DE10128509A1

DE10128509A1 - Verfahren und Nukleinsäuren für die Differenzierung von Prostata- und Nierenkarzinomen

Info

Publication number: DE10128509A1
Application number: DE10128509A
Authority: DE
Inventors: Juergen Distler; Fabian Model; Peter Adorjan
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2001-06-14
Filing date: 2001-06-14
Publication date: 2003-01-02
Also published as: AU2002325241A1; US20040219549A1; WO2002103041A3; EP1395685A2; WO2002103041A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die chemisch modifizierten Nukleinsäuresequenzen genomischer DNA, Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes genomischer DNA sowie ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von Genen zur Charakterisierung, Klassifizierung und/oder Differenzierung von Nieren- und Prostatakarzinomen.

Description

Gebiet der Erfindung

Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern können sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms äußern.
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Oligonukleotide, PNA-Oligomere und eine Methode zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Nieren- und Prostatakarzinomen durch Untersuchung der genetischen und/oder epigenetischen Parameter genomischer DNA und insbesondere deren Cytosin-Methylierungszustand.

Stand der Technik

Die Charakterisierung von Krebszellen beinhaltet gegenwärtig die histologische und zytologische Untersuchung von Gewebe- und Zellproben auf mit maligner Transformation assoziierte Merkmale. Zur Klärung spezifischer Fragen werden Immunhistochemie, Elektronenmikroskopie sowie einzelmolekulare Marker verwendet. Gewebe- und Zellproben werden durch verschiedene Verfahren gewonnen wie chirurgische und endoskopische Biopsie, Kern- und Apirationsnadelbiopsie, Venenpunktion, Spinalpunktion, Abstriche von Gewebeoberflächen sowie Sammeln von exfoliativen Zellen aus Urin oder Sputum.

Die zu untersuchenden Fragen sind zum einen der Malignitätsgrad und zum anderen das Ursprungsgewebe des (malignen) Tumors. Die korrekte Bestimmung des Ursprungsortes ist von großer Bedeutung für Prognose und Therapie. Obwohl das Ursprungsorgan eines Krebses für gewöhnlich bei einer klinischen Routineuntersuchung sowie unterschiedlichen Abbildungstechniken feststellbar ist, kann in etwa 6% der diagnostizierten Krebsfälle das den Primärtumor tragende Organ nicht bestimmt werden. (Greco FA and Hainsworth JD, in: Cancer, Principles & Practice of Oncology, 6^th Edition, DeVita VT jr ed, Lippincott Williams & Wilkins). Darüber hinaus steht oftmals nur eine kleine oder sonst suboptimale Probe zur Verfügung, weswegen eine histologische Untersuchung nicht ohne größere Schwierigkeiten durchgeführt werden kann. Die Wahrscheinlichkeit der Erkennung eines vermutlich zugrundeliegenden Tumortyps ist durch Elektronenmikroskopie, Immunhistochemie und molekulargenetische Verfahren angestiegen, aber dennoch können 60% der Tumoren keiner der histologischen Hauptgruppen zugeordnet werden (Hainsworth JD, Greco FA Oncology 2000, 4: 563-74; discussion 574-6, 578-9).

Auf ähnliche Probleme trifft man bei der Bestimmung von disseminierten Tumorzellen in Körperflüssigkeiten wie beispielsweise peripheres Blut, Urin, Sputum, Pleuraerguss, etc. Disseminierte Tumorzellen werden in frühen Stadien von Krebs im peripheren Blut und anderen Körperflüssigkeiten gefunden (de Cremoux, P, et al. Clin. Cancer Res. 6, 3117-3122, 2000; Kraeft, S. K. et al., Clin. Cancer Res. 6, 434-442, 2000; Racila, E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4589-4594, 1998) und sind verwendbar als frühzeitiger Screeningtest, zur Bestimmung der Ausdehung der Krankheit, Bewertung der minimal residual disease, Früherkennung eines Wiederauftretens sowie zur Überwachung der Therapie. Die Voraussetzungen sind hochempfindliche Verfahren zur Isolierung von Epithelzellen von Körperflüssigkeiten wie beispielsweise immunmagnetische Anreicherung in Verbindung mit Durchflußzytometrie (Martin VM et al. Experimental Hematology 26: 252-264, 1998) oder größen- und dichteabhängige Verfahren (Uciechowski P et al. Br J Cancer. 2000, 83: 1664-73) sowie Bestimmungsverfahren mit denen Krebszellen von unterschiedlichen Ursprungsgeweben unterschieden werden. In jüngster Zeit haben mehrere Gruppen gezeigt, dass eine genaue Bestimmung der Tumorklasse durch Expressionsanalyse auf der Grundlage von Mikroarrays erreicht werden kann. Golub und Mitarbeiter führten ein Screening des Expressionsniveaus von nahezu 7000 Genen durch, von denen zwischen 10 und 100 als ausreichend für die Unterscheidung zwischen akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) und akuter myeloischer Leukämie (AML) nachgewiesen wurden (Golub et al. Science 286: 531-537, 1999). Die Anwendung von mRNA-Analysen in den beschriebenen klinischen Situationen wird aus verschiedenen Gründen verhindert: die extreme Instabilität von mRNA, schnell auftretende, auf bestimmte Auslöser (z. B. Probenahme) folgende Expressionsänderungen sowie, was am entscheidendsten ist, die zur Untersuchung benötigte große Menge an mRNA (Lipshutz, R. J. et al., Nature Genetics 21: 20-24, 1999; Bowtell, D. D. L. Nature genetics suppl. 21: 25-32, 1999).

Aberrante DNA-Methylierung innerhalb von CpG Inseln ist in menschlichen Malignomen häufig anzutreffen und führt zur Abrogation oder Überexpression eines breiten Spektrums von Genen (Jones, P. A. Cancer Res 65: 2463-2467, 1996). Ebenso wurde bei bestimmten Tumoren ein Auftreten anormaler Methylierung in CpG-reichen regulatorischen Elementen in intronischen und kodierenden Teilen von Genen nachgewiesen (Chan, M. F., et al., Curr Top Microbiol Immunol 249: 75-86,2000). Hochcharakteristische DNA-Methylierungsmuster konnten ferner bei Zelllinien von Brustkrebs nachgewiesen werden (Huang, T. H.-M., et al., Hum Mol Genet 8: 459-470, 1999).

5-Methylcytosin ist die häufigste kovalente Basenmodifikation in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin- Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die vom 5-Methylcytosin getragene epigenetische Information vollständig verloren.

Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden konnte, jetzt durch "normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt werden kann. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur mit einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24(24): 5064-6). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden gegenwärtig nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausende von möglichen Methylierungsfällen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.

Eine Übersicht über die weiteren bekannten Verfahren zum Nachweis von 5-Methylcytosin kann dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr; 5(2): 94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. 1997 Nov; 17(3): 275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine "Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2529-31, WO-Patent 9500669) oder durch enzymatischen Verdau (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99/28498).

Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun; 16(6): 431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar; 6(3): 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25; 22(4): 695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the p52 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19; 157(1-2): 261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 and WO 97/45560.

Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung lässt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.

Für die Abtastung immobilisierter DNA-Arrays werden vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden kann beispielsweise über ein Konfokalmikroskop erfolgen. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.

Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15; 60(20): 2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.

MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Mittlerweile gibt es einige ansprechende Matrices für DNA, der Empfindlichkeitsunterschied wurde jedoch nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25; 23(8): 1367-73). Die Kopplung eines "charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit auf das gleiche Niveau, wie es für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von "charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.

Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Beschreibung

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mittel zur Bestimmung des Ursprungsgewebes von Krebszellen zur Verfügung zu stellen. Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren und Nukleinsäuren, welche die Differenzierung von Prostatakrebszellen von Nierenkrebszellen ermöglichen. Beide Krebsformen sind sehr gefährlich und zählen zu den zehn weitverbreitetsten Krebsarten in den USA. Die Bestimmung des Ursprungsgewebes von Krebszellen ist von großer Bedeutung für Prognose und Therapie. Mit den gegenwärtigen Verfahren kann der Ursprung bei einem bedeutenden Teil der Fälle jedoch nicht bestimmt werden. Darüber hinaus erfordern weithin angewendete histologische und zytologische Verfahren, dass ausreichend große Gewebeproben zur Verfügung stehen. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass sich genetische und epigenetische Parameter, insbesondere das Cytosin-Methylierungsmuster genomischer DNA, zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostata- und Nierenkarzinomen besonders eignen. Die beschriebene Erfindung ermöglicht ferner die Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Krebsgewebe mit winzigen Proben, die zur histologischen bzw. zytologischen Untersuchung unzureichend wären.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Nukleinsäure, umfassend eine mindestens 16 Basen lange Sequenz der chemisch vorbehandelten DNA gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 gelöst.

Die chemisch modifizierte Nukleinsäuren (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112) konnten bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von krankheitsrelevanten genetischen und epigenetischen Parametern gebracht werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes von chemisch vorbehandelter DNA, umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 13 Nukleotiden gelöst, die an eine chemisch vorbehandelte DNA gemäß Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligomersonden stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Bestimmung der für Nierenkrebs und/oder Prostatakrebs spezifischen genetischen und epigenetischen Parameter chemisch modifizierter genomischer DNA erst ermöglichen. Bevorzugterweise umfasst die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die Sonden können auch in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Oligonukleotide, bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5.-9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers ist, im Falle von PNA-Oligomeren ist es bevorzugt, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4.-6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers ist.

Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 mindestens ein Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das für jedes der CpG Dinukleotide aus einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 mindestens ein Oligomer umfasst.

Weiterhin stellt die Erfindung ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als sogenannte Primeroligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.

Im Falle der erfindungsgemäßen Sets von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist. Darüber hinaus ist es besonders bevorzugt, dass alle Oligonukleotide eines Sets an die Festphase gebunden sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Satz von mindestens 10 n (Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112) dienen. Diese Sonden ermöglichen die Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Nieren- und Prostatakrebsgewebe. Das Set von Oligomeren kann auch zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in chemisch vorbehandelter DNA gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 verwendet werden.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass eine von der Erfindung zur Verfügung gestellte Anordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine Festphase gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet ist. Die Festphasenoberfläche besteht bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold. Möglich sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse im Zusammenhang mit der Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Nieren- und Prostatakrebsgewebe, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays sind zum Beispiel aus der US 5,744,305 mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen bekannt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen DNA-Chip zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Nieren- und Prostatakrebsgewebe, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. DNA-Chips sind zum Beispiel aus der US 5,837,832 bekannt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einem 16 Basen langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112) entsprechen oder zu ihnen komplementär sind, Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren sowie einer Anleitung zur Durchführung und Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann. Ein Kit im Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten Bestandteile enthalten.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung des Ursprungsgewebes von Krebszellen durch Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern genomischer DNA zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Nieren- und Prostatakrebsgewebe durch Analyse von Cytosin-Methylierungen und Single Nucleotide Polymorphismen zur Verfügung, das folgende Schritte umfasst:
Zunächst muss die genomische DNA-Probe von Gewebe bzw. Zellquellen isoliert werden. Beim Menschen umfassen derartige Quellen zum Beispiel Zelllinien, histologische Objektträger, Körperflüssigkeiten wie beispielsweise Lymphflüssigkeit, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe; beispielsweise Gewebe der Niere, der Prostata oder des Lymphsystems. Die Extraktion kann durch für den Fachmann übliche Mittel erfolgen wie die Verwendung von Detergens-Lysaten, Beschallung mit Ultraschall und Mischen mit Glasperlen. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert worden sind, wird die genomische Doppelstrang-DNA bei der Untersuchung verwendet.

In einer bevorzugten Ausgestaltung kann die DNA vor der chemischen Behandlung zerteilt werden; dabei kann es sich um ein beliebiges, nach dem Stand der Technik übliches Mittel handeln, insbesondere mit Restriktionsendonukleasen.

Die genomische DNA-Probe wird dann derart chemisch behandelt, dass an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden. Dies wird im folgenden unter "chemischer Vorbehandlung" verstanden.

Die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA erfolgt bevorzugt mit Bisulfit (Sulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse, was zur Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.

Aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von erfindungsgemäßen Primeroligonukleotiden und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert. Aus statistischen und praktischen Erwägungen werden bevorzugterweise mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100-2000 Basenpaare lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten kann simultan in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird die Amplifikation mittels einer Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfasst der Satz von Primeroligonukleotiden mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 16 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112) aufgelisteten Basensequenzen sind. Die Primeroligonukleotide sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie kein CpG Dinukleotid enthalten. In einer besonders bevorzugten Ausführung des Verfahrens ist die Sequenz der besagten Primeroligonukleotide so ausgebildet, dass nur ein gezieltes Annealing und Amplifikation der relevanten nieren- und/oder prostata-spezifischen DNA erfolgt und damit die Amplifikation von Background- bzw. nicht relevanter DNA minimiert wird. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird unter Background-DNA genomische DNA verstanden, die kein relevantes, gewebespezifisches Methylierungsmuster aufweist, wobei es sich hier bei dem relevanten Gewebe um Nieren- und/oder Prostatakarzinome handelt. Beispiele derartiger, im Beispiel 2 verwendeter Primer enthält die Tabelle 1.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass bei der Amplifikation mindestens ein Primeroligonukleotid an eine Festphase gebunden ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA- Oligomersequenzen können auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien, wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.

Die mittels der Amplifikation erhaltenen Fragmente können eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können, wobei bevorzugt ist, dass die erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Der Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchgeführt und visualisiert werden.

Die im zweiten Verfahrensschritt erhaltenen Amplifikate werden anschließend an ein Array bzw. einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der Hybridisierung verwendete Satz von Sonden besteht bevorzugterweise aus mindestens 10 Oligonukleotiden oder PNA- Oligomeren. Die Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an eine Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die besagten Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besagten PNA-Oligomere umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers aus gesehen. Bevorzugt ist für jedes CpG Dinukleotid ein Oligonukleotid vorhanden.

Im vierten Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten Amplifikate.

Im letzten Verfahrensschritt werden die hybridisierten Amplifikate nachgewiesen. Dabei ist bevorzugt, dass an den Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können. Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementären Sonden im Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführen und visualisieren kann. Zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer können die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.

Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von Genen eingesetzt, die bei der Charakterisierung, Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Nieren- und Prostatakrebsgewebe verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Oligomere oder Arrays derselben sowie ein erfindungsgemäßes Kit sollen zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Nieren- und Prostatakrebsgewebe durch Analyse von Methylierungsmustern genomischer DNA eingesetzt werden. Erfindungsgemäß dient das Verfahren bevorzugt der Untersuchung wichtiger genetischer und/oder epigenetischer Parameter in genomischer DNA.

Das erfindungsgemäße Verfahren findet beispielsweise Anwendung bei der Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Nieren- und Prostatakrebsgewebe.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 können zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Nieren- und Prostatakrebsgewebe eingesetzt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums und/oder Therapeutikums zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostata- und/oder Nierenkrebs durch Analyse von Methylierungsmustern genomischer DNA, wobei das Diagnostikum und/oder Therapeutikum dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens eine Nukleinsäure, gemäß der vorliegenden Erfindung (Seq. IDs 1 bis 112) zu dessen Herstellung verwendet wird, vorzugsweise zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Diagnostikum und/oder Therapeutikum zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostata- und/oder Nierenkrebs durch Analyse von Methylierungsmustern genomischer DNA, wobei das Diagnostikum und/oder Therapeutikum mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure (Seq. IDs 1 bis 112), vorzugsweise zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen umfasst.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden genetischen und/oder epigenetischen Parameter in deren genomischer DNA mit einem anderen Satz genetischer und/oder epigenetischer Parameter verglichen werden können, wobei die Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen dienen.

Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen.

Mit dem Begriff "funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen bezeichnet, die komplementär zu einer DNA-Sequenz sind und unter stringenten Bedingungen mit der Referenzsequenz hybridisieren.

"Genetische Parameter" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von Genen und zu ihrer Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Insbesondere sind als Mutationen Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnen.

"Epigenetische Parameter" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Cytosin- Methylierungen und weitere chemische Modifikationen von DNA und zu deren Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise die Acetylierung von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung korreliert.

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Sequenzen und Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung weiter verdeutlicht werden, ohne dass die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.

Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1

Trennung von Prostatakarzinomen (1) und Nierenkarzinomen (2). Rot entspricht einer hohen Methylierungswahrscheinlichkeit, Schwarz steht für Unbestimmtheit und Grün bezeichnet eine geringe Wahrscheinlichkeit. Die Markierungen auf der linken Seite der graphischen Darstellung sind Gen- und CpG-Identifikatoren. Die Markierungen auf der rechten Seite geben die Signifikanz der Differenz zwischen den Mittelwerten der beiden Gruppen wieder. Jede Reihe entspricht einem einzigen CpG und jede Spalte den Methylierungsgraden einer Probe. Die CpGs sind nach ihrem Beitrag zur Unterscheidung zur Differentialdiagnose der beiden Tumoren geordnet, wobei der Beitrag von oben nach unten ansteigt.

Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112

Sequenzen mit ungeraden Sequenznummern (z. B. Seq. ID No. 1, 3, 5, . . .) zeigen jeweils Sequenzen der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs. Sequenzen mit geraden Sequenznummern (z. B. Seq. ID No. 2, 4, 6, . . .) zeigen jeweils die zu den vorstehenden Sequenzen komplementären Sequenzen (z. B. ist die zu Seq. ID No. 1 komplementäre Sequenz Seq. ID No. 2, zu Seq. ID No. 3 ist die komplementäre Sequenz Seq. ID No. 4 usw.) der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs.

Seq. ID No. 113 bis Seq. ID No. 116

Seq. ID No. 113 bis Seq. ID No. 116 zeigen Sequenzen von in Beispiel 1 verwendeten Olinonukleotiden.
Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment eines Gens, hier Plättchen-Glykoprotein Ib, in dem eine bestimmte CG-Position auf ihren Methylierungsstatus hin untersucht wird.

Beispiel 1

Methylierungsanalyse des Gens Plättchen-Glykoprotein Ib

Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment des Gens Plättchen-Glykoprotein Ib, in dem eine bestimmte CG-Position auf Methylierung zu untersuchen ist.
Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base substituiert wird, während die an der 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben.
Wird für die Reaktion Bisulfit-Lösung verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Mit der chemisch umgewandelten DNA werden dann methylierte Cytosine nachgewiesen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschließend eine Desulfonierung der DNA durchgeführt. Im dritten Verfahrensschritt amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens Plättchen-Glykoprotein Ib untersucht. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden GGTGATAGGAGAATAATGTTGG (Seq. ID 113) und TCTCCCAACTACAACCAAAC (Seq. ID No. 114) ein definiertes Fragment der Länge 379 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an eine Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise GGTTAGGTCGTAGTATTG (Seq. ID No. 115), wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 172 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primeroligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der mit Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit wird der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins vom Hybridisierungsprodukt abgeleitet.
Zur Überprüfung des Methylierungsstatusses der Position wird eine Probe des Amplifikats weiterhin an ein anderes, vorher an eine Festphase gebundenes Oligonukleotid hybridisiert. Mit Ausnahme der betrachteten Position ist das besagte Oligonukleotid mit dem zuvor zur Untersuchung des Methylierungsstatusses der Probe verwendeten Oligonukleotid identisch. An der zu untersuchenden Position enthält das besagte Oligonukleotid im Gegensatz zu einer Cytosinbase eine Thyminbase, d. h. GGTTAGGTTGTAGTATTG (Seq. ID No. 116). Daher findet die Hybridisierungsreaktion nur statt wenn an der zu untersuchenden Stelle ein unmethyliertes Cytosin vorgelegen hat.

Beispiel 2

Differenzierung von Krebsarten

Um einen Bezug des Methylierungsmusters einer Probe zu einer der gewebe-spezifischen Tumorarten durchzuführen, bedarf es zunächst der Untersuchung der DNA- Methylierungsmuster von Karzinomproben, die von den beiden verschieden Gewebearten stammen. Diese Untersuchungen werden zum Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die so erhaltenen Ergebnisse werden in einer Datenbank abgespeichert und die CpG Dinukleotide identifiziert, die zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich methyliert sind. Dies kann durch Bestimmung einzelner CpG Methylierungsraten erfolgen, wie dies z. B. durch Sequenzieren möglich ist, was ein relativ ungenaues Verfahren zur Quantifizierung der Methylierung an einer bestimmten CpG darstellt, oder aber sehr genau durch eine methylierungssensitive "Primer-Extension-Reaktion". In einer besonders bevorzugten Variante kann der Methylierungsstatus von Hunderten oder Tausenden von CpGs auf einem Oligomer-Array untersucht werden. Ebenso können die Muster können z. B. mittels Clustering-Analysen, die z. B. durch einen Rechner durchgeführt werden können, verglichen werden.
Alle klinischen Proben wurden während einer Operation gewonnen, d. h. in einer routinemäßigen klinischen Situation (Santourlidis, S., Prostate 39: 166-174, 1999, Florl, A. R., Br. J. Cancer 80: 1312-1321, 1999). Eine Auswahl an genomischen Fragmenten aus 56 verschiedenen (in Tabelle 1 aufgeführten) Genen wurde mit Bisulfit behandelt, und die chemisch modifizierten Fragmente (Seq. IDs 1 bis 112) mittels PCR amplifiziert. Die genomische DNA wurde mit den in Tabelle 1 aufgeführten Primerpaaren amplifiziert. Wie für den Fachmann offensichtlich ist, sind jedoch auch andere Primer verwendbar, welche die Genomische auf geeignete Weise amplifizieren. Der Aufbau solcher Primer ist für den Fachmann offensichtlich. Besonders bevorzugt sind jedoch die Primerpaare wie sie in Tabelle 1 aufgeführt sind. Prostatakarzinome und klarzelliges Nierenkarzinome konnten mit einem hochsignifikanten Versuchsfehler von 6% klassifiziert werden. Zwei CpG-Positionen aus den Genen Apolipoprotein C2 und Plättchen-Glykoprotein Ib waren ausreichend; die meisten anderen CpGs dieser Auswahl zeigten jedoch unterschiedliche Methylierungsmuster zwischen den beiden Phänotypen. Unsere Ergebnis zeigen, dass Methylierungsfingerprints die Differentialdiagnose von aus verschiedenartigem menschlichen Gewebe stammenden soliden malignen Tumoren zur Verfügung stellen können und daher in einer großen Zahl klinischer Situationen angewendet werden könnten.
Fig. 1 zeigt die Anwendung des beschriebenen Verfahrens zur Unterscheidung klarzelliger Nierenkarzinome von Prostatakarzinomen. Tabelle 1 Liste der Gene und Primeroligonukleotide gemäß Beispiel 2

Claims

1. Nukleinsäure, umfassend eine mindestens 16 Basen lange Sequenz eines Abschnitts der chemisch vorbehandelten genomischen DNA gemäß einer der Sequenzen aus der Gruppe der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 und zu deren komplementären Sequenzen.

2. Oligomer, insbesondere Oligonukleotid oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomer, wobei das besagte Oligomer jeweils mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 9 Nukleotiden umfasst, die an eine chemisch vorbehandelte genomische DNA gemäß einer der Seq. ID No 1 bis 112 gemäß Anspruch 1 und zu deren komplementären Sequenzen hybridisiert oder mit dieser identisch ist.

3. Oligomer gemäß Anspruch 2, wobei die Basensequenz mindestens ein CpG Dinukleotid umfasst.

4. Oligomer gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Cytosin des CpG Dinukleotids in etwa im mittleren Drittel des Oligomers befindet.

5. Satz von Oligomeren, umfassend mindestens zwei Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.

6. Satz von Oligomeren gemäß Anspruch 5, umfassend Oligomere zur Detektion des Methylierungszustandes aller CpG Dinukleotide innerhalb einer der Sequenzen gemäß der Seq. ID No. 1 bis 112 gemäß Anspruch 1, und zu deren komplementären Sequenzen.

7. Satz von mindestens zwei Oligonukleotiden gemäß Anspruch 2, die als Primeroligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 112 und zu deren komplementären Sequenzen und zu deren komplementären Sequenzen [sic] und Abschnitten davon eingesetzt werden können.

8. Satz von Oligonukleotiden gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.

9. Verwendung eines Satzes von Oligomersonden, umfassend mindestens zehn der Oligomere gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in einer chemisch vorbehandelten genomischen DNA gemäß Anspruch 1.

10. Verfahren zur Herstellung einer auf einem Trägermaterial fixierten Anordnung von unterschiedlichen Oligomeren (Array) zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustand der CpG Dinukleotide einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 112 und zu deren komplementären Sequenzen stehenden Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 an eine feste Phase gekoppelt wird.

11. Anordnung von unterschiedlichen Oligomeren (Array) die gemäß Anspruch 10 erhalten werden kann.

12. Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass diese auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.

13. Array gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.

14. DNA- und/oder PNA-Array zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustand von Genen stehenden Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der voranstehenden Ansprüche umfasst.

15. Verfahren zur Charakterisierung, Klassifizierung und/oder Differenzierung von Nieren- und Prostatakrebs, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Schritte durchgeführt werden:

a) es wird eine biologischen Probe gewonnen, die genomische DNA enthält;

b) die genomischen DNA wird extrahiert;

c) in einer genomischen DNA-Probe werden durch chemische Behandlung an der 5- Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt;

d) aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von Primeroligonukleotiden gemäß Anspruch 7 oder 8 und einer Polymerase amplifiziert, wobei die Amplifikate eine nachweisbare Markierung tragen;

e) Amplifikate werden an einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden gemäß der Ansprüche 5 und 6 oder aber an ein Array gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15 hybridisiert; und

f) die hybridisierten Amplifikate werden anschließend nachgewiesen.

16. Verfahren zur Charakterisierung, Klassifizierung und/oder Differenzierung von Nieren- und Prostatakrebs, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Schritte durchgeführt werden:

a) es wird eine biologischen Probe gewonnen, die genomische DNA enthält;

b) die genomischen DNA wird extrahiert;

d) aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von Primeroligonukleotiden gemäß Anspruch 7 oder 8 und einer Polymerase amplifiziert; und

e) vor der chemischen Behandlung wird die Sequenz der amplifizierten DNA untersucht und der Methylierungsstatus einer oder mehrerer Cytosin-Positionen in der genomischen Probe bestimmt durch Bezugnahme auf einen oder mehrere Datensätze.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass im Amplifikationsschritt bevorzugt DNA amplifiziert wird, die in Nieren- und/oder Prostatazellen aufgrund des spezifischen genomischen Methylierungsstatusses von Nieren- und/oder Prostatazellen von besonderem Interesse ist im Gegensatz zur Background-DNA.

18. Verfahren gemäß der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Behandlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchführt.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert werden, die 100-2000 Basenpaare lang sind.

20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wird.

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase eine hitzebeständige DNA-Polymerase ist.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.

23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen sind.

24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind.

25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet dass die Markierungen der Amplifikate ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.

26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate oder Fragmente der Amplifikate im Massenspektrometer nachgewiesen werden.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 und/oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.

28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visualisiert.

29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die genomische DNA aus Zellen oder Zellbestandteilen erhalten wurde, welche DNA enthalten, wobei Quellen von DNA z. B. Zelllinien, Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, Lymphflüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe wie beispielsweise Gewebe des Lymphsystems, der Niere und der Prostata, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon umfassen.

30. Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.

31. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Oligonukleotids oder PNA- Oligomers gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Kits gemäß Anspruch 30, eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, eines Satzes von Oligonukleotiden gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 zur Charakterisierung, Klassifizierung und/oder Differenzierung von Nieren- und Prostatakrebs.

32. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Oligonukleotids oder PNA- Oligomers gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Kits gemäß Anspruch 30, eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, eines Satzes von Oligonukleotiden gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 zur Therapie von soliden Tumoren und Krebs.