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Gebiet der Erfindung
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Die nach den methodischen Entwicklungen der
letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen
sind die Gene selbst, die Übersetzung
dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im
Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet
wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten
Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung
der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem
veränderten
Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Nukleinsäuren,
Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose und/oder
der Therapie von Erkrankungen, die mit den genetischen und/oder
epigenetischen Parametern von Genen, die mit dem Verhalten assoziiert
sind und insbesondere deren Methylierungsstatus in Zusammenhang
stehen.
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Stand der Technik
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Menschliches Verhalten ist ein sich
entwickelndes System, das in seiner frühen Phase durch genetische
Programmierung kontrolliert wird. Externe Einflüsse beeinflussen das Verhalten
in utero und werden nach der Geburt wichtiger. Ein Wissen über die
natürlichen
und Entwicklungseinflüsse
sowie externe Determinanten ist erforderlich, um das Verhalten insgesamt
zu verstehen. Dieses Verständnis
die Voraussetzung zur Behandlung von psychiatrischen Erkrankungen.
Viele Aspekte des Verhaltens werden genetisch kontrolliert, wie
durch Zwillingsuntersuchungen gezeigt. Gewöhnlich sind Verhaltensmarker komplex
und polygenisch vererbt, was eine arbeitsintensive Analyse erfordert.
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Eingeschlossen in den Verhaltensstörungen, die
mit Neurotransmitter assoziiert sind, sind wichtige depressive Erkrankungen
(Gurguis GN, Vo SP, Griffith JM, Rush AJ. Platelet alpha2A-adrenoceptor function
in major depression: Gi coupling, effects of imipramine and relationship
to treatment outcome. Psychiatry Res. 1999 Dec 20;89(2):73-95),
Schizophrenie (Klimek V, Rajkowska G, Luker SN, Dilley G, Meltzer
HY, Overholser JC, Stockmeier CA, Ordway GA. Brain noradrenergic
receptors in major depression and schizophrenia Neuropsychopharmacology. 1999
Jul;21(1):69-81) oder Tourette-Syndrom (Comings DE, Gade-Andavolu R, Gonzalez
N, Blake H, Wu S, MacMurray JP. Additive effect of three noradrenergic
genes (ADRA2a, ADRA2C, DBH) on attention-deficit hyperactivity disorder
and learning disabilities in Tourette syndrome subjects. Clin Genet.
1999 Mar;55(3):160-72). Neurotransmitter, wie Dopamin und seine
Rezeptoren sind mit psychiatrischen und neurologischen Erkrankungen
assoziiert (Noble EP. The DRD2 gene in psychiatric and neurological
disorders and its phenotypes. Pharmacogenomics. 2000 Aug;1(3):309-33).
Studien in der Vergangenheit haben gezeigt, daß zum Beispiel das Dopamin
D2 Rezeptor Gen mit Alkoholismus (Lu RB, Lee JF, Ko HC, Lin WW.
Dopamine D2 receptor gene (DRD2) is associated with alcoholism with
conduct disorder. Alcohol Clin Exp Res. 2001 Feb;25(2):177-84),
Persönlichkeitsmarkern,
wie Schizophrenie (Mowry BJ, Nancarrow DJ. Molecular genetics of
schizophrenia. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2001 Jan-Feb;28(1-2):66-9),
Drogenmißbrauch
(Blomqvist O, Gelernter J, Kranzler HR. Family-based study of DRD2
alleles in alcohol and drug dependence. Am J Med Genet. 2000 Oct
9;96(5):659-64), Rauchen (Yoshida K, Hamajima N, Kozaki Ki, Saito
H, Maeno K, Sugiura T, Ookuma K, Takahashi T.Association between
the Dopamine D2 Receptor A2/A2 Genotype and Smoking behaviour in
the Japanese. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2001 Apr;10(4):403-5)
oder Spielsucht (Comings DE, Rosenthal RJ, Lesieur HR, Rugle LJ,
Muhleman D, Chiu C, Dietz G, Gade R. A study of the dopamine D2
receptor gene in pathological gambling. Pharmacogenetics. 1996 Jun;6(3):223-34., and several
personality traits) assoziiert ist. Dopamin assoziierte Erkrankungen schließen weiter
humane Immunodefizienz Virus Demenz (Berger JR, Arendt G. HIV dementia:
the role of the basal ganglia and dopaminergic systems. J Psychopharmacol.
2000;14(3):214-21) oder Migräne (Lea
RA, Dohy A, Jordan K, Quinlan S, Brimage PJ, Griffiths LR. Evidence
for allelic association of the dopamine beta-hydroxylase gene (DBH)
with susceptibility to typical migraine. Neurogenetics. 2000 Sep;3(1):35-40)
ein. Die Verhalten in schizophrenen und schizoaffektiven Patienten
sind auch mit der Katechol-O-methyltransferase (Nolan KA, Volavka
J, Czobor P, Cseh A, Lachman H, Saito T, Tiihonen J, Putkonen A,
Hallikainen T, Kotilainen I, Rasanen P, Isohanni M, Jarvelin MR,
Karvonen MK. Suicidal behaviour in patients with schizophrenia is
related to COMT polymorphism. Psychiatr Genet. 2000 Sep;10(3):117-24) assoziiert.
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Weiterhin wird zunehmend gezeigt,
daß einige
mit dem Verhalten assoziierte Gene, einschließlich denjenigen, die oben
erwähnt
sind, eine breitere Rolle bei der Entwicklung von anderen Erkrankungen spielen,
wie zum Beispiel neurologischen Erkrankungen und Krebs. Zum Beispiel
wurde der oben diskutierte Dopaminrezeptor, zusätzlich dazu, daß er ein Schlüssel-Neurotransmitter
ist, der an der Regulation der Sekretion von mehreren anterioren
pituitären Hormonen,
kardiovaskulären
und Nierenfunktionen beteiligt ist, auch mit der Entwicklung von
Krebs in Zusamenhang gebracht (Role of dopamine in malignant tumor
growth Basu S, Dasgupta PS Endocrine. 2000 Jun;12(3):237-41).
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5-Methylcytosin ist die häufigste
kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryontischer Zellen. Sie
spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription,
beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese.
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Eine aberrante DNA Methylierung innerhalb von
CpG Inseln ist bei menschlichen malignen Erkrankungen verbreitet,
was zu einem Einstellen oder der Überexpression eines breiten
Spektrums von Genen führt
(Jones, P.A. Cancer Res 65:2463-2467, 1996). Von der abnormalen
Methylierung wurde auch gezeigt, daß sie in CpG-reichen regulatorischen
Elementen in intronischen und kodierenden Teilen von Genen für bestimmte
Tumore auftritt (Chan, M.F., et al., Curr Top Microbiol Immunol
249:75-86, 2000). Unter der Verwendung von Restriktions „Landmark" genomischem Scanning,
waren Costello und Mitarbeiter in der Lage zu zeigen, daß Methylierungsmuster
Tumortyp spezifisch sind (Costello, J. F., et al., Nat Genet 24:132-138,
2000). Hoch charakteristische DNA-Methylierungsmuster konnten auch
für Brustkrebs-Zellinien
gefunden werden (Huang, T. H.-M., et al., Hum Mol Genet 8:459-470,
1999). Die genomweite Ermittlung des Methylierungsstatus stellt
einen molekularen Fingerprint von Krebsgeweben dar.
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Daher ist die Identifizierung von
5-Methylcytosine als eine Komponente der genetischen Information
von beträchtlichem
Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung
identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten
aufweist wie Cytosin. Darüber
hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information,
welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
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Eine relativ neue und die mittlerweile
am häufigsten
angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin
beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das
nach anschließender
alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem
Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin
wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird
die ursprüngliche
DNA so umgewandelt, daß Methylcytosin,
welches ursprünglich
durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden
werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische
Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation
und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann.
Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll
ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit
betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende
DNA in einer Agarose-Matrix
einschließt,
dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert
nur an einzelsträngiger
DNA) verhindert und alle Fällungs-
und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald
J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based
cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6).
Mit dieser Methode können einzelne
Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht.
Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare
Länge untersucht,
eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen
Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch
dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen
zuverlässig
analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix
verloren.
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Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten,
5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel
entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic
Acids Res. 1998, 26, 2255.
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Die Bisulfit-Technik wird bisher
bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler
W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman
and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences
at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8) nur
in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische
Stücke
eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert
und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation
ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6)
oder einzelne Cytosin-Positionen durch
eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones
PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites
using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE).
Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31, WO 95/00669) oder
einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative
DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4)
nachgewiesen.
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Zudem ist auch der Nachweis durch
Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99/28498).
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Weitere Publikationen, die sich mit
der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei
einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine
residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431; Zeschnigk
M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted
segments in the human genome: different DNA methylation patterns in
the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic
sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95; Feil R,
Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual
chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing.
Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang
X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between
DNA hypomethylation in the 5' region
of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines.
Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO
97/45560.
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Eine Übersicht über den Stand der Technik in der
Oligomer Array Herstellung läßt sich
aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics
(Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort
zitierten Literatur entnehmen.
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Für
die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte
Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist
das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen
Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt
beispielsweise über
ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen
anderen, kommerziell erhältlich.
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Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie
(MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse
von Biomolekülen
(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins
with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988
Oct 15;60(20):2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende
Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix
verdampft und das Analytmolekül
so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird
die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt
die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen
Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere
Ionen erreichen den Detektor früher
als größere.
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MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich
ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse
von Nukleinsäuren
ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations
and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit
etwa 100 mal schlechter als für
Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die
ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben,
ist der Ionisationsprozeß durch
die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie
spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption
von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrizes gefunden worden,
die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile
einige ansprechende Matrizes, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied
nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert
werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem
Peptid ähnlicher
wird. Phosphorothioatnukleinsäuren,
bei denen die gewöhnlichen
Phosphate des Rückgrats
durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache
Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG,
Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by
mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73).
Die Kopplung eines „charge
tags" an diese modifizierte
DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen
Betrag, wie er für
Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen
Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark
erschweren.
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Genomische DNA wird durch Standardmethoden
aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen.
Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und
Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
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Beschreibung
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Es ist die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, die chemisch modifizierte DNA von Genen zur Verfügung zu
stellen, die mit Verhaltensstörungen, neurologischen
Erkrankungen und Krebs assoziiert sind, sowie Oligonukleotide und/oder
PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen sowie ein
Verfahren bereitzustellen, welches sich zur Diagnose und/oder der
Therapie von genetischen und epigenetischen Parametern von Genen,
die mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind, besonders
eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß genetische und
epigenetische Parameter und insbesondere die Cytosin-Methylierungsmuster
von Genen, die mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind, zur Diagnose
und/oder der Therapie von mit Verhaltensstörungen, neurologischen Erkrankungen
und Krebs assoziierten Erkrankungen besonders eignen.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das
zur Verfügung
stellen einer Nukleinsäure,
die einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch
vorbehandelten DNA von Genen, die mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 46 und dazu komplementären Sequenzen,
gelöst.
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Die chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte
bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von genetischen
und epigenetische Parametern gebracht werden.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer zur Detektion
des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA,
umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von
mindestens 13 Nukleotiden gelöst,
die an eine chemisch vorbehandelte DNA von Genen, die mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 46 und dazu komplementären Sequenzen
hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligomersonden
stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung
der genetischen und epigenetischen Parameter von Genen, die mit
Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind, erst ermöglichen.
Bevorzugterweise umfaßt
die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die
Sonden können
auch in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders
bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind
erfindungsgemäße Oligonukleotide,
bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5. – 9. Nukleotid
vom 5'-Ende des
13-mers ist, im Falle von PNA-Oligomeren ist es bevorzugt, daß das Cytosin
des CpG Dinukleotids das 4. – 6.
Nukleotid vom 5'-Ende
des 9-mers ist.
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Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise
in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide
eine der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 46 und dazu
komplementären
Sequenzen mindestens ein Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set,
das für
jedes der CpG Dinukleotide aus einer der Seq ID No. 1 bis Seq ID
No. 46 und dazu komplementären
Sequenzen mindestens ein Oligomer umfaßt.
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Darüber hinaus stellt die Erfindung
ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die
als sogenannte „Primer-Oligonukleotide" zur Amplifikation
von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 46 und
dazu komplementären
Sequenzen oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.
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Im Falle der erfindungsgemäßen Sets
von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, daß mindestens ein Oligonukleotid
an eine Festphase gebunden ist. Es ist weiter bevorzugt, daß alle Oligonukleotide
eines Sets an eine Festphase gebunden sind.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin einen Satz von mindestens 10 n (Oligonukleotiden und/oder
PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes
in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID
No. 46 und dazu komplementären
Sequenzen) dienen. Mit diesen Sonden ist die Diagnose von genetischen
und epigenetischen Parametern von Genen, die mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind, möglich. Das Set
von Oligomeren kann auch zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen
(SNPs) in der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 46 und dazu komplementären Sequenzen
verwendet werden.
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Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß eine von
der Erfindung zur Verfügung
gestellte Anordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren
(ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine
Festphase gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen
Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet
sein, daß es
auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen
Gitters angeordnet ist. Bevorzugterweise besteht die Festphasenoberfläche aus
Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel,
Silber oder Gold. Möglich
sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel
Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial
fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziierten Erkrankungen, bei
dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung
an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von
solchen Arrays sind zum Beispiel aus der
US 5,744,305 mittels Festphasenchemie
und photolabilen Schutzgruppen bekannt.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
betrifft einen DNA-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziierten Erkrankungen,
der mindestens eine Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden Erfindung
umfaßt.
DNA-Chips sind zum
Beispiel aus der
US 5,837,832 bekannt.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden
Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens
zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18 Basenpaaren
langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen (Seq.
ID No. 1 bis Seq. ID No. 46 und dazu komplementären Sequenzen), Oligonukleotiden
und/oder PNA-Oligomeren sowie einer Anleitung zur Durchführung und
Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann. Ein Kit im Sinne
der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten Bestandteile
enthalten.
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Die Erfindung stellt weiterhin ein
Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen
Parametern von Genen, die mit Verhaltensstörungen, neurologischen Erkrankungen
und Krebs assoziiert sind durch Analyse von Cytosin-Methylierungen
und Single Nucleotide Polymorphismen zur Verfügung, das folgende Schritte
umfaßt:
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In einem ersten Verfahrensschritt
wird eine genomische DNA-Probe derart chemisch behandelt, daß an der
5'-Position unmethylierte
Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten
her dem Cytosin unähnliche
Base umgewandelt werden. Dies wird im folgenden unter „chemischer
Vorbehandlung" verstanden.
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Die zu analysierende genomische DNA
wird bevorzugt aus den üblichen
Quellen für
DNA erhalten, wie Zellen oder Zellbestandteilen, zum Beispiel Zellinien,
Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit,
in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm,
Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische
Objektträger
oder Kombinationen davon.
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Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung
genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer
Hydrolyse angewendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter
Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaarungsverhalten
her dem Cytosin unähnliche
Base führt.
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Aus dieser chemisch vorbehandelten
genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von
erfindungsgemäßen Primer-Oligonukleotiden
und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert.
Aus statistischen und praktikablen Erwägungen werden bevorzugterweise
mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100 – 2000 Basenpaare
lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten kann simultan
in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise
wird die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR)
durchgeführt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens umfaßt
der Satz von Primer-Oligonukleotiden
mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers
komplementär
oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt
der im Anhang (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 46 und dazu komplementären Sequenzen)
aufgelisteten Basensequenzen sind. Die Primer-Oligonukleotide sind
vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß sie kein CpG Dinukleotid
enthalten.
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Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß bei der
Amplifikation mindestens ein Primer-Oligonukleotid an eine Festphase gebunden
ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen
können
auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen
Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt
aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer,
Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien,
wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.
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Die mittels der Amplifikation erhaltenen Fragmente
können
eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt
sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden
oder ablösbaren
Molekülfragmenten
mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen
werden können,
wobei bevorzugt ist, daß die
erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer
eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Der Nachweis
kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie
(MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchgeführt und
visualisiert werden.
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Die im zweiten Verfahrensschritt
erhaltenen Amplifikate werden anschließend an einen Satz von Oligonukleotiden
und/oder PNA- Sonden der oder an ein Array hybridisiert. Die Hybridisierung
erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der Hybridisierung
verwendete Satz besteht bevorzugterweise aus mindestens 10 Oligonukleotid
oder PNA-Oligomer
Sonden. Die Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an
einer Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht
hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die besagten
Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer
Länge von
13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt
der im Anhang aufgeführten
Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das
Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13-mers aus betrachtet.
Für jedes
CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besagten PNA-Oligomere
umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 9
Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt
der im Anhang aufgeführten Basensequenzen
ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids
ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9-mers aus gesehen. Für jedes
CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.
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Im vierten Verfahrensschritt entfernt
man die nicht hybridisierten Amplifikate.
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Im letzten Verfahrensschritt detektiert
man die hybridisierten Amplifikate. Dabei ist bevorzugt, daß an den
Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase,
an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar
sind.
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Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß die Markierungen
der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente
mit typischer Masse sind, die in ei nem Massenspektrometer nachgewiesen
werden können.
Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu
den Amplifikaten komplementäre
Sonden im Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion
mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie
(MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführen und
visualisieren kann.
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Zur besseren Detektierbarkeit im
Massenspektrometer können
die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung
aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren zur Ermittlung
von genetischen und/oder epigenetischen Parametern innerhalb von
Genen, die mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind, verwendet.
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Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der vorliegenden
Erfindung der Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 46 und dazu komplementären Sequenzen
können
für die
Diagnose und/oder Therapie von genetischen und/oder epigenetischen
Parametern von Genen, die mit Verhaltensstörungen, neurologischen Erkrankungen
und Krebs assoziiert sind, verwendet werden.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
darüber
hinaus ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums und/oder
Therapeutikums für
die Diagnose und/oder Therapie von Verhaltensstörungen, neurologischen Erkrankungen
und Krebs durch Analyse von Methylierungsmustern von Genen, die
mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind, wobei das
Diagnostikum und/oder Therapeutikum dadurch gekennzeichnet ist,
daß mindestens
eine Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen,
zu seiner Herstellung verwendet wird.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung
betrifft ein Diagnostikum und/oder Therapeutikum für Krankheiten,
die mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind, durch Analyse
von Methylierungsmustern von Genen, die mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind, wobei das
Diagnostikum und/oder Therapeutikum dadurch gekennzeichnet ist,
daß es
mindestens eine Nukleinsäure
gemäß der Erfindung,
gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen enthält.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse
für Patienten
oder Individuen, bei dem die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden
genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb von Genen,
die mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind mit einem
anderen Satz genetischen und/oder epigenetischen Parameter verglichen
werden können
und die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose
nachteiliger Ereignisse für Patienten
oder Individuen dienen.
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Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden
Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur
eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz
im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen.
Als "stringente
Hybridisierungsbedingungen" zu
verstehen sind diejenigen Bedingungen, bei denen eine Hybridisierung
bei 60°C
in 2.5 x SSC Puffer durchgeführt
wird, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer niedrigen Pufferkonzentration,
und stabil bleibt.
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Mit dem Begriff "funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen
bezeichnet, die komplementär zu
einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der
Referenzsequenz hybridisieren und eine zu dem entsprechenden erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche
Aktivität
aufweisen.
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"Genetische
Parameter" im Sinne
dieser Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von Genen, die
mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind und zu deren
Regulation weiterhin erforderlicher Sequenzen. Insbesondere sind
als Mutationen Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen
und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide
Polymorphisms) zu bezeichnen.
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"Epigenetische
Parameter" im Sinne
dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin-Methylierungen und weitere chemische
Modifikationen von DNA-Basen von Genen, die mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind und zu deren
Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Weitere epigenetische
Parameter sind beispielsweise die Acetylierung von Histonen, die
jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt analysiert werden
kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung korreliert.
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Die Erfindung soll nun im folgenden
anhand der Sequenzen und Beispiele unter Bezug auf die beigefügte Figur
weiter verdeutlicht werden, ohne hierauf eingeschränkt zu werden.
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1
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1 zeigte
die Hybridisierung von Fluoreszenz-markierten Amplifikaten an ein
Oberflächen–gebundenes
Oligonukleotid. Die Fluoreszenz an einem Punkt zeigt die Hybridisierung
des Amplifikats an. Die Hybridisierung an ein CG Oligonukleotid zeigt
an, daß die
Methylierung an der Cytosin-Position analysiert wird, die Hybridisierung
an ein TG Oligonukleotid zeigt an, daß keine Methylierung an der Cytosin-Position
analysiert wird. Es kann gesehen werden, daß Probe II ein höheres Ausmaß an Methylierung
aufweist, als Probe I.
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Seq ID No. 1 bis Seq ID
No. 46
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Sequenzen, die ungerade Sequenznummern
haben (z.B., Seq. ID No. 1, 3, 5, ...) zeigen in jedem Fall Sequenzen
der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von verschiedenen Genen,
die mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziiert sind. Sequenzen,
die gerade Sequenznummern aufweisen (z.B., Seq. ID No. 2, 4, 6,...)
zeigen in jedem Fall Sequenzen der chemisch vorbehandelten genomischen
DNAs von verschiedenen Genen, die mit Verhaltensstörungen, neurologischen
Erkrankungen und Krebs assoziiert sind, die komplementär zu den
voranstehenden Sequenzen sind (z.B., die komplementäre Sequenz
zu Seq. ID No. 1 ist Seq. ID No. 2, die komplementäre Sequenz
zu Seq. ID No. 3 ist Seq. ID No. 4, usw.)
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Seq ID No. 47 bis Seq
ID No. 50
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Seq. ID No. 47 bis Seq. ID No. 50
zeigen Oligonukleotid-Sequenzen, wie in Beispiel 1 verwendet.
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Beispiel 1: Methylierungsanalyse
des Angiotensin-Gens
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Das folgende Beispiel betrifft ein
Fragment des Angiotensin-Gens, worin eine spezifische CG-Position
auf ihren Methylierungsstatus hin analysiert wird.
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Im ersten Schritt wird eine genomische
Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit)
derart behandelt, daß alle
nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden,
daß eine
hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht,
während die
in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben.
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Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet,
so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt.
Zudem müssen
ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen
sein. Eine anschließende
alkalische Hydrolyse führt
dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in
Uracil. Die chemisch umgewandelte DNA dient dann dazu, methylierte
Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man
die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung. Bevorzugt wird anschließend eine
Desulfonierung der DNA bei alkalischem pH-Wert durchgeführt. Im
dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe in
einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase.
Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Angiotensin-Gens analysiert. Dazu
wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden TGAGYGGGTAGTAGGGTTAG
(Seq. ID No. 47) und CRACTTACCTTCTACTATAA (Seq. ID No. 48) ein definiertes
Fragment der Länge
507 bp amplifiziert. Die Einzelgen PCR Reaktion wurde auf einem Thermocycler
(Eppendorf GmbH) unter der Verwendung von Bisulfite DNA 10 ng, jeweils
Primer 6 pMol, dNTP jeweils 200 μM,
1,5 mM MgC12 und 1 U HotstartTaq (Qiagen AG) durchgeführt. Die
anderen Bedingungen waren wie durch den Taq Polymerase Hersteller
empfohlen. In der Multiplex-PCR
wurden bis zu 16 Primerpaare innerhalb der PCR Reaktion verwendet.
The Multiplex-PCR
wurde gemäß der Einzelgen
PCR mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: Primer jeweils 0,35 pMol,
dNTP jeweils 800 μM
und 4,5 mM MgC12. Das Zyklusprogramm für die Einzelgen PCR und Multiplex-PCR
was wie folgt: Schritt 1, 14 min 96 °C; Schritt 2, 60 sec 96°C; Schritt
3, 45 sec 55 °C;
Schritt 4 ,75 sec 72 °C;
Schritt 5, 10 min 72 °C;
die Schritte 2 bis Schritt 4 wurden 39 fach wiederholt.
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Dieses Amplifikat dient als Probe,
die an ein vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter
Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise ATATTTTTCGGGGTTGGG
(Seq. ID No. 49), wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position
119 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts
beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primer-Oligonukleotiden,
die für
die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten
DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt
es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem
Oligonukleotid. Somit kann der Methylierungsstatus des jeweiligen
zu untersuchenden Cytosins über
das Hybridisierungsprodukt abgeleitet werden.
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Um den Methylierungsstatus der Position
zu überprüfen, wird
eine Probe des Amplifikats weiterhin an ein anderes Oligonukleotid
hybridisiert, das vorher an eine feste Phase gebunden wurde. Dieses
Oligonukleotid ist identisch zu dem Oligonukleotid, das vorher benutzt
wurde, um den Methylierungsstatus der Probe zu analysieren, mit
der Ausnahme der fraglichen Position. An der zu analysierenden Position
umfaßt
das Oligonukleotid eine Thymin-Base, im Gegensatz zu einer Cytosin-Base
d.h. die Sequenz ATATTTTTTGGGGTTGGG (Seq. ID No. 50). Daher findet
die Hybridisierungsreaktion nur statt, falls ein nicht-methyliertes
Cytosin an der zu analysierenden Positionen vorhanden ist.
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Beispiel 2: Diagnose von
mit Verhaltensstörungen, neurologischen
Erkrankungen und Krebs assoziierten Erkrankungen
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Um einen Bezug der Methylierungsmuster zu
einer der mit Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs assoziierten Erkrankungen
herzustellen, bedarf es zunächst
der Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster einer Gruppe von erkrankten
und einer Gruppe von gesunden Personen. Diese Untersuchungen werden
zum Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die so erhaltenen Ergebnisse
werden in einer Datenbank abgespeichert und die CpG Dinukleotide
identifiziert, die zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich methyliert
sind. Dies kann durch Bestimmung einzelner CpG Methylierungsraten
erfolgen, wie dies z. B. durch Sequenzieren relativ ungenau oder
aber durch eine Methylierungssensitive „Primer-Extension-Reaktion" sehr genau möglich ist.
Auch gleichzeitige Analyse des gesamten Methylierungsstatus ist
möglich,
und die Muster können
z.B. mittels Clustering-Analysen,
die z.B. durch einen Rechner durchgeführt werden können, verglichen
werden.
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Anschließend ist es möglich, die
untersuchten Patienten einer spezifischen Therapiegruppe zuzuordnen
und diese Patienten selektiv mit einer individualisierten Therapie
zu behandeln. Beispiel 2 kann zum Beispiel für Verhaltensstörungen,
neurologischen Erkrankungen und Krebs, insbesondere wichtige depressive
Erkrankung, Schizophrenie, Tourette Syndrom, psychiatrische und
neurologische Erkrankungen, insbesondere Alkoholismus, Persönlichkeitsmarker,
Drogenmißbrauch,
Rauchen, Spielsucht, humane Immunodefizienz Virus Demenz, Migräne, Verhalten
in schizophrenen und schizoaffektiven Patienten und Suizidverhalten
in Patienten mit Schizophrenie durchgeführt werden.