DE60207979T2

DE60207979T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Gewebespezifität von freier DNA in Körperflüssigkeiten

Info

Publication number: DE60207979T2
Application number: DE60207979T
Authority: DE
Inventors: Kurt Berlin; Andrzej Sledziewski
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2002-03-05
Filing date: 2002-03-05
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2022-03-06
Also published as: AU2003218691B2; EP1342794A1; EP1342794B1; WO2003074730A1; EP1483410A1; CA2478493A1; ATE312946T1; AU2003218691A1; ES2253461T3; DK1342794T3; JP4727149B2; JP2005518809A; DE60207979D1; US20050221314A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Nachweis frei-flottierender Nukleinsäuren, wie sie in nicht zellulär gebundenen Nukleinsäuren vorhanden sind, in Körperflüssigkeiten, z.B. Plasma oder Serumfraktionen menschlichen oder tierischen Blutes oder irgend anderen Gewebeproben, die vom menschlichen oder tierischen Körper genommen werden, um eine zelllproliferativen Erkrankungen diagnostizieren zu können. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf den Nachweis erhöhter Spiegel von Nukleinsäuren in Körperflüssigkeiten. Des weiteren ermöglicht die Erfindung, den Ursprung der angereicherten DNA zu bestimmen, indem das Verhältnisses von DNA, die von einem bestimmten Organ abstammt, gegenüber der Gesamt-DNA anderer Organe in einer bestimmten Körperflüssigkeitsprobe gemessen wird, indem das Methylierungsmuster der DNA spezifiziert wird. Dies kann mit oder ohne Erhöhung der DNA-Konzentration einer vorgegebenen biologischen Probe erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform gestattet eine weitere Analyse dieses Methylierungsmusters den Nachweis des Vorhandenseins einer tumorartigen oder anderweitig proliferativen Erkrankung des besagten Organs.
Stand der Technik
Auf DNA basierende Versuche um Krebs nachzuweisen
Eine Reihe genetischer Veränderungen wie Mutationen in gewissen Genen, aber auch Verlust von Heterozygotie und Microsatelliten-Instabilität an bestimmten Loci können in DNA Proben von Tumorgewebe nachgewiesen werden. Diese DNA Veränderungen können in DNA, die vom Tumorgewebe eines Patienten genommen wurde, nachgewiesen werden. In einigen Fällen wurde berichtet, daß diese Veränderungen auch in DNA Proben von Serum oder Blut oder Sputum solcher Tumorpatienten festgestellt wurden.
Es ist bekannt, daß Zigarettenraucher erhöhte Bronchialsekretionen haben, die abgeblätterte Zellen vom Bronchialbaum enthalten. Durch die Analyse dieser abgeschiedenen Zellen, konnten prämaligne, zytologische Veränderungen bereits mehrere Jahre vor einer klinischen Diagnose von Lungenkrebs in Hochrisikopatienten nachgewiesen werden (Saccomanno et al. (1974) Cancer (Phila.), 33: 256–270). Diese Untersuchungen waren nicht leicht reproduzierbar und erforderten besondere Fachkenntnis der Person, die jene Proben analysierte. Deshalb wurden, um den prädikativen Wert der Sputumproben zu fördern, die Anwendung molekularer Versuche vorgeschlagen, z.B., um Mutationen in dem K-ras Gen nachzuweisen oder Mikrosatelliten-Veränderungen, die spezifisch für den Tumor sind (Mao et al. (1944) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 9871–9875 and Mao et al. (1944) Cancer Res., 54: 1634–1637). K-ras als auch p53 Mutationen wurden in Körperflüssigkeiten nachgewiesen, wie sie in zytologischen Proben von Sputum und bronchialer Lavage von Lungenkrebspatienten und chronischen Rauchern festgestellt wurden (Kersting et al. (2000) J. Clin. Oncol., 18: 3221–3229 und Ahrendt et al. (1999) J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda), 91: 332–339). Wenn man die Nukleinsäuresequenzen spezifischer Markergene kennt, die an gewissen Arten von Krebs beteiligt sind, wie z.B. Lungenkrebs, so ermöglichte die Analyse dieser Sputumproben, die Entstehung des Lungenkrebses in Hochrisikopatienten vorherzusagen. Relevantere Informationen zu diesem Thema finden sich in Patent WO 95/16792 von Maurice Stroun, Philippe Anker und Valeri Vasioukhin. Diese Verfahren sind jedoch nicht ideal, denn es fehlt ihnen die Sensitivität, und die insgesamte Prävalenz dieser Veränderungen im non-small-cell-Lungenkrebs beträgt weniger als 25% (Palmisano et al. (2000), Caner Res. 60: 5954–5958). Auch für Prostatakrebs wurde berichtet, daß die Inaktivierung des HPC2/ELAC2 Gens mittels LOH ein relativ seltener Vorgang ist (Wu et al. (2001) Cancer Res 61: 8651–8653). Ein anderer Faktor, der stark korreliert wird mit dem Auftreten von Tumoren, ist die Hypermethylierung gewisser Promotoren und Promotorenregionen.
Methylierung
In den letzten Jahrzehnten fokussierten die Untersuchungen in der Molekularbiologie hauptsächlich auf die Gene, die Translation jener Gene zu RNA und die Transkription der RNA zu Protein. Es gab nur eine begrenztere Analyse des regulatorischen Mechanismus im Zusammenhang mit der Genkontrolle. Genregulation, wie z.B. in welchem Stadium der Entwicklung eines Individuums ein Gen aktiviert oder inhibiert wird, und die gewebespezifische Eigenschaft dieser Regulation wurde weniger verstanden. Jedoch kann sie mit einem hohen Grad an Wahrscheinlichkeit korreliert werden mit dem Ausmaß und der Beschaffenheit der Methylierung des Gens oder des Genoms. Aufgrund dieser Beobachtung macht die Folgerung Sinn, daß pathogene genetische Störungen durch irreguläre genetische Methylierungsmuster nachgewiesen werden können, was bei einer Anzahl von Fällen aufgezeigt wurde. Des weiteren offenbart diese Erfindung ein Verfahren, wie die Herkunft von DNA in einer Körperflüssigkeit bestimmt werden kann, indem ihre Methylierungsmusters analysiert wird, um aberrierende Spiegel von DNA, die von einem gewissen Organ abstammen, nachzuweisen, die auf eine zellproliferative Erkrankung jenes Organs schließen lassen.
In höheren Eukaryoten wird DNA fast ausschließlich am Cytosin methyliert, welches 5'-seitig zu Guanosin liegt in den CpG-Dinucleotiden. Diese Einschränkung hat wichtige regulatorische Auswirkungen auf die Genexpression, ganz besonders dann, wenn sie CpG-angereicherte Zonen involviert, die als CpG-Inseln bekannt sind und in den Promotorenregionen vieler Gene gelegen sind. Während fast alle Gen-assoziierten Inseln der autosomalen Chromosomen vor der Methylierung geschützt sind, wurde die extensive Methylierung von CpG-Inseln assoziiert mit der transkriptionellen Inaktivierung von ausgewählten imprinted Genen und Genen auf dem inaktiven X-Chromosom von Frauen. Aberrierende Methylierung von normalweise unmethylierter CpG Inseln wurde als häufig vorkommender Vorgang bei immortalisierten und transformierten Zellen beschrieben und wurde assoziiert mit transkriptioneller Inaktivierung von bestimmten Tumor-Suppressor-Genen beim menschlichen Krebs.
Typischerweise enthalten menschliche Krebszellen somatisch veränderte Genome, die durch Mutation und Amplifikation, oder Deletion von wesentlichen Genen gekennzeichnet sind. Des weiteren, zeigt das DNA Template humaner Krebszellen oft somatische Veränderungen in der DNA Methylierung (E. R. Fearon, et al., Cell, 61: 759, 1990; P. A. Jones, et al., Cancer Res., 46: 461, 1986; R. Holliday, Science, 238: 163, 1987; A. De Bustros, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 5693, 1988; P. A. Jones, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 1929, 1992; N. Ohtani-Fujita, et al., Oncogene, 8: 1063, 1993). Jedoch ist die genaue Rolle abnormaler DNA-Methylierung bei der Entstehung des menschlichen Tumors nicht geklärt. DNA Methylasen transferieren Methylgruppen vom Universa-lmethyldonator S-adenosyl Methionin zu spezifischen Mutationsorten auf der DNA.
Mehrere biologische Funktionen wurden den methylierten Basen in der DNA zugeschrieben. Die am weitesten verbreitete Funktion ist die Protektion der DNA vor Verdau durch verwandte Restriktionsenzyme. Das Phänomen der Modifikation der Restriktionsschnittstellen wurde bislang nur in Bakterien festgestellt. Säugerzellen besitzen jedoch eine andere Methylase, die ausschließlich Cytosinreste der DNA methyliert, die 5' Nachbarn von Guanin (CpG) sind. Diese Methylierung, wie in mehrere Veröffentlichungen gezeigt, spielen eine Rolle der Genaktivität, der Zelldifferenzierung, der Tumorgenesis, der X-Chromosomeninaktivierung, dem genomischen Imprinting und anderen wichtigen biologischen Prozessen (Razin, A., H., and Riggs, R. D. eds. in DNA Methylation Biochemistry and Biological Significance, Springer-Verlag, N. Y., 1984).
Obwohl die genauen Mechanismen, mit denen DNA-Methylierung eine DNA-Transkription bewirkt, nicht bekannt sind, wurde der Zusammenhang zwischen Erkrankung und Methylierung ausführlich dokumentiert. Eine Fehlregulierung der Gene kann vorhergesagt werden, indem man deren Methylierungsmuster mit phänotypisch „normalen"' Expressionsmustern vergleicht. Die folgenden sind Fälle von Erkrankungen, die mit modifizierten Methylierungsmustern assoziiert werden. Die spezifische Rolle der Methylierung bei Krebs wird im nächsten Absatz beschrieben:

– Hodgkin's disease (Garcia JF et al „Loss of p16 protein expression associated with methylation of the p16INK4A gene is a frequent finding in Hodgkin's disease" Lab invest 1999 Dec; 79 (12): 1453–9)
– Prader-Willi/Angelman's syndrome (Zeschnigh et al "Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method" Human Mol. Genetics (1997)(6) 3 pp 387–395)
– ICF syndrome (Tuck-Muller et al "CMDNA hypomethylation and unusual chromosome instability in cell lines from ICF syndrome patients" Cytogenet Call Genet 2000; 89 (1-2): 121–8
– Dermatofibroma (Chen TC et al "Dermatofibroma is a clonal proliferative disease" J. Cutan Pathol 2000 Jan; 27 (1): 36–9)
– Hypertension (Lee SD et al. "Monoclonal endothelial cell proliferation is present in primary but not secondary pulmonary hypertension" J clin Invest 1998 Mar 1, 101 (5): 927–34)
– Autism (Klauck SM et al. "Molecular genetic analysis of the FMR-1 gene in a large collection of autistic patients" Human Genet 1997 Aug; 100 (2): 224–9)
– Fragile X syndrome (Hornstra IK et al. <<High resolution methylation analysis of the FMR1 gene trinucleotide repeat region in fragile X syndrome>> Hum Mol Genet 1993 Oct, 2 (10): 1659–65)
– Huntington's disease (Ferluga J et al. "possible organ and age related epigenetic factors in Huntington's disease and colorectal carcinoma" Med hypotheses 1989 May; 29 (1); 51–4)

Alle hier zitierten Dokumente sind hiermit als Referenz inkorporiert.
Hypermethylierung und Krebs
DNA-Methylierung kann Genexpression herunterregulieren und, wenn dies unpassendenderweise geschieht, kann es z.B. zu einer Ausschaltung der Tumorunterdrückergene führen und Krebs entstehen. Folglich wurde häufig gezeigt, daß gewisse Regionen des Genoms im Tumorgewebe hypermethyliert sind, während dies bei den benachbarten, unbeeinflußten Zellen nicht der Fall ist. Ein gut erforschtes System ist die Inaktivierung von GSTP1 (Glutathione-S-Transferase Promotor 1) durch CpG Insel Hypermethylierung, der bislang für menschlichen Prostatakrebs am häufigsten berichteten somatischen Genomveränderung, die früh während der Entstehung des menschlichen Prostatakarzinoms auftritt und zu einem Verlust der GSTP1 Care-Taker-Funktion führt und die Prostatazellen mit inadäquaten Verteidigungsmechanismen gegen Oxidationsmittel und electrophile Karzinogene hinterläßt. Die genetische Diagnose von Prostatakrebs mittels Nachweis des Methylierungsstatus der GSTP1 wurde im US Patent 5,552,277 beschrieben. Ein weiteres Beispiel von vielen anderen wurde in folgender Veröffentlichung beschrieben: Yanagisawa Y et al. (2000) „Methylation of the hMLH1 promoter in familial gastric cancer with microsatellite instability „Int J Cancer 85: 50–3).
Ein neueres Beispiel für die Korrelation von Hypermethylierung und Krebs wird von Maruyama et al. gegeben, die von einer positiven Korrelation zwischen dem mittleren Methylierungsindex einer Anzahl ausgewählter Gene und der Prognose von Blasenkrebsentwicklung im Dezember 2001 berichteten (Maruyama et al. (2001) Cancer Res 61: 8659–8663). Methylierung von CDH1, FHIT, und ein hoher MI wurden in Zusammenhang mit verkürztem Überleben gebracht. Ein CDH1 positiver Methylierungsstatus wurde unabhängig davon in Zusammenhang gebracht mit geringen Überlebenschancen in vielfältigsten Analysen. Die Autoren folgerten, daß das Methylierungsprofil ein potentieller neuer Biomarker zur Risikovorhersage bei Blasenkrebs sein könnte, da sie jedoch nur Biopsieproben analysierten, würde dies einen chirurgischen Eingriff am Patienten voraussetzen. Jedoch haben noch neuere Untersuchungen die Möglichkeit des Nachweises von DNA-Methylierung in der DNA von Körperflüssigkeiten statt im Tumorgewebe selbst hervorgehoben.
DNA Methylierung in Körperflüssigkeiten
In der DNA von abgeblätterten Zellen in Sputumproben von Lungenpatienten z.B. oder Hochrisikopatienten konnte für den p16-Tumor-Supressor-Gen-Promotor und/oder die O6-Methylguanin-DNA Methyltransferase Promotoren gezeigt werden, daß sie fehlerhaft methyliert wurden. Die fehlerhafte Methylierung konnte in DNA von Sputum in 100% von Patienten mit schuppenartigen Zellen Lungenkarzinom bis zu 3 Jahre vor einer klinischen Diagnose nachgewiesen werden (Palmisano et al. (2000), Cancer Res. 60: 5954–5958).
Als der Methylierungsstatus von p15 und p16 Promotorenregionen von Tumor DNA und Blut (Plasma, Serum und Leukozytenfilmproben), DNA von hepatozellulären Karzinompatienten untersucht wurde, konnte bei 87% der Patienten mit Tumormethylierung auch methylierte DNA im Blutstrom nachgewiesen werden. Keine der Kontrollproben war methylierungspositiv (Wong et al. (2000) Clin Cancer Res 6(9): 3516–3521). Des weiteren zeigte eine Untersuchung über Kopf- und Nackenkrebs eine Wechselbeziehung zwischen Serum DNA Methylierung und Tumor DNA Methylierung von 42% (Sanchez-Cespedes et al. (2000) Cancer Res 60: 892–895).
Methylierte DNA als Tumormarker ist nicht nur beschränkt auf Sputum oder Blutstrom – sondern kann, zumindest bei Prostatakarzinom-Patienten – auch in Urin- oder Ejakulatproben gefunden werden. In dieser Studie wurden 94% der Tumor DNA Proben methyliert, 72% der Plasma- oder Serumproben, 50% der Ejakulatproben und 36% der Urinproben (nach prostatischer Massage zur Freisetzung von prostatischem Sekret) von Patienten mit Prostatakrebs, wohingegen keine Methylierung bei Proben der Kontrollgruppe nachgewiesen wurde (Cairns et al. (2001) Clin Cancer Res 7: 2727–2730).
Der Nachweis aberrierender Promotorenregion-Methylierung stellt einen vielversprechenden Ansatz dar, auf DNA-Methylierung aufgebaute Markerversuche zur Früherkennung von verbreiteten menschlichen Krebsarten anzuwenden. Da Hypermethylierung bei einer großen Anzahl von Krebsarten beteiligt ist, kann man an eine Reihe ähnlicher Ansätze für andere Krebsarten denken.
Für einen Überblick siehe:
Esteller, M., Corn, P. G., Baylin, S. B., Herman, J. G. (2001). A Gene Hypermethy-lation Profile of Human Cancer. Cancer Res 61: 3225–3229.
Oder für eine Auswahl neuerer Publikation dieses Themas:
Byun, D.-S., Lee, M.-G., Chae, K.-S., Ryu, B.-G., Chi, S.-G. (2001) Frequent Epigenetic Inactivation of RASSF1A by Aberrant Promoter Hypermethylation in Human Gastric Adenocarcinoma. Cancer Res 61: 7034–7038.
Agathanggelou A., Honorio S., Macartney D. P., Marinez A., Dallol A., Rader J., Fullwood P., Chauhan A., Walker R., Shaw J. A., Hosoe S., Lerman M. I., Minna J. D., Maher E. R., Latif F. (2001). Mehtylation associated inactivation of RASSF1A from region 3p21.3 in lung, breast and ovarian tumours. Oncogene, 20: 1509–1518.
Dong, S. M., Kim, H.-S., Rha, S.-H., Sidransky, D. (2001). Promoter Hypermethylation of Multiple Genes in Carcinoma of the Uterine Cervix. Clin Cancer Res/: 1982–1986.
Herman J. G., Latif F., Weng Y. K., Lerman M. I., Zbar B., Liu S., et al (1994) Silencing of the VHL tumor suppressor gene by DNA methylation in renal cacinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 9700–9704.
Usadel, H. et al. (2002). Quantitative adenomatous poly-posis coli promoter methylation analysis in tumor tissue, serum, and plasma of patients with lung cancer.
Verfahren zum Nachweis methylierter DNA
In den vorhergehenden Absätzen wurde die Bedeutung der Methylierung gewisser Cytosinbasen im Hinblick auf Genaktivität, Zelldifferenzierung, Tumorgenese, X-Chromosom Inaktivierung, genomisches Imprinting und anderer bedeutende biologischer Prozesse (Razin, A., H., and Riggs, R. D. eds. In DNA Methylation Biochemistry and Biological Significance, Springer-Verlag, N. Y., 1984) beschrieben. Die Modifizierung des Cytosins in Form von Methylierung enthält signifikante Information. Es ist offensichtlich, daß die Identifizierung von 5-Methylcytosin in einer DNA Sequenz im Gegensatz zu unmethyliertem Cytosin von größter Bedeutung ist, um dessen Rolle weiter analysieren zu können. Da jedoch das 5-Methylcytosin sich genauso verhält wie Cytosin hinsichtlich seiner Hybridisierungspräferenz (einer Eigenschaft, auf die man sich bei der Sequenzanalyse verläßt), können deren Positionen nicht durch eine normale Sequenzierungsreaktion nachgewiesen werden. Außerdem wird bei einer PCR Amplifizierung diese relevante epigenetische Information, methyliertes Cytosin oder unmethyliertes Cytosin, vollkommen verloren gehen.
Mehrere Verfahren sind bekannt, um dieses Problem zu lösen. Für gewöhnlich wird die genomische DNA mit einer Chemikalie oder einem Enzym behandelt, was zu einer Umwandlung der Cytosinbasen führt, und folglich danach die Differenzierung der Basen erlaubt. Einige Restriktionsenzyme können zwischen methylierter und unmethylierter DNA unterscheiden.
Eine relativ neues und derzeit am häufigsten angewandtes Verfahren zur Analyse von DNA auf 5-Methylcytosin basiert auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das in der nachfolgenden alkalischen Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, wohingegen 5-Methylcytosin unter diesen Bedingungen unverändert bleibt (Shapiro et al. (Shapiro et al. (1970) Nature 227: 1047). Uracil entspricht in seinem Basenpaarungsverhalten Thymidin, wohingegen 5-Methylcytosin seine chemischen Eigenschaften bei dieser Behandlung nicht verändert und Guanin entspricht. Folglich wird die ursprüngliche DNA auf die Weise verändert, daß das Methylcytosin, das ursprünglich nicht von Cytosin aufgrund seines Hybridisierungsverhaltens unterschieden werden konnte, nun nachgewiesen werden kann als einzig verbleibendes Cytosin, indem man „normale" molekularbiologische Verfahren anwendet, z.B. durch Amplifizierung und Hybridisierung oder Sequenzierung. Alle diese Verfahren beruhen auf Basenpaarung, die nun voll ausgenutzt werden kann. Ein Vergleich der Sequenzen von DNA mit oder ohne Bisulfitbehandlung ermöglicht eine leichte Identifizierung jener Basen, die methyliert wurden.
Ein Überblick über die weiteren bekannten Verfahren zum Nachweis von 5-Methylcytosin kann im folgenden Reviewartikel gewonnen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26,2255.
Was die Sensitivität anbelangt, so wird der Stand der Technik durch ein Verfahren definiert, das die zu analysierende DNA in eine Agarosematrix einschließt, um auf diese Weise die Diffusion und Renaturierung der DNA zu verhindern (Bisulfit reagiert nur mit einzelsträngiger DNA), und um alle Fällungs- und Reinigungsschritte mit einer schnellen Dialyse zu ersetzen (Olek A, Oswald J, Walter J. (1996) A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24: 5064–6). Bei Anwendung dieses Verfahrens kann man einzelne Zellen analysieren, was das Potenzial des Verfahrens zeigt.
Bis heute wird – mit wenigen Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. (1997) A single-tube PCR test fort he diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 5: 94–8) das Bisulfit-Verfahren nur in der Forschung angewandt. Immer werden jedoch spezifische Fragmente eines bekannten Gens nach einer Bisulfitbehandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. (1997) The preimplantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 3: 275–6) oder einzelne Cytosinpositionen durch Primerextensionsreaktion (Gonzalgo ML and Jones PA. (1997) Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 25: 2529–31, WO 95/00669) oder durch enzymatischen Verdau (Xiog Z, Laird PW. (1997) COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 25: 2532–4) nachgewiesen.
Ein anderes Verfahren zum Nachweis der Hypermethylierung ist die sog. methylierungsspezifische PCR (MSP)(Herman JG, Graff JR, Myohanden S, Nelkin BD and Baylin SB. (1996), Methylation specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA. 93: 9821–6). Das Verfahren beruht auf der Anwendung von Primern, die zwischen einer methylierten und nicht-methylierten Sequenz unterscheiden, wenn sie nach einer Bisulfitbehandlung besagter DNA Sequenz angewandt werden. Der Primer enthält entweder ein Guanin an der Position, die dem Cytosin entspricht, in welchem Fall er nach der Bisulfitbehandlung nur bindet, wenn die Position methyliert wurde. Oder, der Primer enthält ein Adenin an der entsprechenden Cytosinposition und bindet daher nur an die besagte DNA Sequenz nach der Bisulfitbehandlung, wenn das Cytosin unmethyliert war und demzufolge durch die Bisulfitbehandlung so verändert wurde, daß es an Adenin hybridisiert. Bei der Anwendung dieser Primer, können Amplikons ganz spezifisch hergestellt werden, entsprechend dem Methylierungsstatus eines gewissen Cytosins, und können als solche dessen Methylierungszustand anzeigen.
Ein anderes neues Verfahren besteht im Nachweis der Methylierung mittels Taqman PCR, auch bekannt als MethylLight (WO 00/70090). Mit diesem Verfahren wurde es möglich, den Methylierungsstand einzelner oder mehrerer Positionen direkt während der PCR zu bestimmen, ohne, daß die PCR Produkte in einem zusätzlichen Schritt analysiert werden müssen.
Außerdem auch beschrieben, wurde der Nachweis mittels Hybridisierung von (Olek et al., WO 99/28498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung des Bisulfitverfahrens zum Nachwies der Methylierung in einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. (1994) Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays 16: 431–6; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. (1997) Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 6: 387–95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. (1994) Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22: 695–6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. (1995) Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5'region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene 157: 261–4; WO 97/46705, WO 95/15373 and WO 97/45560.
Erhöhte Spiegel zirkulierender DNA
Eine andere charakteristische Eigenschaft von Krebs und anderer proliferativer Erkrankungen besteht in einer erhöhten Menge frei-flottierender, zirkulierender DNA im Blut und/oder Serum. Auch der Zelltod, hervorgerufen durch z.B. toxische Dosen von bakteriellem Lipopolysaccharid, HgC12, CC14, Cyclophosphamid und Hydroxyurea, löst die Freisetzung von Produkten des Chromatinkatabolismus aus, besonders von DNA in den extrazellulären Räume. Zumindest wurde von diesen gezeigt, daß sie in einem von der Dosis abhängigen Verhältnis verantwortlich sind für die Freisetzung extrazellulärer DNA in Plasma bei Mäusen. Es wurde daher vorgeschlagen, die Quantifizierung extrazellulärer DNA für die Erforschung von in vivo Zelltodphänomenen anzuwenden, die durch toxische Wirkstoff oder Wirkstoffe ausgelöst werden (Bret et al. (1990) Toxicology 61(3): 283–92).
Es ist bekannt, daß der Plasma DNA Gehalt den Grad des Zelltods spiegelt, der im ganzen Körper stattfindet und bei pathologischen Prozessen einschließlich Krebs erhöht ist. Erhöhte DNA-Gehalte im Serum wurden im Zusammenhang mit systemischer Lupus Erythematose (Leon et al. (1977) Cancer Res. 37: 646–650) festgestellt, bösartigen gastrointestinalen Erkrankungen (Shapiro et al. (1983), Cancer 51: 2116–2120), Bauchspeicheldrüsenkrebs (Anker et al. (1999), Cancer Metastasis Rev. 18: 65–73) und Lungenkrebs (Maebo A. (1990), Jap J Thoraic Dis 28: 1085–1091 and Fournié et al. (1995), Cancer Let 2: 221–227). Während gesunde Menschen frei-flottierende DNA Spiegel im Bereich von 2–30 ng/ml haben, zeigten Krebspatienten, im besonderen Patienten mit systemischer Lupus Erythematose in einer frühen Studie von 1977 Spiegel von bis zu 180 ng/ml. (Leon et al. (1977) Cancer Res. 37: 646–650). In einer Publifikation von Jahr et al. wird eine Tabelle gezeigt, die Plasma DNA Spiegel von 23 Patienten, in 12 verschiedene Tumorgruppen aufgeteilt, zeigt. Im extremsten Fall war der DNA Spiegel 100x erhöht im Vergleich zu einem mittleren Wert des DNA Spiegels bei gesunden Patienten. Sie folgerten, daß erhöhte Spiegel zirkulierender DNA ein charakteristisches Merkmal bei den meisten, aber nicht bei allen Karzinomerkrankungen zu sein scheinen. Der festgestellte Spiegel zirkulierender DNA alleine konnte nicht in Wechselbeziehung mit der Art des Krebses oder dem klinischen Zustand gebracht werden. Man muß jedoch sagen, daß in Jahrs Untersuchung lediglich 4 Wiederholungen eines jeden der Tumore durchgeführt werden (Jahr et al. (2001), Cancer Res. 61: 1659–1655).
Jahr et al. versuchte zu analysieren, wie viel dieser zirkulierenden DNA von Tumorzellen abstammte. Von Untersuchungen, die auf tumorspezifischen Mikrosatellitenveränderungen basierten, wurde berichtet, daß fast die ganze zirkulierende Plasma DNA von Tumorzellen abstammte (Goessl C. et al. (1998) Cancer Res., 58: 4728–4732). Andere Untersuchungen hingegen wiesen Wildtyp DNA im Plasma fast aller Krebspatienten nach. Um zwischen Tumor DNA und nicht-Tumor-DNA unterscheiden zu können, bestimmten sie den Methylierungsstatus der DNA in der Annahme, daß die methylierte DNA ausschließlich vom Tumorgewebe abstammte und nicht-methylierte DNA von gesunden Zellen. Es stellte sich heraus, daß, wenn die DNA-Zahl im Plasma sehr hoch war, der Prozentsatz der Methylierung ziemlich niedrig war, wohingegen, wenn der DNA-Spiegel ziemlich niedrig war, der Prozentsatz methylierter DNA bis über – zumindest in einem Fall – 90% lag. Die Autoren betonen die Tatsache, daß es schwierig sein würde, zu untersuchen, ob die unmethylierte DNA vom benachbarten Tumorgewebe abstammte oder von einer anderen Quelle „weil DNA Marker, die bestimmte Zellarten unterscheiden könnten, nicht verfügbar seien. In dieser Veröffentlichung wird Beweismaterial besprochen, das die Annahme unterstützt, daß zirkulierende DNA von apoptotischen und nekrotischen Zellen abstammt.
Obwohl der exakte Mechanismus der Freisetzung zirkulierender DNA noch zu beweisen ist, wurde auch eine aktive Freisetzung zirkulierender DNA von hochproliferativen Zellen vorgeschlagen (Anker et al. (1999), Cancer Metastasis Rev. 18: 65–73). Hierin diskutieren die Autoren, warum die Herkunft zirkulierender DNA im Blutstrom von Krebspatienten aller Wahrscheinlichkeit nach eine „aktive Freisetzung" ist und kein Zerfall zirkulierender Krebszellen, Nekrose oder Apoptose.
Botezatu et al. beschrieben, wie man extrazelluläre DNA im Urin nachweist und wie man diese DNA analysiert, um Krebs diagonstizieren zu können (Botezatu et al. (2000) Genetic analysis of DNA excreted in urine: a new approach for detecting specific genomic DNA sequences from dying cells in an organism. Clin Chem 46: 1078–1084). Anders als in vorherigen Arbeiten, die die diagnostische Anwendung von Urin zum Krebsnachweis darstellen (Mao L. (1996) Genetic alterations as colonal markers for bladder cancer detection in urine. J Cell Biochem Suppl 25: 191–196 and Eisenberger et al. (1999) Diagnosis of renal cancer by molecular urinalysis. J Natl Cancer Inst 91: 2028–2032), sind die von Botezatu et al., ausgewählten Krebsarten, nämlich die Bauchspeicheldrüse betreffende und kolorektale Karzinome, nicht urologischen Ursprungs. Frühere Arbeiten haben darauf hingewiesen, daß pankreatische und kolorektale Krebszellen (Anker et al. (1997 K-ras mutations are found in DNA extracted from the plasma of patients with colorectal cancer. Gastroenterology 112: 1114–1120) tumoröse DNA in das Plasma freisetzten können. Die neuen Erkenntnisse von Botezatu et al. gehen einen Schritt weiter, indem sie behaupten, daß Tumor-DNA nach Freisetzung in den Blutstrom, in den Urin ausgeschieden wird in Mengen, die für die PCR Analyse ausreichend sind und folglich für unsere Verfahren zur Bestimmung des Methylierungsmusters anwendbar sind.
Die Daten von Botezaatu et al. schließen nur Patienten mit relativ fortgeschrittenen Erkrankungen ein (Stadium III und IV). Die Anwendbarkeit der Urin-DNA-Analyse zum Nachweis früher, nicht urologischer, bösartiger Tumore muß noch in zukünftigen Untersuchungen bestätigt werden (Lo et al. (2000 Molecular Testing of Urine: Catching DNA on the Way Out. Clinical Chemistry 46: 1039–1040).
Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäuren
Die DNA Konzentrationen roher chromosomaler oder auf gereinigter Plasmid-DNA-Proben genau bestimmen zu können, ist ein wesentlicher Schritt bei der quantitativen Manipulation der DNA. Zwei Arten von Verfahren sind weit verbreitet bei der Messung der Menge von Nukleinsäure in einem Präparat. Wenn die Probe rein ist (d.h. ohne signifikante Mengen von Verunreinigungsstoffen wie Proteinen, Phenol, Agarose oder anderen Nukleinsäuren) ist die spektrophotometrische Messung der Menge an ultravioletter Strahlung, die von den Basen absorbiert wird, einfach und genau. Zwei unterschiedliche Verfahren stützen sich auf spektrophotometrische und/oder fluorometrische Analysen, z.B. um die Konzentration einer verdünnten Probe von Plasmid-DNA zu bestimmen, die durch zwei Durchgänge durch einen Ethidium Bromid – Cäsium Chlorid (EtBr-CsCl) Zentrifugationsgradienten gereinigt wurde. Die Probe kann entweder auf z.B. einem LKB Biochrom Ultrospec II Spectophotometer auf Absorption von Wellenlängen von 260 nm und 280 nm getestet werden, oder sie kann auf Emission von 460 mit auf dem Hoefer TKO 100 Mini-Fluorometer in Gegenwart von Bisbenzimidazol, einem fluoreszierenden Farbstoff, bekannt als Hoechst H 33258 (hergestellt durch die American Hoechst Corporation) getestet werden, der ein Anregungsmaximum bei 365 nm hat und ein Emissionsmaximum von 458, wenn gebunden an DNA (Labarca and Paigen (1980) Anal. Biochem. 102, 344–352). Der Spektrophotometer kann Absorption aufgrund von RNA als auch DNA nachweisen, während der Hoechstfarbstoff, der im Fluorometer Anwendung findet, speziell mit Adenosin- und Thymidin -Rückständen der DNA interagiert. Aufgrund der außerordentlich spezifischen Beschaffenheit des Hoechstfarbstoffes scheint der Mini-Fluorometer höchst genau bei der Quantifizierung roher chromosomaler DNA zu sein, jedoch weniger verläßlich bein Plasmide und anderer DNA mit begrenzter Komplexität.
Ist die Menge der DNA oder RNA sehr klein oder, enthält die Probe signifikante Mengen an Verunreinigung, kann die Menge an Nukleinsäure aufgrund der Fluoreszenz, die von den in die DNA interkalierten Ethidium-Bromid-Molekülen emittiert wird, geschätzt werden (Sambrook; Fritsch and Maniatis (1989) Molecular Cloning – A laboratory manual (second edition) 3: E.5). Ein einfaches Verfahren dieses allgemeinen Ansatzes ist die Anwendung von EtBr Agaroseplatten. DNA Proben von 2–10 μl werden auf 1% Agarose, das 0,5 μg/ml EtBr enthält, in einer Petrischale getupft. Danach wird die Platte UV Licht ausgesetzt und fotografiert. Eine andere Variante besteht darin, 5–10 μl von einer 0,5 μg/ml Lösung von EtBr mit 10 μl von DNA zu mischen, die auf Kunststoffverpackungsfolie oder ein silikonisiertes Diapositiv getupft wird, das sich auf einem UV Transilluminator befindet. Der Vorteil dieses Verfahrens ist, daß DNA Proben mit so wenig wie 1–10 ng an DNA innerhalb von Minuten quantifiziert werden können. Der Nachteil besteht in der Interkalierung des Farbstoffes mit RNA als auch DNA und der Beschränkung auf doppelsträngige DNA.
Andere Verfahren zur Quantifizierung von DNA sind z.B. der Invitrogen Nukleinsäure-Qualifizierungs-Dipstick (TM) Kit, von dem behauptet wird, daß er sensitiv genug ist, um so wenig wie 0,1 ng/μl an Nukleinsäure nachzuweisen. Leider kann dieses Verfahren nicht bei Proben angewandt werden, die mehr als 10 ng/μl Nukleinsäuren enthalten. (siehe: Trends in Biochemical Sciences 19, 46–47).
Verfahren zum Nachweis spezifischer DNA
Verfahren um spezifische Nukleinsäuren nachzuweisen und zu quantifizieren, werden zum Nachweis von Mikroorganismen, Viren und biologischen Molekülen angewendet. Daher werden sie in der Human- und Veterinärmedizin, in der Lebensmittelverarbeitung und Umweltuntersuchungen angewendet. Des weiteren findet der Nachweis und/oder die Quantifizierung spezifischer Biomoleküle aus biologischen Proben (z.B. Gewebe, Sputum, Urin, Blut, Samen, Speichel) Anwendung in der forensischen Wissenschaft, z.B. bei der Identifizierung und dem Ausschluß kriminell Verdächtiger, dem Vaterschaftsnachweis und der ärztlichen Diagnostik. Jedoch basiert die Mehrzahl dieser Anwendungen auf zwei Verfahren: Hybridisierung und PCR. Beide weisen nach und bestimmen einen ganz spezifischen Teil der genomischen DNA.
Hybridisierung ist bekannt als eines der Verfahren, eine Nukleinsäure mit einer bestimmten Basensequenz nachzuweisen (im folgenden „Target Nukleinsäure genannt). Dieses Verfahren wendet eine Oligonukleotidprobe an, das eine Basensequenz hat, die an die Target Nukleinsäure hybridisiert und als Nachweisprobe ein Hybrid bildet, und den Nachweis der Target Nukleinsäure dadurch führt, daß das Hybrid mittels verschiedener Nachweismittel nachgewiesen werden kann.
Im Patent US 6,228,592 werden die Nachteile dieses Verfahrens genannt, besonders, wenn versucht wird, dieses zum Nachweis einer spezifischen Sequenz in einem sie umgebenden Umfeld, wie biologisch aktive Flüssigkeit, oder in der lebenden Zelle, nachzuweisen. Wenn eine Nachweisprobe in das Cytoplasma eingeführt wird, wird sie sich 1) schnell zum Nukleus bewegen und b) die Probe oder das Hybrid zwischen der Nachweisprobe und der Target-Nukleinsäure wird schnell verdaut durch verschiedene Arten von Nukleasen, die sich im Zytoplasma befinden, was den Nachweis der Target-Nukleinsäure erschwert. Man kann dies umgehen, indem man eine Oligonukleotidprobe mit einer Basensequenz anwendet, die in der Lage ist, an die eine bestimmte Basensequenz einer Target Nukleinsäure zu hybridisieren, die an ein Kernmembran undurchlässiges Molekül mittels eines Linkers, gebunden ist, und markiert ist mit einem fluoreszierenden Farbstoff und auf diese Weise ein Hybrid zwischen der Target Nukleinsäure und der Probe bildet. Eine Veränderung der Fluoreszenz des fluoreszierenden Farbstoffs aufgrund der Bildung des Hybrids weist auf diese Weise die Existenz der Target Nukleinsäure im Zytoplasma einer lebenden Zelle oder irgend einem anderen Hintergrund nach, der mit DNAs kontaminiert wurde. Ein anderes Verfahren zum Nachweis hybridisierter Nukleinsäure macht sich die Polymerase-Kettenreaktion zu Nutze (PCR). Der PCR Vorgang ist Standard der Technik (U.S. Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,800,159). Um die PCR kurz zusammenzufassen: Nukleinsäureprimer, komplementär zu gegenüberliegenden Strängen einer Nukleinsäure-Amplifikations-Targetsequenz werden zum Abkühlen an einer denaturierten Probe gebracht. Eine DNA Polymerase (typischerweise hitzebeständig) verlängert das DNA Duplex ausgehend vom hybridisierten Primer. Der Vorgang wird wiederholt, um das Nukleinsäure-Target zu amplifizieren. Wenn die Nukleinsäure-Primer nicht an die Probe hybridisieren, dann gibt es kein entsprechendes amplifiziertes PCR Produkt. In diesem Fall fungiert der PCR Primer als Hybridisierungsprobe. Auf PCR basierende Verfahren sind von begrenztem Nutzen für den Nachweis von Nukleinsäuren mit unbekannter Sequenz.
Bei einem PCR Verfahren, kann die amplifizierte Nukleinsäure auf mehrere Weisen nachgewiesen werden, z.B. durch die Inkorporierung eines markierten Nukleotids in dem amplifizierten Strang, indem man markierter Primer verwende. Primer, die bei der PCR angewendet werden, wurden durch Radioaktivität, fluoreszierende Farbstoffe, Digoxygenin, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Akridiniumester, Biotin und Jackbean Urease, markiert. PCR Produkte, die mit unmarkierten Primern gemacht wurden, kann man auf andere Weisen nachweisen, wie z.B. elektrophorische Gel-Separierung, gefolgt von Visualisierung, die auf Farbstoffen beruht.
Fluoreszenzverfahren sind auch bekannt für den Nachweis von Nukleinsäurehybriden. U.S. Pat. No. 5,691,146 beschreibt fluoreszierende Hybridisierungsproben die mit Fluoreszenz gequenched werden bis sie an die Target-Nukleinsäuresequenz hybridisiert sind, oder bis die Probe verdaut wurde. Solche Verfahren bieten Information über Hybridisierung und sind von unterschiedlich großem Nutzen für die Bestimmung von Veränderungen von Einzelbasen in Sequenzen. Einige Fluoreszenzverfahren umfassen den Verdau eines Nukleinsäurehybrids in einer 5'-3'-Richtung, um ein Fluoreszenzsignal aus der Umgebung eines Fluoreszenzquenchers freizugeben, z.B. TaqMan. RTM. (Perkin Elmer; U.S. Pat. Nos. 5,691,146 und 5,876,930).
Echt-Zeit PCR-Monitoring unter Anwendung von Fluoreszenz wurde auf verschiedene Arten beschrieben. Erstens, erlaubt die Bindung doppelsträngiger DNA spezifischer Fluoreszenzfarbstoffe, wie z.B. Ethidiumbromid die Kontrolle der Akkumulation von PCR-Produkt durch die Zuordnung erhöhter Fluoreszenz. Ein zweites Nachweisverfahren, der Polymerase-abhängige Exonuklease-Verdau wendet die 5'-Exonuklease-Aktivität von Polymerasen wie z.B. Taq an. Eine Oligonukleotidprobe die komplementär zum PCR-Produkt ist, jedoch verschieden vom PCR-Primer ist, wird mit einem FRET-Paar markiert, so daß das Donatormolekül durch ein Akzeptormolekül gequenched wird. Während der PCR-Amplifikation schickt sich die 5'-Exonuklease an, die Probe zu verdauen, indem sie das FRET-Paar separiert was zu erhöhter Fluoreszenz führt. Eine Variation dieser Technologie nutzt eine Nukleinsäure, in der das FRET-Paar intern gequenched wird, z.B. indem es ein Hairpin-Struktur hat. Bei der Hybridisierung an eine Sequenz von Interesse, wird das FRET-Paar separiert und das Donatormolekül emittiert Fluoreszenz. Diese Technologie kann z.B. für die Analyse von SNPs angewendet werden.
Eine alternative Technologie stützt sich auf die Anwendung von zwei Arten von Hybridisierungsproben, jede davon markiert mit einem Teil des FRET-Paars. Bei der Hybridisierung von beiden Proben an die Target-Sequenz in hinreichender Nähe zueinander, wird ein Fluoreszenzsignal emittiert. Diese Technologie kann wiederum zum Nachweis von SNPs angewendet werden.
Ein wesentlicher Vorteil der Anwendung solcher auf FRET basierender PCR Technologien ist, daß die Reaktion in einem geschlossenen Gefäß überwacht werden kann, die auch geeignet ist für Anwendungen mit hoher oder mittlerer Durchlaufleistung und die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination verrringert wird.
Verfahren zur Extraktion und zum Nachweis von DNA in Körperflüssigkeiten
Verfahren zum Nachweis zirkulierender DNA werden in einer Reihe von Artikeln beschrieben. In der Mehrheit der Fälle zur Separierung der DNA von biologischen Proben verlassen sich die Wissenschaftler auf ein Kit, der von Qiagen geliefert wird und QIAamp Blut Kit heißt (Qiagen, Hilden, Germany):
Z.B. bei Jahr et al. (2001), Cancer Res 61: 1659–1655: „Nach erfolgreicher Separation des Plasmas von den Blutzellen mittels Zentrifugation bei 3000 g für 20 min kann die DNA mittels QIAamp Blut Kit (Qiagen, Hilden, Germany) aus dem Plasma extrahiert warden, unter Verwendung des Blut und Körperflüssigkeiten Protokoll von Wong et al. (1999), Cancer Res 59: 71–73 and Lo et al. (1998) Am. J. Genet. 62: 768–775."
Wong et al. (1999), Cancer Res 59: 71–173: "Blutproben warden bei 3000 g zentrifugiert und das Plasma und Serum wird aus dem EDTA-Röhrchen entfernt und in Polypropylenröhrchen überführt (Chen at al. (1996). Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients. Nat Med 2: 1033–1035)."
Chen et al.: "Frisches gefrorenes Gewebe wurde mit SDS behandelt, wohnach Proteinase-K und Phenol-Chloroform-Extraktion folgte. In paraffin eingelegtes Gewebe wurde von den Objektträgern gekrazt und in Xylol gewaschen, um das Paraffin zu entfernen. Nach der Zugabe von einem Volumen Ethanol wurde das Gemisch zentrifugiert und als Pellet mit Proteinase-K und SDS verdaut, worauf Phenol-Chloroform-Extraktion folgten. Kontrolllymphozyten und Plasma-DNA wurden mittels Qiagen-Säulen (Qiamp Blood Kit, Basel, Schweiz) nach dem "Blut und Körperflüssigkeit Protokoll" gereinigt. Plasma (1–3 ml) wurde auf die Säule übertragen. Nach der Reinigung ergibt 1 ml von Plasma durchschnittlich 39 ng von DNA.
Die Mengen von Plasma DNA können durch kompetitive PCR bestimmt werden gemäß dem Verfahren von Diviacco et al. (1992) Gene 122: 313–320, indem man z.B. den Lamin B2 Locus als ein typisches Beispiel für ein Einzel-Kopie Gen verwendet. Das Kompetitormolekül, das ein 20-bp Insert trägt, wurde direkt von zwei Amplifikationsprodukten, durch das „Overlap extension"-Verfahren gewonnen (Diviacco et al. (1992) Gen 122: 313–320).
Eine Quantifizierung kompetitiver Templates kann durch OD260 Messung erreicht werden. Eine festgelegte Menge von Plasma DNA kann mit zunehmenden Mengen des Kompetitortemplates gemischt werden. Für die kompetitive PCR, müssen zwei zusätzliche Primer konstruiert werden. Nach der PCR Amplifizierung und PAGE entsprechen offensichtlich zwei Produkte dem genomischen und Kompetitor-Templates. Die Verhältnisse der amplifizierten Produkte spiegeln genau die ursprüngliche Konzentrierung der genomischen DNA gegenüber der des hinzugefügten Kompetitors. Eine Quantifizierung von Kompetitor- und genomischen Banden kann durch das densitometrisches Scanning des Ethidiumbromid-gefärbten Gels erreicht werden.
Die Ergebnisse mittels kompetitiver PCR können durch Quantifizierung mit der Kontroll Kit DNA in einem LightCycler System (Roche Diagnostics) erhalten werden, indem man die LightCycler Kontrol Kit DNA anwendet, um ein 110 bp Fragment des menschlichen Beta-Globin Gens zu amplifizieren. Das Amplikon kann durch Fluoreszenz nachgewiesen werden, indem man ein spezifisches Paar von Hybridisierungsproben (LC-Red 640) anwendet.
Ein ähnlicher Ansatz wurde von Lee et al. benutzt, um genomische DNA von Serum und Plasmaproben-DNA zu quantifizieren, indem Reagenzien eines HIV Assay Kits (HIV Monitor Assay, Roche Molecular Systems, Emryville, CA) verwendet wurden. Unmittelbar nach dem Auftauen, wurden Plasma- und Serumproben mit höhere Drehzahl 5 Minuten lang in der Mikrozentrifuge zentrifugiert, um sauberes Plasma oder Serum, freie Aggregate und unspezifische Präzipitate (Fällungsprodukte) herzustellen. Plasma und/oder Serum (100 μl) wurde entnommen und in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen deponiert, das 300 μl eines funktionierenden Lysereagenz enthielt. Das Röhrchen wurde dann kräftig 3–5 Sekunden lang geschüttelt und 10–15 Minuten lang bei Zimmertemperatur in den Inkubator gegeben. Nach der Wärmebehandlung, wurden in jedes Röhrchen 400 μl von 100%igem Isopropanol hinzugegeben, das dann 3–5 Sekunden geschüttelt und bei 10.000 g (12.000 rpm Microfuge II, Beckman Instruments) 15–30 Minuten lang bei Zimmertemperatur in der Mikrozentrifuge zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde entfernt und 1 ml 70%-iger Ethanol wurde in jedes Röhrchen hinzugegeben; diesem Schritt folgte Zentrifugation in der Mikrozentrifuge bei 10.000 g für 5–10 Minuten bei Zimmertemperatur. Der Überstand wurde entfernt und dann wurden die DNA Pellets übernacht bei Zimmertemperatur belassen, um etwa zurückgebliebenes Ethanol zu evaporisieren. Das Pellet wurde in 100 μl einer PCR-Lösung A (100 mM KCl, 10 mM Tris, 2.5 mM MgCl₂; pH 8.3) und PCR-Lösung B (10 mM Tris, 2.5 mM MgCl2, 1% Tween-20, 1% Nonidet P-40; pH 8.3) resuspendiert.
Gereinigte DNA wurde mit HLA DQ-alpha Primern oder menschlichen Y-Chromosomen-Primern amplifiziert. Standardkurven wurden vorbereitet und für die Quantifizierung in jede Amplifizierung eingeschlossen (Lee et al. (2001) Transfusion 41: 276–282).
Im Patent US 6156504 (Gocke et al.), das sich auch bezieht auf den Nachweis von Tumorassoziierten, extrazellulären Nukleinsäuren in Plasma oder Serumfraktionen, wird ein Überblick über mehrere Verfahren gegeben, wie man zirkulierende DNA aus Blut- oder Serumproben extrahieren und darin nachweisen kann.
Um die DNA Konzentration in einer Urinprobe bestimmen zu können, müssen die Proben frisch sein, da der menschliche Urin eine Nukleaseaktivität enthält (Botezatu et al. 2000). Die frischen Proben werden 10 Min. bei 800 g zentrifugiert und DNA aus dem Überstand isoliert, wie von Labarca und Paigen (Labarca and Paigen (1980) Anal Biochem 102: 344–352) beschrieben.
Zusammenfassend, so besteht der Stand der Technik darin, mehr und mehr auf Nukleinsäure aufgebaute Untersuchungen zu entwickeln, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von auf Tumor hinweisendem Protein oder cDNA von tumorspezifischen Genen, den sog. Markergenen im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten, nachweisen zu können. Der Nachweis krebsspezifischer Veränderungen von Genen, die an der Entstehung von Karzinomen beteiligt sind, wie onkogene Mutationen oder Deletionen, Tumor-Suppressor-Gen oder -Deletionen, oder Mikrosatellitveränderungen, werden dann eine Vorhersage ermöglichen, ob der Patient Krebs in sich trägt oder nicht (z.B. Patent WO 95/16792 or US 5,952,170 (Stroun et al.)). In einem fortgeschrittenem Stadium, wird es das Ziel sein, ein Kit herzustellen, der es dem Wissenschaftler erlaubt, eine große Zahl von Proben in kurzer Zeit mit hoher Genauigkeit im Screeningverfahren zu untersuchen. Diese Kits werden nicht nur für eine verbesserte Präventivmedizin und die Früherkennung von Krebs interessant sein, sondern auch um das Verhalten des Tumors nach der Therapie zu kontrollieren.
Ebenso wurde der Nachweis der Hypermethylierung gewisser Gene, insbesondere gewisser Promotorenregionen als ein wichtiger Indikator für die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Tumors erkannt. Nach unserem Wissen hatten alle Untersuchungen, die sich mit Methylierungsanalyse befaßten bisher nur den Methylierungsstatus gewisser Markergene im Auge. Von diesen Genen weiß man, daß sie eine Rolle in der Regulierung der Karzinomentstehung spielen, oder mit anderen Worten, man glaubt mit ihnen das Anschalten und das Abschalten der Tumorentstehung bestimmen zu können. Am weitesten fortgeschritten ist das Wissen über Methylierung und Prostatakrebs. Daher wurde das Verfahren, das den Methylierungszustand eines gewissen Markergens (GSTP1), das auf Prostatakrebs hinweist, unter Nutzung von Körperflüssigkeiten, patentrechtlich geschützt ( US 5,552,277 ). Die Bestimmung des Methylierungszustandes gewisser, noch zu identifizierender Indikatorengene könnte sogar ein nützliches Instrument werden, um die Ansprechempfindlichkeit eines Patienten bei Chemotherapie und Radiotherapie (Hanna et al. (2001) Cancer Res 61: 2376–2380) vorherzusagen. Auf der anderen Seite sind alle diese Ansätze der Screening-Ansätze eingeschränkt auf gewisse Krebsarten, und zwar deshalb, weil sie alle darauf beschränkt sind, nach gewissen Markergenen, die ganz spezifisch für eine Art von Krebs sind, zu suchen. Die Erfindung, die in Patent US 6,156,504 (Gocke et al.) beschrieben ist, bezieht sich ebenfalls auf den Nachweis von extrazellulären Nukleinsäuren im Plasma oder in Serumfraktionen, jedoch behandelt das Patent nur das Verfahren, mutierte extrazelluläre K-ras Nukleinsäure im Blut nachzuweisen. Dies ist ein weiteres Beispiel für die Abhängigkeit der meisten Untersuchungen von spezifischen Markergenen, in diesem Fall vom Tumorgen K-ras. Für eine Reihe von Krebsarten sind jedoch diese Gene noch gar nicht bekannt. Auch würde bei einem frühen Screening, wenn noch kein Grund besteht, anzunehmen, daß der Patient an einer spezifischen Krebsart leidet, ein Screening erforderlich sein, das jede mögliche Genveränderung, die bislang bekannt ist, untersucht. Man kann dies als nicht machbar bezeichnen.
Auf der anderen Seite führen zellproliferative Erkrankungen dazu, daß der extrazelluläre DNA Spiegel im Blut oder in anderen Körperflüssigkeiten ansteigt. Unseres Wissens nach wurde die Quantifizierung extrazellulärer DNA beim Menschen noch nie benutzt, um das Risiko vorherzusagen, daß der Patient in sich eine zellproliferative Erkrankung trägt wie z.B. Krebs. Einige Berichte wurden publiziert, in denen erhöhte Spiegel zirkulierender DNA im Blut von Krebspatienten erwähnt sind, diese wurden jedoch nur als eine Quelle für leichter zu isolierende DNA genutzt, um deren Eigenschaften weiter zu analysieren (Jahr et al. 2001). Es ist auch bekannt, daß diese DNA Moleküle aus den Geweben stammen, in denen Zellen sterben, was immer hierfür der Grund sein mag (wie oben behandelt). Dennoch besteht bis jetzt ein Mangel an Know-how, um den Ursprung der DNAs bestimmen zu können und es war daher nicht möglich, das allgemeine Ergebnis von erhöhten DNA Spiegeln in Körperflüssigkeiten wie Blut in Verbindung mit einer zellproferativen Erkrankung in einem bestimmten Organ zu bringen. Dieser Mangel ist der Nichtverfügbarkeit gewebespezifischer Marker (Jahr et al. 2001) zuzuschreiben, die die Bestimmung der Herkunft der DNAs ermöglichen würden. Dies ist genau die Lücke, die unsere Erfindung schließen kann.
Kurz ausgedrückt, wäre das erste Ergebnis einer Analyse einer Körperflüssigkeit durch ein Screening eine Information über den zirkulierenden DNA Spiegel. In Fällen, wo dieser über das normale hinaus erhöht ist (Durchschnitt gesunder Menschen), was bislang per se noch nicht als ein signifikanter Risikofaktor angesehen wurde, würde dies nun zu einer weiteren Analyse hinsichtlich Analyse der Methylierung führen. Ohne raten zu müssen, welche Art von Krebs verantwortlich sein könnte für die Emission jener DNA Spiegel und ohne Versuche hinsichtlich gewisser Markergene durchführen zu müssen, kann mit unserer Erfindung die Herkunft der DNAs offengelegt werden. Dies beruht auf der Entdeckung gewebespezifischer Methylierungsmuster. Mit ihnen sind wir in der Lage, ein gewisses Methylierungsmuster als zu einer bestimmten Gewebeart gehörig zu interpretieren.
Es ist daher Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das a) ein Vorhersage ermöglicht, daß der Patient möglicherweise an einer zellproliferativen Erkranken leiden wird, indem der Spiegel an frei-flottierender, zirkulierender DNA in seinem Blut oder anderer Körperflüssigkeit bestimmt wird, und b) eine Vorhersage ermöglicht, welches Gewebe die DNA freisetzt und daher möglicherweise die Krankheit in sich trägt.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines Krankheitszustandes wie Krebs oder eine andere zellproliferative Erkrankung zu bestimmen. Das Verfahren verwendet mehrere Schritte, beginnend mit der Beschaffung einer Probe einer Person in Form einer Gewebeprobe oder einer biologischen Flüssigkeit wie Blut, Serum, Urin oder anderer Flüssigkeiten wie unten definiert und endend mit der schlußfolgernden Interpretation der Daten einer Methylierungsmuster Analyse von DNA, die aus besagter Probe gewonnen wurde und Information gibt über die Wahrscheinlichkeit, daß die Person an besagter Erkrankung leidet. Das Verfahren beruht auf der Quantifizierung frei-flottierender DNA in besagter biologischer Flüssigkeit und der folgenden Bestimmung von deren Methylierungszustand. Die Bestimmung von letzterem ermöglicht eine Entscheidung darüber, woher (von welchem Organ) die potentiell erhöhten Spiegel der DNA abstammen. Dies ermöglicht die Vorhersage, ob das Individuum eine zellproliferative Erkrankung, z.B. Krebs, in besagtem Organ trägt. Um die Gültigkeit nachzuprüfen, könnte der nächste Schritt z.B. sein, einen maßgeschneiderten Test-Assay einzusetzen, der die Markergenexpression, die spezifisch für besagtes Organ oder Gewebe ist, anzeigt.
Das Konzept, die quantitative Analyse der DNA in einer biologischen Probe wie Blut zu kombinieren mit einer nachfolgenden Analyse deren Methylierungszustandes, um ihre Herkunft vorherzusagen, ist neu und führt zu neuen Möglichkeiten große Populationen nach frühen Anzeichen von z.B. Krebs rastermäßig zu untersuchen, noch vor einem klinischen Stadium, dann, wenn keine anderen Symptome erkennbar sind. Da der Frühnachweis der wichtigste Schritt in der Bekämpfung einer Erkrankung wie Krebs ist, bietet diese Verfahren eine bedeutende Verbesserung hinsichtlich einer erfolgreichen Bekämpfung jener Krankheiten. Des weiteren kann das Verfahren eingesetzt werden, die Progression des Tumors nach Behandlung zu kontrollieren und erlaubt dadurch, die Dosierung besagter Behandlung zu optimieren oder anzupassen an eine andere Behandlung in patientenspezifischer, individueller Art.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
„Körperflüssigkeit"' bezieht sich hierin auf eine Mischung von Makromolekülen, die von einem Organismus erhalten werden. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Blut, Blutplasma, Blutserum, Urin, Sputum, Ejakulat, Samen, Tränen, Schweiß, Speichel, Lymphflüssigkeit, bronchiale Lavage, pleurale Effusion, peritoneale Flüssigkeit, meningale Flüssigkeit, amniotische Flüssigkeit, glanduläre Flüssigkeit, feine Nadelspirate, Brustwarzenaustrittsflüssigkeit, Spinalflüssigkeit, Konjunktivalflüssigkeit, Vaginalflüssigkeit, duodenale Säfte, pankreatische Säfte, Gallenflüssigkeit und zerebrospinale Flüssigkeit. Dies schließt auch experimentell separierte Fraktionen aller vorhergehenden ein. „Körperflüssigkeiten" schließen auch Lösungen oder Mischungen ein, die homogenisierte, feste Stoffe enthalten wie Fäkalien.
Ein „methylspezifischer Wirkstoff" bezieht sich hierin auf jegliche Chemikalie oder jegliches Enzym, das mit Nukleinsäuren interagiert oder derart reagiert, daß zwischen methylierter und unmethylierter Nukleobase differenziert werden kann. Indem sie spezifisch agiert auf entweder die eine oder die andere, oder interagiert mit beiden auf unterschiedliche Weise, wird es einfacher sein, durch Verfahren, die heute verfügbar sind, zwischen diesen Nukleobasen zu unterscheiden, als es vor der Interaktion besagter „methylspezifischer Wirkstoffe" war. Beispiele für die Behandlung mit „methylspezifischen Wirkstoffen" ist die sog. Bisulfitbehandlung oder die Behandlung mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen.
Der Ausdruck „Bisulfitbehandlung" bezieht sich auf ein Verfahren, das dem Fachmann im allgemeinen bekannt ist. Beispiele für die Behandlung finden sich z.B. in einigen der hierin zitierten Referenzen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, ist der Ausdruck „Hybridisierung" zu verstehen als eine Bindung eines Oligonukleotids an eine vollkommen komplementäre Sequenz, analog der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben-DNA, die eine Duplexstruktur bildet.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, das Vorhandensein oder die Abwesenheit und die Überwachung einer Erkrankung eines Individuums, wobei die Erkrankung dadurch gekennzeichnet ist, daß sie erhöhte Spiegel freier, nicht zellgebundener DNA in einer Körperflüssigkeit aufweist, wie oben definiert. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist diese Erkrankung eine zellproliferative oder neoplastische Erkrankung. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist diese Erkrankung eine Art von Krebs.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Analyse zirkulierender Nukleinsäuren. Sie offenbart eine Möglichkeit offen, zwischen gesunden (oder erkrankten) Geweben aus verschiedenen Quellen im menschlichen Körper zu unterscheiden. Es wird offenbart, daß typische Methylierungsmuster gewisser Gene positiv mit gewissen Organen oder Geweben korreliert werden können. Dies ermöglicht die Identifizierung der Herkunft der frei-flottierenden DNA, oder in anderen Worten, die Bestimmung der organischen Quelle dieser zirkulierenden Nukleinsäuren. Dies wird durch einen Versuch erreicht, der die Methylierung an spezifischen CpG-Stellen durch Restriktionsenzym-Analyse nachweist, oder durch ein Verfahren, das auf Nukleinsäuren basiert.
Die Erfindung stellt hiermit eine Möglichkeit zur verbesserter Diagnose, Prognose, Stadiumfeststellung und Schweregradbestimmung von Krebs auf molekularer Ebene bereit, indem sie die Fähigkeit anwendet, zwischen Herkunftsquellen frei-flottierenden DNA in Körperflüssigkeiten differenzieren zu können. Auch wird dieses neue Instrument, den eigentlichen Grund für eine Zunahme der Nukelinsäuren im Blut oder Serum z.B: entdecken helfen.
Des weiteren bietet die offenbarte Erfindung Verbesserungen gegenüber dem Stand der Technik, da die derzeitigen Verfahren der Methylierungsanalyse auf histologischen oder zytologischen Analysen aufgebaut sind, die eine Biopsie erfordern, um ausreichende Menge an Gewebe zur Verfügung zu haben. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann zur Klassifizierung leicht zugänglicher Proben wie Körperflüssigkeiten angewandt werden, die keine Biopsie erfordern.
Die Erfindung stellt des weiteren eine Verfahren zum Nachweis der organischen Herkunftsquelle von Nukleinsäuren bereit und ist gekennzeichnet dadurch, daß gewisse Gene mit einem Reagenz oder einer Serie von Reagenzien in Kontakt gebracht werden, die zwischen methylierten und nicht-methylierten Dinukleotiden innerhalb einer gegebenen Target-Sequenz unterscheiden können.
Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren ein Verfahren zur Bestimmung genetischer und/oder epigenetischer Parameter genomischer DNA zur Verfügung.
In einer bevorzugten Ausführungsform, umfaßt das Verfahren folgende Schritte, die mit Bezug auf 1 beschrieben sind und ein Ablaufdiagramm des bevorzugten Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung zeigt:
Im ersten Schritt des Verfahrens, wird eine Probe von einem Patienten oder Individuum in Form besagter Körperflüssigkeiten (wie oben definiert) beschafft. Die Beschaffung der besagten Probe kann auf jede dem Fachmann bekannte Weise geschehen. Eine detaillierte Beschreibung kann in relevanten technischen Artikeln und Fachbüchern, die die Technik beschreiben, gefunden werden. Diese beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Ventrikulärpunktion, auch bekannt als Sammeln von Gehirnrückenmarksflüssigkeits, ein Verfahren zum Erhalt einer Probe von (CSF) Gehirnrückenmarksflüssigkeit; Thorazentese, die sich auf die Insertion einer Nadel zwischen den Rippen in die Brusthöhle unter Anwendung einer Lokalanästhesie bezieht, um die pleurale Effusionsflüssigkeit zu erhalten; Amniozentese, die sich auf ein Verfahren bezieht, das angewendet wird, indem man eine hohle Nadel durch die Abdominalwand in den Uterus inseriert, um eine kleine Menge an Flüssigkeit aus dem Beutel, der den Foetus umgibt; zu ziehen, aber auch zum Sammeln von Urin, Sperma und Sputum.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Proben von allen oben in der Definition genannten Körperflüssigkeiten erhalten In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Proben aus Gesamtblut, Blutserum, Urin, Speichel oder Ejakulat des besagten Individuums gewonnen.
In einem zweiten Schritt werden die extrazellulären Nukleinsäuren der Körperflüssigkeit quantifiziert. Zu diesem Zweck können die frei-flottierenden Nukleinsäuren aus der RNA, wenn notwendig, extrahiert und/oder separiert werden. Jedoch sind die folgenden Schritte auch möglich, ohne irgendeine der vorgenannten Behandlungen durchzuführen. Auch kann die DNA vor der Quantifizierung gereinigt oder anderweitig aufbereitet und präpariert werden. Reinigung kann z.B. an Qiagen Säulen durchgeführt werden, die in dem Qiamp Blut Kit angeboten werden, wie beschrieben in Chen et al. (1996) (Nature medicine 2, 1033–1035). Die Quantifizierung kann entweder sofort nach der Beschaffung der Probe oder nach einer nicht spezifizierten Lagerungszeit der besagten Probe erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die frei-flottierende DNA von der zellgebundenen DNA mittels Zentrifugation separiert, entweder nachdem die Menge der gesamten DNA in besagter Probe (inklusive der zellgebundenen) bestimmt wurde, oder ohne überhaupt die zellgebundene DNA zu bestimmen.
Jedes Verfahren, das in Schritt 2 erwähnt wurde, kann auch eine für den Fachmann standardisierte Verfahrensweise geschehen, diese schließen die Anwendung von Detergenzien zur Lyse, Sonifikation und Vortexen mit Glaskugeln ein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Probe auch aufbereitet mittels Präservierung, wie Erhitzen oder Hinzufügen von Chemikalien, um Deoxyribonukleasen oder andere Nukleinsäure abbauende Enzyme zu deaktivieren oder inhibieren; Aufbewahrung bei erniedrigten (unter Raum-temperatur) oder nicht erniedrigte Temperaturen; Kühlen; Erhitzen; Zugabe von Detergenzien; Filtern und/oder Zentrifugieren. Z.B. kann die Probe mit Proteinase K (von Boehringer Mannheim) behandelt werden und Sodium Dodecyl Sulfat bei 48°C übernacht, bevor die DNA aus den Serumproben isoliert wird, wie beschrieben von Eisenberger et al. (1999) (J Natl Cancer Inst 91: 2028–2032).
Auch die Aufbereitung umfaßt in diesem Zusammenhang die Anwendung von Verfahren zur Konzentrierung der DNA in besagter Probe. Diese Verfahren können entweder ein oder mehrere der Verfahren der Beschreibung vom Stand der Technik sein und können auch für den Fachmann standardisierte Verfahrensweise sein. Einige davon sind im Anhang E des gut bekannten Labor Manuals Sambrook, Fritsch and Maniatis (1989) Molecular Cloning – A Laboratory Manual (second edition): Precipitation of DNA in microfuge tubes, precipitation of RNA with ethanol, concentrating nucleic acids by extraction with butanol (vol 2: E.12, E.15 and E.16 respectively) detailliert beschrieben.
In bevorzugten Ausführungsformen kann Aufbereitung auch jegliche Art von chemischer Behandlung bedeuten, wie Hinzufügen eines Anti-Koagulaten, Behandlung mit reduzierenden Agenzien, Behandlung mit interkalierenden Chemikalien oder Chemikalien, die kovalente Bindungen mit der DNA aufbauen.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA vor der chemischen Behandlung gespalten werden, dies kann mittels in der Technik standardisierter Verfahrensweisen geschehen, insbesondere mit Restriktionsendonukleasen.
Die Quantifizierung kann ebenso auf für den Fachmann standardisierte Weise geschehen. Für gewöhnlich angewandte Methoden basieren auf spektrophotometrischen und/oder fluorometrischen Analysen, z.B.: Die Konzentration einer verdünnten Probe von Plasmid DNA, gereinigt durch zwei Durchgänge durch einen Ethidium Bromid – Cäsium Chlorid (EtBr-CsCl) Zentrifugierungsgradienten, kann entweder auf einem LKB Biochrom Ultrospec II Spektrophotometer bei Wellenlängen von 260 nm und 280 nm auf Absorption untersucht werden, oder sie kann auf Emission von 460 nm auf dem Hoefer TKO 100 Mini-Fluorometer in Anwesenheit von Bisbenzimidizol, einem fluoreszierenden Farbstoff, der als Hoechst H 33258 bekannt ist (hergestellt von der American Hoechst Corporation), der ein Exzitationsmaximum bei 356 nm und ein Emissionsmaximum von 458 hat, wenn er an DNA gebunden wird (Labarca and Paigen (1980) Anal. Biochem. 102, 344–352), geprüft werden. Der Spektophotometer weist Absorption aufgrund von RNA aber auch DNA nach, während der Hoechst Farbstoff, der im Fluorometer angewendet wird, besonders mit Adenosin- und Thymidinrückständen von DNA interagiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Invitrogen Nukleinsäure DNA Quantifizierungs-^TM Meßstab Kit angewendet, von dem behauptet wird, daß es so sensitiv ist, weniger als 0,1 ng/μl Nukleinsäure nachweisen zu können. Leider kann das Verfahren nicht angewandt werden bei Proben, die mehr als 10 ng/μl an Nukleinsäure enthalten (Trends in Biochemical Sciences 19, 46–47).
Die Gesamtmenge an frei-flottierender DNA kann z.B. durch Interkalierung von fluoreszierenden Farbstoffen oder anderen Farbstoffen gemessen werden, die ihre Fluoreszenzeigenschaften beim Abbinden an die DNA verändern, und auch durch Hybridisierung an DNA spezifische Proben, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Oligonukleotide oder PNA (Peptidnukleinsäure) Oligomere, Echt-Zeit PCR Assays oder andere Echt-Zeit Amplifikationsverfahren, UV-Vis Absorption oder im allgemeinen Amplifikationsverfahren mit darauf folgender Bestimmung der Menge des gewonnen Produkts.
In einem dritten Schritt, wird das Methylierungsmuster der frei-flottierenden DNA bestimmt, um festzustellen, wo die Hauptmenge der DNA herkommt.
Um dies zu tun, wird die Nukleinsäureprobe zuerst mit einem „methylspezifischen Wirkstoff" behandelt wie, aber nicht beschränkt auf, Bisulfit oder mit z.B. methylierungssensitiven Restriktionsenzymen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die extrazellulären Nukleinsäuren chemisch so behandelt, daß Cytosinbasen, die unmethyliert sind, auf der 5'-Position umgesetzt werden zu Uracil, Thymin oder einer anderen Base, die, bezüglich ihres Hybridisierungsverhalten, Cytosin unähnlich ist. Dies wird verstanden als Behandlung mit einem „methylspezifischen Wirkstoff". Besagte chemische Umsetzung kann in jeder Aufbereitung, die in der Anwendung Standard ist, stattfinden. Diese schließen Veränderungen im Agarose Gel oder in den Denaturierungslösungen ein, sind jedoch nicht auf sie beschränkt. Die Nukleinsäure kann, muß aber nicht, konzentriert und/oder anderweitig aufbereitet sein, bevor die besagte Nukleinsäureprobe mit dem Wirkstoff behandelt wird. In diesem dritten Schritt des Verfahrens wird es vorgezogen, daß die oben beschriebene Behandlung der extrazellulären Nukleinsäuren mit Bisulfit (Sufit, Disulfit) und darauf folgender alkalischer Hydrolyse durchgeführt wird, was zu einer Umsetzung der nichtmethylierten Cytosin Nukleobasen zu Uracil oder einer anderen Base führt, die hinsichtlich ihres Basenpaarungsverhaltens Cytosin unähnlich ist.
Die doppelsträngige DNA ist vorzugsweise denaturiert. Dies kann in Form einer Hitzedenaturierung sein, die bei variablen Temperaturen durchgeführt wird. Die Denaturierungstemperatur hängt im allgemeinen vom Puffer ab, aber bei hochmolekularer DNA, kann sie bis zu 90°C betragen. Die Analyse kann jedoch an kleineren Fragmenten durchgeführt werden, die keine so hohe Temperaturen erforderlich machen. Des weiteren läßt, in dem Maße, wie die Reaktion voranschreitet und die Cytosinrückstände zu Uracil umgesetzt werden, die Komplementarität zwischen den Strängen nach. Ein zyklisches Reaktionsprotokoll kann deshalb aus variablen Denaturierungstemperaturen bestehen. Die Bisulfitumsetzung besteht dann aus zwei wichtigen Schritten, die Sulfonierung des Cytosins und die darauf folgende Deaminierung. Die Gleichgewichte der Reaktion sind auf der richtigen Seite bei zwei unterschiedlichen Temperaturen für jede Arbeitsstufe der Reaktion. Die Temperaturen und die Länge mit der jede Arbeitsstufe ausgeführt wird, können gemäß der spezifischen Anforderung der Situation variiert werden. Eine bevorzugte Variante des Verfahrens umfaßt jedoch eine Änderung der Temperatur von 4°C (10 Minuten) bis 50°C (20 Minuten). Diese Form der Bisulfitbehandlung ist Stand der Technik unter Bezugnahme auf WO 99/284498.
Besagte chemische Umsetzung kann in jedem Format stattfinden, welches Standard in der Technik ist. Diese schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf Modifikation im Agarosegel, in den denaturierenden Lösungsmitteln oder in den Kapillaren.
In bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die Bisulfitumsetzung im Agarose Gel wie beschrieben von Olek et al, Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064–5066. Das DNA Fragment wird in Agarose Gel gebettet und die Umsetzung von Cytosin zu Uracil findet mit Hydrogensulfit und einem Radikalfänger statt. Die DNA kann dann ohne Notwendigkeit weiterer Reinigungsschritte amplifiziert werden.
Des weiteren werden die Veränderungen in besagter Nukleinsäure, die durch besagte Behandlung verursacht werden, nachgewiesen durch die Anwendung der unten beschrieben Standardverfahren.
Für eine Reihe von gesunden Organen und Geweben wurden gewisse CpG Stellen identifiziert und werden in dieser Erfindung offengelegt, die speziell methyliert sind. Aus dem Pool unterschiedlicher Nukleinsäuren, die in den Körperflüssigkeiten zirkulieren, werden diese Mutationsorte nach ihrem Methylierungzustand untersucht. Dies wird, wie unten beschrieben, getan: Fragmente der chemisch vorbehandelten DNA werden amplifiziert, indem man Sets von Primer Oligonukleotiden und eine vorzugsweise Hitzestabile Polymerase anwendet. Aus statistischen und praktischen Erfahrungen werden vorzugsweise mehr als zehn verschiedene Fragmente mit einer Länge von 100–2000 Basenpaaren amplifiziert. Die Amplifizierung mehrer DNA-Fragmente kann gleichzeitig in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Für gewöhnlich wird die Amplifikation mittels einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) durchgeführt.
Das Verfahren kann auch durch die Anwendung alternativer Primer ermöglicht werden, der Aufbau der Primer ist dem Fachmann klar. Diese sollten mindestens zwei Oligonukleotide einschließen, deren Sequenzen jeweils reverser-komplementär oder identisch mit mindestens einem 18 Basenpaaren langem Segment von Basensequenzen sind. Besagte Primer Oligonukleotide sind vorzugsweise gekennzeichnet dadurch, daß sie keine CpG Dinukleotide enthalten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens, ist die Sequenz besagter Primeroligonukleotide so aufgebaut, daß sie nur selektiv an die gewebespezifische DNA von Interesse annealen und amplifizieren und dadurch die Amplifikation von Background oder nicht relevanter DNA minimieren. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung versteht man unter Background DNA, genomische DNA, die kein relevantes gewebespezifisches Methylierungsmuster aufweist, in diesem Fall ist das relevante Gewebe ein Gewebe von vielen, für das Markergene gefunden wurden, sowohl gesundem als auch krankem.
Gemäß vorliegender Erfindung, wird bevorzugt, daß wenigstens ein Primer Oligonukleotid während der Amplifikation an eine feste Phase gebunden ist. Die verschiedenen Oligonukleotidsequenzen können angeordnet werden auf einer ebenen festen Phase in der Form eines rechteckigen oder sechseckigen Gitters, wobei die feste Phasenoberfläche bevorzugterweise aus Silikon, Glass, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold, besteht, es aber möglich ist, daß auch andere Materialien wie Nitrozellulose oder Plastik verwendet werden.
Die Fragmente, die mittels Amplifikation erhalten werden, können einen direkt oder indirekt nachweisbaren Marker tragen. Vorgezogen werden Marker in Form von Fluoreszenzmarkern, Radionuklide, oder abtrennbare Molekülfragmente, die typische Masse haben, um im Massenspektrometer nachgewiesen zu werden, wobei es vorgezogen wirde, daß die Fragmente, die produziert werden, eine einfache positive oder negative Nettoladung zum besseren Nachweis im Massenspektrometer haben. Der Nachweis kann durchgeführt oder visualisiert werden mittels matrixunterstützter-Laser-Desorption/Ionisierung-Massenspektro-metrie (MALDI) oder durch die Anwendung der Elektronen-Spray-Massenspektrometrie.
Die erhaltenen Amplifikate werden danach hybridisiert an eine Anordnung oder ein Set von Oligonukleotiden und/oder PNA (Peptidnukleinsäure) Proben. In diesem Zusammenhang findet die Hybridisierung auf die im folgenden beschriebene Weise statt. Das Set an Proben, das während der Hybridisierung angewendet wird, besteht vorzüglich aus mindestens 10 Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren. Im Wirkungsprozeß dienen die Amplifikate als Proben, die an Oligonukleotide hybridisieren, die vorher an eine feste Phase gebunden wurden. Die nicht hybridisierten Fragmente werden danach entfernt. Besagte Oligonukleotide enthalten mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 10 Nukleotiden, die reverse-komplementär oder identisch zu einem im Anhang spezifizierten Segment der Basensequenzen ist, wobei das Segment mindestens ein CpG-Dinukleotid aufweist, Das Cytosin des CpG-Dinukleotids ist das 5. oder 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 10-mers. Besagte PNA-Oligomere enthalten mindestens eine Basensequenz von einer Länge von 9 Nukleotiden, die reverse-komplementär oder identisch sind zu einem im Anhang spezifizierten Segment der Basensequenz, wobei das Segment mindestens ein CpG-Dinukleotid hat. Das Cytosin des CpG-Dinukleotids ist das 4. und 6. Nukleotid ausgehend vom 5'-Ende des 9-mers. Vorzugsweise gibt es ein Oligonukleotid für jedes CpG Dinukleotid.
Im nächsten Schritt werden die nicht hybridisierten Amplifikate entfernt.
Im letzten Schritt dieses Verfahrens werden die hybridisierten Amplifikate nachgewiesen. In diesem Zusammenhang ist es vorzuziehen, daß die an die Amplifikate angehängten Marker an jeder Stelle der festen Phase, an der eine Oligonukleotidsequenz liegt, identifizierbar sind.
Gemäß vorliegender Erfindung sind die Marker der Amplifikate vorzugsweise fluoreszierende Marker, Radionuklide oder abtrennbare Molekülfragmente, die eine typische Masse haben, die im Massenspektrometer nachgewiesen werden kann. Das Massenspektrometer wird vorzugsweise zum Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder der Proben, die auf die Amplifikate abgestimmt sind, eingesetzt, so daß der Nachweis durch matrixunterstützte-Laser-Desorption/Ionisierung-Massenspektrometrie (MALDI) durchgeführt und visualisiert werden kann, oder durch die Anwendung der Elktronenspray-Massenspektrometrie (ESI). Die produzierten Fragmente können eine einfach positive oder negative Nettoladung zum besseren Nachweis im Massenspektrometer haben.
Die Methylierungsmuster, die in der untersuchten Probe gefunden werden, werden als zu einem bestimmten Gewebe oder Organ gehörig identifiziert. Dies wird erreicht durch Prüfung des Methylierungsmusters gewisser organspezifischer Markergene oder durch Vergleich des Methylierungsmusters einer breiteren Auswahl von mehrerer Genen mit dem Muster jener gleichen Gene, zum Zeitpunkt als sie aus verschiedenen Geweben oder Organen extrahiert wurden. Ein einzelner Datensatz wird verglichen mit Daten, die aus früheren Untersuchungen erhalten wurden, oder mit einem Datensatz, der in einem parallelen Experiment mit Kontrollflüssigkeit erhalten wurde.
Diese Analyse wird die Dominanz einer bestimmten Quelle von DNA offen-legen. Auf diese Weise wird die Menge frei-flottierender DNA, die von diesem Gewebe abstammt, und dadurch gekennzeichnet ist, daß sie einen bestimmten spezifischen Methylierungszustand in Bezug auf die Gesamtmenge der frei-flottierenden DNA aufweist, nachgewiesen.
In einem vierten Schritt, wird die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Krankheitszustandes in besagtem Organ bestimmt durch einen Vergleich der Untersuchungsergebnisse des Individuums, bezüglich des Verhältnisses einer Single-Source-DNA zur Gesamt-DNA mit dem Datenset, das im Haus in vorangegangenen Untersuchungen aufgebaut wurde. Dieses beruht auf dem Verhältnis der Fraktion von frei-flottierender DNA, die von einem spezifischen Gewebe oder Organ abstammt und der gesamten Menge an frei-flottierender DNA. Aufgebaut auf diesen Ergebnissen ist es möglich, Patienten mit abnormalen Mengen von DNA eines gewissen Organs oder Gewebes zu identifizieren, wie z.B. um mehr als 10% über dem Wert liegend, der als „normal" definiert wird, in ihren Körperflüssigkeiten. In einer bevorzugten Ausführungsart ist es möglich, Patienten mit frei-flottierenden DNA Spiegeln eindeutig zu identifizieren, die mindestens, aber nicht begrenzt sind, auf 20% über dem Wert liegend, der als normal definiert wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsart ist es möglich, Patienten mit einem erhöhten Spiegel frei-flottierender DNA zu identifizieren, der als mindestens erhöht, aber nicht begrenzt auf 40% über normal angegeben ist.
Des weiteren und am wichtigsten, wird uns besagte Analyse nicht nur darüber informieren, daß der DNA Spiegel des Patienten erhöht ist, sondern auch die mögliche Ursache hiervon offenlegen, indem sie spezifiziert, woher diese extrazelluläre DNA abstammt. Dies wird dem behandelnden Arzt oder Krankenhausarzt ein wertvolles Instrument zur Verfügung stellen, eine Erkrankung bereits in ihren frühen Tagen zu identifizieren, sogar bevor bemerkbare Symptome aufgetreten sind.
Die Erfindung stellt ein Verfahren wie oben beschrieben bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das besagte Methylierungsmuster als spezifisch für besagtes Organ oder Gewebe erkannt wird im Hinblick auf andere Organe oder Gewebe. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren gekennzeichnet dadurch, daß das besagte Methylierungsmuster als spezifisch für besagtes Organ oder Gewebe erkannt wird im Hinblick auf Methylierungsmuster, die in DNA von anderen Organen oder Geweben gefunden werden kann, spezifiziert durch die Tatsache, daß sie nicht in anderen Organen oder Geweben gefunden werden kann, die am Krankheitszustand von Interesse beteiligt sind und dadurch, unabhängig von dem Krankheitszustand der bei dem Patienten diagnostiziert wurde.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren gekennzeichnet dadurch, daß das besagte Methylierungsmuster als spezifisch für besagtes Organ oder Gewebe hinsichtlich anderer Organe oder Gewebe erkannt wird, wenn die Krankheit, die beim Patienten diagnostiziert wurde, ein Tumor oder andere zellproliferative Erkrankung ist.
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Bestimmung der Fraktion frei-flottierender DNA in einer Körperflüssigkeit, die von einem Organ oder Gewebe von Interesse abstammt, gekennzeichnet dadurch, daß die folgenden Schritte ausgeführt werden: Erstens, Beschaffen einer Körperflüssigkeitsprobe von besagtem Individuum wie oben beschrieben; zweitens, Bestimmen der Menge an gesamter frei-flottierender DNA in besagter Probe, wie oben beschrieben; drittens, Bestimmen der Menge frei-flottierender DNA, die von einem spezifischen Gewebe oder Organ abstammt durch Bestimmen der Menge frei-flottierender DNA, die ein Methylierungsmuster aufweist, das charakteristisch ist für ein spezifisches Gewebe, das vorher bestimmt wurde; viertens, Bestimmen der Fraktion der gesamten frei-flottierenden DNA, die von besagtem Gewebe oder Organ stammt; fünftens, Schlußfolgern, ob ein abnormaler Spiegel der gesamten frei-flottierenden DNA vorliegt, ob diese DNA von besagtem Gewebe oder Organ abstammt und sechstens, Schlußfolgern, ob eine Erkrankung im Zusammenhang mit besagtem Gewebe oder Organ vorliegt.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zur Bestimmung der Fraktion frei-flottierender DNA in einer Körperflüssigkeit, die von einem Organ oder Gewebe von Interesse abstammt und gekennzeichnet ist durch folgende auszuführenden Schritte: Erstens, Beschaffen einer Körperflüssigkeitsprobe von besagtem Individuum; zweitens, Aufbereiten der besagten Probe, um die Bindung der frei-flottierenden DNA an eine Oberfläche vorzubereiten; drittens, Nachweisen der Menge von gesamter frei-flottierender DNA durch Messen der Menge von DNA, die an besagte Oberfläche gebunden ist; viertens, Unterziehen der besagten Oberfläche mit der immobilisierten DNA einer chemischen und/oder enzymatischen Behandlung, die alle unmethylierten Cytosine in der DNA zu Uracil umsetzt, jedoch an Position 5 methylierter Cytosine unverändert läßt, wie oben beschrieben; fünftens, Amplifizieren der behandelten DNA; sechstens, Analysieren mehrerer Positionen in besagter DNA und Bestimmen der Menge von DNA, die gewebespezifische DNA Methylierungsmuster aufweist, die vorher festgelegt wurden; siebtens, Bestimmen der Fraktion von gesamter frei-flottierender DNA, die von besagtem Gewebe oder Organ abstammt.
In einer weiteren Ausführungsform schließt das Verfahren folgende Schritte ein: Wenn ein abnormaler Spiegel von gesamter frei-flottierender DNA vorliegt, wird schlußgefolgert, ob diese DNA von besagtem Gewebe oder Organ abstammt und, ob ein Krankheitszustand im Zusammenhang mit besagtem Gewebe oder Organ vorliegt.
Die vorliegende Erfindung zielt auch auf ein Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung oder eines Krankheitszustandes ab, das jedes der Verfahren, die in der Erfindung offenbart wurden, umfaßt.
Des weiteren, wird eine Möglichkeit offenbart, eine Vorrichtung herzustellen, um die gesamte Menge der frei-flottierenden DNA in einer Körperflüssigkeit zu bestimmen, die eine Oberfläche umfaßt, um DNA, die in einer Probemenge von Körperflüssigkeit flottiert, zu binden und eine Möglichkeit, die Menge an DNA, die an diese feste Oberfläche gebunden ist, zu bestimmen. Die Vorrichtung ist weiter gekennzeichnet dadurch, daß sie eine Kammer umfaßt, die, die Oberfläche und Reagenzien aufnimmt, um die an besagte Oberfläche gebundene DNA chemisch und enzymatisch verändern zu können, und eine Möglichkeit, die Temperatur in dieser Kammer zu kontrollieren und anzupassen.
Besagte Oberfläche kann dieselbe sein, die beschrieben und angewendet werden im DNA DipStick TM Kit (geliefert von Invitrogen) oder aus anderen Möglichkeiten bestehen, die ermöglichen, daß die DNA selektiv an einen Stoff bindet, der auf einen Träger unspezifizierter Art appliziert wird, der entweder mobil oder fix sein kann. Das Binden kann z.B. auf einer unspezifischen Hybridisierung von Nukleinsäuren beruhen. Die Quantifizierung der DNA, die an besagte Oberfläche gebunden ist, kann auf jede dem Fachmann bekannt Art und Weise ausgeführt werden oder z.B. indem man den Anweisungen folgt, die in dem DNA DipStick TM Kit gegeben werden. Des weiteren wird eine Möglichkeit offenbart, wie man eine Kammer oder eine ähnliche Art von geschlossenem Ambiente herstellt zur Aufnahme besagter Oberfläche zusammen mit den erforderlichen Reagenzien und/oder Enzymen, um die DNA, die an die feste Oberfläche gebunden ist, zu verändern.
Die Art und Weise, die Temperatur in dieser Kammer zu kontrollieren und anzupassen, kann auf dem Fachmann bekannte Weise erfolgen, z.B. indem man ein elektronisches Thermometer oder irgendeine Vorrichtung anbringt, die Temperatur lesen und sie verbinden kann mit einem Chip, der programmiert ist, auf gewisse Weise zu reagieren, indem er ein Kühl- oder Erhitzungseinheit anschaltet.
Jedoch kann ein Kit auch nur Teile der vorgenannten Komponenten enthalten und die Vorrichtung nicht einschließen. Es kann z.B. bestehen aus einem Bisulfit enthaltenden Reagenz, einem Set von Primer Oligonukleotiden, das mindestens zwei Oligonukleotide enthält, deren Sequenzen in jedem Fall einem 18 Basen langen Segment einer spezifischen Basensequenz entsprechen oder dazu komplementär sind, Oligonukleotiden und/oder PNA (Peptid Nukleinsäure)-Oligomere als auch Anweisungen das beschriebene Verfahren anzuwenden und zu evaluieren.

Claims

Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Erkrankungszustandes in einem Gewebe oder Organ eines Individuums, umfassend die folgenden Schritte: a) Bestimmen der Menge von gesamter frei-flottierender DNA in einer Körperflüssigkeitsprobe, die von dem Individuum erhalten wurde; b) Bestimmen der Menge von frei-flottierender DNA in der Probe, die von dem Gewebe oder Organ abstammt; c) Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Erkrankungszustandes, basierend auf der Gesamtmenge von frei-flottierender DNA und der Fraktion von frei-flottierender DNA, die von dem Gewebe oder Organ abstammt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe aufbereitet wird, bevor die Menge von frei-flottierender DNA nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mittels Zentrifugation, Filtration, Erhitzen, Abkühlen, Konzentrieren oder chemischer Behandlung aufbereitet wird.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge von DNA, die von einem bestimmten Organ oder Gewebe abstammt, durch Analysieren eines DNA-Methylierungsmusters bestimmt wird, das für das Organ oder Gewebe charakteristisch ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Methylierungsmuster in dem Organ oder Gewebe gefunden wird und nicht in anderen Organen oder Geweben, die an dem Erkrankungszustand von Interesse beteiligt sind.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Erkrankungszustand ein Tumor oder eine andere proliferative Erkrankung ist.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben von Körperflüssigkeiten erhalten werden, wie etwa Gesamtblut, Blutplasma, Blutserum, Urin, Sputum, Ejakulat, Samen, Tränen, Schweiß, Speichel, Lymphflüssigkeit, bronchialer Lavage, pleuraler Effusion, peritonealer Flüssigkeit, meningaler Flüssigkeit, amniotischer Flüssigkeit, glandulärer Flüssigkeit, feiner Nadelaspirate, Brustwarzenaustrittsflüssigkeit, Spinalflüssigkeit, Konjunktivalflüssigkeit, Vaginalflüssigkeit, duodenaler Säfte, pankreatischer Säfte, Gallenflüssigkeit und zerbospinaler Flüssigkeit von dem Individuum.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Methylierungsmuster durch Unterziehen der DNA einer chemischen oder enzymatischen Behandlung bestimmt wird, die alle nicht methylierten Cytosine in der DNA in Uracil überführt, jedoch Position 5-methylierte Cytosine unverändert läßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt b) umfaßt: I) Bestimmen der Menge von frei-flottierender DNA, die von dem Gewebe oder Organ abstammt, durch Bestimmen der Menge von frei-flottierender DNA, die ein Gewebe- oder Organ-charakteristisches DNA-Methylierungsmuster aufweist; II) Bestimmen der Fraktion von gesamter frei-flottierender DNA, die von dem Gewebe oder Organ abstammt; und worin Schritt c) umfaßt III) Schlußfolgern, ob ein abnormaler Spiegel von frei-flottierender DNA vorhanden ist, die von dem Gewebe oder Organ abstammt; und IV) Schlußfolgern, ob ein mit dem Gewebe oder Organ assoziierter Erkrankungszustand vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die folgenden Schritte a) Aufbereiten einer Körperflüssigkeitsprobe, die von einem Individuum erhalten wurde, um die Bindung von frei-flottierender DNA an eine Oberfläche vorzubereiten; b) Binden von mindestens einem Teil der DNA an die Oberfläche; c) Nachweisen der Menge von gesamter frei-flottierender DNA durch Messen der Menge von DNA, die an die Oberfläche gebunden wurde; d) Unterziehen der Oberfläche, die die gebundene DNA umfaßt, einer chemischen und/oder enzymatischen Behandlung, die alle nicht methylierten Cytosine in der DNA in Uracil überführt, wobei jedoch Position-5-methylierte Cytosine unverändert bleiben; e) Amplifizieren der behandelten DNA; und f) Analysieren von mehreren Positionen in der behandelten DNA und Bestimmen der Menge von DNA, die ein Gewebe- oder Organ-charakteristisches DNA-Methylierungsmuster aufweist; und g) Bestimmen der Menge von gesamter frei-flottierender DNA, die von dem Gewebe oder Organ abstammt.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden zusätzlichen Schritte durchgeführt werden: h) Schlußfolgern, ob diese DNA von dem Gewebe oder Organ abstimmt, falls ein abnormaler Spiegel von gesamter frei-flottierender DNA vorhanden ist; und i) Schlußfolgern, ob ein mit dem Gewebe oder Organ assoziierter Erkrankungszustand vorhanden ist.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gesamte Menge von frei-flottierender DNA durch interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe oder andere Farbstoffe gemessen wird, die ihre Fluoreszenzeigenschaften ändern, wenn sie an DNA binden, Hybridisierung an DNA-spezifische Sonden einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere, Echt-Zeit-PCR-Tests oder andere Echt-Zeit-Amplifikationsverfahren, UV-Vis-Absorption oder im allgemeinen Amplifikationsverfahren mit anschließender Bestimmung der Menge von gebildeten Produkt.