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Gebiet der Erfindung
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Die nach den methodischen Entwicklungen
der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen
sind die Gene selbst, die Übersetzung
dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im
Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet
wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten
Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung
der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem
veränderten
Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Nukleinsäuren,
Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose und/oder
der Therapie von Erkrankungen, die mit dem genetischen und/oder
epigenetischen Parametern von Genen, die mit Metastase assoziiert
sind, und insbesondere deren Methylierungsstatus, in Zusammenhang
stehen.
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Stand der Technik
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Das Schlüsselmerkmal von malignen Zellen
ist deren Fähigkeit,
in normales gesundes Gewebe einzudringen und durch den Körper hindurch
zu entfernten Organen disseminiert zu werden. Diese Fähigkeit,
als Metastase bekannt, ist eine der am meisten fatalen Metastase
von Krebs. In Brustkrebs, zum Beispiel, ist das Ausmaß von Metastase
zu den Lymphknoten einen Schlüssel-prognostischer
Faktor der Erkrankung. Ungefähr
30% der Krebsarten sind zum Zeitpunkt der Diagnose metastatisch
und weitere 30-40% der verbleibenden Fälle beinhalten okkulte Metastasen.
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Die Metastase ist ein hoch komplizierter
Signalweg, der viele proteolytische Enzyme, Zelladhäsion, Verformbarkeit,
Zellrezeptoren und Motilität
einschliesst. Krebs-Metastase kann in den folgenden Schritten beschrieben
werden. Die anfänglichen
Ereignisse schließen
die Etablierung des primären
Tumors ein. Diese umfassen das anfängliche transformierende Ereignis
und die Teilung der transformierten Zellen, gefolgt von einem Ausweichen
des Immun-Mechanismus
und der Etablierung einer Nährstoffversorgung.
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Von dem primären Tumor schreitet die Metastase
durch lokale Invasion und Zerstörung
von extrazellulärer
Matrix und parenchymalen Zellen fort. Es wird angenommen, dass die
Zerstörung
der basalen Membran in einer zwei-Schritt-Weise fortschreitet. Zuerst
bindet sich die Krebszellen an die Membran, Gießen wird durch die Bindung
von Tumorzellenoberflächenproteinen
an Glycoproteine, wie zum Beispiel Laminin, Typ IV Collagen, und
Fibronectin vermittelt. Die Invasion schreitet dann durch enzymatische
Mittel fort, sowohl Proteinasen (Serin-, Cystein- Aspartat-Proteinasen
und Metalloproteinasen) und Tumour-sekretierte hydrolytische Enzyme (z.B.
Glycosidase, Hyaluronidase und Heparanase) wurden damit in Zusammenhang
gebracht.
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Der nächste Schritt schließt die Migration
der Tumorzellen von dem primären
Tumor ein. Die Billigung von den Zellen durch biologische Barrieren
kann durch eine Zahl von Faktoren angetrieben werden. Diese schließen Tumour-abgeleitete
chemotaktische Faktoren, Wirtabgeleitete Chemoattraktanten und Kombinationen
dieser zwei ein. Untersuchungen haben gezeigt, dass Tumorzellen
auf Wachstumsfaktoren, Collagen, Peptide, Matrixkomponenten und
proteolytische Fragmente von Matrixkomponenter, Adhäsionsproteine,
wie zum Beispiel Laminin und Fibronectin und Tumor-abgeleitete Attraktanten
chemotaktisch antworten. Weiterhin wurde auch die Wichtigkeit von
autokrinen Wachstumsfaktoren auf die Motilität der transformierten Zelle
gezeigt.
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Die mobilisierten Zellen versuchen
dann, die Blutgefäßwände zu durchdringen.
Sobald die mobilisierten Zellen in den Blutstrom eintreten, werden
sie zu entfernten Organen embolisiert. Die Zellen können dann in
dem Lumen von kleinen Blutgefäßen oder
lymphatischen Gefäßen fest
gehalten werden. Die Krebszellen schreiten dann fort, selber durch
die Wände
der Gefäße hindurch
auszutreten. Die Etablierung von sekundären Tumoren schreitet dann
durch die Teilung der transformierten Zellen fort, gefolgt von einem
Ausweichen der Immun-Mechanismen
und der Etablierung einer Nährstoffversorgung.
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Die metastatischen Signalwege schließen die
Beteiligung von Enzymen ein, die in vielen verschiedenen normalen
Signalwegen verwendet werden. Daher kann der wesentliche Unterschied
zwischen normalen Zellen und malignen kanzerösen Zellen als einer der Genregulation
definiert werden. Die DNA Methylierung wurde als ein regulatorischer
Schlüsselmechanismus
bei der Tumorentstehung impliziert, wobei die Rolle der Methylierung
bei der Tumorent stehung durch Singal und Ginder 'DNA Methylation'
Blood, Vol. 93 No. 12 (June 15), 1999: pp. 4059-4070 zusammenfassend
beschrieben wurde. Beispiele der Methylierungsgekoppelten Onkogenese
schließen
ein:
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- – Kopf-
und Nackenkrebs (Sanchez-Cespedes M et al. „Gene promoter hypermethylation
in tumours and serum of head and neck cancer patients„ Cancer
Res. 2000 Feb. 15;60 (4):892-5).
- – Hodgkin's
Erkrankung (Garcia JF et al „Loss
of p16 protein expression associated with methylation of the p16INK4A
gene is a frequent finding in Hodgkin's disease„ Lab invest 1999 Dec; 79
(12):1453-9).
- – Cardiomyopathie;
Narula et. al. "Apoptosis in heart failure: release of cytochrome
c from mitochondria and activation of caspase-3 in human cardiomyopathy"
Proc Natl Acad Sci U S A.;96:8144-8149 (1999).
- – Magenkrebs
(Yanagisawa Y et al. „ Methylation
of the hMLHl promoter in familial gastric cancer with microsatellite
instability„ Int
J Cancer 2000 Jan 1; 85 (1):50-3).
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Es besteht ein anhaltender Bedarf,
neue Verfahren zur Behandlung und Diagnose von Krebs zu entwickeln.
Die Identifizierung der Methylierungs-abhängigen Regulation von Krebsgenen
hat die Möglichkeit
eröffnet,
alternative Verfahren der Krebsbehandlung und Diagnose zu entwickeln.
Von der Behandlung mit DNA Methylierungsinhibitoren wurde gezeigt,
dass sie die Genexpression des Schlüssel-Tumour-Suppressor- und Oncogens
p 16, Bender et. al. "Inhibition of DNA methylation by 5-aza-2'-deoxycytidine
suppresses the growth of human tumor cell lines." Cancer research
58; 95-101 (1998) wieder herstellt. Dies führte zu heritablen Spiegeln
der Genexpression, die zu der Unterdrückung des Wachstums in Tumorzellinien
führte.
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Methylierungs-basierte Therapien
könnten
beträchtliche
Vorteile über
augenblickliche Verfahren der Behandlung, wie z. B. Chemotherapie,
Chirurgie und Radiotherapie haben. Sie könnten sogar, wie durch Soengas
et al "Inactivation of the apoptosis effector Apaf-1 in malignant
melanoma" Nature 409; 207-211(2001) gezeigt, ein Mittel zur Behandlung
von Tumoren zur Verfügung
stellen, die gegenüber
herkömmlichen
Behandlungen resistent sind. Zusätzlich
zu der Entwicklung von Methylierungs-spezifischen Therapien haben
Experimente mit Min-Mäusen
gezeigt, dass die Inhibierung von DNA Methylierung die Tumorinitiation
unterdrücken kann
(Laird et. al. 'Suppression of intestinal neoplasia by DNA hypomethylati on'
Cell 81; 197-205 1995). Weiterhin kann die DNA-Methylierungsanalyse
neue Mittel zur Tumordiagnose zur Verfügung stellen.
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Die Identifizierung von Methylierung
als ein regulatorischer Mechanismus und die Charakterisierung der
Komponenten der metastatischen Kaskade stellen eine neue Basis für die Entwicklung
von Therapien und Diagnostika durch die Methylierungsanalyse von
mit der Metastase zusammenhängenden
Genen zur Verfügung.
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5-Methylcytosin ist die häufigste
kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt
beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim
genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung
von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist
daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch
nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin
das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus
geht bei einer PCR-Amplifikation
die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen,
vollständig
verloren.
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Eine relativ neue und die mittlerweile
am häufigsten
angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin
beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das
nach anschließender
alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem
Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin
wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird
die ursprüngliche
DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch
sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden
kann, jetzt durch „normale"
molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise
durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen
werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche
jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit
betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende
DNA in einer Agarose-Matrix
einschließt,
dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert
nur an einzelsträngiger
DNA) verhindert und alle Fällungs-
und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald
J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based
cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6).
Mit dieser Methode können
einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode
veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen
bis etwa 3000 Basenpaare Länge
untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von
möglichen
Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch
dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen
zuverlässig
analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix
verloren.
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Eine Übersicht über die weiteren bekannten
Möglichkeiten,
5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel
entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic
Acids Res. 1998, 26, 2255.
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Die Bisulfit-Technik wird bisher
bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler
W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman
and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences
at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8) nur in
der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines
bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder
komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny
of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6)
oder einzelne Cytosin-Positionen durch
eine „Primer-Extension-Reaktion"
(Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences
at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide
primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31,
WO 95/00669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a
sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids
Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der
Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO
99/28498).
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Weitere Publikationen, die sich mit
der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei
einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine
residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431; Zeschnigk
M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted
segments in the human genome: different DNA methylation patterns
in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the
genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95;
Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis
on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic
sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 025;22(4):695-6; Martin
V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing
indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region
of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene.
1995 May 19;157(1-2):261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO 97/45560.
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Eine Übersicht über den Stand der Technik in
der Oligomer Array Herstellung läßt sich
aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics
(Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort
zitierten Literatur entnehmen.
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Für
die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte
Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist
das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der
jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten
Sonden erfolgt beispielsweise über
ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen
anderen, kommerziell erhältlich.
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Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie
(MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse
von Biomolekülen
(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins
with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988
Oct 15;60(20):2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende
Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix
verdampft und das Analytmolekül
so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird
die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt
die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen
Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen
erreichen den Detektor früher
als größere.
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MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich
ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse
von Nukleinsäuren
ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations
and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit
etwa 100 mal schlechter als für
Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die
ein vielfach negativ geladenes Rückgrat
haben, ist der Ionisationsprozeß durch
die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie
spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption
von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrizes gefunden worden,
die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile
einige ansprechende Matrizes, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied
nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verrin gert
werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem
Peptid ähnlicher wird.
Phosphorothioatnukleinsäuren,
bei denen die gewöhnlichen
Phosphate des Rückgrats
durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache
Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG,
Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by
mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73).
Die Kopplung eines „charge
tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der
Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein
weiterer Vorteil von „charge
tagging" ist die erhöhte
Stabilität
der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter
Substrate stark erschweren.
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Genomische DNA wird durch Standardmethoden
aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen.
Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und
Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
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Beschreibung
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Es ist die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, die chemisch modifizierte DNA von Genen zur Verfügung zu
stellen, die mit Metastase assoziiert sind, sowie Oligonukleotide
und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen
sowie ein Verfahren bereitzustellen, welches sich zur Diagnose von
genetischen und epigenetischen Parametern von Genen, die mit Metastase
assoziiert sind, besonders eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis
zugrunde, dass genetische und epigenetische Parameter und insbesondere
die Cytosin-Methylierungsmuster
von Genen, die mit Metastase assoziiert sind, zur Diagnose und/oder
der Therapie von mit Metastase assoziierten Erkrankungen besonders
eignen.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch
das zur Verfügung
stellen einer Nukleinsäure,
die einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch
vorbehandelten DNA von Genen, die mit Metastase assoziiert sind
gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 198 und dazu komplementären Sequenzen und/oder
der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Metastase assoziiert
sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene enthält, gelöst. In der
Tabelle sind nach den aufgelisteten Gen-Bezeichnungen die jeweiligen
Datenbanknummern (Zugangsnummern) angegeben, die die dazugehörigen Gensequenzen
als einmalig definieren. GenBank am National Institute of Health
wurde als die zu Grunde liegende Datenbank unter der Internet Adresse
www.ncbi.nlm.nih.gov verwendet. Die chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte
bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von genetischen
und epigenetische Parametern gebracht werden.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer zur Detektion
des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA,
umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von
mindestens 13 Nukleotiden gelöst,
die an eine chemisch vorbehandelte DNA von Genen, die mit Metastase
assoziiert sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 198 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Metastase assoziiert
sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene hybridisiert.
Die erfindungsgemäßen Oligomersonden
stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung
der genetischen und epigenetischen Parameter von Genen, die mit
Metastase assoziiert sind, erst ermöglichen. Bevorzugterweise umfaßt die Basensequenz
der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die Sonden können auch
in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders
bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind
erfindungsgemäße Oligonukleotide,
bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5. – 9. Nukleotid
vom 5'-Ende des 13 mers ist, im Falle von PNA-Oligomeren ist es
bevorzugt, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4. – 6. Nukleotid
vom 5'-Ende des 9 mers ist.
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Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise
in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide
eine der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 198 und dazu
komplementären
Sequenzen und/oder Genen gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene und dazu komplementärer Sequenzen
mindestens ein Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das für jedes
der CpG Dinukleotide aus einer der Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 198
und dazu komplementären
Sequenzen und/oder Genen gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene und dazu komplementärer Sequenzen mindestens
ein Oligomer umfaßt.
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Darüber hinaus stellt die Erfindung
ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als
sogenannte „Primer-Oligonukleotide"
zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq.
ID No. 198 und dazu komplementären
Sequenzen und/oder Genen gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene und dazu komplementärer Sequenzen
oder Abschnitten davon eingesetzt werden können. Im Falle der erfindungsgemäßen Sets
von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, dass mindestens ein Oligonukleotid
an eine Festphase gebunden ist.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin einen Satz von mindestens 10 n (Oligonukleotiden und/oder
PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes
in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No. 1 bis Seq.
ID No. 198 und dazu komplementären
Sequenzen und/oder Genen gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene und dazu komplementärer Sequenzen) dienen.
Mit diesen Sonden ist die Diagnose und/oder Therapie von genetischen
und epigenetischen Parametern von Genen, die mit Metastase assoziiert
sind, möglich.
Das Set von Oligomeren kann auch zur Detektion von Single Nucleotide
Polymorphismen (SNPs) in der chemisch vorbehandelten DNA von Genen,
die mit Metastase assoziiert sind gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis
Seq. ID No. 198 und dazu komplementären Sequenzen und/oder von
Genen gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene und dazu komplementärer Sequenzen
verwendet werden.
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Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass eine
von der Erfindung zur Verfügung
gestellte Anordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder
PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine Festphase
gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen Oligonukleotid-
und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein,
dass es auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen
Gitters angeordnet ist. Bevorzugterweise besteht die Festphasenoberfläche aus
Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel,
Silber oder Gold. Möglich
sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel
Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial
fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit Metastase assoziierten
Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung
an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von
solchen Arrays sind zum Beispiel aus der
US 5,744,305 mittels Festphasenchemie
und photolabilen Schutzgruppen bekannt.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
betrifft einen DNA-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit Metastase
assoziierten Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung umfaßt.
DNA-Chips sind zum Beispiel aus der
US
5,837,832 bekannt.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden
Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens
zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18
Basenpaaren langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen
(Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 198 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder Genen gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene und dazu komplementärer Sequenzen),
Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren
sowie einer Anleitung zur Durchführung
und Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann. Ein Kit
im Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten
Bestandteile enthalten.
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Die Erfindung stellt weiterhin ein
Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern
von Genen, die mit Metastase assoziiert sind durch Analyse von Cytosin-Methylierungen
und Single Nucleotide Polymorphismen zur Verfügung, das folgende Schritte
umfaßt:
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- In einem ersten Verfahrensschritt wird eine genomische DNA-Probe
derart chemisch behandelt, dass an der 5'-Position unmethylierte
Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten
her dem Cytosin unähnliche
Base umgewandelt werden. Dies wird im folgenden unter „chemischer
Vorbehandlung" verstanden.
Die zu analysierende genomische
DNA wird bevorzugt aus den üblichen
Quellen für
DNA erhalten, wie Zellen oder Zellbestandteilen, zum Beispiel Zelllinien,
Biopsine, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit,
in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen,
Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische
Objektträger
oder Kombinationen davon.
Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene
Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit)
und anschließender
alkalischer Hydrolyse angewendet, die zu einer Umwandlung nicht
methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom
Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt. Aus
dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente
unter Verwendung von Sätzen
von erfindungsgemäßen Primer-Oligonukleotiden
und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert.
Aus statistischen und praktikablen Erwägungen werden bevorzugterweise
mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100 – 2000 Basenpaare
lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten kann simultan
in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird
die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens umfasst der Satz von Primer-Oligonukleotiden mindestens zwei Oligonukleotide,
deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18
Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang (Seq. ID No. 1 bis Seq.
ID No. 198 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder von Genen gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene und dazu komplementären Sequenzen)
aufgelisteten Basensequenzen sind. Die Primer-Oligonukleotide sind
vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie kein CpG Dinukleotid
enthalten.
Erfindungsgemäß bevorzugt
ist es, dass bei der Amplifikation mindestens ein Primer-Oligonukleotid an
eine Festphase gebunden ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid
und/oder PNA-Oligomersequenzen können
auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen
Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt
aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer,
Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien,
wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.
Die
mittels der Amplifikation erhaltenen Fragmente können eine direkt oder indirekt
nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt sind Markierungen in Form
von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten
mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen
werden können, wobei
bevorzugt ist, dass die erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit
im Massenspektrometer eine einzelne positive oder negative Nettoladung
aufweisen. Der Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations
Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI)
durchgeführt
und visualisiert werden.
- Die im zweiten Verfahrensschritt erhaltenen Amplifikate werden
anschließend
an einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA- Sonden der oder
an ein Array hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgt dabei auf
die unten angegebene Art und Weise. Der bei der Hybridisierung verwendete
Satz besteht bevorzugterweise aus mindestens 10 Oligonukleotid oder
PNA-Oligomer Sonden.
Die Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an einer
Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht hybridisierten
Fragmente werden anschließend
entfernt. Die besagten Oligonukleotide umfassen mindestens eine
Basensequenz mit einer Länge von
13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt
der im Anhang aufgeführten Basenequenzen
ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotics
ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers aus betrachtet.
Für jedes
CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besagten PNA-Oligomere
umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von
9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt
der im Anhang aufgeführten
Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das
Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende
des 9 mers aus gesehen. Für
jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.
- Im vierten Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten
Amplifikate.
- Im letzten Verfahrensschritt detektiert man die hybridisierten
Amplifikate. Dabei ist bevorzugt, dass an den Amplifikaten angebrachte
Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet,
identifizierbar sind.
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Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass die
Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide
oder ablösbare
Molekülfragmente
mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen
werden können.
Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu
den Amplifikaten komplementäre
Sonden im Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion
mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie
(MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführen und
visualisieren kann.
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Zur besseren Detektierbarkeit im
Massenspektrometer können
die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung
aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Ver fahren zur Ermittlung
von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von Genen, die
mit Metastase assoziiert sind, verwendet.
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Die erfindungsgemäßen Oligomere oder Arrays derselben
sowie ein erfindungsgemäßen Kit
sollen zur Diagnose und/oder Therapie einer mit Metastase assoziierten
Krankheit durch Analyse von Methylierungsmustern von Genen, die
mit Metastase assoziiert sind, verwendet werden. Erfindungsgemäss bevorzugt
ist die Verwendung des Verfahrens zur Diagnose und/oder Therapie
bedeutender genetischer und/oder epigenetischer Parameter innerhalb
von Genen, die mit Metastase assoziiert sind.
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Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Beispiel
der Diagnose und/oder der Therapie von soliden Tumoren und Krebs.
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Auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der
Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 198 und dazu komplementäre Sequenzen
und/oder die chemisch vorbehandelte DNA von Genen, die mit Metastase
assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene und dazu komplementäre Sequenzen
können für die Diagnose
und/oder der Therapie von genetischen und/oder epigenetischen Parametern
von Genen, die mit Metastase assoziiert sind, verwendet werden.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums und/oder
Therapeutikums zur Diagnose und/oder der Therapie von Krankheiten,
die mit Metastase assoziiert sind durch Analyse von Methylierungsmustern
von Genen, die mit Metastase assoziiert sind, wobei das Diagnostikum
und/oder das Therapeutikum dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens
eine Nukleinsäure,
gemäß der vorliegenden
Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen
zu dessen Herstellung verwendet wird.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung betrifft ein Diagnostikum und/oder Therapeutikum für Krankheiten,
die mit Metastase assoziiert sind, durch Analyse von Methylierungsmustern
von Genen, die mit Metastase assoziiert sind, wobei das Diagnostikum
und/oder Therapeutikum dadurch gekennzeichnet ist, das es mindestens
eine Nukleinsäure
gemäß der Erfindung,
gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen
enthält.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten
oder Individuen, bei dem die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden
genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb von Genen,
die mit Metastase assoziiert sind mit einem anderen Satz genetischen
und/oder epigenetischen Parameter verglichen werden können und
die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose
nachteiliger Ereignisse für
Patienten oder Individuen dienen.
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Unter dem Begriff "Hybridisierung"
im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung
einer Duplex-Struktur eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz
im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen.
Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen
zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5
x SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer
geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.
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Mit dem Begriff "funktionelle Varianten"
sind alle DNA-Sequenzen bezeichnet, die komplementär zu einer
DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der Referenzsequenz
hybridisieren und eine zu dem entsprechenden erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche
Aktivität
aufweisen.
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"Genetische Parameter" im Sinne dieser
Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von Genen, die mit
Metastase assoziiert sind und zu deren Regulation weiterhin erforderlicher
Sequenzen. Insbesondere sind als Mutationen Insertionen, Deletionen,
Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt
SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnen.
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"Epigenetische Parameter" im Sinne
dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin-Methylierungen und weitere chemische
Modifikationen von DNA-Basen von Genen, die mit Metastase assoziiert
sind und zu deren Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen.
Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise die Acetylierung
von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt
analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung
korreliert.
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Im folgenden wird die Erfindung auf
Basis der Sequenzen und Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne
hierauf eingeschränkt
zu werden.
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Sequenz ID Nos. 1 bis 198
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Sequenzen, die ungerade Sequenznummern
haben (z.B., Seq. ID No. 1, 3, 5,...) zeigen in jedem Fall Sequenzen
der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von verschiedenen Genen,
die mit Metastase assoziiert sind. Sequenzen, die gerade Sequenznummern
aufweisen (z.B., Seq. ID No. 2, 4, 6,...) zeigen in jedem Fall Sequenzen
der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von verschiedenen Genen,
die mit Metastase assoziiert sind, die komplementär zu den
voranstehenden Sequenzen sind (z.B., die komplementäre Sequenz
zu Seq. ID No. 1 ist Seq. ID No. 2, die komplementäre Sequenz
zu Seq. ID No. 3 ist Seq. ID No. 4, usw.)
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Seq. ID No. 199 bis Seq.
ID No. 202
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Seq. ID No. 199 bis Seq. ID No. 202
zeigen die Sequenzen von Oligonukleotiden, wie in Beispiel 1 verwendet.
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Das folgende Beispiel betrifft ein
Fragment eines Gens, das mit Metastase assoziiert ist, in diesem
Fall CD22, worin eine spezifische CG-Position auf ihren Methylierungsstatus
hin analysiert wird.
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Beispiel 1: Methylierungsanalyse
in dem mit Metastase assoziierten Gen CD22
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Das folgende Beispiel betrifft ein
Fragment des Gens CD22, worin eine spezifische CG-Position auf ihren
Methylierungsstatus hin analysiert wird.
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Im ersten Schritt wird eine genomische
Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit)
derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten
Cytosine so verändert
werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche
Base entsteht, während
die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben.
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Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet,
so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt.
Zudem müssen
ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein.
Eine anschließende
alkalische Hydrolyse führt
dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in
Uracil. Die chemisch umgewan- delte
DNA (Sequenz ID No. 159) dient dann dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen.
Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe
mit Wasser oder einer wässrigen
Lösung.
Bevorzugt wird anschliessend eine Desulfonierung der DNA (10-30
min, 90-100 °C)
bei alkalischem pH-Wert durchgeführt.
Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe
in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase.
Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens DAPK1 analysiert.
Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden TGTGTGTTGTTAAATGAAGA
(Seq. ID No. 199) und ACACAAATATTAAAATTATC (Seq. ID No. 200) ein
definiertes Fragment der Länge
470 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein
vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung
einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise TTGTTATACGTTTTGTTT
(Seq. ID No. 210), wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position
210 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts
beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primer-Oligonukleotiden,
die für
die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten
DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt
es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem
Oligonukleotid. Somit kann der Methylierungsstatus des jeweiligen
zu untersuchenden Cytosins über
das Hybridisierungsprodukt abgeleitet werden.
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Um den Methylierungsstatus der Position
zu überprüfen, wird
eine Probe des Amplifikats weiterhin an ein anderes Oligonukleotid
hybridisiert, das vorher an eine feste Phase gebunden wurde. Dieses
Oligonukleotid ist identisch zu dem Oligonukleotid, das vorher benutzt
wurde, um den Methylierungsstatus der Probe zu analysieren, mit
der Ausnahme der fraglichen Position. An der zu analysierenden Position
umfasst das Oligonukleotid eine Thymin-Base, im Gegensatz zu einer
Cytosin-Base d.h. TTGTTATATGTTTTGTTT (Seq. ID No. 202). Daher findet
die Hybridisierungsreaktion nur statt, falls ein nicht-methyliertes
Cytosin an der zu analysierenden Positionen vorhanden ist.
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Beispiel 2: Diagnose von
mit Metastase assoziierten Erkrankungen
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Um einen Bezug der Methylierungsmuster
zu einer der mit Metastase assoziierten Erkrankungen herzustellen,
bedarf es zunächst
der Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster einer Gruppe von erkrankten und
einer Gruppe von gesunden Personen. Diese Untersuchungen werden
zum Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die so erhaltenen Ergebnisse
werden in einer Datenbank abgespeichert und die CpG Dinukleotide
identifiziert, die zwi schen den beiden Gruppen unterschiedlich methyliert
sind. Dies kann durch Bestimmung einzelner CpG Methylierungsraten
erfolgen, wie dies z. B. durch Sequenzieren relativ ungenau oder aber
durch eine Methylierungs-sensitive „Primer-Extension-Reaktion"
sehr genau möglich
ist. Auch gleichzeitige Analyse des gesamten Methylierungsstatus
ist möglich,
und die Muster können
z.B. mittels Clustering-Analysen, die z.B. durch einen Rechner durchgeführt werden
können,
verglichen werden.
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Nachfolgend ist es möglich, untersuchte
Patienten einer bestimmten Therapiegruppe zuzuordnen und diese Patienten
gezielt mit einer individualisierten Therapie zu behandeln.
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Beispiel 2 kann zum Beispiel für Krebs
und solide Tumore durchgeführt
werden.
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Tabelle
1 Auflistung von bevorzugten Genen, die mit Metastase assoziiert
sind, gemäß der Erfindung.
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