließend an einen Satz von Oligonukleotiden
und/oder PNA- Sonden der oder an ein Array hybridisiert. Die Hybridisierung
erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der
Hybridisierung verwendete Satz besteht bevorzugterweise aus mindestens
10 Oligonukleotid oder PNA-Oligomer
Sonden. Die Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an
einer Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht
hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die besagten
Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer
Länge von
13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt
der im Anhang aufgeführten
Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das
Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13-mers aus betrachtet.
Für jedes
CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besagten PNA-Oligomere
umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von
9 Nukleo tiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt
der im Anhang aufgeführten
Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das
Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9-mers
aus gesehen. Für
jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.
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Im vierten Verfahrensschritt entfernt
man die nicht hybridisierten Amplifikate.
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Im letzten Verfahrensschritt detektiert
man die hybridisierten Amplifikate. Dabei ist bevorzugt, daß an den
Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase,
an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar
sind.
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Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß die Markierungen
der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente
mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen
werden können.
Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu
den Amplifikaten komplementäre
Sonden im Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion
mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie
(MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführen und
visualisieren kann.
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Zur besseren Detektierbarkeit im
Massenspektrometer können
die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung
aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren zur Ermittlung
von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von Genen, die
mit der Entwicklung und Erkrankungen assoziiert sind, verwendet.
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Die Oligomere gemäß der vorliegenden Erfindung
oder Arrays davon, sowie ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung
sind für
die Verwendung zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen,
die mit der Entwicklung assoziiert sind, durch Analyse von Methylierungsmustern
von Genen, die mit der Entwicklung assoziiert sind, vorgesehen.
Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird das Verfahren bevorzugterweise für die Diagnose und/oder Therapie
von wichtigen genetischen und/oder epigenetische Parametern innerhalb
von Entwicklungsgenen, die mit Erkrankungen assoziiert sind, verwendet.
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Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
wird zum Beispiel für
die Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen verwendet, die mit
Entwicklungsgenen assoziiert sind.
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Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der
vorliegenden Erfindung der Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 350 und dazu
komplementären
Sequenzen und/oder eine chemisch vorbehandelte DNA von Genen die
mit Erkrankungen assoziiert sind, die mit der Entwicklung assoziiert
sind gemäß Tabelle
1 können
für die
Diagnose und/oder Therapie von genetischen und/oder epigenetischen
Parametern von Entwicklungsgenen verwendet werden, die mit Erkrankungen
assoziiert sind.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums und/oder
Therapeutikums für
die Diagnose und/oder Therapie von Krankheiten, die mit der Entwicklung
assoziiert sind, durch Analyse von Methylierungsmustern von Genen,
die mit Erkrankungen assoziiert sind, die mit der Entwicklung assoziiert
sind, wobei das Diagnostikum und/oder Therapeutikum dadurch gekennzeichnet
ist, daß mindestens
eine Nukleinsäure
gemäß der Erfindung
zu seiner Herstellung verwendet wird, gegebenenfalls zusammen mit
geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen enthält.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung betrifft ein Diagnostikum und/oder Therapeutikum für Krankheiten,
die mit Entwicklungsgenen assoziiert sind, durch Analyse von Methylierungsmustern
von Entwicklungsgenen, die mit Erkrankungen assoziiert sind, wobei
das Diagnostikum und/oder Therapeutikum dadurch gekennzeichnet ist,
das es mindestens eine Nukleinsäure
gemäß der Erfindung,
gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen enthält. Solche
mit der Entwicklung assoziierten Erkrankungen sind zum Beispiel
Erkrankungen, die mit Homeobox enthaltenden Genen (HOX) in Zusammenhang
stehen, z. B. Diabetes und Krebs, mit Apoptose in Zusammenhang stehende
Erkrankungen, sind Syndrome, die mit kongenitaler Herzerkrankung
in Zusammenhang stehen, Epilepsie, Erkrankungen, die mit der Histon-Deacetylierung
in Zusammenhang stehen, Currarino-Syndrom, Erkrankungen, die mit der Entwicklung
des Gehirns in Zusammenhang stehen und „limb girdle" Muskeldystrophie,
Zwergwuchs und andere.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten
oder Individuen, bei dem die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden
genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb von Entwicklungsgenen,
die mit Erkrankungen assoziiert sind mit einem anderen Satz genetischen
und/oder epigenetischen Parameter verglichen werden können und
die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose
nachteiliger Ereignisse für
Patienten oder Individuen dienen. Such mit der Entwicklung in Zusammenhang
stehende Erkrankungen sind zum Beispiel Erkrankungen, die mit Homeobox
enthaltenden Genen (HOX) in Zusammenhang stehen, z. B. Diabetes
und Krebs, mit Apoptose in Zusammenhang stehende Erkrankungen, sind
Syndrome, die mit kongenitaler Herzerkrankung in Zusammenhang stehen,
Epilepsie, Erkrankungen, die mit der Histon-Deacetylierung in Zusammenhang
stehen, Currarino-Syndrom, Erkrankungen, die mit der Entwicklung
des Gehirns in Zusammenhang stehen und „limb girdle" Muskeldystrophie,
Zwergwuchs und andere.
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Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden
Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur
eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz
im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen.
Als "stringente
Hybridisierungsbedingungen" sind
diejenigen Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung
bei 60°C
in 2.5 x SSC Puffer durchgeführt
wird, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer niedrigen Puffer
Konzentration, und stabil bleibt.
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Mit dem Begriff "functionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen
bezeichnet, die komplementär
zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit
der Referenzsequenz hybridisieren und eine zu dem entsprechenden
erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche
Aktivität
aufweisen.
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"Genetische
Parameter" im Sinne
dieser Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von Genen, die
mit Der Entwicklung assoziiert sind und zu deren Regulation weiterhin
erforderlicher Sequenzen. Insbesondere sind als Mutationen Insertionen,
Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und
besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnen.
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"Epigenetische
Parameter" im Sinne
dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin-Methylierungen und weitere chemische
Modifikationen von DNA-Basen von Genen, die mit Der Entwicklung
assoziiert sind und zu deren Regulation weiterhin erforderliche
Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise die Acetylierung
von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt
analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung
korreliert.
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Die vorliegende Erfindung soll nun
im folgenden anhand der Sequenzen und Beispiele unter Bezug auf
die beigefügte
Figur weiter verdeutlicht werden, ohne hierauf eingeschränkt zu werden.
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Figur 1
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1 zeigte
die Hybridisierung von Fluoreszenz-markierten Amplifikaten an ein
Oberflächengebundenes
Oligonukleotid. Die Hybridisierung an ein CG Oligonukleotid zeigt
an, daß die
Methylierung an der Cytosin-Position analysiert wird, die Hybridisierung
an ein TG Oligonukleotid zeigt an, daß keine Methylierung an der
Cytosin-Position analysiert wird. Es kann gesehen werden, daß Probe
II ein höheres
Ausmaß an
Methylierung aufweist, als Probe I.
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Seq ID No. 1 bis Seq ID
No. 350
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Sequenzen, die ungerade Sequenznummern
haben (z.B., Seq. ID No. 1, 3, 5,...) zeigen in jedem Fall Sequenzen
der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von verschiedenen Genen,
die mit Erkrankungen assoziiert sind, die mit der Entwicklung assoziiert
sind. Sequenzen, die gerade Sequenznummern aufweisen (z.B., Seq.
ID No. 2, 4, 6,...) zeigen in jedem Fall Sequenzen der chemisch
vorbehandelten genomischen DNAs. Diese genomischen DNAs sind komplementär zu der
genomischen DNA, von der die voranstehende Sequenz abgeleitet wurde
(z.B., die komplementäre
Sequenz zu der genomischen DNA von der Seq. ID No. 1 abgeleitet
ist, ist die genomische Sequenz von der Seq. ID No. 2 abgeleitet
ist, die komplementäre
Sequenz zu der genomischen DNA von der Seq. ID No. 3 abgeleitet
ist, ist die Sequenz von der Seq. ID No. 4 abgeleitet ist, usw.).
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Seq. ID No. 351 bis Seq.
ID No. 354
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Seq. ID No. 351 bis Seq. ID No. 354
zeigen spezifische Oligonukleotid-Sequenzen, wie in
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Beispiel 1 verwendet.
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Beispiel 1: Methylierungsanalyse
des Gens PBX2 Das folgende Beispiel betrifft ein Fragment des Gens
PBX2, worin eine spezifische CG-Position
auf ihren Methylierungsstatus hin analysiert wird.
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Im ersten Schritt wird eine genomische
Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit)
derart behandelt, daß alle
nicht an der 5-Position der Base methylierten Cyto sine so verändert werden,
daß eine
hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht,
während
die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben.
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Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet,
so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt.
Zudem müssen
ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein.
Eine anschließende
alkalische Hydrolyse führt
dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in
Uracil. Die chemisch umgewandelte DNA dient dann dazu, methylierte
Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man
die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung. Bevorzugt wird anschließend eine
Desulfonierung der DNA bei alkalischem pH-Wert durchgeführt. Im dritten
Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polymerasekettenreaktion,
bevorzugt mit einer hitzebeständigen
DNA-Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens PBX2
analysiert. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden
GTTTTTAGAAGATTTAGAATATGTG (Seq. ID No. 47) und CCACTAAATCTCAATTCCTCT
(Seq. ID No. 48) ein definiertes Fragment der Länge 718 bp amplifiziert. Die
Einzelgen PCR Reaktion wurde auf einem Thermocycler (Eppendorf GmbH)
unter der Verwendung von Bisulfit DNA 10 ng, Primer jeweils 6 pmol,
dNTP jeweils 200 μM,
1.5 mM MgC12 und 1 U HotstartTaq (Qiagen AG) durchgeführt. Die
anderen Bedingungen waren wie durch den Hersteller der Taq Polymerase empfohlen.
In der Multiplex-PCR
wurde bis zu 16 Primeraare innerhalb der PCR Reaktion verwendet.
Die Multiplex-PCR wurde gemäß der Einzelgen
PCR mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: Primer jeweils 0,35 pmol,
dNTP jeweils 800 μM
und 4,5 mM MgC12. Das Zyklusprogramm für die Einzelgen PCR und die Multiplex-PCR
war wie folgt: Schritt 1, 14 min 96 °C; Schritt 2, 60 sec 96°C; Schritt
3, 45 sec 55 °C;
Schritt 4 ,75 sec 72 °C;
Schritt 5, 10 min 72 °C;
die Schritte 2 bis Schritt 4 wurden 39 fach wiederholt.
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Dieses Amplifikat dient als Probe,
die an ein vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter
Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise TGGGATATCGGTTGGGTT
(Seq. ID No. 49), wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 470 des
Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht
auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primer-Oligonukleotiden, die
für die
Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten
DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt
es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem
Oligonukleotid. Somit kann der Methylierungsstatus des jeweiligen
zu untersuchenden Cytosins über
das Hybridisierungsprodukt abgeleitet werden.
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Um den Methylierungsstatus der Position
zu überprüfen, wird
eine Probe des Amplifikats weiterhin an ein anderes Oligonukleotid
hybridisiert, das vorher an eine feste Phase gebunden wurde. Dieses
Oligonukleotid ist identisch zu dem Oligonukleotid, das vorher benutzt
wurde, um den Methylierungsstatus der Probe zu analysieren, mit
der Ausnahme der fraglichen Position. An der zu analysierenden Position
umfaßt
das Oligonukleotid eine Thymin-Base, im Gegensatz zu einer Cytosin-Base
d.h. die Sequenz TGGGATATTGGTTGGGTT (Seq. ID No. 50). Daher findet
die Hybridisierungsreaktion nur statt, falls ein nicht-methyliertes
Cytosin an der zu analysierenden Positionen vorhanden ist.
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Beispiel 2: Diagnose von
mit Entwicklungsgenen assoziierten Erkrankungen
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Um einen Bezug der Methylierungsmuster
zu einer der mit Der Entwicklung assoziierten Erkrankungen herzustellen,
bedarf es zunächst
der Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster
einer Gruppe von erkrankten und einer Gruppe von gesunden Personen.
Diese Untersuchungen werden zum Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die
so erhaltenen Ergebnisse werden in einer Datenbank abgespeichert
und die CpG Dinukleotide identifiziert, die zwischen den beiden
Gruppen unterschiedlich methyliert sind. Dies kann durch Bestimmung
einzelner CpG Methylierungsraten erfolgen, wie dies z. B. durch
Sequenzieren relativ ungenau oder aber durch eine Methylierungs-sensitive „Primer-Extension-Reaktion" sehr genau möglich ist.
Auch gleichzeitige Analyse des gesamten Methylierungsstatus ist
möglich,
und die Muster können
z.B. mittels Clustering-Analysen, die z.B. durch einen Rechner durchgeführt werden
können,
verglichen werden.
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Nachfolgend ist es möglich, untersuchte
Patienten einer bestimmten Therapiegruppe zuzuordnen und diese Patienten
gezielt mit einer individualisierten Therapie zu behandeln.
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Beispiel 2 kann zum Beispiel für Erkrankungen,
die mit Homeobox enthaltenden Genen (HOX) in Zusammenhang stehen,
z. B. Diabetes und Krebs, mit Apoptose in Zusammenhang stehende
Erkrankungen, sind Syndrome, die mit kongenitaler Herzerkrankung
in Zusammenhang stehen, Epilepsie, Erkrankungen, die mit der Histon-Deacetylierung
in Zusammenhang stehen, Currarino-Syndrom, Erkrankungen, die mit
der Entwicklung des Gehirns in Zusam menhang stehen und „limb girdle" Muskeldystrophie,
Zwergwuchs und andere durchgeführt
werden:
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Tabelle 1
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Auflistung von bevorzugten Genen
gemäß der vorliegenden
Erfindung, die mit der Entwicklung assoziiert sind.
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* "n.a." Bezeichnet
Gene, für
die keine aussagekräftige
Sequenzen identifiziert werden konnten