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Gebiet der Erfindung
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Die nach den methodischen Entwicklungen
der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen
sind die Gene selbst, die Übersetzung
dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im
Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet
wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten
Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung
der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem
veränderten
Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Nukleinsäuren,
Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose und/oder
der Therapie von Erkrankungen, die mit dem genetischen und/oder
epigenetischen Parametern von Genen, die mit Apoptose assoziiert
sind, und insbesondere deren Methylierungsstatus, in Zusammenhang
stehen.
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Stand der Technik
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Während
der Embryogenese, der Gewebeerneuerung oder Metamorphose behalten
multizelluläre
eukaryotische Organismen ihre Fähigkeit
bei, unerwünschte
Zellen zu beseitigen. Diese Form von programmiertem Zelltod wird „Apoptose" genannt. Die Apoptose
findet in Antwort auf eine Vielzahl von Stimuli statt, die biochemische
Signalwege auslösen
die zu einem charakteristischen Set von Prozessen führen, die
im Zelltod resultieren.
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Die Stimuli, die Apoptose auslösen, können die
Spiegel von essentiellen Wachstumsfaktoren, die Behandlung mit Glucocorticoiden,
Bestrahlung und die Aktivierung von bestimmten Rezeptoren einschließen. Diese
lösen eine
Vielzahl von biochemischen Signalwegen aus. Der „klassische" Signalweg besteht
aus einer Liganden-Rezeptor-Interaktion, die die Aktivierung einer
Protease auslöst.
Dies führt
zu der Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien. Dieses
aktiviert im Gegenzug eine Reihe von Proteasen, deren Wirkungen
zu der Zerstörung
von zellulären
Strukturen führen.
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Zum Beispiel schließt ein herkömmlicher
Signalweg die Aktivierung von Caspase-8 durch Oligomerisierung an
einem aktivierten Oberflächenrezeptor
ein. Caspase-8 spaltet Bid, das die Freisetzung von Cytochrom C
aus den Mitochondrien auslöst.
Das Cytochrom C bewirkt, dass Apaf-1 mit Caspase-9 oligomerisiert. Die
aktivierte Caspase-9 süaltet
Procaspase-3, deren zwei Untereinheiten dann die aktive Protease
bilden. Diese spaltet verschiedene Ziele, was zum Zelltod führt. Zelltod
durch Apoptose ist durch Prozesse gekennzeichnet, in denen die Zelle
kompakter wird, einer Blasenbildung an der Membranen auftritt, das
Chromatin kondensiert wird und die DNA fragmentiert wird.
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Die korrekte Kontrolle von Apoptose
ist möglicherweise
für alle
höheren
Organismen essenziell. Zum Beispiel sterben in dem Modell-Organismus
C. elegans 131 der 1090 Zellen einen definierten Punkten des Lebenszyklus
des Organismus. In Wirbeltieren wurde die Wichtigkeit der Apoptose
durch die Verwendung von Knockout-Mausmodellen nachgewiesen. In
Menschen wurden Apoptose-Signalwege mit einer Vielzahl von Erkrankungen
in Zusammenhang gebracht, einschließlich neurodegenerativen Erkrankungen,
Alterung und Krebs:
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- – HIV-Infektion;
Badley et. al. "Mechanisms
of HIV-associated lymphocyte apoptosis" Blood, Vol. 96; 2951-2964 (2000).
- – Bloom
Syndrom; Bischof et. al. 'Selective
cleavage of BLM, the Bloom syndrome protein, during apoptotic cell
death.' J Biol Chem
2001 Jan 11.
- – Cardiomyopathie;
Narula et. al. "Apoptosis
in heart failure: release of cytochrome c from mitochondria and activation
of caspase-3 in human cardiomyopathy" Proc Natl Acad Sci U S A.;96:8144-8149
(1999).
- – Familiäre Alzheimer-Erkrankung;
Simian et. al. Presenilin-1 P264L Knock-In Mutation: Differential
Effects on Aß Production,
Amyloid Deposition, and Neuronal Vulnerability The Journal of Neuroscience, 20(23):8717-8726
(1999).
- – Alterung;
Schindowski et. al. 'Age-related
changes of apoptotic cell death in human lymphocytes.' Neurobiol Aging
2000 Sep-Oct;21(5):661-70.
- – Herpes
simplex Virusinfektion; Perng et. al. "Virus-Induced Neuronal Apoptosis Blocked
by the Herpes Simplex Virus Latency-Associated Transcript" Science 287: 1500-1503
(2000).
- – Renale
Ischämie;
Yuexian et. al. "Downregulation
of the calpain inhibitor protein calpastatin by caspases during
renal ischemia-reperfusion" Am.
J. Physiol. 279: 509-517.
- – Amyotrophe
Lateralsklerose; Li et. al. "Functional
Role of Caspase-1 and Caspase-3 in an ALS Transgenic Mouse Model" Science 288 (5464);
335-339 (2000).
- – Brustkrebs;
Sierra et. al. 'Bcl-2
with loss of apoptosis allows accumulation of genetic alterations:
a pathway to metastatic progression in human breast cancer.' Int J Cancer. 2000
Mar 20;89(2):142-7.
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Die Komplexitäten der Signalwege, die zu
Apoptose führen,
ermöglichen
viele Mechanismen, durch die diese umgeleitet werden können. Zusätzlich zu
genomischen Mutationen wurde die epigenetische Kontrolle von Genen
mit Unterbrechungen in Apoptose-Signalwegen in Zusammenhang gebracht.
Der epigenetische Parameter, der am besten charakterisiert wurde,
DNA-Methylierung, wurde als ein Schlüsselfaktor bei der Resistenz
von Tumoren auf Chemotherapie impliziert. Es wurde gezeigt (Soengas
et al "Inactivation
of the apoptosis effector Apaf-1 in malignant melanoma" Nature 409; 207-211;2001),
das in malignen Melanomen Unterbrechungen in dem Apoptose-Signalweg
einer Stummschaltung des Apaf-1 Gens zugeordnet werden konnten.
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Die Identifizierung von Methylierung
von Apoptosegenen als ein Faktor bei der Tumour-Malignität öffnet die Möglichkeit zur Erzeugung von
alternativen Verfahren zur Behandlung. Methylierungs-basierte Therapien
könnten
beträchtliche
Vorteile über
augenblickliche Verfahren der Behandlung, wie z. B. Chemotherapie, Chirurgie
und Radiotherapie haben. Sie können
sogar, wie durch Soengas et al gezeigt, ein Mittel zur Behandlung
von Tumoren zur Verfügung
stellen, die gegenüber
herkömmlichen
Behandlungen resistent sind. Zusätzlich
zu der Entwicklung von Methylierungs-spezifischen Therapien haben
Experimente mit Min-Mäusen gezeigt,
dass die Inhibierung von DNA Methylierung die Tumorinitiation unterdrükken kann
(Laird et. al. 'Suppression
of intestinal neoplasia by DNA hypomethylation' Cell 81; 197-205 1995). Weiterhin kann
die DNA-Methylierungsanalyse neue Mittel zur Tumordiagnose zur Verfügung stellen,
wie durch Rosas et. al. 'Promoter
hypermethylation patterns of p16, 06-methylguanine-DNA-methyltransferase,
and death-associated protein kinase in tumors and saliva of head
and neck cancer patients.' Cancer
Res 2001 Feb 1;61(3):939-42 vorgeschlagen.
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5-Methylcytosin ist die häufigste
kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt
beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim
genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung
von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist
daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch
nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin
das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus
geht bei einer PCR-Amplifikation
die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen,
vollständig
verloren.
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Eine relativ neue und die mittlerweile
am häufigsten
angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin
beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das
nach anschließender
alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem
Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin
wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird
die ursprüngliche
DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch
sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden
kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische
Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation
und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann.
Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll
ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit
betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende
DNA in einer Agarose-Matrix
einschließt,
dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert
nur an einzelsträngiger
DNA) verhindert und alle Fällungs-
und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald
J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based
cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6).
Mit dieser Methode können
einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode
veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen
bis etwa 3000 Basenpaare Länge
untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von
möglichen
Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch
dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen
zuverlässig
analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix
verloren.
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Eine Übersicht über die weiteren bekannten
Möglichkeiten,
5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel
entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic
Acids Res. 1998, 26, 2255.
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Die Bisulfit-Technik wird bisher
bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler
W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman
and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences
at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8) nur in
der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines
bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder
komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny
of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6)
oder einzelne Cytosin-Positionen durch
eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones
PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites
using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE).
Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31, WO 95/00669) oder
einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative
DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4)
nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben
worden (Olek et al., WO 99/28498).
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Weitere Publikationen, die sich mit
der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei
einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine
residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431; Zeschnigk
M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted
segments in the human genome: different DNA methylation patterns
in the Prader-Willi/Angelmau syndrome region as determined by the
genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95;
Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis
on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic
sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6; Martin V,
Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates
a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2
gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995
May 19;157(1-2):261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO 97/45560.
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Eine Übersicht über den Stand der Technik in
der Oligomer Array Herstellung läßt sich
aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics
(Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort
zitierten Literatur entnehmen.
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Für
die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte
Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist
das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen
Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt
beispielsweise über
ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen
anderen, kommerziell erhältlich.
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Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie
(MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse
von Biomolekülen
(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins
with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988
Oct 15;60(20):2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende
Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix
verdampft und das Analytmolekül
so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird
die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt
die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen
Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen
erreichen den Detektor früher
als größere.
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MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich
ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse
von Nukleinsäuren
ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations
and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit
etwa 100 mal schlechter als für
Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die
ein vielfach negativ geladenes Rückgrat
haben, ist der Ionisationsprozeß durch
die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie
spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption
von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrizes gefunden worden,
die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile
einige ansprechende Matrizes, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied
nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert
werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem
Peptid ähnlicher wird.
Phosphorothioatnukleinsäuren,
bei denen die gewöhnlichen
Phosphate des Rückgrats
durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache
Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG,
Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by
mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73).
Die Kopplung eines „charge
tags" an diese modifizierte
DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen
Betrag, wie er für
Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse
gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate
stark erschweren.
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Genomische DNA wird durch Standardmethoden
aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen.
Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und
Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
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Beschreibung
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Es ist die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, die chemisch modifizierte DNA von Genen zur Verfügung zu
stellen, die mit Apoptose assoziiert sind, sowie Oligonukleotide
und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen
, sowie ein Verfahren bereitzustellen, welches sich zur Diagnose
und/oder der Therapie von genetischen und epigenetischen Parametern
von Genen, die mit Apoptose assoziiert sind, besonders eignet. Der
Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass genetische und epigenetische
Parameter und insbesondere die Cytosin-Methylierungsmuster von Genen,
die mit Apoptose assoziiert sind, zur Diagnose und/oder der Therapie
von mit Apoptose assoziierten Erkrankungen besonders eignen.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch
das zur Verfügung
stellen einer Nukleinsäure,
die einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch
vorbehandelten DNA von Genen, die mit Apoptose assoziiert sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 78 und dazu komplementären Sequenzen und/oder
der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Apoptose assoziiert
sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene enthält, gelöst. In der
Tabelle sind nach den aufgelisteten Gen-Bezeichnungen die jeweiligen
Datenbanknummern (Zugangsnummern) angegeben, die die dazugehörigen Gensequenzen
als einmalig definieren. GenBank am National Institute of Health
wurde als die zu Grunde liegende Datenbank unter der Internet Adresse
www.ncbi.nlm.nih.gov verwendet.
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Die chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte
bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von genetischen
und epigenetische Parametern gebracht werden.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer zur Detektion
des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA,
umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von
mindestens 13 Nukleotiden gelöst,
die an eine chemisch vorbehandelte DNA von Genen, die mit Apoptose
assoziiert sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 78 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Apoptose
assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene hybridisiert.
Die erfindungsgemäßen Oligomersonden
stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung
der genetischen und epigenetischen Parameter von Genen, die mit
Apoptose assoziiert sind, erst ermöglichen. Bevorzugterweise umfaßt die Basensequenz
der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die Sonden können auch
in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders
bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind
erfindungsgemäße Oligonukleotide,
bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5. – 9. Nukleotid
vom 5'-Ende des
13 mers ist, im Falle von PNA-Oligomeren ist es bevorzugt, dass
das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4. – 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers
ist.
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Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise
in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide
eine der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 78 und dazu
komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Apoptose
assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene mindestens ein
Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das für jedes der CpG Dinukleotide
aus einer der Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 78 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Apoptose
assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene mindestens ein
Oligomer umfaßt.
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Darüber hinaus stellt die Erfindung
ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als
sogenannte „Primer-Oligonukleotide" zur Amplifikation
von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 78 und
dazu komplementären
Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die
mit Apoptose assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene oder Abschnitten
davon eingesetzt werden können.
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Im Falle der erfindungsgemäßen Sets
von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, dass mindestens ein Oligonukleotid
an eine Festphase gebunden ist.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin einen Satz von mindestens 10 n (Oligonukleotiden und/oder
PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes
in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No. 1 bis Seq.
ID No. 78 und dazu komplementären
Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die
mit Apoptose assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene) dienen. Mit diesen
Sonden ist die Diagnose von genetischen und epigenetischen Parametern
von Genen, die mit Apoptose assoziiert sind möglich. Das Set von Oligomeren
kann auch zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs)
in der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Apoptose assoziiert
sind gemäß einer
der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 78 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Apoptose
assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene verwendet werden.
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Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass eine
von der Erfindung zur Verfügung
gestellte Anordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder
PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine
Festphase gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen
Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet
sein, dass es auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder
hexagonalen Gitters angeordnet ist. Bevorzugterweise besteht die
Festphasenoberfläche
aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer,
Nickel, Silber oder Gold. Möglich
sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel
Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial
fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit Apoptose assoziierten
Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung
an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von
solchen Arrays sind zum Beispiel aus der
US 5,744,305 mittels Festphasenchemie
und photolabilen Schutzgruppen bekannt.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
betrifft einen DNA-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit Apoptose
assoziierten Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden
Erfindung umfaßt.
DNA-Chips sind zum Beispiel aus der
US
5,837,832 bekannt.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden
Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens
zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18
Basenpaaren langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen
(Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 78 und dazu komplementären Sequenzen
und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Apoptose
assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene), Oligonukleotiden
und/oder PNA-Oligomeren sowie einer Anleitung zur Durchführung und
Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann. Ein Kit im
Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten
Bestandteile enthalten.
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Die Erfindung stellt weiterhin ein
Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern
von Genen, die mit Apoptose assoziiert sind durch Analyse von Cytosin-Methylierungen
und Single Nucleotide Polymorphismen zur Verfügung, das folgende Schritte
umfaßt:
In einem ersten Verfahrensschritt wird eine genomische DNA-Probe
derart chemisch behandelt, dass an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen
in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten
her dem Cytosin unähnliche
Base umgewandelt werden. Dies wird im folgenden unter „chemischer
Vorbehandlung" verstanden.
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Die zu analysierende genomische DNA
wird bevorzugt aus den üblichen
Quellen für
DNA erhalten, wie Zellen oder Zellbestandteilen, zum Beispiel Zeltlinien,
Biopsine, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit,
in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen,
Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische
Objektträger
oder Kombinationen davon.
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Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene
Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit)
und anschließender
alkalischer Hydrolyse angewendet, die zu einer Umwandlung nicht
methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom
Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.
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Aus dieser chemisch vorbehandelten
genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von
erfindungsgemäßen Primer-Oligonukleotiden
und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert.
Aus statistischen und praktikablen Erwägungen werden bevorzugterweise
mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100 – 2000 Basenpaare
lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten kann simultan
in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird
die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens umfasst der Satz von Primer-Oligonukleotiden mindestens zwei Oligonukleotide,
deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens
18 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang (Seq. ID No. 1 bis
Seq. ID No. 78 und dazu komplementären Sequenzen und/oder der
chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit Apoptose assoziiert sind
gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene und dazu komplementären Sequenzen) aufgelisteten
Basensequenzen sind. Die Primer-Oligonukleotide sind vorzugsweise
dadurch gekennzeichnet, dass sie kein CpG Dinukleotid enthalten.
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Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass bei
der Amplifikation mindestens ein Primer-Oligonukleotid an eine Festphase gebunden
ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen können auf
einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen
Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt
aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer,
Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien,
wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.
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Die mittels der Amplifikation erhaltenen
Fragmente können
eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt
sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden
oder ablösbaren
Molekülfragmenten
mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen
werden können,
wobei bevorzugt ist, dass die erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit
im Massenspektrometer eine einzelne positive oder negative Nettoladung
aufweisen. Der Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations
Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie
(ESI) durchgeführt
und visualisiert werden.
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Die im zweiten Verfahrensschritt
erhaltenen Amplifikate werden anschließend an einen Satz von Oligonukleotiden
und/oder PNA- Sonden der oder an ein Array hybridisiert. Die Hybridisierung
erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der
Hybridisierung verwendete Satz besteht bevorzugterweise aus mindestens
10 Oligonukleotid oder PNA-Oligomer
Sonden. Die Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an
einer Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht
hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die besagten
Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer
Länge von
13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt
der im Anhang aufgeführten
Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das
Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers
aus betrachtet. Für
jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besagten
PNA-Oligomere umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von
9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt
der im Anhang aufgeführten
Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das
Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers
aus gesehen. Für
jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.
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Im vierten Verfahrensschritt entfernt
man die nicht hybridisierten Amplifikate.
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Im letzten Verfahrensschritt detektiert
man die hybridisierten Amplifikate. Dabei ist bevorzugt, dass an den
Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase,
an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar
sind.
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Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass die
Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide
oder ablösbare
Molekülfragmente
mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen
werden können.
Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu
den Amplifikaten komplementäre
Sonden im Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion
mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie
(MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführen und
visualisieren kann.
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Zur besseren Detektierbarkeit im
Massenspektrometer können
die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung
aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren zur Ermittlung
von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von Genen, die
mit Apoptose assoziiert sind, verwendet.
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Die erfindungsgemäßen Oligomere oder Arrays derselben
sowie ein erfindungsgemäßes Kit
sollen zur Diagnose und/oder Therapie einer mit Apoptose assoziierten
Krankheit durch Analyse von Methylierungsmustern von Genen, die
mit Apoptose assoziiert sind, verwendet werden. Erfindungsgemäss bevorzugt
ist die Verwendung des Verfahrens zur Diagnose und/oder Therapie
bedeutender genetischer und/oder epigenetischer Parameter innerhalb
von Genen, die mit Apoptose assoziiert sind.
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Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Beispiel
der Diagnose und/oder der Therapie von HIV-Infektion, Bloom Syndrom,
Cardiopathie, Alterung, neurodegenerativer Erkrankungen, Herpes
simplex Virusinfektion, renaler Ischämie, Amyotropher Lateralsklerose,
soliden Tumoren und Krebsarten.
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Auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der
Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 78 und dazu komplementäre Sequenzen
und/oder die chemisch vorbehandelte DNA von Genen, die mit Apoptose
assoziiert sind gemäß einer
der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene und dazu komplementäre Sequenzen
können für die Diagnose
und/oder der Therapie von genetischen und/oder epigenetischen Parametern
von Genen, die mit Apoptose assoziiert sind, verwendet werden.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums und/oder
Therapeutikums zur Diagnose und/oder der Therapie von Krankheiten,
die mit Apoptose assoziiert sind durch Analyse von Methylierungsmustern
von Genen, die mit Apoptose assoziiert sind, wobei das Diagnostikum
und/oder das Therapeutikum dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens
eine Nukleinsäure,
gemäß der vorliegenden
Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen
zu dessen Herstellung verwendet wird.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung betrifft ein Diagnostikum und/oder Therapeutikum für Krankheiten,
die mit Apoptose assoziiert sind, durch Analyse von Methylierungsmustern
von Genen, die mit Apoptose assoziiert sind, wobei das Diagnostikum
und/oder Therapeutikum dadurch gekennzeichnet ist, das es mindestens
eine Nukleinsäure
gemäß der Erfindung,
gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen
enthält.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten
oder Individuen, bei dem die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden
genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb von Genen,
die mit Apoptose assoziiert sind mit einem anderen Satz genetischen
und/oder epigenetischen Para meter verglichen werden können und
die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose
nachteiliger Ereignisse für
Patienten oder Individuen dienen.
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Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden
Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur
eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz
im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen.
Unter "stringenten
Hybridisierungsbedingungen" sind
solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei
60°C in
2,5 x SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer
geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.
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Mit dem Begriff "funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen
bezeichnet, die komplementär
zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit
der Referenzsequenz hybridisieren und eine zu dem entsprechenden
erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche
Aktivität
aufweisen.
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"Genetische
Parameter" im Sinne
dieser Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von Genen, die
mit Apoptose assoziiert sind und zu deren Regulation weiterhin erforderlicher
Sequenzen. Insbesondere sind als Mutationen Insertionen, Deletionen,
Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt
SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnen.
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"Epigenetische
Parameter" im Sinne
dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin-Methylierungen und weitere chemische
Modifikationen von DNA-Basen von Genen, die mit Apoptose assoziiert
sind und zu deren Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen.
Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise die Acetylierung
von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt
analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung
korreliert.
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Die Erfindung soll nun im folgenden
auf Basis der Sequenzen und Beispiele weiter verdeutlicht werden,
ohne dass die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.
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1
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1 zeigte
die Hybridisierung von Fluoreszenz-markierten Amplifikaten an ein
Oberflächengebundenes
Oligonukleotid. Probe I stammt von gesundem Gewebe und Probe II stammt
von pilocytischem Astrocytom (Tumor)-Gewebe. Die Fluoreszenz an
einem Punkt zeigt die Hybridisierung des Amplifikats an. Die Hybridisierung
an ein CG Oligonukleotid zeigt an, dass die Methylierung an der
Cytosin-Position analysiert wird, die Hybridisierung an ein TG Oligonukleotid
zeigt an, dass keine Methylierung an der Cytosin-Position analysiert
wird.
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Sequenz ID Nos. 1 bis
74
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Sequenzen, die ungerade Sequenznummern
haben (z.B., Seq. ID No. 1, 3, 5, ...) zeigen in jedem Fall Sequenzen
der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von verschiedenen Genen,
die mit Apoptose assoziiert sind. Sequenzen, die gerade Sequenznummern
aufweisen (z.B., Seq. ID No. 2, 4, 6, ...) zeigen in jedem Fall
Sequenzen der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von verschiedenen
Genen, die mit Apoptose assoziiert sind, die komplementär zu den
voranstehenden Sequenzen sind (z.B., die komplementäre Sequenz
zu Seq. ID No. 1 ist Seq. ID No. 2, die komplementäre Sequenz
zu Seq. ID No. 3 ist Seq. ID No. 4, usw.)
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Seq. ID No. 75 bis Seq.
ID No. 78
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Seq. ID No. 75 bis Seq. ID No. 78
zeigen die Sequenzen von Oligonukleotiden, wie in Beispiel 1 verwendet.
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Das folgende Beispiel betrifft ein
Fragment eines Gens, das mit Apoptose assoziiert ist, in diesem
Fall „Death-associated
Protein 1" (DAPK1),
worin eine spezifische CG-Position auf ihren Methylierungsstatus
hin analysiert wird.
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Beispiel 1: Methylierungsanalyse
in dem mit Apoptose assoziierten Gen DAPK1
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Das folgende Beispiel betrifft ein
Fragment des Gens DAPK1, worin eine spezifische CG-Position auf ihren
Methylierungsstatus hin analysiert wird.
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Im ersten Schritt wird eine genomische
Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit)
derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten
Cytosine so verändert
werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche
Base entsteht, während
die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben.
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Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet,
so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt.
Zudem müssen
ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein.
Eine anschließende
alkalische Hydrolyse führt
dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in
Uracil. Chemisch umgewandelte DNA (Sequence ID Nos. 73 und 74) dient
dann dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt
verdünnt
man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen
Lösung.
Bevorzugt wird anschliessend eine Desulfonierung der DNA (10-30
min, 90-100 °C)
bei alkalischem pH-Wert durchgeführt.
Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe
in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase.
Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens DAPK1 analysiert.
Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden ATTAATATTATGTAAAGTGA
(Seq. ID No. 75) und CTTACAACCATTCACCCACA (Seq. ID No. 76) ein definiertes Fragment
der Länge
465 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein
vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung
einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise GTTATATCGTGGAGGATA
(Seq. ID No. 76), wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position
135 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts
beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primer-Oligonukleotiden,
die für
die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten
DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt
es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem
Oligonukleotid. Somit kann der Methylierungsstatus des jeweiligen
zu untersuchenden Cytosins über
das Hybridisierungsprodukt abgeleitet werden.
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Um den Methylierungsstatus der Position
zu überprüfen, wird
eine Probe des Amplifikats weiterhin an ein anderes Oligonukleotid
hybridisiert, das vorher an eine feste Phase gebunden wurde. Dieses
Oligonukleotid ist identisch zu dem Oligonukleotid, das vorher benutzt
wurde, um den Methylierungsstatus der Probe zu analysieren, mit
der Ausnahme der fraglichen Position. An der zu analysierenden Position
umfasst das Oligonukleotid eine Thymin-Base, im Gegensatz zu einer
Cytosin-Base d.h. die Sequenz GTTATATTGTGGAGGATA (Seq. ID No. 78).
Daher findet die Hybridisierungsreaktion nur statt, falls ein nicht-methyliertes
Cytosin an der zu analysierenden Positionen vorhanden ist. Das Verfahren
wurde an zwei Zellproben aus 2 Patienten durchgeführt, wobei
Probe 1 aus normalem gesunden Gewebe und Probe 2 aus einer pilocytischem
Astrocytom Tumorprobe stammte.
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Aus den Ergebnissen (siehe 1) kann gesehen werden,
dass Probe I ein Gemisch von sowohl methylierten und nicht-methylierten
Zellen an der Position des Amplifikats enthielt, wohingegen Probe
2 nur methylierte Zellen an Position 135 des Amplifikats enthielt.
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Beispiel 2: Diagnose von mit Apoptose
assoziierten Erkrankungen Um einen Bezug der Methylierungsmuster
zu einer der mit Apoptose assoziierten Erkrankungen herzustellen,
bedarf es zunächst
der Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster einer Gruppe von erkrankten
und einer Gruppe von gesunden Personen. Diese Untersuchungen werden
zum Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die so erhaltenen Ergebnisse
werden in einer Datenbank abgespeichert und die CpG Dinukleotide
identifiziert, die zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich methyliert
sind. Dies kann durch Bestimmung einzelner CpG Methylierungsraten
erfolgen, wie dies z. B. durch Sequenzieren relativ ungenau oder
aber durch eine Methylierungs-sensitive „Primer-Extension-Reaktion" sehr genau möglich ist.
Auch gleichzeitige Analyse des gesamten Methylierungsstatus ist
möglich,
und die Muster können
z.B. mittels Clustering-Analysen, die z.B. durch einen Rechner durchgeführt werden
können,
verglichen werden.
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Nachfolgend ist es möglich, untersuchte
Patienten einer bestimmten Therapiegruppe zuzuordnen und diese Patienten
gezielt mit einer individualisierten Therapie zu behandeln.
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Beispiel 2 kann zum Beispiel für die folgenden
Erkrankungen durchgeführt
werden: HIV-Infektion, Bloom Syndrom, Cardiopathie, Alterung, neurodegenerativer
Erkrankungen, Herpes simplex Virusinfektion, renaler Ischämie, Amyotropher
Lateralsklerose, soliden Tumoren und Krebsarten.
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