DE10054974A1

DE10054974A1 - Diagnose von mit Cdk4 assoziierten Krankheiten

Info

Publication number: DE10054974A1
Application number: DE10054974A
Authority: DE
Inventors: Alexander Olek; Christian Piepenbrock; Kurt Berlin
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2000-11-06
Filing date: 2000-11-06
Publication date: 2002-06-06
Also published as: WO2002036814A2; WO2002036814A3; EP1332228A2; AU2002218283A1; US20040072198A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die chemisch modifizierte genomische Sequenz des Cdk4 Gens, gegen die Sequenz gerichtete Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes des Cdk4 Gens sowie ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern des Cdk4 Gens.

Description

Gebiet der Erfindung

Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in be stimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylie rung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen, die mit dem genetischen und/oder epigenetischen Parametern des Gens Cdk4 und insbesondere dessen Methylierungsstatus in Zusammenhang stehen.

Stand der Technik

Die meisten bisher bekannten genetischen Läsionen zielen auf die Aktivierung von Genen, deren Produkte die Zellproliferation steuern, dabei kann eine Deregulation der Zellzykluspro gression ebenfalls die Grundlage für eine maligne Transformation darstellen. Ein in der G1 Phase des Zellzyklus wichtiger Faktor ist Cyclin D1. Es konnte gezeigt werden, dass Cyclin D1 in Kooperation mit aktivierten myc Genen in transgenen Mäusen lymphoide Tumoren erzeugen kann (Lovec H, Grzeschiczek A, Kowalski MB, Moroy T. Cyclin D1/bcl-1 coope rates with myc genes in the generation of B-cell lymphoma in transgenic mice. EMBO J. 1994 Aug 1; 13(15): 3487-95). Cyclin D1 kann also als Onkogen wirken, benötigt aber zell spezifische kooperierende Partner. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass nicht nur Cyclin D1 onkogenes Potential besitzt, sondern auch die mit Cyclin D1 assoziierte Cyclin-abhängige Kinase 4 (CDK 4). So ist Cdk4 beispielsweise an akuter lymphatischer Leukämie (Mekki Y, Catallo R, Bertrand Y, Manel AM, Ffrench P, Baghdassarian N, Duhaut P, Bryon PA, Ffrench M. Enhanced expression of p16ink4a is associated with a poor prognosis in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 1999 Feb; 13(2): 181-9; Omura-Minamisawa M, Diccianni MB, Batova A, Chang RC, Bridgeman LJ, Yu J, Pullen J, Bowman WP, Yu AL. Universal inactivation of both p16 and p15 but not downstream components is an essential event in the pathogenesis of T-cell acute lymphoblastic leukemia. Clin Cancer Res. 2000 Apr; 6(4): 1219-28) oder an akuter myeloischer Leukämie (Guo SX, Taki T, Ohnishi H, Piao HY, Tabuchi K, Bessho F, Hanada R, Yanagisawa M, Hayashi Y. Hypermethylation of p16 and p15 genes and RB protein expression in acute leukemia. Leuk Res. 2000 Jan; 24(1): 39-46) beteiligt. Ebenso besteht ein Zusammenhang zu Magenkrebs (Myung N, Kim MW Chung IP, Kim H, Jang JJ. Loss of p16 and p27 is associated with progression of human gastric cancer. Cancer Lett. 2000 May 29; 153(1-2): 129-36), zu der Alzheimer Erkrankung (Tsujioka Y, Ta kahashi M, Tsuboi Y, Yamamoto T, Yamada T. Localization and expression of cdc2 and cdk4 in Alzheimer brain tissue. Dement Gematr Cogn Disord. 1999 May-Jun; 10(3): 192-8), zu präkanzeröser Veränderung der Mundschleimhaut und Plattenepithelkarzinom der Mund schleimhaut (Chen Q, Luo G, Li B, Samaranayake LP. Expression of p16 and Cdk4 in oral premalignant lesions and oral squamous cell carcinomas: a semi-quantitative immunohisto chemical study. J Oral Pathol Med. 1999 Apr; 28(4): 158-64), zu nicht-kleinzelligem Lungen krebs (Malusecka E, Zborek A, Krzyzowska-Gruca S. Changes in expression of pRb, p16 and cyclin D l in non-small cell lung cancer: an immunohistochemical study. Folia Histochem Cytobiol. 1999; 37(1): 19-24) oder zu parostalem Osteosarkom (Wunder JS, Eppert K, Burrow SR, Gokgoz N, Bell RS, Andrulis IL, Gogkoz N. Co-amplification and overexpression of Cdk4, SAS and MDM2 occurs frequently in human parosteal osteosarcomas. Oncogene. 1999 Jan 21; 18(3): 783-8). Weiterhin scheint Cdk4 an der Ausbildung des malignen peripheren Nervenscheidentumors (Berner JM, Sorlie T, Mertens F, Henriksen J, Saeter G, Mandahl N, Brogger A, Myklebost O, Lothe RA. Chromosome band 9p21 is frequently altered in ma lignant peripheral nerve sheath tumors: studies of CDKN2A and other genes of the pRB pa thway. Genes Chromosomes Cancer. 1999 Oct; 26(2): 151-60) sowie an Prostatakrebs (Lee CT, Capodieci P, Osman I, Fazzari M, Ferrara J, Scher HI, Cordon-Cardo C. Overexpression of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16 is associated with tumor recurrence in human prostate cancer. Clin Cancer Res. 1999 May; 5(5): 977-83) beteiligt zu sein; ebenso an Niere nerkrankung (Wolf G. Angiotensin II is involved in the progression of renal disease: importance of non-hemodynamic mechanisms. Nephrologie. 1998; 19(7): 451-6), Gebärmutter krebs (Ito K, Sasano H, Yoshida Y, Sato S. Yajima A. Immunohistochemical study of cyclins D and E and cyclin-dependent kinase (cdk) 2 and 4 in human endometrial carcinoma. Anti cancer Res. 1998 May-Jun; 18(3A): 1661-4) und Brustkrebs (Sweeney KJ, Swarbrick A, Sutherland RL, Musgrove EA. Lack of relationship between CDK activity and G1 cyclin ex pression in breast cancer cells. Oncogene. 1998 Jun 4; 16(22): 2865-78). Weitere Assoziatio nen von Cdk4 betreffen das diffuse großzellige B-Zell-Lymphom (Rao PH, Houldsworth J, Dyomina K, Parsa NZ, Cigudosa JC, Louie DC, Popplewell L, Offit K, Jhanwar SC, Chaganti RS. Chromosomal and gene amplification in diffuse large B-cell lymphoma. Blood. 1998 Jul 1; 92(1): 234-40), das multiple Myelom (Tasaka T, Asou H, Munker R, Said JW, Berenson J, Vescio RA, Nagai M, Takahara J, Koeffler HP. Methylation of the p16INK4A gene in mul tiple myeloma. Br J Haematol. 1998 Jun; 101(3): 558-64), das rundzellige Liposarkom (Dei Tos AP, Piccinin S. Doglioni C, Vukosavljevic T, Mentzel T, Boiocchi M, Fletcher CD. Mo lecular aberrations of the G1-S checkpoint in myxoid and round cell liposarcoma. Am J Pa thol. 1997 Dec; 151(6): 1531-9), die tuberöse Sklerose (Soucek T, Pusch O, Wienecke R, De- Clue JE, Hengstschlager M. Role of the tuberous sclerosis gene-2 product in cell cycle con trol. Loss of the tuberous seierosis gene-2 induces quiescent cells to enter S phase. J Biol Chem. 1997 Nov 14; 272(46): 29301-8), Eierstockkrebs (Masciullo V, Scambia G, Marone M, Giannitelli C, Ferrandina G, Bellacosa A, Benedetti Panici P, Mancuso S. Altered expression of cyclin D1 and Cdk4 genes in ovarian carcinomas. Int J Cancer. 1997 Aug 22; 74(4): 390-5), das Ewing Sarkom (Ladanyi M, Lewis R, Jhanwar SC, Gerald W, Huvos AG, Healey JH. MDM2 and Cdk4 gene amplification in Ewing's sarcoma. J Pathol. 1995 Feb; 175(2): 211-7) oder vererbbare Melanome und Nävi (Greene MH The genetics of hereditary melanoma and nevi. 1998 update. Cancer. 1999 Dec 1; 86(11 Suppl): 2464-77).

5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zel len. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das glei che Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR- Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.

Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in sei nem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch "normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Se quenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose- Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24(24): 5064-6). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Me thylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr klei nen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffu sionsschutz durch die Matrix verloren.

Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lich C, Bui ting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr; 5(2): 94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov; 17(3): 275-6) oder einzelne Cytosin- Positionen durch eine "Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quanti tation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2529-31, WO 95/00669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitati ve DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).

Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungs nachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun; 16(6): 431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar; 6(3): 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25; 22(4): 695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19; 157(1-2): 261-4; WO 97 46705, WO 95 15373 und WO 97 45560.

Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.

Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.

Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15; 60(20): 2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix ein gebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisa tion des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark be schleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.

MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Protei nen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nu kleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verrin gert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25; 23(8): 1367-73). Die Kopplung eines "charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von "charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.

Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonsti gen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Aufgabenstellung

Die vorliegende Erfindung soll Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen und ein Verfahren bereitstellen, welches sich zur Diagnose von ge netischen und epigenetischen Parametern des Cdk4-Gens besonders eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass sich insbesondere Cytosin-Methylierungsmuster zur Dia gnose von mit Cdk4 assoziierten Erkrankungen besonders eignen.

Beschreibung

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die chemisch modifizierte DNA des Gens Cdk4, sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen, sowie ein Verfahren bereit zu stellen, welches sich zur Diagnose von genetischen und epige netischen Parametern des Cdk4 Gens besonders eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass sich genetische und epigenetische Parameter und insbesondere das Cytosin- Methylierungsmuster des Cdk4 Gens zur Diagnose von mit Cdk4 assoziierten Erkrankungen besonders eignen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA des Gens Cdk4 gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4 gelöst. Die chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von genetischen und epigenetische Parametern gebracht werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oli gomer zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 13 Nukleotiden gelöst, die an eine chemisch vorbehandelte DNA des Gens Cdk4 gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4 hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligomersonden stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung der genetischen und epigenetischen Pa rameter des Cdk4-Gens erst ermöglichen. Bevorzugterweise umfasst die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die Sonden können auch in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Oligonukleotide, bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5.-9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers ist, im Falle von PNA- Oligomeren ist es bevorzugt, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4.-6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers ist.

Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide eine der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4 minde stens ein Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das für jedes der CpG Dinukleotide aus einer der Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 4 mindestens ein Oligomer umfasst.

Weiterhin stellt die Erfindung ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als sogenannte Primeroligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4 oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.

Im Falle der erfindungsgemäßen Sets von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Satz von mindestens 10 Oligomeren (Oli gonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4) dienen. Mit diesen Sonden ist die Diagnose von genetischen und epigeneti schen Parametern des Cdk4-Gens möglich. Das Set von Oligomeren kann auch zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in der chemisch vorbehandelten DNA des Gens Cdk4 gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4 verwendet werden.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass eine von der Erfindung zur Verfügung gestellte An ordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine Festphase gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet ist. Bevorzugterweise besteht die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Alumini um, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold. Möglich sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz- Matrizes vorliegen können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf ei nem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit Cdk4 assoziierten Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays sind zum Beispiel aus der US 5,744,305 mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen bekannt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft einen DNA-Chip zur Analyse in Zusammen hang mit Cdk4 assoziierten Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vor liegenden Erfindung umfasst. DNA-Chips sind zum Beispiel aus der US 5,837,832 bekannt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18 Basenpaaren langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4) entsprechen oder zu ihnen komplementär sind, Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren sowie einer Anleitung zur Durchführung und Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann. Ein Kit im Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten Bestandteile enthalten.

Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epige netischen Parametern des Cdk4 Gens durch Analyse von Cytosin-Methylierungen und Single Nucleotide Polymorphismen zur Verfügung, das folgende Schritte umfasst:
In einem ersten Verfahrensschritt wird eine genomische DNA-Probe derart chemisch behan delt, dass an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden. Dies wird im folgenden unter chemischer Vorbehandlung verstanden.

Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus den üblichen Quellen für DNA erhalten, wie Zellen oder Zellbestandteilen, zum Beispiel Zelllinien, Biopsine, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispiels weise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, hi stologische Objektträger oder Kombinationen davon.

Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hy drogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer Um wandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaa rungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.

Aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwen dung von Sätzen von erfindungsgemäßen Primeroligonukleotiden und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert. Aus statistischen und praktikablen Erwägungen werden bevorzugterweise mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100-2000 Ba senpaare lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten kann simultan in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfasst der Satz von Primeroligonu kleotiden mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4) aufgelisteten Basensequenzen sind. Die Primeroligonukleotide sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie kein CpG Dinukleotid enthalten.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass bei der Amplifikation mindestens ein Primeroligonu kleotid an eine Festphase gebunden ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA- Oligomersequenzen können auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien, wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.

Die mittels der Amplifikation erhaltenen Fragmente können eine direkt oder indirekt nach weisbare Markierung tragen. Bevorzugt sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkie rungen, Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können, wobei bevorzugt ist, dass die erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Der Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massen spektrometrie (ESI) durchgeführt und visualisiert werden.

Die im zweiten Verfahrensschritt erhaltenen Amplifikate werden anschließend an einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden der oder an ein Array hybridisiert. Die Hybridi sierung erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der Hybridisierung verwendete Satz besteht bevorzugterweise aus mindestens 10 Oligonukleotid oder PNA- Oligomer Sonden. Die Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an einer Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht hybridisierten Fragmente werden an schließend entfernt. Die besagten Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Ab schnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers aus betrachtet. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besag ten PNA-Oligomere umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 9 Nukleo tiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführ ten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers aus gesehen. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.

Im vierten Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten Amplifikate.

Im letzten Verfahrensschritt detektiert man die hybridisierten Amplifikate. Dabei ist bevor zugt, dass an den Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmar kierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können. Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementäre Sonden im Massen spektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massen spektrometrie (ESI) durchführen und visualisieren kann.

Zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer können die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern des Cdk4 Gens verwendet.

Die erfindungsgemäßen Oligomere oder Arrays derselben sowie ein erfindungsgemäßes Kit sollen zur Diagnose einer mit Cdk4 assoziierten Krankheit durch Analyse von Methylie rungsmustern des Cdk4-Gens verwendet werden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Ver wendung des Verfahrens zur Diagnose bedeutender genetischer und/oder epigenetischer Pa rameter innerhalb des Cdk4-Gens.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Beispiel der Diagnose von akuter lymphatischer Leukämie, akute lymphatische Leukämie von T-Zellen, akuter myeloischer Leukämie, Ge bärmutterkrebs, Magenkrebs, Alzheimer Erkrankung, präkanzeröser Veränderung der Mund schleimhaut und Plattenepithelkarzinom der Mundschleimhaut, nicht-kleinzelligem Lungen krebs, parostalem Osteosarkom, malignem peripherem Nervenscheidentumor, nicht- kleinzelligem Lungenkrebs, parostalem Osteosarkom, malignem peripherem Nervenschei dentumor, Prostatakrebs, Nierenerkrankung, Brustkrebs, diffusem großzelligem B-Zell- Lymphom, multiplem Myelom, rundzelligem Liposarkom, tuberöser Sklerose, Eierstock krebs, Ewing Sarkom und vererbbaren Melanome und Nävi.

Auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 4 können für die Diagnose von genetischen und/oder epigenetischen Parametern des Cdk4 Gens verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnosti kums zur Diagnose von mit Cdk4 assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylie rungsmustern des Cdk4-Gens, wobei das Diagnostikum dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens eine Nukleinsäure, gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen zu dessen Herstellung verwendet wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Diagnostikum zur von mit Cdk4 assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylierungsmustern des Cdk4-Gens, das mindestens eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigne ten Zusatz- und Hilfsstoffen umfasst.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, bei dem die mittels der Erfindung erhaltenen be deutenden genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb des Cdk4 Gens mit ei nem anderen Satz genetischen und/oder epigenetischen Parameter verglichen werden können und die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose nachteili ger Ereignisse für Patienten oder Individuen dienen.

Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur eines Oligonukleotids an eine vollständig komple mentäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verste hen. Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 × SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Wasch schritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.

Mit dem Begriff "funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen bezeichnet, die komple mentär zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der Referenzse quenz hybridisieren und eine zu dem entsprechenden erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche Aktivität aufweisen.

"Genetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen des Cdk4 Gens und zu seiner Regulation weiterhin erforderlicher Sequenzen. Insbesondere sind als Mutationen Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnen. Polymor phismen können aber ebenso Insertionen, Deletionen oder Inversionen sein.

"Epigenetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin- Methylierungen und weitere chemische Modifikationen von DNA-Basen des Cdk4 Gens und zu seiner Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise die Acetylierung von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen Verfah ren nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung korre liert.

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Sequenzen und Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne dass die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.

Seq. ID No. 1 zeigt die Sequenz der chemisch vorbehandelten genomischen DNA des Gens Cdk4

Seq. ID No. 2 zeigt die Sequenz einer zweiten chemisch vorbehandelten genomischen DNA des Gens Cdk4

Seq. ID No. 3 zeigt die revers komplementäre Sequenz der Seq. ID 1 der chemisch vorbehan delten genomischen DNA des Gens Cdk4

Seq. ID No. 4 zeigt die revers komplementäre Sequenz der Seq. ID 2 der chemisch vorbehan delten genomischen DNA des Gens Cdk4

Seq. ID No. 5 zeigt die Sequenz eines Oligonukleotids zur Amplifizierung von Cdk4 aus Bei spiel 1

Seq. ID No. 6 zeigt die Sequenz eines zweiten Oligonukleotids zur Amplifizierung von Cdk4 aus Beispiel 1

Seq. ID No. 7 zeigt die Sequenz eines Oligonukleotids zur Hybridisierung des Amplifikats von Cdk4 aus Beispiel 1

Seq. ID No. 8 zeigt die Sequenz eines zweiten Oligonukleotids zur Hybridisierung des Ampli fikats von Cdk4 aus Beispiel 1

Seq. ID No. 9 zeigt die Sequenz eines dritten Oligonukleotids zur Hybridisierung des Amplifi kats von Cdk4 aus Beispiel 1

Seq. ID No. 10 zeigt die Sequenz eines vierten Oligonukleotids zur Hybridisierung des Ampli fikats von Cdk4 aus Beispiel 1

Seq. ID No. 11 zeigt die Sequenz eines Oligonukleotids zur Hybridisierung des Amplifikats von Cdk4 aus Beispiel 1

Seq. ID No. 12 zeigt die Sequenz eines fünften Oligonukleotids zur Hybridisierung des Ampli fikats von Cdk4 aus Beispiel 1

Seq. ID No. 13 zeigt die Sequenz eines Oligonukleotids zur Hybridisierung des Amplifikats von Cdk4 aus Beispiel 1

Seq. ID No. 14 zeigt die Sequenz eines sechsten Oligonukleotids zur Hybridisierung des Am plifikats von Cdk4 aus Beispiel 1

Seq. ID No. 15 zeigt die Sequenz eines siebten Oligonukleotids zur Hybridisierung des Ampli fikats von Cdk4 aus Beispiel 1

Seq. ID No. 16 zeigt die Sequenz eines achten Oligonukleotids zur Hybridisierung des Ampli fikats von Cdk4 aus Beispiel 1

Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment des Gens Cdk4, in dem eine bestimmte CG-Position auf ihren Methylierungsstatus hin untersucht wird.

Beispiel 1 Durchführung der Methylierungsanalyse im Cdk4-Gen Beispiel 1 Durchführung der Methylierungsanalyse im Cdk4-Gen Beispiel 1 Durchführung der Methylierungsanalyse im CDK4-Gen

Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogen sulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cyto sine so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedli che Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit im Konzentrationsbereich zwischen 0.1 und 6 M verwendet, so fin det an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturie rendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließen de alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin- Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzu weisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschliessend eine Desulfonierung der DNA (10-30 min. 90-100°C) bei alkalischem pH-Wert durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfah rens amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase.

Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens CDK4, hier aus der 5'UTR, untersucht. Mit Sequenzen dieses Gens können Proben von Patienten mit der Diagnose ALL von gesunden B- /T-Zellen unterschieden werden. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden TTTTGGTAGTTGGTTATATG (Seq. ID 5) und AAAAATAACACAATAACTCA (Seq. ID 6) ein definiertes Fragment der Länge 474 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung einer Du plexstruktur hybridisiert, beispielsweise GATTCCTACGACCCCATA (Seq. ID 7) oder GATTCCTACAACCCCATA (Seq. ID 8), wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Positi on 120 des Amplifikats befindet. Das methylierte Cytosin wird mit dem Oligonukleotid (Seq. ID 7), welches an der betreffenden komplementären Stelle ein Guanin aufweist, nachgewie sen, wogegen die unmethylierte Zustandsform, die durch ein Thymin repräsentiert wird, mit dem Oligonukleotid (Seq. ID 8), welches an der betreffenden komplementären Stelle ein Adenin aufweist, nachgewiesen wird.. Weitere Oligonukleotide, die zur Hybridisierung ver wendet werden können beinhalten nachfolgende Sequenzen: CCCTTAAACGACCCTTCC (Seq. ID 9) und CCCTTAAACAACCCTTCC (Seq. ID 10) mit dem nachzuweisenden Cyto sin an Position 276 des Amplifikats, CCACTTCCCGCCCTTAAA (Seq. ID 11) und CCACTTCCCACCCTTAAA (Seq. ID 12) mit dem nachzuweisenden Cytosin an Position 286 des Amplifikats.

Des weiteren können Proben von Patienten mit der Diagnose ALL von Proben von Patienten mit der Diagnose AML unterschieden werden. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligo nukleotiden TTTTGGTAGTTGGTTATATG (Seq. ID 5) und AAAAATAACACAATAACTCA (Seq. ID 6) ein definiertes Fragment der Länge 474 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebunde nes Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise CCCTTAAACGACCCTTCC (Seq. ID 9) und CCCTTAAACAACCCTTCC (Seq. ID 10) mit dem nachzuweisenden Cytosin an Position 276 des Amplifikats, CCTTACATCGAAAATCCT (Seq. ID 13) und CCTTACATAGAAAATCCT (Seq. ID 14) mit dem nachzuweisenden Cytosin an Position 349 des Amplifikats, TCCAACCACGTAAAACCC (Seq. ID 15) und TCCAACCACATAAAACCC(Seq. ID 16) mit dem nachzuweisenden Cytosin an Position 433 des Amplifikats. Das methylierte Cytosin wird mit dem Oligonukleotid (Seq. ID 7), welches an der betreffenden komplementären Stelle ein Guanin aufweist, nachgewiesen, wogegen die unmethylierte Zustandsform, die durch ein Thymin repräsentiert wird, mit dem Oligonukleotid (Seq. ID 8), welches an der betreffenden komplementären Stelle ein Adenin aufweist, nachgewiesen wird.

Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf CY5 fluoreszenzmarkierten Primeroli gonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behan delten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hy bridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungspro dukt.

Beispiel 2 Diagnose von CDK4 assoziierten Erkrankungen

Um einen Bezug der Methylierungsmuster zu einer der mit Cdk4 assoziierten Erkrankungen, beispielsweise akute lymphatische Leukämie und akute lymphatische Leukämie von T-Zellen, akute myeloischer Leukämie, Gebärmutterkrebs, Magenkrebs, Alzheimer Erkrankung, prä kanzeröse Veränderung der Mundschleimhaut und Plattenepithelkarzinom der Mundschleim haut, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, parostales Osteosarkom, malignes peripheres Nerven scheidentumor, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, parostalem Osteosarkom, malignem peri pherem Nervenscheidentumor, Prostatakrebs, Nierenerkrankung, Brustkrebs, diffuses groß zelliges B-Zell-Lymphom, multiples Myelom, rundzelliges Liposarkom, tuberöse Sklerose, Eierstockkrebs, Ewing Sarkom und vererbbare Melanome und Nävi durchzuführen, bedarf es zunächst der Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster einer Gruppe von erkrankten und einer Gruppe von gesunden Personen. Diese Untersuchungen werden zum Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die so erhaltenen Ergebnisse werden in einer Datenbank abge speichert und die CpG Dinukleotide identifiziert, die zwischen den beiden Gruppen unter schiedlich methyliert sind. Dies kann durch Bestimmung einzelner CpG Methylierungsraten erfolgen, wie dies z. B. durch Sequenzieren relativ ungenau oder aber durch eine methylie rungssensitive "Primer-Extension-Reaktion" sehr genau möglich ist. Auch gleichzeitige Analyse des gesamten Methylierungsstatus ist möglich, und die Muster können z. B. mittels Clustering-Analysen, die z. B. durch einen Rechner durchgeführt werden können, verglichen werden.

Nachfolgend ist es möglich, untersuchte Patienten einer bestimmten Therapiegruppe zuzuord nen und diese Patienten gezielt mit einer individualisierten Therapie zu behandeln.

Claims

1. Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der che misch vorbehandelten DNA des Cdk4 Gens gemäß einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 4.

2. Oligomer (Oligonukleotid oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomer) zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend jeweils min destens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden, die an eine che misch vorbehandelte DNA des Cdk4-Gens gemäß einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 4 hybridi siert.

3. Oligomer gemäß Anspruch 2, wobei die Basensequenz mindestens ein CpG Dinukleotid umfasst.

4. Oligomer gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Cytosin des CpG Dinu kleotids in etwa im mittleren Drittel des Oligomers befindet.

5. Satz von Oligomeren gemäß Anspruch 3, umfassend mindestens ein Oligomer zur Detekti on des Methylierungszustandes zumindest eines der CpG Dinukleotide aus einer der Sequen zen der Seq. ID 1 bis Seq. ID 4.

6. Satz von Oligomeren gemäß Anspruch 3, umfassend mindestens ein Oligomer zur Detekti on des Methylierungszustandes aller CpG Dinukleotide aus einer der Sequenzen der Seq. ID 1 bis Seq. ID 4.

7. Satz von mindestens zwei Oligonukleotiden gemäß Anspruch 2, die als Primeroligonu kleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 4 oder Ab schnitten davon eingesetzt werden können.

8. Satz von Oligonukleotiden gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.

9. Satz von Oligomersonden zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in chemisch vorbehandelter genomischer DNA gemäß einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 4, umfassend mindestens zehn der Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.

10. Verfahren zur Herstellung einer auf einem Trägermaterial fixierten Anordnung von unter schiedlichen Oligomeren (Array) zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylie rungszustandes der CpG Dinukleotide einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 4 stehenden Erkrankun gen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 an eine feste Pha se gekoppelt wird.

11. An eine Festphase gebundene Anordnung von unterschiedlichen Oligomeren (Array) nach einem der Ansprüche 2 bis 4.

12. Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass diese auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.

13. Array gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Festpha senoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.

14. DNA- und/oder PNA-Array zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungs zustand von Genen stehenden Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der voranstehenden Ansprüche umfasst.

15. Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern zur Dia gnose von bestehenden Erkrankungen oder der Prädisposition für bestimmte Erkrankungen durch Analyse von Cytosin-Methylierungen, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte ausführt:

a) in einer genomischen DNA-Probe werden durch chemische Behandlung an der 5-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt;
b) aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwen dung von Sätzen von Primeroligonukleotiden gemäß Anspruch 7 oder 8 und einer Polymerase amplifiziert, wobei die Amplifikate eine nachweisbare Markierung tragen;
c) Amplifikate werden an einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden gemäß der Ansprüche 2 bis 4 oder aber an ein Array gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13; hybridisiert
d) die hybridisierten Amplifikate werden anschließend nachgewiesen.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Be handlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchführt.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert werden, die 100-2000 Basenpaare lang sind.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Am plifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wird.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Po lymerase eine hitzebeständige DNA-Polymerase ist.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Mar kierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen sind.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind.

23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet dass die Mar kierungen der Amplifikate ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in ei nem Massenspektrometer nachgewiesen werden.

24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Am plifikate oder Fragmente der Amplifikate im Massenspektrometer nachgewiesen werden.

25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 und/oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne po sitive oder negative Nettoladung aufweisen.

26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visualisiert.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die ge nomische DNA aus Zellen oder Zellbestandteilen erhalten wurde, welche DNA enthalten, wobei Quellen von DNA z. B. Zeillinien, Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Au gen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon umfassen.

28. Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.

29. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Oligonukleotids oder PNA- Oligomers gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Kits gemäß Anspruch 28, eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 oder eines Satz von Oligonukleotiden, umfassend min destens ein Oligomer für zumindest eines der CpG Dinukleotide einer der Sequenzen der Seq. ID 7 bis Seq. ID 16 zur Diagnose von akuter lymphatische Leukämie, akuter lymphatischer Leukämie von T-Zellen, akuter myeloischer Leukämie, Gebärmutterkrebs, Magenkrebs, Alz heimer Erkrankung, präkanzeröser Veränderung der Mundschleimhaut und Plattenepithelkar zinom der Mundschleimhaut, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, parostalem Osteosarkom, malignem peripherem Nervenscheidentumor, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, parostalem Osteosarkom, malignem peripherem Nervenscheidentumor, Prostatakrebs, Nierenerkrankung, Brustkrebs, diffusem großzelligem B-Zell-Lymphom, multiplem Myelom, rundzelligem Li posarkom, tuberöser Sklerose, Eierstockkrebs, Ewing Sarkom und vererbbaren Melanome und Nävi

30. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Oligonukleotids oder PNA- Oligomers gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Kits gemäß Anspruch 28, eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 oder eines Satz von Oligonukleotiden, umfassend min destens ein Oligomer für zumindest eines der CpG Dinukleotide einer der Sequenzen der Seq. ID 7 bis Seq. ID 18 zur Therapie von akuter lymphatischer Leukämie, akuter lymphatischer Leukämie von T-Zellen, akuter myeloischer Leukämie, Gebärmutterkrebs, Magenkrebs, Alz heimer Erkrankung, präkanzeröser Veränderung der Mundschleimhaut und Plattenepithelkar zinom der Mundschleimhaut, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, parostalem Osteosarkom, malignem peripherem Nervenscheidentumor, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, parostalem Osteosarkom, malignem peripherem Nervenscheidentumor, Prostatakrebs, Nierenerkrankung, Brustkrebs, diffusem großzelligem B-Zell-Lymphom, multiplem Myelom, rundzelligem Li posarkom, tuberöser Sklerose, Eierstockkrebs, Ewing Sarkom und vererbbaren Melanome und Nävi

31. Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere gemäß Anspruch 30.

32. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Oligonukleotids oder PNA- Oligomers gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Kits gemäß Anspruch 28 oder eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 zur Unterscheidung von Proben von Patienten mit ALL (akute lymphatische Leukämie) von gesunden B/T-Zellen und zur Unterscheidung von Proben von Patienten mit ALL von AML (akute myeloische Leukämie)