DE60317045T2

DE60317045T2 - Verfahren und nukleinsäuren zur analyse von störungen der proliferation kolorektaler zellen

Info

Publication number: DE60317045T2
Application number: DE60317045T
Authority: DE
Inventors: Peter Adorjan; Matthias Burger; Sabine Maier; Ralf Lesche; Susan Seattle COTTRELL; Theo Seattle DE VOS
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2002-02-27
Filing date: 2003-02-13
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2023-02-14
Also published as: DE60335245D1; EP1478784A2; US20140179563A1; JP2005518218A; DE60317045D1; EP1478784B1; US9988683B2; WO2003072820A2; EP1478778A2; AU2003248349B2; US20150275312A1; EP1478778B1; US20060234224A1; EP1481095B1; WO2003072820A3; AU2003210265A1; WO2003072812A2; AU2003248349A1; EP1340818A1; WO2003072821A2

Description

Bereich der Erfindung
Kolorektaler Krebs ist die vierthäufigste Ursache von Krebsmortalität bei Männern und Frauen. Die Fünfjahres-Überlebensrate ist 61% über alle Phasen hinweg, wobei der frühe Nachweis eine Vorraussetzung für die heilende Therapie der Erkrankung ist. Bis zu 95% der kolorektalen Krebsarten sind Adenokarzinome variierender Differenzierungsgrade.
Sporadischer Darmkrebs entwickelt sich in einem Multischritt-Prozeß, der mit der pathologischen Transformation von normalem Darmepithel zu einem Adenom beginnt, das sich nachfolgend zu invasivem Krebs fortentwickelt. Die Fortentwicklungsrate von Darmadenomen wird augenblicklich basierend auf ihrem histologischen Aussehen, dem Ort, dem Ausmaß an Verteilung und dem Ausmaß an Darmbeteiligung vorhergesagt. Zum Beispiel entwickeln sich Tubular-Typ benigne Adenome selten zu malignen Tumoren fort, wohingegen villöse benigne Adenome, insbesondere wenn sie größer als zwei Zentimeter im Durchmesser sind, ein signifikantes malignes Potential aufweisen.
Während der Fortentwicklung von benignen proliferativen Läsionen zu malignen Neoplasmen sind mehrere auftretende genetische und epigenetische Veränderungen bekannt. Somatische Mutation des APC-Gens scheint eines der am frühesten auftretende Ereignisse in 75 bis 80% von kolorektalen Adenomen und Karzinomen zu sein. Von der Aktivierung von K-ras wird angenommen, daß sie ein kritischer Schritt im Fortschreiten in Richtung auf einen malignen Phänotyp ist. Anschließend häufen sich Mutationen in anderen Onkogenen sowie Veränderungen, die zur Inaktivierung von Tumorsuppressor-Genen führen an.
Die aberrante DNA Methylierung innerhalb von CpG Inseln findet sich unter den am frühesten und am häufigsten auftretenden Veränderungen in menschlichen Krebsarten, was zu einer Abschaltung oder Überexpression eines breiten Spektrums an Genen führt. Zusätzlich wurde von abnormaler Methylierung gezeigt, daß sie in CpG-reichen regulatorischen Elementen in intronischen und kodierenden Teilen von Genen bei bestimmten Tumoren auftritt. Im Gegensatz zu der spezifischen Hypomethylierung von Tumorsuppressor-Genen kann eine insgesamte Hypomethylierung von DNA in Tumorzellen beobachtet werden. Diese Abnahme in der globalen Methylierung kann früh nachgewiesen werden, weit vor der Entwicklung einer freien Tumorbildung. Auch wurde eine Korrelation zwischen Hypomethylierung und der erhöhten Genexpression für viele Onkogene berichtet. Bei Darmkrebs stellt die aberrante DNA Methylierung eine der deutlichsten Veränderungen dar und inaktiviert viele Tumuorsuppressor-Gene wie z. B. p14ARF, p16INK4a, THBS1, MINT2 und MINT31 und DNA-Fehlpaarungs-Reparaturgene, wie z. B. hMLH1.
Bei der molekularen Entwicklung von Darmkrebs wurde für DNA Methylierungsfehler vermutet, daß diese zwei getrennte Rollen spielen. In normalen Darmmucosa-Zellen häufen sich Methylierungsfehler als eine Funktion des Alters oder als zeitabhängige Ereignisse an, was diese Zellen für eine neoplastische Transformation prädisponiert. Zum Beispiel konnte von einer Hypermethylierung bestimmter Loci gezeigt werden, daß diese bereits in Adenomen vorhanden ist, insbesondere in den tubuvillösen und villösen Subtypen. In späteren Phasen spielt die erhöhte DNA Methylierung von CpG Inseln eine wichtige Rolle in einer Untergruppe von Tumoren, die durch den sogenannten CpG Insel-Methylator Phänotyp (CIMP) beeinträchtigt sind. Die meisten CIMP+ Tumore, die ungefähr 15% aller sporadischen kolorektalen Krebsarten darstellen, sind durch Mikrosatelliteninstabilität (MIN) aufgrund von Hypermethylierung des hMLH1 Promotors und anderer DNA Fehlpaarungsreparatur-Gene gekennzeichnet. Im Gegensatz dazu entwickeln sich CIMP-Darmkrebsarten entlang eines klassischeren genetischen Instabilitätssignalwegs (CIN), mit einer hohen Rate von p53 Mutationen und chromosomalen Veränderungen.
Jedoch zeigen die molekularen Subtypen nicht nur variierende Frequenzen im Hinblick auf molekulare Veränderungen. In Abhängigkeit von der Anwesenheit von entweder Mikrosatelliteninstabilität oder chromosomalen Veränderungen kann Darmkrebs in zwei Klassen subklassifiziert werden, die auch signifikante klinische Unterschiede aufweisen. Fast alle MIN Tumore entstammen dem proximalen Darm (Aszendes und Transversum), wohingegen 70% der CIN Tumore im distalen Darm und dem Rektum lokalisiert sind. Dies wurde der variierenden Prävalenz von verschiedenen Karzinogenen in verschiedenen Abschnitten des Darms zugeordnet. Methylierende Karzinogene, die das vorherrschende Karzinogen im proximalen Kolon darstellen, wurden als eine Rolle in der Pathogenese von MIN Krebsarten spielend vorgeschlagen, wohingegen von CIN Tumoren geglaubt wird, daß sie häufiger durch Addukt bildende Karzinogene verursacht werden, die häufiger in distalen Teilen des Kolons und dem Rektum auftreten. Darüber hinaus weisen MIN Tumore eine bessere Prognose auf als dies Tumore mit einem CIN Phänotyp tun und sprechen besser auf eine adjuvante Chemotherapie an.
Die Identifizierung von Markern zur Unterscheidung von Darmkarzinomen sowie für einen frühen Nachweis sind hauptsächliche Ziele der augenblicklichen Forschung.
EYA4 ist das am kürzlichsten identifizierte Mitglied der Vertebraten-Eya (eyes-absent) Genfamilie, einer Gruppe von vier Transkriptionsaktivatoren, die mit anderen Proteinen in einer konservierten regulatorischen Hierarchie interagieren, um eine normale embryonale Entwicklung sicherzustellen. Das EYA4 Gen ist auf 6q22.3 kartiert und kodiert für ein 640 Aminosäureprotein. Die Struktur von EYA4 entspricht dem Basismuster, das durch EYA1–3 etabliert wurde und schließt einen hochkonservierten 271 Aminosäure C-Terminus ein, der EYA-homologe Region (eyaHR, alternativ auch als die eya-Domäne oder eya Homologie Domäne 1 bezeichnet) genannt wird, und eine mehr divergierende Prolin-Serin-Threonin (PST)-reiche (34–41%) Transaktivierungs-Domäne am N-Terminus (Borsani G, et al., EYA4, a novel vertebrate gene related to Drosophila eyes absent. Hum Mol Genet 1999 Jan; 8(1): 11–23). EYA Proteine interagieren mit Mitgliedern der SIX und DACH Proteinfamilien während der frühen embryonalen Entwicklung. Mutationen im EYA4 Gen sind für den postlingualen, progressiven autosomal-dominanten Hörverlust am DFNA10 Lokus verantwortlich (Wayne S, Robertson NG, DeClau F, Chen N, Verhoeven K, Prasad S, Tranebjarg L, Morton CC, Ryan AF, Van Camp G, Smith RJ: Mutations in the transcriptional activator EYA4 cause late onset deafness at the DFNA10 locus. Hum Mol Genet 2001 Feb 1; 10(3): 195–200, mit weiteren Referenzen).
WO 01/68912 und WO 02/00926 beschreiben den Zusammenhang zwischen der Methylierung von EYA4 und Krebs. "Hiltunen et al: Hypermethylation of the wt1 and calcitonin gene promoter regions at chromosome 11p in human colerectal cancer" BRITISH JOURNAL OF CANCER, LONDON, Vol. 76, Nr. 9, 1997, Seiten 1124–1130 beschreiben die Beteiligung von wt1 und Calcitonin in Kolon proliferativen Erkrankungen.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalente Basenmodifikation in der DNA von eukaryontischen Zellen. Sie spielt z. B. eine Rolle bei der Regulation der Transkription, bei genetischem Imprinting und in der Tumorgenese. Daher ist die Identifizierung von 5-Methylcytosin als einer Komponente an genetischer Information von beträchtlichem Interesse. Jedoch können 5-Methylcytosin-Positionen nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das selbe Basenpaarungsverhalten wie Cytosin aufweist. Darüber hinaus geht die durch 5-Methylcytosin getragene epigenetische Information während der PCR Amplifikation vollständig verloren.
Ein relativ neues, und augenblicklich das am häufigsten verwendete Verfahren zur Analyse von DNA auf 5-Methylcytosin, basiert auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse, in Uracil überführt wird, das in seinem Basenpaarungsverhalten Thymidin entspricht. Jedoch bleibt 5-Methylcytonsin unter diesen Bedingungen unverändert. Konsequenterweise wird die ursprüngliche DNA auf solch eine Weise umgewandelt, das Methylcytonsin, das ursprünglich nicht von Cytosin durch sein Hybridisierungsverhalten unterschieden werden konnte, jetzt als das einzig verbleibende Cytosin nachgewiesen werden kann, wobei "normale" molekularbiologische Techniken verwendet werden, wie z. B. Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung. Alle diese Techniken basieren auf der Basenpaarung, die jetzt vollständig ausgenutzt werden kann. Im Hinblick auf die Sensitivität wird der Stand der Technik durch ein Verfahren definiert, das die DNA, die analysiert werden soll, in eine Agarosematrix einschließt, was die Diffusion und die Renaturierung der DNA verhindert (Bisulfit reagiert nur mit einzelsträngiger DNA) und was alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch eine schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dez 15; 24(24): 5064–6). Unter der Verwendung dieses Verfahrens ist es möglich einzelne Zellen zu analysieren, was das Potential der Methode verdeutlicht. Jedoch können im Augenblick nur einzelne Regionen eine Länge von bis zu ungefähr 3000 Basenpaaren analysiert werden, eine globale Analyse von Zellen auf Tausende von möglichen Methylierungsereignissen ist nicht möglich. Jedoch kann auch dieses Verfahren nicht verläßlich sehr kleine Fragmente aus kleinen Probenmengen analysieren. Diese gehen trotz des Diffusionsschutzes durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiterhin bekannten Verfahren zum Nachweis von fünf Methylcytosin kann aus dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
Augenblicklich wird die Bisulfittechnik, mit ein paar Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test fort he diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based an alletic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr; 5(2): 94–8) nur in der Forschung verwendet. Immer werden jedoch kurze, spezifische Fragmente eines bekannten Gens im Anschluß an eine Bisulfitbehandlung amplifiziert und entweder vollständig sequenziert, (Olek A, Walter J. The preimplantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat. Genet. 1997 Nov; 17(3): 275–6), oder aber individuelle Cytosinpositionen werden durch eine Primer-Verlängerungsreaktion (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide Primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2529–31, WO 95/00669 ) oder durch enzymatischen Verdau (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2532–4) nachgewiesen. Zusätzlich wurde auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben (Olek et al., WO 99/28498 ).
Weitere Publikationen, die die Verwendung der Bisulfittechnik für den Methylierungsnachweis in einzelnen Genen behandeln, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun; 16(6): 431–6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation Patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar; 6(3): 387–95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis an individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25; 22(4): 695–6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19; 157(1–2); 261–4; WO 97/46705 und WO 95/15373 .
Einen Überblick über den Stand der Technik bei der Herstellung von Oligomer-Arrays kann aus einer Sonderauflage von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999), publiziert im Januar 1999, entnommen werden und aus der darin zitierten Literatur.
Fluoreszenz-markierte Sonden werden oft zum Scannen von immobilisierten DNA Arrays verwendet. Die einfach Anbringung von Cy3- und Cy5-Farbstoffen an das 5'-OH der spezifischen Sonde sind besonders für Fluoreszenzmarkierungen geeignet. Der Nachweis der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden kann z. B. über ein konfokales Mikroskop durchgeführt werden. Cy3- und Cy5-Farbstoffe sind neben vielen anderen kommerziell erhältlich.
Matrix-gestützte Laser-Desorptions-Ionisierungs-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr effiziente Entwicklung zur Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of Proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15; 60(20): 2299–301). Ein Analyt wird in einer Licht-absorbierenden Matrix eingebettet. Die Matrix wird durch einen kurzen Laserpuls verdampft, was das Analytmolekül auf eine unfragmentierte Weise in die Dampfphase transportiert. Der Analyt wird durch Kollisionen mit Matrixmolekülen ionisiert. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Aufgrund ihrer verschiedenen Massen werden die Ionen mit unterschiedlichen Raten beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor eher, als größere.
Die MALDI-TOF-Spektrometrie ist ausgezeichnet für die Analyse von Peptiden und Proteinen geeignet. Die Analyse von Nukleinsäuren ist ein wenig schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147–57). Diese Sensitivität für Nukleinsäuren ist ungefähr 100-fach schlechter als für Peptide und nimmt disproportional mit ansteigender Fragmentgröße ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisierungsprozeß über die Matrix beträchtlich weniger effizient. In der MALDI-TOF-Spektrometrie spielt die Auswahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden wurden mehrere sehr effiziente Matrizes gefunden, die eine sehr feine Kristallisation produzieren. Es gibt nun mehrere responsive Matrizes für DNA, jedoch wurde der Unterschied in der Sensitivität nicht verringert. Der Unterschied in der Sensitivität kann durch die chemische Modifikation der DNA auf solche Weise verringert werden, daß sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioat-Nukleinsäuren, in denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate ersetzt sind, können unter der Verwendung von einfacher Alkylierungschemie in eine Ladungs-neutrale DNA überführt werden (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25; 23/8): 1367–73). Die Kopplung eines geladenen Markers an diese modifizierte DNA führt zu einem Anstieg der Sensitivität im selben Ausmaß wie diejenige, die für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil der Ladungsmarkierung ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis von unmodifizierten Substraten beträchtlich schwieriger machen.
Genomische DNA wird aus DNA einer Zelle, Gewebe oder anderen Testproben unter der Verwendung von Standardverfahren erhalten. Diese Standardmethodologie kann in Referenzen, wie z. B. Sambrook, Fritsch und Maniatis Herausgeber, Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 1989, gefunden werden.
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung beschreibt neue Verfahren zum Nachweis von proliferativen Erkrankungen von Zellen. Die Erfindung beschreibt die Verwendung des Gens EYA4 sowie ihres Promotors und regulatorischer Elemente als ein Marker für proliferative Erkrankungen von Kolonzellen. Genauer zeigt der offenbarte Gegenstand die Anwendbarkeit des Gens für den Nachweis von proliferativen Erkrankungen von Kolonzellen, der Unterscheidung zwischen verschiedenen Klassen von proliferativen Erkrankungen von Kolonzellen, sowie der Differenzierungen von proliferativen Erkrankungen von Kolonzellen von proliferativen Erkrankungen von Zellen, die aus anderen Geweben abstammen. In einem Aspekt der Erfindung stellen die beschriebenen Gegenstände neue Nukleinsäuresequenzen zur Verfügung, die für die Analyse von Methylierung innerhalb des Gens brauchbar sind, andere Aspekte stellen neue Verwendungen des Gens und des Genprodukts sowie Verfahren, Assays und Kits zur Verfügung, die auf den Nachweis, die Differenzierung und die Unterscheidung von proliferativen Erkrankungen von Kolonzellen gerichtet sind, sowie therapeutische und diagnostische Verfahren dafür.
In einer Ausführungsform beschreibt das Verfahren die Verwendung des Gens EYA4 als ein Marker für die Differenzierung, den Nachweis und die Unterscheidung von proliferative Erkrankungen von Kolonzellen. Diese Verwendung des Gens kann mittels jeglicher Analyse der Expression des Gens mittels mRNA Expressionsanalyse oder Proteinexpressionsanalyse ermöglicht werden. Jedoch wird in der am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung der Nachweis die Differenzierung und die Unterscheidung von proliferativen Erkrankungen von Kolonzellen mittels der Analyse des Methylierungsstatus des Gens EYA4 und seines Promotors oder regulatorischer Elemente ermöglicht.
Um die Anwesenheit von mRNA die für EYA4 im einen Nachweissystem für Kolonkrebs nachzuweisen, wird eine Probe von einem Patienten erhalten. Die Probe kann eine Gewebebiopsieprobe oder eine Probe von Blut, Plasma, Serum oder ähnlichem sein. Die Probe kann behandelt werden, um die Nukleinsäuren, die darin enthalten sind, zu extrahieren. Die sich ergebende Nukleinsäure aus der Probe wird einer Gelelektrophorese oder anderen Auftrennungstechniken unterzogen. Der Nachweis schließt ein in Kontakt bringen der Nukleinsäuren und insbesondere der mRNA der Probe mit einer DNA Sequenz ein, die als eine Sonde dient, um Hybridduplexe zu bilden. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch eine Zahl von Faktoren während der Hybridisierung und während des Waschverfahrens bestimmt, einschließlich Temperatur, Ionenstärke, Länge der Zeit und Konzentration von Formamid. Diese Faktoren sind in z. B. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual 2. Aufl., 1989) angegeben. Der Nachweis der sich ergebenden Duplex wird gewöhnlicherweise durch die Verwendung von markierten Sonden erreicht. Alternativ kann die Sonde nicht markiert sein, kann jedoch durch spezifische Bindung mit einem Liganden der markiert ist, entweder direkt oder indirekt nachweisbar sein. Geeignete Marker und Verfahren zum Markieren von Sonden und Liganden sind im Stand der Technik bekannt und schließen z. B. radioaktive Markierungen ein, die durch bekannte Verfahren inkorporiert werden können (z. B. Nicktranslation oder Kinasebehandlung), Biotin, fluoreszente Gruppen, chemilumineszente Gruppen (z. B. Dioxitane, insbesondere getriggerte Dioxitane), Enzyme, Antikörper und ähnliches.
Um die Sensitivität des Nachweises in einer Probe von mRNA, die für EYA4 kodiert, zu erhöhen, kann die Technik der reversen Transkription/Polymerisationskettenreaktion verwendet werden, um die cDNA zu amplifizieren, die aus einer mRNA transkribiert wurde, die für EYA4 kodiert. Das Verfahren der reversen Transkription/PCR ist im Stand der Technik gut bekannt (z. B. siehe Watson und Fleming, supra).
Das reverse Transkription/PCR Verfahren kann wie folgt durchgeführt werden. Gesamtzelluläre RNA wird durch z. B. das Standard-Guanidium Isothiocyanatverfahren isoliert, und die Gesamt-RNA wird revers transkribiert. Das reverse Transkriptionsverfahren schließt die Synthese von RNA auf einem Templat von RNA unter der Verwendung eines reversen Trankriptase-Enzyms und eines 3'-Ende Primers ein. Typischerweise enthält der Primer eine Oligo (dT)-Sequenz. Die so produzierte cDNA wird dann unter der Verwendung des PCR-Verfahrens und EYA4 spezifischen Primern amplifiziert (Belyavsky et al, Nucl Acid Res 17: 2919–2932, 1989; Krug and Berger, Methods in Enzymology, Academic Press N. Y., Vol. 152, S. 316–325, 1987).
Die vorliegende Erfindung kann in bestimmten Ausführungsformen auch als ein Kit zur Verwendung beim Nachweis eines Kolonkrebserkrankungszustands durch Testen einer biologischen Probe beschrieben werden. Ein repräsentatives Kit kann eines oder mehrere Nukleinsäuresegmente wie oben beschrieben umfassen, die selektiv an EYA4 mRNA hybridisieren, und einen Behälter für jedes der ein oder mehrere Nukleinsäuresegmente. In bestimmten Ausführungsformen können die Nukleinsäuresegmente in einem einzigen Gefäß kombiniert werden. In weiteren Ausführungsformen können die Nukleinsäuresegmente auch ein Paar von Primern zur Amplifikation der Ziel-mRNA einschließen. Solche Kits können auch jegliche Puffer, Lösungen, Lösungsmittel, Enzyme, Nukleotide oder andere Komponenten für die Hybridisierungs-, Amplifikations- oder Nachweisreaktionen einschließen. Bevorzugte Kit-Komponenten schließen Reagenzien für reverse Transkription-PCR, in situ Hibridisierung, Northemanalyse und/oder RPA ein.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit des Polypeptids EYA4 in einer von einem Patienten erhaltenen Probe zur Verfügung. Jedes im Stand der Technik zum Nachweis von Proteinen bekannte Verfahren kann verwendet werden. Solche Verfahren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Immundiffusion, Immuno-Elektrophorese, immunchemische Verfahren, Binder-Ligandenassays, immunohistochemische Techniken, Agglutinations- und Komplementassays (zum Beispiel siehe Basic and Clinical Immunology, Sites und Terr, Hrsg., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. S. 217–262, 1991). Bevorzugt sind Binder-Ligandenimmunoassay-Verfahren, einschließlich des Reagierens von Antikörpern mit einem Epitop oder Epitopen von EYA4 und kompetitive Verdrängung eines markierten EYA4-Proteins oder Derivats davon.
Bestimmte Ausführungsformen der folgenden Erfindung umfassen die Verwendung von Antikörpern, die für das durch das EYA4-Gen kodierte Polypeptid spezifisch sind. Solche Antikörper können für diagnostische und prognostische Anwendungen beim Nachweis des Erkrankungszustandes brauchbar sein, durch Vergleichen des Spiegels von Kolonerkrankungs-Markerexpressionen eines Patienten mit der Expression derselben Marker in normalen Individuen. In bestimmten Ausführungsformen kann die Herstellung von monoklonalen oder polyklonaren Antikörpern durch die Verwendung des EYA4-Polypeptids als Antigen induziert werden. Solche Antikörper können umgekehrt dazu verwendet werden, um exprimierte Proteine als Marker für menschliche Erkrankungszustände nachzuweisen. Die Spiegel von solchen Proteinen wie in peripherem Blut oder Prostatagewebeproben eines Patienten vorhanden, können durch herkömmliche Verfahren quantifiziert werden. Antikörper-Proteinbindung kann durch eine Vielzahl von Mitteln, die im Stand der Technik bekannt sind, nachgewiesen werden und quantifiziert werden, wie zum Beispiel Markieren mit fluoreszenten oder radioaktiven Liganden. Die Erfindung umfaßt weiterhin Kits zur Durchführung der oben genannten Verfahren, wobei solche Kits Antikörper enthalten, die für die EYA4-Polypeptide spezifisch sind.
Zahlreiche kompetitive und nicht-kompetitive proteinbindende Immunoassays sind im Stand der Technik gut bekannt. Antikörper, die in solchen Assays verwendet werden, können nicht markiert sein, zum Beispiel wie in Agglutinationstests verwendet oder zur Verwendung in einer großen Vielzahl von Assayverfahren markiert sein. Marker, die verwendet werden können, schließen Radionuklide, Enzyme, fluoreszente Gruppen, chemilumineszente Gruppen, Enzymsubstrate oder Co-Faktoren, Enzyminhibitoren, Partikel, Farbstoffe und ähnliches zur Verwendung in Radioimmunoassay (RIA), Enzyminununoassays, z. B. Enzym-gekoppelter Immunsorbentassay (ELISA), Fluoreszenzimmunassays und ähnliches ein. Polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen EYA4 oder ein Epitop davon können zur Verwendung in Immunassays durch jedes einer Zahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Ein Ansatz zur Herstellung von Antikörpern gegen ein Protein ist Selektion und Präparation einer Aminosäuresequenz des ganzen oder eines Teils des Proteins, chemisches Synthetisieren der Sequenz und Injizieren desselben in ein geeignetes Tier, gewöhnlicherweise ein Kaninchen oder eine Maus (Milstein und Köhler Nature 256: 495–497, 1975; Gulfre und Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73: 1–46, Langone und Banatis Hrsg., Academic Press, 1981). Verfahren zur Präparation von EYA4 oder einem Epitop davon schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, chemische Synthese, rekombinante DNA-Techniken oder Isolierung aus biologischen Proben.
Die Erfindung stellt signifikante Verbesserungen über den Stand der Technik zur Verfügung, weil im Augenblick keine Marker verwendet werden, um Kolonkrebs aus Körperflüssigkeitsproben nachzuweisen. Augenblickliche Verfahren, die dazu verwendet werden, um proliferative Erkrankungen von Kolonzellen nachzuweisen und zu diagnostizieren, schließen Kolonoskopie, Sigmoidoskopie und fäkale okkulte Bluttests ein. Im Vergleich zu diesen Verfahren ist die beschriebene Erfindung viel weniger invasiv als die Kolonoskopie und genauso, wenn nicht sogar sensitiver als die Sigmoidoskopie und FOBT. Verglichen zu den früheren Beschreibungen dieser Marker in der Literatur stellt die beschriebene Erfindung signifikante Vorteile im Hinblick auf die Sensitivität und Spezifität aufgrund der vorteilhaften Kombination der Verwendung von hochsensitiven Assaytechniken zur Verfügung.
Die Aufgabe der Erfindung kann durch die Analyse des Methylierungszustands der CpG-Di-nukleotide innerhalb der genomischen Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 und dazu komplementären Sequenzen erreicht werden. SEQ ID Nr. 1 beschreibt das Gen EYA4 und seinen Promotor und regulatorische Elemente, wobei das Fragment CpG-Dinukleotide umfaßt, die ein erkrankungsspezifisches Methylierungsmuster zeigen. Das Methylierungsmuster des Gens EYA4 und seines Promotors und regulatorischer Elemente wurden bisher nicht im Hinblick auf proliferative Erkrankungen von Zellen analysiert. Aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes sollte die Sequenz, wie in SEQ ID Nr. 1 angegeben, so ausgelegt werden, daß sie alle im wesentlichen ähnlichen und äquivalenten Sequenzen stromaufwärts der Promotorregion eines Gens einschließt, das ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität derjenigen, wie durch EYA4 kodiert, einschließt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Aufgabe der Erfindung durch die Analyse einer Nukleinsäure gelöst, die eine Sequenz von mindestens 18 Basen in ihrer Länge gemäß einer der SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementären Sequenzen umfaßt.

Die Sequenzen von SEQ ID Nrn. 2 bis 5 stellen modifizierte Versionen der Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 1 zur Verfügung, wobei die Umwandlung der Sequenz zur Synthese einer Nukleinsäure führt, die eine Sequenz aufweist, die wie folgt einmalig und unterscheidbar von SEQ ID Nr. 1 ist (siehe auch die folgende Tabelle 1): SEQ ID Nr. 1, Sinn-DNA-Strang des EYA4-Gens und seines Promotors und regulatorischer Elemente; SEQ ID Nr. 2, umgewandelte SEQ ID Nr. 1, worin "C" "T" ist, jedoch "CpG" "CpG" bleibt (d. h. Fällen entspricht, in denen für SEQ ID Nr. 1 alle "C"-Gruppen von CpG-Dinukleotidsequenzen methyliert sind und daher nicht umgewandelt wurden); SEQ ID Nr. 3, Komplement von SEQ ID Nr. 1, worin "C", "T" ist, jedoch "CpG" "CpG" bleibt, (d. h. entspricht einem Fall, in dem für das Komplement (Anti-Sinnstrang) von SEQ ID Nr. 1 alle "C"-Reste von CpG-Dinukleotidsequenzen methyliert sind und daher nicht umgewandelt werden); SEQ ID Nr. 4, umgewandelte SEQ ID Nr. 1, worin "C" "T" für alle "C"-Reste ist, einschließlich denjenigen von CpG-Dinukleotidsequenzen (d. h. entspricht dem Fall, in dem für SEQ ID Nr. 1 alle "C"-Reste von CpG-Dinukleotidsequenzen nicht methyliert sind); SEQ ID Nr. 5, Komplement von SEQ ID Nr. 1, worin "C" oder "T" für alle "C"-Reste ist, einschließlich denjenigen von CpG-Dinukleotidsequenzen (d. h. entspricht dem Fall, in dem für das Komplement (Anti-Sinnstrang) von SEQ ID Nr. 1 alle "C"-Reste der CpG-Dinukleotidsequenzen nicht methyliert sind). Tabelle 1. Beschreibung von SEQ ID Nrn. 1 bis 5

SEQ ID Nr.	Verhältnis zu SEQ ID Nr. 1	Art der Cytosinbasenumwandlung
SEQ ID Nr. 1	Sinnstrang (EYA4-Gen einschließlich Promotor und regulatorische Elemente)	Keine; unbehandelte Sequenz
SEQ ID Nr. 2	Umgewandelter Sinnstrang	"C" zu "T", wobei "CpG" "CpG" bleibt (alle "C"-Rest von CpGs sind methyliert)
SEQ ID Nr. 3	Umgewandelter Anti-Sinnstrang	"C" zu "T", wobei "CpG" "CpG" bleibt (alle "C"-Rest von CpGs sind methyliert)
SEQ ID Nr. 4	Umgewandelter Sinnstrang	"C" zu "T" für alle "C"-Reste (alle "C"-Reste von CpGs sind nicht methyliert)
SEQ ID Nr. 5	Umgewandelter Anti-Sinnstrang	"C" zu "T" für alle "C"-Reste (alle "C"-Reste von CpGs sind nicht methyliert)

Signifikanterweise wurden bis jetzt die Nukleinsäuresequenzen und Moleküle gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 nicht mit der Ermittlung von proliferativen Erkrankungen von Kolonzellen in Verbindung gebracht, oder damit in Zusammenhang gebracht.
Die beschriebene Erfindung beschreibt weiter ein Oligonukleotid oder Oligomer zum Nachweis des Cytosin-Methylierungszustands innerhalb von vorbehandelter DNA gemäß SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 5. Das Oligonukleotid oder Oligomer, das eine Nukleotidsäuresequenz, die eine Länge von mindestens neun (9) Nukleotiden umfaßt, unter moderat stringenten oder stringenten Bedingungen (wie hier oben definiert) an eine vorbehandelte Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 5 und/oder Sequenzen, die dazu komplementär sind hybridisiert.
Daher schließt die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle (z. B. Oligonukleotide und Peptidnukleinsäure(PNA)-Moleküle (PNA-Oligomere) ein), die unter moderat stringenten und/oder stringenten Hybridisierungsbedingungen an die ganze oder einen Teil der Sequenzen der SEQ ID Nrn. 2 bis 5 oder an die Komplemente davon hybridisiert. Der hybridisierende Teil der hybridisierenden Nukleinsäuren ist typischerweise mindestens 9, 15, 20, 25, 30 oder 35 Nukleotide lang. Jedoch weisen längere Moleküle eine erfindungsgemäße Brauchbarkeit auf und liegen daher innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung.
Bevorzugterweise ist der hybridisierende Teil der erfindungsgemäßen hybridisierenden Nukleinsäuren zu mindestens 95%, oder mindestens 98% oder 100% identisch zu der Sequenz oder einem Teil davon von SEQ ID Nr: 2 bis 5 oder den Komplementen davon.
Hybridisierende Nukleinsäuren des hier beschriebenen Typs können zum Beispiel als ein Primer verwendet werden (z. B. ein PCR-Primer) oder als eine diagnostische und/oder prognostische Sonde oder Primer. Bevorzugterweise wird die Hybridisierung der Oligonukleotid-Sonde an eine Nukleionsäure-Probe unter stringenten Bedingungen durchgeführt, und die Sonde ist 100% identisch zu der Zielsequenz. Die Nukleinsäure-Duplex- oder Hybridstabilität wird als die Schmelztemperatur oder Tm ausgedrückt, die diejenige Temperatur ist, bei der eine Sonde von einer Ziel-DNA dissoziiert. Diese Schmelztemperatur wird dazu verwendet, um die erforderlichen Stringenzbedingungen zu definieren.
Für Zielsequenzen, die mit den entsprechenden Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 verwandt und im wesentlichen identisch (wie zum Beispiel EYA41 allelische Varianten und SNPs), anders als identisch, sind ist es brauchbar, zuerst die niedrigste Temperatur zu etablieren, bei der nur eine homologe Hybridisierung auftritt, mit einer bestimmten Konzentration an Salz (z. B. SSC oder SSPE). Dann wird unter der Annahme, daß 1% Fehlpaarung zu einer 1°C Zunahme in der Tm führt, die Temperatur des finalen Waschschritts in der Hybridisierungsreaktion entsprechend verringert (zum Beispiel, wenn Sequenzen gesucht werden, die > 95% Identität mit der Sonde aufweisen, wird die finale Waschschritttemperatur um 5°C verringert). In der Praxis kann die Veränderung in der Tm zwischen 0,5°C und 1,5°C pro 1% Fehlpaarung liegen.
Beispiele von erfindungsgemäßen Oligonukleotiden mit der Länge X (in Nukleotiden), wie durch Polynukleotidpositionen im Hinblick auf z. B. SEQ ID Nr. 1 angegeben, schließen diejenigen ein, die Sets von aufeinanderfolgenden überlappenden Oligonukleotiden der Länge X entsprechen, wobei die Oligonukleotide innerhalb jedes aufeinanderfolgenden überlappenden Sets (die einem gegebenen X-Wert entsprechen) als das finite Set von Z Oligonukleotiden von Nukleotidpositionen wie folgt definiert sind: n bis (n + (X – 1));wobei n = 1, 2, 3, ... (Y – (X – 1));
wobei Y der Länge (Nukleotide oder Basenpaare) der SEQ ID Nr. 1 entspricht;
wobei X der gemeinsamen Länge (in Nukleotiden) jedes Oligonukleotids in dem Set entspricht (z. B. X = 20 für ein Set von aufeinander folgenden überlappenden 20-meren); und
wobei die Zahl (Z) von aufeinanderfolgenden überlappenden Oligomeren der Länge X für eine gegebene SEQ ID Nr. einer Länge Y, Y – (X – 1) entspricht. Zum Beispiel Z = 2,785 – 19 = 2,766 für entweder Sinn- oder Gegensinn-Sets von SEQ ID Nr. 1, worin X = 20.
Bevorzugterweise ist das Set auf diejenigen Oligomere beschränkt, die mindestens ein CpG-, TpG- oder CpA-Dinukleotid umfassen.
Die vorliegende Erfindung schließt für jede der SEQ ID Nrn. 2 bis 5 (Sinn und Gegensinn) multiple aufeinander folgende überlappende Sets von Oligonukleotiden oder modifizierten Oligonukleotiden der Länge X ein, worin z. B. X = 9, 10, 17, 20, 22, 23, 25, 27, 30 oder 35 Nukleotide ist.
Die Oligonukleotide oder Oligomere gemäß der folgenden Erfindung stellen effektive Werkzeuge dar, um genetische und epigenetische Parameter der genomischen Sequenz entsprechend zu SEQ ID Nr. 1 zu ermitteln. Bevorzugte Sets von solchen Oligonukleotiden oder modifizierten Oligonukleotiden der Länge X sind diejenigen aufeinanderfolgenden und überlappenden Sets von Oligomeren, die SEQ ID Nrn. 1–5 entsprechen (und den Komplementen dazu). Bevorzugterweise umfassen die Oligomere mindestens ein CpG-, TpG- oder CpA-Dinukleotid. Eingeschlossen in diesen bevorzugten Sets sind die bevorzugten Oligomere entsprechend zu SEQ ID Nr. 11–SEQ ID Nr. 15.
Besondere bevorzugte Oligonukleotide oder Oligomere gemäß der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, in denen das Cytosin der CpG-Dinukleotidsequenzen (oder das des entsprechend umgewandelten TpG- oder CpA-Dinukleotids) innerhalb des mittleren Drittels des Oligonukleotids liegt, das bedeutet, wenn das Oligonukleotid zum Beispiel 13 Basen lang ist, dann ist das CpG-, TpG- oder CpA-Dinukleotid innerhalb des fünften bis neunten Nukleotids von dem 5'-Ende positioniert.
Die Oligonukleotide der Erfindung können auch durch chemisches Verbinden des Oligonukleotids an eine oder mehrere Gruppen oder Konjugate modifiziert werden, um die Aktivität, Stabilität oder den Nachweis des Oligonukleotids zu verbessern. Solche Gruppen oder Konjugate schließen Chromophore, Fluorophore, Lipide, wie zum Beispiel Cholesterin, Cholinsäure, Thioether, aliphatische Ketten, Phospholipide, Polyamine, Polyethylenglycol (PEG), Palmitylgruppen und andere, wie zum Beispiel beschrieben in U.S.-Patent Nrn. 5,514758 , 5,565,552 , 5,567,810 , 5,574,142 , 5,585,481 , 5,587,371 , 5,597,696 und 5,958,773 , ein. Die Sonden können auch in der Form einer PNA vorhanden sein (Peptidnukleinsäure), die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Daher kann das Oligonukleotid auch andere angehängte Gruppen einschließen, wie zum Beispiel Peptide und kann Hybridisierungsausgelöste Spaltmittel (Krol et al., BioTechniques 6: 958–976, 1988) oder interkalierende Mittel (Zon, Pharm. Res. 5: 539–549) einschließen. Zu diesem Zweck kann das Oligonukleotid an ein anderes Molekül konjugiert sein, z. B. ein Chromophor, Fluorophor, Peptid, Hybridisierungs-ausgelöstes kreuzvernetzendes Mittel, Transportmittel, Hybridisierungs-ausgelöstes Spaltungsmittel, usw.
Das Oligonukleotid kann auch mindestens eine im Stand der Technik bekannte modifizierte Zucker- und/oder Basengruppe umfassen oder kann ein modifiziertes Rückgrat oder nicht-natürliche Internukleosid-Verbindung umfassen.
Die Oligomere gemäß der vorliegenden Erfindung werden normalerweise in sogenannten "Sets" verwendet, die mindestens ein Oligomer zur Analyse jedes der CpG-Dinukleotide einer genomischen Sequenz umfassend SEQ ID Nr. 1 und dazu komplementären Sequenzen enthalten, oder gegen deren entsprechende CG-, TG- oder CA-Dinukleotide innerhalb der vorbehandelten Nukleinsäuren gemäß SEQ ID Nr. 2–SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementären Sequenzen. Bevorzugt ist ein Set, das mindestens ein Oligomer für jedes der CpG-Dinukleotide innerhalb des Gens EYA4 und seines Promotors und regulatorischer Elemente in sowohl der vorbehandelten und genomischen Version des Gens, jeweils SEQ ID Nr. 2 bis 5 und SEQ ID Nr. 1, enthält. Jedoch ist vorgesehen, daß es aufgrund ökonomischer und anderer Faktoren bevorzugt sein kann, eine begrenzte Auswahl der CpG-Dinukleotide innerhalb der Sequenzen zu analysieren, und die Inhalte des Sets an Oligonukleotiden sollten entsprechend verändert werden. Daher betrifft die vorliegende Erfindung darüber hinaus ein Set von mindestens 3 n (Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomere), die zum Nachweis des Cytosin-Methylierungszustands in vorbehandelter genomischer DNA (SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementären Sequenzen) und genomischer DNA (SEQ ID Nr. 1 und dazu komplementäre Sequenzen) verwendet werden. Diese Sonden ermöglichen die Diagnose und/oder Therapie von genetischen und epigenetischen Parameter von proliferativen Erkrankungen von Zellen. Das Set von Oligomeren kann auch dazu verwendet werden, um Einzel-Nukleotidpolymorphismen (SNPs) in vorbehandelter genomischer DNA (SEQ ID Nr. 2–SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementäre Sequenzen) und genomischer DNA (SEQ ID Nr. 1 und dazu komplementäre Sequenzen) nachzuweisen.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als sogenannte "Primer-Oligonukleotide" zur Amplifizierung von DNA-Sequenzen einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementären Sequenzen oder Segmenten davon verwendet werden können.
Im Fall der Sets von Oligonukleotiden gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß mindestens eines und, weiter bevorzugt, alle Mitglieder des Sets an Oligonukleotiden an eine feste Phase gebunden sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt, daß eine Anordnung von verschiedenen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array"), wie durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt, auf eine Weise vorhanden ist, daß es ähnlich an eine feste Phase gebunden ist. Diese Anordnung von verschiedenen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, daß es auf der festen Phase in Form eines rechteckigen oder hexagonalen Gittermusters angeordnet ist. Die Oberfläche der festen Phase ist bevorzugterweise aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt. Jedoch können Nitrozellulose sowie Kunststoffe, wie zum Beispiel Nylon, die in der Form von Pellets oder auch als Harz-Matrizes vorliegen könne, auch verwendet werden.
Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Arrays, das an ein Trägermaterial angebracht ist, zur Analyse im Zusammenhang mit proliferativen Erkrankungen von Zellen, wobei in diesem Verfahren mindestens ein Oligomer gemäß der vorliegenden Erfindung an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung solcher Arrays sind zum Beispiel aus U.S.-Patent 5,744,305 mittels Fest-Phasenchemie und photolabilen Schutzgruppen bekannt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen DNA-Chip zu einer Analyse von proliferativen Erkrankungen von Zellen. DNA-Chips sind zum Beispiel in U.S.-Patent 5,837,832 bekannt.
Die beschriebene Erfindung stellt weiterhin eine Zusammenstellung von Gegenständen zur Verfügung, die zum Nachweis, der Differenzierung und der Unterscheidung zwischen proliferativen Erkrankungen von Kolonzellen brauchbar ist. Eine solche Zusammenstellung umfaßt mindestens eine Nukleinsäure mit 18 Basenpaaren Länge eines Segments der Nukleinsäuresequenz wie offenbart in SEQ ID Nrn. 2–5 und eine oder mehrere Substanzen, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend:
1–5 mM Magnesiumchlorid, 100–500 μM dNTP, 0,5–5 Einheiten Taq-Polymerase, Rinderserumalbumin, ein Oligomer, insbesondere ein Oligonukleotid- oder Peptidnukleinsäure (PNA)-Oligomer, wobei das Oligomer in jedem Fall mindestens eine Basensequenz umfaßt, die eine Länge von mindestens 9 Nukleotiden aufweist, die komplementär ist zu, oder unter moderat stringenten oder stringenten Bedingungen an eine vorbehandelte genomische DNA gemäß einer der SEQ ID Nr. 2–SEQ ID Nr. 5 oder dazu komplementären Sequenzen hybridisiert. Es ist bevorzugt, daß die Zusammenstellung von Gegenständen eine Pufferlösung umfaßt, die für die Stabilisierung der Nukleinsäure in einer wäßrigen Lösung geeignet ist und Polymerase-basierte Reaktionen innerhalb der Lösung ermöglicht. Geeignete Puffer sind im Stand der Technik bekannt und käuflich erhältlich.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Durchführung eines Tests um genetische und/oder epigenetische Parameter des Gens EYA4 und seines Promotors und regulatorischer Elemente zu ermitteln, zur Verfügung. Am meisten bevorzugt wird der Test gemäß des folgenden Verfahrens dazu verwendet, um Methylierung innerhalb des Gens EYA4 nachzuweisen, wobei die methylierten Nukleinsäuren in einer Lösung vorhanden sind, die weiterhin einen Überschuß an Hintergrund-DNA umfaßt, wobei die Hintergrund-DNA bei zwischen 100–1000-fach der Konzentration der DNA vorhanden ist, die nachgewiesen werden soll. Das Verfahren umfaßt ein in Kontakt bringen einer Nukleinsäureprobe, die von dem Subjekt erhalten wurde, mit mindestens einem Reagenz oder einer Reihe von Reagenzien, wobei das Reagenz oder die Reihe von Reagenzien zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG-Dinukleotiden innerhalb der Zielnukleinsäuresequenz unterscheidet.
Bevorzugterweise umfaßt das Verfahren die folgenden Schritte: Im ersten Schritt wird eine Probe des zu analysierenden Gewebes erhalten. Die Quelle kann jede geeignete Quelle sein, bevorzugterweise ist die Quelle der Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus histologischen Objektträgern, Biopsien, Paraffin-eingebettetem Gewebe, Körperflüssigkeiten, Plasma, Serum, Stuhl, Urin, Blut und Kombinationen davon. Bevorzugterweise ist die Quelle Biopsien, Körperflüssigkeiten, Urin oder Blut.
Die DNA wird dann aus der Probe isoliert. Die Extraktion kann durch Mittel durchgeführt werden, die für den Fachmann Standard sind, einschließlich der Verwendung von Detergens-Lysaten, Beschallung und Vortexen mit Glassperlen. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert wurden, wird die genomische Doppelstrang-DNA in der Analyse verwendet.
Im zweiten Schritt des Verfahrens wir die genomische DNA auf solche Weise behandelt, daß Cytosinbasen, die an der 5'-Position nicht methyliert sind, in Uracil, Thymin oder in eine andere Base umgewandelt werden, die von Cytosin im Hinblick auf ihr Hybridisierungsverhalten verschieden ist. Dies wird hier als "Vorbehandlung" verstanden.
Die oben beschriebene Behandlung von genomischer DNA wird bevorzugterweise mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse durchgeführt, was zu einer Umwandlung von nicht-methylierten Cytosinnukleobasen zu Uracil oder einer anderen Base führt, die im Hinblick auf das Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterschiedlich ist. Das Einschließen der zu analysierenden DNA in einer Agarose-Matrix, wodurch die Diffusion und Renaturierung der DNA verhindert wird (Disulfit reagiert nur mit Einzelstrang-DNA) und das Ersetzen aller Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse (Olek A, et al., A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis, Nucleic Acids Res. 24: 5064–6, 1996). Es ist weiter bevorzugt, daß die Bisulfitbehandlung in der Anwesenheit einer Radikalfalle oder eines DNA-Denaturierungsmittels durchgeführt wird.
Im dritten Schritt des Verfahrens werden Fragmente der vorbehandelten DNA amplifiziert. Wenn die Quelle freie DNA aus Serum ist, oder DNA, die aus Paraffin extrahiert wurde, ist es besonders bevorzugt, daß die Größe des Amplifikatfragments zwischen 100 und 200 Basenpaaren lang ist, und wenn die DNA-Quelle aus zellulären Quellen extrahiert wurde (z. B. Gewebe, Biopsien, Zelllinien) ist es bevorzugt, daß das Amplifikat zwischen 100 und 350 Basenpaare in Länge ist. Es ist besonders bevorzugt, daß die Amplifikate mindestens eine 20-Basenpaar-Sequenz umfassen, die mindestens drei CpG-Dinukleotide umfaßt. Die Amplifikation wird unter Verwendung von Primer-Oligonukleotiden gemäß der vorliegenden Erfindung und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase durchgeführt. Die Amplifikation von verschiedenen DNA-Segmenten kann gleichzeitig in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden, in einer Ausführungsform des Verfahrens werden bevorzugterweise sechs oder mehr Fragmente gleichzeitig amplifiziert. Typischerweise wird die Amplifikation unter Verwendung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Das Set an Primer-Oligonukleotiden schließt mindestens zwei Oligonukleotide ein, deren Sequenzen jeweils revers-komplementär oder identisch sind, oder unter stringenten oder hoch-stringenten Bedingungen an ein mindestens l8-Basenpaar langes Segment der Basensequenzen von SEQ ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 5 und dazu komplementären Sequenzen hybridisiert.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann der Methylierungsstatus von ausgewählten CpG Positionen innerhalb der Nukleinsäuresequenzen umfassend SEQ ID Nr: 2 bis SEQ ID Nr: 5 durch die Verwendung von methylierungs-spezifischen Primeroligonukleotiden nachgewiesen werden. Diese Technik (MSP) wurde in United States Patent Nr. 6,265,171 von Herman beschrieben. Die Verwendung von Methylierungsstatus-spezifischen Primern zur Amplifikation von Bisulfit behandelter DNA ermöglicht die Unterscheidung zwischen methylierten und nicht-methylierten Nukleinsäuren. MSP Primerpaare enthalten mindestens einen Primer, der an ein Bisulfit behandeltes CpG Dinukleotid hybridisiert. Daher umfaßt die Sequenz dieser Primer mindestens ein CpG, TpG oder CpA Dinukleotid. Für nicht-methylierte DNA spezifische MSP Primer enthalten ein „T" an der 3'-Position der C-Position in dem CpG. Bevorzugterweise erfordert daher die Basensequenz der Primer, daß sie eine Sequenz umfassen, die eine Länge von mindestens 18 Nukleotiden aufweist, die an eine vorbehandelte Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 bis SEQ ID NO: 5 und dazu komplementären Sequenzen hybridisiert, wobei die Basensequenz des Oligomers mindestens ein CpG, TpG oder CpA Dinukleotid umfaßt. In dieser Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung ist es besonders bevorzugt, daß die MSP Primer zwischen 2 und 4 CpG, TpG oder CpA Dinukleotide umfassen. Es ist weiter bevorzugt, daß diese Nukleotide innerhalb der 3' Hälfte des Primers lokalisiert sind. Z. B. wenn ein Primer 18 Basen lang ist, sind die angegebenen Dinukleotide innerhalb der ersten 9 Basen von dem 3'-Ende des Moleküls lokalisiert. Zusätzlich zu den CpG, TpG oder CpA Dinukleotiden ist es weiter bevorzugt, daß die Primer weiterhin mehre Bisulfit-umgewandelte Basen umfassen (d. h. Cytosin zu Thymin umgewandelt, oder, auf dem hybridiserenden Strang, Guanin umgewandelt zu Adenosin). In einer weiter bevorzugten Ausführungsform sind die Primer so aufgebaut, daß sie nicht mehr als 2 Cytosin- oder Guanin-Basen umfassen.
In einer Ausführungsform der Erfindung können die Primer ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr: 6 bis SEQ ID Nr: 10.
Die mittels der Amplifikation erhaltenen Fragmente können einen direkt oder indirekt nachweisbaren Marker tragen. Bevorzugt sind Marker in der Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten, die eine typische Masse aufweisen, die in einem Massenspektometer nachgewiesen werden kann. Wenn die Marker Massenmarker sind, dann ist es bevorzugt, daß die markierten Amplifikate eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen, was eine bessere Nachweisbarkeit im Massenspektrometer ermöglicht. Der Nachweis kann durchgeführt und visualisiert werden mittels von z. B. Matrixunterstützter Laser-Desorptions-/Ionisierungs-Massenspekrometrie (MALDI) oder unter der Verwendung von Elektronspray-Massenspekrometrie (ESI).
Matrix-unterstützter Laserdesorptions-/Ionisierungs-Massenspekrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr effiziente Entwicklung zur Analyse von Biomolekülen (Karas & Hillenkamp, Anal Chem., 60: 2299–301, 1988). Ein Analyt wird in einer Licht-absorbierenden Matrix eingebettet. Die Matrix wird durch einen kurzen Laserpuls verdampft, was das Analytmolekül auf unfragmentierte Weise in die Dampfphase transportiert. Der Analyt wird durch Kollisionen mit Matrixmolekülen ionisiert. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Rohr. Aufgrund ihrer verschiedenen Massen werden die Ionen mit verschiedenen Raten beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor eher, als größere. Die MALDI-TOF Spektrometrie ist für die Analyse von Peptiden und Proteinen gut geeignet. Die Analyse von Nukleinsäuren ist ein wenig schwieriger (Gut & Beck, Current Innovations and Future Trends, 1: 147–57, 1995). Die Sensitivität im Hinblick auf Nukleinsäureanalyse ist ungefähr 100fach geringer, als die für Peptide und nimmt disproportional mit zunehmender Fragmentgröße ab. Darüber hinaus ist für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückrad haben, der Ionisierungsprozess über die Matrix beträchtlich weniger effizient. In der MALDI- TOF Spektrometrie spielt die Auswahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden wurden mehrere sehr effiziente Matrizes gefunden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Es gibt nun verschiedene responsive Matrizes für die DNA, jedoch wurde der Unterschied in der Sensitivität zwischen Peptiden und Nukleinsäuren nicht verringert. Dieser Unterschied in der Sensitivität kann jedoch durch chemische Modifizierung der DNA auf solche Weise verringert werden, das sie einem Peptid ähnlicher wird. Z. B. können Phosophorothioatnukleinsäuren, in denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückrads durch Thiophosphate ersetzt sind, unter der Verwendung von einfacher Alkylierungschemie (Gut & Beck, Nucleic Acids Res. 23: 1637–73, 1995) in eine ladungsneutrale DNA umgewandelt werden. Das Koppeln eines Ladungsmarkers an diese modifizierte DNA führt zu einem Anstieg in der MALDI-TOF Sensitivität auf denselben Spiegel, wie derjenige, der für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil der Ladungsmarkierung ist die ansteigende Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, was den Nachweis von nichtmodifizierten Substraten beträchtlich schwieriger macht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Amplifikation von Schritt drei in der Anwesenheit von mindestens einer Spezies von Blocker-Oligonukleotiden durchgeführt. Die Verwendung von solchen Blocker-Oligonukleotiden wurde durch Yu et al., BioTechniques 23: 714–720, 1997 beschrieben. Die Verwendung von Blocker-Oligonukleotieden ermöglicht die verbesserte Spezifität der Amplifikation einer Subpopulation von Nukleinsäuren. Blocker-Sonden, die an eine Nukleinsäure hybridisiert sind, unterdrücken oder behindern die Polymerase-vermittelte Amplifikation der Nukleinsäure. In einer Ausführungsform des Verfahrens werden die Blocker-Oligonukleotide so aufgebaut, um an Hintergrund-DNA zu hybridisieren. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Oligonukleotide so aufgebaut, um die Amplifikation von nicht-methylierten Nukleinsäuren im Gegensatz zu methylierten Nukleinsäuren oder umgekehrt zu behindern oder zu unterdrücken.
Die Blocker-Sonden-Oligonukleotide wenden an die Bisulfit behandelte Nukleinsäure gemeinsam mit dem PCR Primern hybridisiert. Die PCR Amplifikation der Nukleinsäure wird an der 5'-Position der Blocker-Sonde beendet, so daß die Amplifikation einer Nukleinsäure unterdrückt wird, wo die komplementäre Sequenz zu der Blocker-Sonde vorhanden ist. Die Sonden können so aufgebaut sein, um an die Bisufit behandelte Nukleinsäure auf eine Methylierungsstatus-spezifische Weise zu hybridisieren. Z. B. würde zum Nachweis von methylier ten Nukleinsäuren innerhalb einer Population von nicht-methylierten Nukleinsäuren die Unterdrückung der Amplifikation von Nukleinsäuren, die an der fraglichen Position nicht methyliert sind, durch die Verwendung von Blocking-Sonden mit einem „TpG" an der fraglichen Position, im Gegensatz zu einem „CpG", durchgeführt werden. In einer Ausführungsform des Verfahrens sollte die Sequenz der Blocker-Oligonukleotide identisch oder komplementär zu einem Molekül sein, das komplementär oder identisch ist zu einer Sequenz von mindestens 18 Basenpaaren Länge ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr: 2 bis 10, bevorzugterweise umfassend eines oder mehrere CpG, TpG oder CpA Dinukleotide. In einer Ausführungsform des Verfahrens ist die Sequenz der Oligonukleotide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr: 15 und SEQ ID Nr: 16 und dazu komplementären Sequenzen.
Für PCR Verfahren unter der Verwendung von Blocker-Oligonukleotiden macht die effiziente Unterbrechung der Polymerase-vermittelten Amplifikation es erforderlich, daß Blocker-Oligonukleotide nicht durch die Polymerase verlängert werden. Bevorzugterweise wird dies durch die Verwendung von Blockern erreicht, die 3'-Desoxynukleotide sind oder durch Oligonukleotide, die an der 3'-Position mit etwas anderem als einer "freien" Hydroxylgruppe derivatisiert sind. Z. B. sind 3'-O-Acetyl-Oligonukleotide repräsentativ für eine bevorzugte Klasse von Blockermolekülen.
Zusätzlich sollte die Polymerase-vermittelte Dekomposition der Blocker-Oligonukleotide ausgeschlossen werden. Bevorzugterweise umfaßt solch ein Ausschluß entweder die Verwendung einer Polymerase, der eine 5'-3'-Exonukleaseaktivität fehlt oder die Verwendung von modifizierten Blocker-Oligonukleotiden die z. B. Thioatbrücken am 5' Terminus davon aufweisen, was das Blockermolekül Nuklease-resistent macht. Bestimmte Anwendungen können solche 5'-Modifikationen der Blocker nicht erforderlich machen. Z. B., wenn die Blocker- und Primer-Bindungsstellen überlappen, wodurch die Bindung des Primers verhindert wird (z. B. durch Überschuß an Blocker), wird der Abbau des Blocker-Olignukleotids im wesentlichen ausgeschlossen sein. Dies liegt daran, daß die Polymerase den Primer nicht in Richtung und durch (in der 5'-3'Richtung) den Blocker verlängern wird – ein Verfahren, das normalerweise zum Abbau des hybridisierten Blocker-Oligonukleotids führt.
Eine besonders bevorzugte Blocker/PCR Ausführungsform für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, und wie hier implementiert, umfaßt die Verwendung von Peptidnukleinsäure (PNA) Oligomeren als Blocking-Oligonukleotide. Solche PNA Blocker-Oligomere sind ideal geeignet, da sie weder abgebaut noch durch die Polymerase verlängert werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Bindungsstelle der Blocker-Oligonukleotide identisch zu oder überlappt mit dem derjenigen der Primer und verhindert dadurch die Hybridisierung der Primer an ihre Bindungsstelle. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden zwei oder mehrere solcher Blocker-Oligonukleotide verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform behindert die Hybridisierung eines der Blocker-Oligonukleotide die Hybridisierung eines Vorwärtsprimers, und die Hybridisierung einer anderen der Sonden (Blocker) Oligonukleotide behindert die Hybridisierung eines reversen Primers, der an das Amplifikatprodukt des Vorwärtsprimer bindet.
In einer alternativen Ausführungsform des Verfahrens hybridisiert das Blocker-Oligonukleotid an eine Stelle zwischen der reversen und vorwärts Primer-Position der behandelten Hintergrund-DNA, wodurch die Verlängerung der Primeroligonukleotide verhindert wird.
Es ist besonders bevorzugt, daß die Blocker-Oligonukleotide bei mindestens 5fach der Konzentration der Primer vorhanden sind.
Im vierten Schritt des Verfahrens werden die während des dritten Schritts des Verfahrens erhaltenen Amplifikate analysiert, um den Methylierungsstatus der CpG Dinukleotide vor der Behandlung zu ermitteln.
In Ausführungsformen, wo die Amplifikate mittels MSP-Amplifikation und/oder Blocker-Oligonukleotiden erhalten werden, ist die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Amplifikats selber für den Methylierungszustand, der durch die Primer die Blocker-Oligonukleotide abgedeckten CpG Positionen indikativ, gemäß den Basensequenzen davon. Alle möglichen bekannten molekularbiologischen Verfahren können für diesen Nachweis verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Gelelektrophorese, Sequenzierung, Flüssigkeitschromatographie, Hybrisierungen, real-time PCR Analyse, oder Kombinationen davon. Dieser Schritt des Verfahrens dient weiter als eine qualitative Kontrolle der vorangegangenen Schritte.
Im vierten Schritt des Verfahrens werden mittels von sowohl Standard und methylierungsspezifischer PCR erhaltene Amplifikate weiter analysiert, um den CpG Methylierungsstatus der genomischen DNA wie im ersten Schritt des Verfahrens isoliert zu bestimmen. Dies kann mittels Basen basierten Verfahren, wie z. B., jedoch nicht begrenzt auf, Array Technologie und Sonden-basierten Technologien sowie mittels Techniken wie z. B. Sequenzierung und Templat-gesteuerter Verlängerung durchgeführt werden.
In einer Ausführungsform des Verfahrens werden die in Schritt drei synthetisierten Amplifikate anschließend an ein Array oder ein Set von Oligonukleotiden und/oder PNA Sonden hybridisiert. In diesem Zusammenhang findet die Hybridisierung auf die folgende Weise statt: das während der Hybridisierung verwendete Set an Sonden ist bevorzugterweise aus mindestens zwei Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren zusammengesetzt; in dem Verfahren dienen die Amplifikate als Sonden, die an vorher an eine feste Phase gebundene Oligonukleotide hybridisieren; die nicht-hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt; die Oligonukleotide enthalten mindestens eine Basensequenz, die eine Länge von mindestens 9 Nukleotiden aufweist, die revers-komplementär ist zu oder identisch ist zu einem Segment der in den SEQ ID Nr: 2 bis SEQ ID Nr: 5 angegebenen Basensequenzen; und das Segment umfaßt mindestens ein CpG, TpG oder CpA Dinukleotid.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Dinukleotid im zentralen Drittel des Oligomers vorhanden. Z. B., wenn das Oligonukleotid ein CpG Dinukleotid umfaßt ist, das Dinukleotid bevorzugterweise das 5 bis 9 Nukleotid von dem 5'-Ende eines 13-mers. Ein Oligonukleotid existiert für die Analyse jedes CpG Dinukleotids innerhalb der Sequenz gemäß SEQ ID Nr: 1 und den äquivalenten Positionen innerhalb SEQ ID Nr: 2 bis 5. Die Oligonukleotide können auch in Form von Peptidnukleinsäuen vorhanden sein. Die nicht-hybridisierten Amplifikate werden dann entfernt. Die hybridisierten Amplifikate werden nachgewiesen. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, daß Markierungen, die an die Amplifikate angebracht sind, an jeder Position der festen Phase identifizierbar sind, an der eine Oligonukleotidsequenz lokalisiert ist.
In noch einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens kann der genomische Methylierungsstatus der CpG-Positionen mittels von Oligonukleotidsonden ermittelt werden, die zusammen mit den PCR Amplifikationsprimern an die Bisulfit-behandelte DNA hybridisiert werden (wobei die Primer entweder methylierungsspezifisch oder standard sein können).
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens ist die Verwendung von Fluoreszenz-basierter real-time quantitativer PCR (Neid et al., Genome Res. 6: 986–994, 1996; siehe auch Untited States Patent Nr. 6,331,393 ). Es gibt zwei bevorzugte Ausführungsformen der Verwendung dieses Verfahrens. Eine Ausführungsform, als der TaqMan^TM Assay bekannt, verwendet eine 2fach-makierte fluoreszente Oligonukleotidsonde. Die TaqMan^TM benutzt die Verwendung eines nicht-verlängerbaren unterbrechenden Oligonukleotids, eine TaqMan^TM Sonde genannt, das so aufgebaut ist, um an eine CpG-reiche Sequenz zu hybridisieren, die zwischen den vorwärts- und rückwärts-Amplifikationsprimern lokalisiert ist. Die TaqMan^TM Sonde umfaßt weiterhin eine fluoreszente „Reportergruppe" und eine „Lösch-Gruppe", die kovalent an Linkergruppen (z. B. Phosphoramidite) gebunden sind, die an die Nukleotide des TaqMan^TM Oligonukleotids angebracht sind. Hybridisierte Sonden werden durch die Polymerase der Amplifikationsreaktion verdrängt und abgebaut, wodurch dies zu einem Anstieg in der Fluoreszenz führt. Zur Analyse von Methylierung innerhalb Nukleinsäuren anschließend an die Bisulfidbehandlung ist es erforderlich, daß die Sonde methylierungsspezifisch ist, wie in United States Patent Nr. 6,331,393 beschrieben, auch als der MethylLight Assay bekannt. Die zweite bevorzugte Ausführungsform dieser Technologie ist die Verwendung von Dual-Sondentechnologie (Lightcycler^®), die jeweils Donor- oder Rezipient-Fluoreszenzgruppen tragen, die Hybridisierung von zwei Sonden nahe aneinander wird durch einen Anstieg oder fluoreszente Amplifikationsprimer angezeigt. Beide dieser Techniken können auf eine Weise angepaßt werden, daß sie für die Verwendung mit Bisulfit behandelter DNA und darüber hinaus für die Methylierungsanalyse innerhalb von CpG Dinukleotiden geeignet sind.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfaßt der vierte Schritt des Verfahrens die Verwendung von Templat-gesteuerter Oligonukleotidverlängerung, wie z. B. MS-SNuPE, wie beschrieben von Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529–2531, 1997. In dieser Ausführung ist es bevorzugt, daß der MS-SNuPE Primer identisch ist zu oder komplementär ist zu einer Sequenz von mindestens 9, jedoch bevorzugterweise nicht mehr als 25 Nukleotiden Länge von einer oder mehrerer der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr: 2 bis SEQ ID Nr: 5.
In noch einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens umfaßt der vierte Schritt des Verfahrens die Sequenzierung und anschließende Sequenzanalyse des im dritten Schritt des Verfahrens erzeugten Amplifikats (Sanger F., et al., Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463–5467, 1977).
Weitere Ausführungsformen der Erfindung stellen ein Verfahren zur Analyse des Methylierungszustands von genomischer DNA gemäß der Erfindung (SEQ ID Nr: 1) zur Verfügung, ohne den Bedarf an Vorbehandlung.
Im ersten Schritt solcher zusätzlichen Ausführungsformen wird die genomische DNA-Probe von Gewebe oder zellulären Quellen isoliert. Bevorzugterweise schließen solche Quellen Zelllinien, histologische Objektträger, Körperflüssigkeiten oder in Paraffin eingebettetes Gewebe ein. Die Extraktion kann durch Mittel erfolgen, die Standard für den Fachmann sind, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, die Verwendung von Detergenslysaten, Beschallung und Vortexen mit Glasperlen. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert wurden, wird die genomische Doppelstrang-DNA in der Analyse verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA vor der Behandlung gespalten werden, und dies kann durch jedes Standardmittel im Stand der Technik durchgeführt werden, insbesondere mit Methylierungs-sensitiven Restriktionsendonukleasen.
Im zweiten Schritt wird dann die DNA mit einem oder mehreren Methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen verdaut. Der Verdau wird so durchgeführt, daß die Hydrolyse der DNA an der Restriktionsstelle für den Methylierungsstatus eines spezifischen CpG-Dinukleotids informativ ist.
Im dritten Schritt, der optional ist, jedoch eine bevorzugte Ausführungsform darstellt, werden die Restriktionsfragmente amplifiziert. Dies wird bevorzugterweise unter der Verwendung einer Polymerasekettenreaktion durchgeführt, und die Amplifikate können geeignete nachweisbare Marker, wie oben diskutiert, tragen, nämlich fluorophore Marker, Radionuklide und Massenmarker.
In dem finalen Schritt werden die Amplifikate nachgewiesen. Der Nachweis kann durch jedes Standardmittel im Stand der Technik durchgeführt werden, z. B., jedoch nicht begrenzt auf, Gelelektrophoreseanalyse, Hybridisierungsanalyse, Inkorporation von nachweisbaren Markern innerhalb des PCR-Produkts, DNA-Arrayanalyse, MALDI- oder ESI-Analyse.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Diagnose und/oder Prognose von Ereignissen, die für Patienten oder Individuen nachteilig sind, wobei wichtige genetische und/oder epigenetische Parameter innerhalb des EYA4-Gens und seines Promotors oder regulatorische Elemente als Marker verwendet werden können. Die mittels der vorliegenden Erfindung erhaltenen Parameter können mit einem anderen Set von genetischen und/oder epigenetischen Parametern verglichen werden, wobei die Unterschiede als eine Basis für eine Diagnose und/oder Prognose von Ereignissen dienen, die für Patienten oder Individuen nachteilig sind.
Genauer stellt die vorliegende Erfindung diagnostische und/oder prognostische Krebstests basierend auf Messungen der differentiellen Methylierung von EYA4 CpG Dinukleotidsequenzen zur Verfügung. Bevorzugte Gensequenzen, die zur Messung solcher unterschiedlicher Methylierung brauchbar sind, werden hier durch SEQ ID Nr: 1 bis 5 dargestellt. Typischerweise schließen solche Tests das Erhalten einer Gewebeprobe aus einem Testgewebe, Durchführen eines Tests, um den Methylierungszustand von mindestens einer der erfindungsgemäßen EYA4-spezifischen CpG-Dinukleotidsequenzen abgeleitet von der Gewebeprobe, relativ zu einer Kontrollprobe zu erhalten, und Erstellen einer Diagnose oder Prognose basierend darauf, ein.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen werden erfindungsgemäße Oligomere verwendet, um den Methylierungsstatus von EYA4-spezifischen CpG-Dinukleotiden zu ermitteln, sowie denjenigen basierend auf SEQ ID Nr: 1 bis 5, einschließlich den repräsentativen bevorzugten Oligomeren, die SEQ ID Nr: 11 bis 15 entsprechen, oder Arrays davon, sowie einem darauf basierenden Kit, die brauchbar für die Diagnose und/oder Prognose von Krebs und/oder proliferativen Erkrankungen von Zellen sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus ein diagnostisches Mittel und/oder therapeutisches Mittel für die Diagnose und/oder Therapie von proliferativen Erkrankungen von Kolonzellen, wobei das diagnostische Mittel und/oder das therapeutische Mittel dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens ein Primer oder eine Sonde basierend auf SEQ ID Nr: 1 bis 5 zur Herstellung davon verwendet wird, gegebenenfalls gemeinsam mit geeigneten Zusatzstoffen und Hilfsstoffen. In einer Ausführungsform kann das EYA4-Polypeptid oder ein Fragment oder Derivat davon an ein Subjekt verabreicht werden, um Kolonkrebs zu behandeln oder vorzubeugen.
In einer anderen Ausführungsform kann ein Vektor, der in der Lage ist, EYA4 oder ein Fragment oder ein Derivat davon zu exprimieren auch an ein Subjekt verabreicht werden, um Kolonkrebs zu behandeln oder vorzubeugen.
In einer weiteren Ausführungsform können Agonisten, die spezifisch für ihr EYA4 sind, dazu verwendet werden, um die Aktivität von EYA4 zu stimulieren oder zu verlängern, und können an ein Subjekt verabreicht werden, um Kolonkrebs zu behandeln oder diesem vorzubeugen.
In anderen Ausführungsformen kann jedes der oben beschriebenen therapeutischen Proteine oder Vektoren in Kombination mit anderen geeigneten therapeutischen Mitteln verabreicht werden. Die Auswahl der geeigneten Mittel zur Verwendung in Kombinationstherapie kann durch den Fachmann im Stand der Technik durchgeführt werden, gemäß herkömmlichen pharmazeutischen Prinzipien. Die Kombination von therapeutischen Mitteln kann synergistisch wirken, um die Behandlung oder die Vorbeugung von Kolonkrebs zu bewirken. Unter der Verwendung dieses Ansatzes kann man in der Lage sein, eine therapeutische Effizienz mit geringeren Dosen eines jeden Mittels zu erreichen, wodurch das Potential für nachteilige Nebenwirkungen verringert wird.
Von Retroviren, Adenovirus, Herpes oder Vacciniavirus abgeleitete Expressionsvektoren oder von verschiedenen bakteriellen Plasmiden abgeleitete Expressionsvektoren können für die Zuführung von Nukleotidsequenzen an das ausgewählte Organ, Gewebe oder die Zeitpopulation verwendet werden.
Eine zusätzliche Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung in Konjunktion mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können aus EYA4 oder Agonisten von EYA4 bestehen. Die Zusammensetzungen können allein oder in Kombination mit mindestens einem weiteren Mittel, wie z. B. einer stabilisierenden Verbindung, verabreicht werden, die in jeglichem sterilen, biokompatiblen pharmazeutischen Träger verabreicht werden kann, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose und Wasser. Die Zusammensetzung können an einen Patienten allein oder in Kombination mit anderen Mitteln, Wirkstoffen oder Hormonen verabreicht werden.
Die in dieser Erfindung verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzungen können durch jede einer Zahl von guten einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, oral, intravenös, intra-muskulär, intra-arteriell, intramedullär, intrathekal, intraventrikulär, transdermal, subkutan, intraperitoneal, intranasal, enteral, topikal, sublingual oder rektaler Mittel verabreicht werden.
Zusätzlich zu den aktiven Inhaltsstoffen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch-akzeptable Träger enthalten, umfassend Hilfsstoffe und Trägerstoffe, die die Prozessierung der aktiven Verbindungen in Präparationen erleichtern, die pharmazeutisch verwendet werden können. Weitere Details im Hinblick auf Techniken zur Formulierung und Verabreichung können in der neuesten Auflage von Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa) gefunden werden.
Darüber hinaus ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Kit, umfassend, z. B., ein Bisulfit-enthaltendes Reagens, sowie mindestens ein Oligonukleotid dessen Sequenz in jedem Fall entspricht, komplementär ist oder unter stringenten oder hochstringenten Bedingungen an ein 10-basenlanges Segment der SEQ ID Nr: 1 bis 5 hybridisiert. Das Kit kann weiterhin Anweisungen zur Durchführung und Evaluierung des beschriebenen Verfahrens umfassen. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform kann das Kit weiterhin Standardreagentien zur Durchführung einer CpG-Position-spezifischen Methylierungsanalyse umfassen, wobei die Analyse eine oder mehrere der folgenden Techniken umfaßt: MS-SNuPE, MSP, MethyLight^TM, HeavyMethyl^TM, COBRA und Nukleinsäuresequenzierung. Jedoch kann ein Kit in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung auch nur einen Teil der oben genannten Komponenten enthalten.
Typische Reagentien (z. B. wie in einem typischen COBRA-basierten Kit gefunden werden können) für die COBRA-Analyse können einschließen, sind jedoch nicht begrenzt auf: PCR-Primer für ein spezifisches Gen (oder eine methylierungs-veränderte DNA-Sequenz oder CpG-Insel), ein Restriktionsenzym und geeignete Puffer, Gen-Hybridisierungsoligo, Kontrollhybridisierungsoligo, Kinase-Markierungskit für Oligosonde und radioaktive Nukleotide. Zusätzlich können Bisulfitumwandlungs-Reagentien einschließen: DNA-Denaturierungspuffer, Sulfonierungspuffer, DNA-Rückerhaltungs-Reagentien oder Kits (z. B. Fällung, Ultrafiltration, Affinitätssäule), Desulfonierungspuffer und DNA-Rückerhaltungskomponenten.
Typische Reagentien (z. B. wie möglicherweise in einem typischen MethyLight^®-basierten Kit gefunden) für die MethyLight^®-Analyse können einschließen, sind jedoch nicht begrenzt auf: PCR-Primer für das spezifische Gen (oder die methylierungs-veränderte DNA-Sequenz oder CpG-Insel), TaqMan^®-Sonden, optimierte PCR-Puffer und Desoxynukleotide und Taq-Polymerase.
Typische Reagentien (z. B. wie möglicherweise in einem typischen Ms-SNuPE-basierten Kit gefunden) für die Ms-SNuPE-Analyse können einschließen, sind jedoch nicht begrenzt auf PCR-Primer für das spezifische Gen (oder die methylierungs-veränderte DNA-Sequenz oder CpG-Insel), optimierte PCR-Puffer und Desoxynukleotide, Gelextraktionskit, positive Kontrolle, Primer, Ms-SNuPE-Primer für das spezifische Gen, Reaktionspuffer (für die Ms-SNuPE-Reaktion) und radioaktive Nukleotide. Zusätzliche Bisulfitumwandlungsreagentien können einschließen: DNA-Denaturierungspuffer, Sulfonierungspuffer, DNA-rückerhaltende Reagentien oder Kit (z. B. Fällung, Ultrafiltration, Affinitätssäule), Desulfinierungspuffer und DNA-rückerhaltende Komponenten.
Typische Reagentien (z. B. wie möglicherweise in einem typischen Ms-SNuPE-basierten Kit gefunden) für die MSP-Analyse können einschließen, sind jedoch nicht begrenzt auf methylierte und nicht-methylierte PCR-Primer für das spezifische Gen (oder für die methylierungsveränderte DNA-Sequenz oder CpG-Insel), optimierte PCR-Puffer und Desoxynukleotide und spezifische Sonden.
Definitionen:
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck "CpG-Insel" eine durchgehende Region von genomischer DNA, die die Kriterien von (1) aufweisen einer Sequenz von CpG-Dinukleotiden entsprechend zu einem "beobachteten/erwarteten Verhältnis" > 0,6 und (2) aufweisen eines "GC-Gehalts" von > 0,5 erfüllt. CpG-Inseln sind typischerweise, jedoch nicht immer, zwischen ungefähr 0,2 bis ungefähr 1 kb lang.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck "Methylierungszustand" oder "Methylierungsstatus" die Anwesenheit oder Abwesenheit von 5-Methylmethosin ("5-mCyt") an einer oder einer Vielzahl von CpG-Dinukleotiden innerhalb einer DNA-Sequenz. Methylierungszustände an einer oder mehreren insbesondere palindromischen CpG-Methylierungsstellen innerhalb einer DNA-Sequenz (die jeweils zwei CpG in CpG-Dinukleotidsequenzen aufweisen), schließen "nicht methylierte", "voll methylierte" und "hemi-methylisierte" ein.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck "Hemi-Methylierung" oder "Hemimethylierung" den Methylierungszustand einer palindronischen CpG-Methylierungsstelle, wobei nur ein einzelnes Cytosin in einer der beiden CpG-Dinukleotidsequenzen der palindromischen CpG-Methylierungsstelle methyliert ist (z. B. 5'-CC^MGG-3 (oberer Strang): 3'-GGCC-5' (unterer Strang).
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck "Hypermethylierung" den durchschnittlichen Methylierungszustand entsprechend einer erhöhten Anwesenheit von 5-mCyt an einer oder einer Vielzahl von CpG-Dinukleotiden innerhalb einer DNA-Sequenz einer Test-DNA-Probe, relativ zu der Menge von 5-mCyt gefunden an entsprechenden CpG-Dinukleotiden innerhalb einer normalen Kontroll-DNA-Probe.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft die "Hypomethylierung" den durchschnittlichen Methylierungszustand entsprechend zu einer abnehmenden Anwesenheit von 5-mCyt an einer oder einer Vielzahl von CpG-Dinukleotiden innerhalb einer DNA-Sequenz einer Test-DNA-Probe, relativ zu der Menge von 5-mCyt gefunden an entsprechenden CpG-Dinukleotiden innerhalb einer normalen Kontroll-DNA-Probe.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck "Microarray" breit sowohl "DNA Microarrays" als auch "DNA Chip(s)" wie im Stand der Technik gebräuchlich, umfaßt alle im Stand der Technik gebräuchlichen festen Träger und umfaßt alle Verfahren zur Anbindung von Nukleinsäuremolekülen daran oder der Synthese von Nukleinsäuren darauf.
"Genetische Parameter" sind Mutationen und Polymorphismen von Genen und Sequenzen, die weiter für deren Regulation erforderlich sind. Als Mutationen bezeichnet werden insbe sondere Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und insbesondere bevorzugt SNPs (Einzel-Nukleotidpolymorphismen).
"Epigenische Parameter" sind insbesondere Cytosinmethylierungen. Weitere epigenetische Parameter schließen zum Beispiel die Acetylierung von Histonen ein, die jedoch nicht direkt unter der Verwendung des beschriebenen Verfahrens analysiert werden kann, die jedoch umgekehrt mit der DNA-Methylierung korreliert.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck "Bisulfitreagenz" ein Reagenz umfassend Bisulfit, Disulfit, Hydrogensulfit oder Kombinationen davon, das wie hier beschrieben brauchbar ist, um zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG-Dinukleotidsequenzen zu unterscheiden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck "Methylierungsassay" jeden Assay zur Bestimmung des Methylierungszustandes einer oder mehrerer CpG-Dinukleotidsequenzen innerhalb einer Sequenz an DNA.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck "MS.AP-PCR" (Methylierungs-Sensitive arbiträr-geprimte Polymerase-Kettenreaktion), die im Stand der Technik bekannte Technologie, die ein globales Scannen des Genoms unter der Verwendung von CG-reichen Primern ermöglicht, um sich auf die Regionen zu fokussieren, die am wahrscheinlichsten CpG-Dinukleotide enthalten, und die durch Gonzalgo et al., Cancer Research 57: 594–599, 1997, beschrieben wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck "MethyLight" die im Stand der Technik bekannte Fluoreszenz-basierte Real-Time PCR-Technik, beschrieben bei Eads et al., Cancer Res. 59: 2302–2306, 1999.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck "HeavyMethyl^TM" Assay, in der hier implementierten Ausführungsform davon, einen HeavyMethyl^TM-MethyLight-Assay, der eine Variation des MethyLight-Assays ist, wobei der MethyLight-Assay mit methylierungsspezifischen Blockersonden kombiniert wird, die CpG-Positionen zwischen den Amplifikationsprimern abdecken.
Der Ausdruck "MS-SNuPE" (Methylierungs-Sensitive Einzelnukleotid-Primerverlängerung) betrifft den im Stand der Technik bekannten Assay, beschrieben von Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529–2531, 1997.
Der Ausdruck "MSP" (Methylierungs-spezifische PCR) betrifft den im Stand der Technik bekannten Methylierungsassay, von Herman et al. Proc. Natl. Acad. USA 93: 9821–9826, 1996 und durch U.S.-Patent Nr. 5,786,146 beschrieben.
Der Ausdruck "COBRA" (Kombinierte Bisulfit Restriktionsanalyse) betrifft dem Stand der Technik bekannten Methylierungsassay beschrieben von Xiong & Laird, Nucleic Acisd Res. 25: 2532–2534, 1997.
Der Ausdruck "Hybridisierung" soll als eine Bindung eines Oligonukleotids an eine komplementäre Sequenz entlang der Prinzipien der Watson-Crick-Basenpaarungen in der Proben-DNA erstanden werden, wobei eine Duplexstruktur gebildet wird.
"Stringente Hybridisierungsbedingungen", wie hier definiert, schließen die Hybridisierung bei 86°C in 5 × SSC/5 × Denhardt's-Lösung in /1,0% SDS, und Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur ein, oder schließen das im Stand der Technik bekannte Aquivalent davon ein (z. B. Bedingungen, wobei eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 × SSC-Puffer durchgeführt wird, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringen Pufferkonzentration, und dabei stabil bleibt). Moderat stringente Bedingungen, wie hier definiert, schließen Waschen in 3 × SSC bei 42°C oder das im Stand der Technik bekannte Äquivalent davon ein. Die Parameter der Salzkonzentration und Temperatur können variiert werden, um das optimale Niveau an Identität zwischen der Sonde und der Ziel-Nukleinsäure zu erreichen. Anweisungen im Hinblick auf solche Bedingungen sind im Stand der Technik erhältlich, zum Beispiel durch Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.; und Ausubel et al. (Herausgeber) 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N. Y.) in Kapitel 2.10.
"Hintergrund-DNA", wie hier verwendet, betrifft jegliche Nukleinsäure, die anders als von Kolonzellen abstammt.
Die Erfindung wird nun basierend auf den folgenden Beispielen, SEQ IDs und Figuren genauer beschrieben werden, ohne darauf beschränkt zu werden. Im Sequenzprotokoll und den Figuren
zeigt SEQ ID Nr. 1 die Sequenz des menschlichen Gens EYA4,
SEQ ID Nrn. 2–5 zeigen chemisch vorbehandelte Sequenzen des Gens EYA4,
SEQ ID Nrn. 6–10 zeigen die Sequenzen von in den Beispielen verwendeten Primern, und
SEQ ID Nrn. 11–15 zeigen die Sequenzen von in den Beispielen verwendeten Sonden.
1 zeigt das Niveau an Methylierung wie bestimmt durch einen MSP-MethyLight-Assay und durch einen Heavy-MethyLight-Assay gemäß Beispielen in 1 und 2. Die Y-Achse zeigt das Ausmaß an Methylierung innerhalb der Region des untersuchten EYA4-Gens. Tumorproben sind durch weiße Punkte dargestellt und normale Kolongewebeproben durch schwarze Punkte. Ein signifikant höheres Ausmaß an Methylierung wurde in Tumorproben, anders als in gesunden Gewebeproben, beobachtet. Das Niveau des Signifikanz wie unter der Verwendung eines t-Tests gemessen war p: 0,00000312 (MSP-ML, Beispiel 1) und p = 0,000000326 (HM-ML, Beispiel 2).
2 zeigt die Receiver Operating Charakteristik Kurve (ROC-Kurve) des MSP-MethyLight-Assays für Adenokarzinome gemäß Beispiel 1. Eine ROC ist ein Plot der echten Positiv-Rate gegen die Falsch-Positiv-Rate für die verschiedenen möglichen Schnittpunkte eines diagnostischen Tests. Sie zeigt den Kompromiß zwischen Sensitivität und Spezifität in Abhängigkeit von dem ausgewählten Schnittpunkt (jede Zunahme in der Sensitivität wird durch eine Abnahme in der Spezifität begleitet. Der Bereich unter einer ROC-Kurve (AUC) ist ein Maß für die Genauigkeit eines diagnostischen Tests (je größer der Bereich, desto besser, ein Optimum ist 1, ein zufälliger Test würde eine ROC-Kurve aufweisen, die auf der Diagonalen mit einem Bereich von 0,5 liegt). Die AUC für den MSP-MethyLight-Assay ist: 0,94.
3 zeigt die Receiver Operating Charakteristik Kurve (ROC-Kurve) des HM-MethyLight-Assays für Adenokarzinome gemäß Beispiel 2. Der Bereich unter einer ROC-Kurve (AUC) ist ein Maß für die Genauigkeit eines diagnostischen Tests. Die AUC für den HM-MethyLight-Assay ist: 0,91.
4 zeigt das Niveau an Methylierung wie bestimmt durch einen Heavy-MethyLight-Assay gemäß Beispiel 2, wobei ein zusätzliches Set von Kolonproben getestet wird (25 Adenokarzinome, 33 Normale und 13 Adenome). Die Y-Achse zeigt das Ausmaß an Methylierung innerhalb der Region des untersuchten EYA4-Gens. Adenkarzinom-Proben sind durch weiße Quadrate angegeben und normale Kolongewebeproben durch schwarze Rauten. Ein signifikant höheres Ausmaß an Methylierung wurde in Tumorproben, anders als in gesunden Gewebeproben, beobachtet. Das Niveau der Signifikanz wie gemessen unter der Verwendung eines t-Tests war 0,00424.
5 zeigt die Receiver Operating Charakteristik Kurve (ROC-Kurve) des HM-MethyLight-Assays für Adenokarzinome und Adenome gemäß Beispiel 2 (zusätzliche Sets von Proben). Der Bereich unter einer ROC-Kurve (AUC) ist ein Maß für die Genauigkeit eines diagnostischen Tests. Die AUC für den HM-MethyLight-Assay ist: 0,81.
6 zeigt die Receiver Operating Charakteristik Kurve (ROC-Kurve) des HM-MethyLight-Assays für nur Adenkarzinome gemäß Beispiel 2 (zusätzliche Sets von Proben). Der Bereich unter einer ROC-Kurve (AUC) ist ein Maß für die Genauigkeit eines diagnostischen Tests. Die AUC für den HM-MethyLight-Assay ist: 0,844.
7 zeigt die Receiver Operating Charakteristik Kurve (ROC-Kurve) des HM-MethyLight-Assays für Adenome gemäß Beispiel 2 (zusätzliche Sets von Proben). Der Bereich unter einer ROC-Kurve (AUC) ist ein Maß für die Genauigkeit eines diagnostischen Tests. Die AUC für den HM-MethyLight-Assay ist: 0,748.
8 zeigt das Ausmaß an Methylierung in verschiedenen Tumor- und gesunden Geweben, bestimmt durch einen Heavy-MethyLight-Assay gemäß Beispiel 3. Die Y-Achse zeigt das Ausmaß an Methylierung innerhalb der Region des untersuchten EYA4-Gens. Neben den Kolonkrebsproben war nur eines der zwei Brustkrebsgewebe methyliert.
9 zeigt das Ausmaß an Methylierung in verschiedenen Brustkrebsgeweben, bestimmt durch einen Heavy-MethyLight-Assay gemäß Beispiel 3. Nur ein Gewebe war methyliert.
10 zeigt das Ausmaß an Methylierung in Serumproben, bestimmt durch einen Heavy-MethyLight-Assay gemäß Beispiel 4. Die Y-Achse zeigt das Ausmaß an Methylierung innerhalb der Region des untersuchten EYA4-Gens.
Beispiel 1
Analyse von Methylierung innerhalb von Kolonkrebs unter der Verwendung eines MSP-MethyLight-Assays
DNA wurde aus 33 Kolon-Adenkarzinom-Proben und 43 normalen angrenzenden Kolongeweben unter der Verwendung eines Qiagen^® Extraktions-Kits extrahiert. Die DNA aus jeder Probe wurde unter der Verwendung einer Bisulfit-Lösung (Hydrogen-Sulfit, Disulfit) gemäß dem Agarose-Perlen-Verfahren (Olek et al. 1996) behandelt. Die Behandlung ist so, daß alle nicht-methylierten Cytosine innerhalb der Probe in Thymidin überführt werden. Umgekehrt verbleiben 5-methylierte Cytosine innerhalb der Probe unverändert.
Der Methylierungszustand wurde mit einem MSP-MethyLight-Assay bestimmt, der für die CpG-Inseln von Interesse aufgebaut war, und einem Kontrollfragment aus dem beta-Aktingen (Eads et al., 2001). Der CpG-Insel-Assay deckt CpG-Stellen in sowohl den Primern als auch der Taqman-Stil-Sonde ab, während das Kontrollgen dies nicht tut. Das Kontrollgen wird als ein Maß von gesamter DNA-Konzentration verwendet, und der CpG-Insel-Assay (Methylierungs-Assay) bestimmt die Methylierungs-Spiegel an dieser Stelle.
Verfahren: der EYA4-Gen-CpG-Insel-Assay wurde unter der Verwendung der folgenden Primer und Sonden durchgeführt.
Vorwärtsprimer: CGGAGGGTACGGAGATTACG (SEQ ID Nr. 6)
Rückwärtsprimer: CGACGACGCGCGAAA (SEQ ID Nr. 7) und
Sonde: CGAAACCCTAAATATCCCGAATAACGCCG (SEQ ID Nr. 12).
Der entsprechende Kontrollassay wurde unter der Verwendung der folgenden Primer und Sonden durchgeführt:
Primer: TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT (SEQ ID Nr. 8)
Primer: ACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (SEQ ID Nr. 9) und
Sonde: ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA (SEQ ID Nr. 13).
Die Reaktionen wurden in dreifachen Ansätzen mit jeder DNA-Probe unter den folgenden Assay-Bedingungen durchgeführt:
Reaktionslösung: (900 nM Primer, 300 nM Sonde, 3,5 mM Magnesiumchlorid; 1 Einheit Taq-Polymerase; 200 μM dNTPs; 7 μl DANN, in einem finalen Reaktionsvolumen von 20 μl);
Zyklusbedingungen: (96°C für zehn Minuten, dann 50 Zyklen von: 95°C für 15 Sekunden; 60°C für 1 Minute). Die Daten wurden unter Verwendung einer PMR-Berechnung analysiert, die vorher in der Literatur beschrieben wurde (Eads et al., 2001).
Ergebnisse: Der mittlere PMR für normale Proben war 0,15, mit einer Standardabweichung von 0,18. Der mittlere PMR für Tumorproben war 17,98, mit einer Standardabweichung von 18,18. Der Gesamtunterschied in den Methylierungsspiegeln zwischen Tumor- und normalen Proben ist in einem t-Test (p = 0,00000312) signifikant. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Eine Receiver Operating Charakteristik Kurve (ROC-Kurve) des Tests wurde ebenfalls bestimmt. Ein ROC ist ein Plot der echt positiven Rate gegen die falsch-positive Rate für die verschiedenen möglichen Schnittpunkte eines diagnostischen Tests. Sie zeigt den Kompromiß zwischen Sensitivität und Spezifität in Abhängigkeit von dem ausgewählten Schnittpunkt (jede Zunahme in der Sensitivität wird durch eine Abnahme in der Spezifität begleitet). Die Fläche unter einer ROC-Kurve (AUC) ist ein Maß für die Genauigkeit eines diagnostischen Tests (je größer die Fläche, desto besser, ein Optimum ist 1, ein zufälliger Test würde eine ROC-Kurve aufweisen, die auf der Diagonale liegt, mit einer Fläche von 0,5, zur Referenz: J. P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975). Die AUC für den MSP-MethyLight-Assay ist : 0,94 (2).
Beispiel 2
Methylierung innerhalb Kolonkrebs wurde unter der Verwendung eines Heavy-Methyl MethyLight^TM-Assays analysiert.
Dieselben DNA-Proben wurden auch verwendet, um die Methylierung der CpG-Insel mit einem Heavy-Methyl MethyLight (oder HM-MethyLight)-Assay, auch als der Heavy-Methyl-Assay bezeichnet, zu analysieren. Der Methylierungszustand wurde mit einem HM-MethyLight-Assay, der für die CpG-Insel von Interesse aufgebaut war, und mit demselben Kontrollassay wie oben beschrieben bestimmt. Der CpG-Insel-Assay deckt CpG-Stellen in sowohl den Blockern und der Taqman Stil-Sonde ab, während das Kontrollgen dies nicht tut.
Verfahren: Der CpG-Insel-Assay (Methylierungs-Assay) wurde unter der Verwendung der folgenden Primer und Sonden durchgeführt:
Vorwärtsprimer: GGTGATTGTTTATTGTTATGGTTTG (SEQ ID Nr. 10)
Reverserprimer: CCCCTCAACCTAAAAACTACAAC (SEQ ID Nr. 11)
Vorwärtsblocker: GTTATGGTTTGTGATTTTGTGTGGG (SEQ ID Nr. 15)
Reverserblocker: AAACTACAACCACTCAAATCAACCCA (SEQ ID Nr. 16)
Sonde: AAAATTACGACGACGCCACCCGAAA (SEQ ID Nr. 14).
Die Reaktionen wurden jeweils in dreifachen Ansätzen auf jeder DNA-Probe mit den folgenden Assay-Bedingungen durchgeführt:
Reaktionslösung: (400 nM Primer, 400 nM Sonde; 10 μM beider Blocker; 3,5 mM Magnesiumchlorid, 1 × ABI Taqman-Puffer, 1 Einheit ABI TaqGold-Polymerase; 200 μM dNTPs und 7 μl DNA, in einem finalen Reaktionsvolumen von 20 μl);
Zyklusbedingungen: (95°C für 10 Minuten); (95°C für 15 Sekunden, 64°C für 1 Minute (2 Zyklen)); (95°C für 15 Sekunden, 62°C für 1 Minute (2 Zyklen); (95°C für 15 Sekunden, 60°C für 1 Minute (3 Zyklen)) und 95°C für 15 Sekunden, 85°C für 1 Minute, 60°C für 40 Sekunden (40 Zyklen)).
Ergebnisse. Der mittlere PMR für normale Proben war 1,12 mit einer Standardabweichung von 1,45. Der mittlere PMR für Tumorproben war 38,23 mit einer Standardabweichung von 33,22. Der Gesamtunterschied in den Methylierungsspiegeln zwischen Tumor- und normalen Proben ist in einem t-Test signifikant (p = 0,000000326). Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Eine ROC-Kurve des Tests wurde auch bestimmt. Die AUC für den MSP-MethyLight-Assay ist 0,91 (3).
Der Assay wurde auf einem zusätzlichen Set von Kolonproben getestet (25 Adenkarzinome, 33 Normale und 13 Adenome). Die Ergebnisse zeigten wiederum einen signifikanten Unterschied (4). Die ROCs sind in 5-7 gezeigt.
Beispiel 3
Der HeavyMethyl-MethylLight-Assay wurde auch gegen ein Panel von anderen Geweben getestet (8). Neben den Kolonkrebsproben war nur eines der zwei Brustkrebsgewebe methyliert. Jedoch war auf einem Panel von 21 zusätzlichen Brusttumoren (verschiedene Phasen) nur eines methyliert (9). Daher ist der Marker für Kolon-Tumorproben spezifisch. Alle Primer, Sonden, Blocker und Reaktionsbedingungen waren mit denjenigen in der Analyse der Kolonkrebsproben (Beispiel 2) identisch.
Beispiel 4
Zwölf der durch Real-Time PCT analysierten Kolongewebe wiesen auch ein entsprechend vor der Chirurgie entnommenes passendes Serum auf. Wir extrahierten DNA aus 1 ml diesen Serums unter der Verwendung eines Qiagen Ulta Sens^® DNA Extraktionskits, Disulfitbehandelten die DNA-Probe und führten mit diesen Proben den HeavyMethyl-MethyLight-Assay durch. Das Kontrollgen wurde in drei der Krebs-Serumproben und drei der normalen Serumproben nicht amplifiziert, so daß wir schlußfolgern, daß die Probenpräparation in diesen Fällen nicht funktionierte. In den anderen Fällen gab es Hinweise auf eine höhere Methylierung in den Krebsproben, als in den normalen Proben (10). Sequenzprotokoll

Claims

In vitro Verfahren zur Diagnose einer proliferativen Erkrankung von Colonzellen in einem Subjekt, umfassend die Schritte von: a) Erhalten einer oder mehrerer Testproben aus Colongewebe oder Serum oder beidem, Blut oder Stuhl von dem Subjekt; und b) Nachweisen einer Abnahme der Menge oder der Expression eines Polypeptids, das von dem EYA4 Gen exprimiert wird oder der Anwesenheit oder Abwesenheit von mRNA, die für ein EYA4 Polypeptid kodiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die proliferativen Erkrankungen von Colonzellen ausgewählt werden aus der Gruppe umfassend Adenkarzinome, squamöse Zell-Krebserkrankungen, karzinoide Tumore, Sarkome und Lymphome.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Nachweis durch einen Immunoassay erfolgt, insbesondere durch einen ELISA.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Schritte von: a) zur Verfügung stellen eine Polynukleotidsonde, die spezifisch hybridisiert an oder identisch ist zu einem Polynukleotid bestehend aus SEQ ID NO: 1, b) Inkubieren der Probe mit der Polynukleotidsonde unter Bedingungen hoher Stringenz, um einen spezifischen Hybridisierungskomplex zwischen einer mRNA und der Sonde zubilden; und c) Nachweisen des Hybridisierungskomplexes.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Nachweis eine Methylierungsanalyse des Gens EYA 4, seines Promotors und/oder regulatorischen Elemente, insbesondere die Methylierungsanalyse einer genomischen DNA Sequenz nach SEQ ID NO: 1 umfaßt.
Verfahren zum Nachweisen von proliferativen Erkrankungen von Colonzellen nach Anspruch 5, umfassend: a) Erhalten, von einem Subjekt, eine biologische Probe, die genomische DNA des Subjekts aufweist; b) Behandeln der genomischen DNA, oder eines Fragments davon, mit einem oder mehreren Reagenzien, um 5-Position-nicht-methylierte Cytosinbasen in Uracil oder eine andere Base umzuwandeln, die nachweisbar im Hinblick auf die Hybridisierungseigenschaften von Cytosin verschieden ist; c) in Kontakt bringen der behandelten genomischen DNA, oder dem behandelten Fragment davon, mit einem Amplifikationsenzym und mindestens zwei Primern umfassend, in jedem Fall, eine durchgehende Sequenz von mindestens 18 Nukleotiden Länge die komplementär ist zu, oder unter moderat stringenten oder stringenten Bedingungen an eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOS: 2 bis 5 und Komplemente davon hybridisiert, wobei die behandelte DNA oder ein Fragment davon entweder amplifiziert wird, um eines oder mehrere Amplifikate zu produzieren, oder nicht amplifiziert wird; und d) Nachweisen, basierend auf der Anwesenheit oder der Abwesenheit von oder auf einer Eigenschaft des Amplifikats, des Methylierungszustands der mindestens einen CpG Dinukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder eines Durchschnitts oder eines Wertes, der einen durchschnittlichen Methylierungszustand einer Vielzahl von CpG Dinukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 1 widerspiegelt.
Verfahren zum Nachweisen von proliferativen Erkrankungen von Colonzellen nach Anspruch 6, umfassend die folgenden Schritte von a) Erhalten, von einem Subjekt, eine biologische Probe, die genomische DNA des Subjekts aufweist; b) Behandeln der genomischen DNA, oder eines Fragments davon, mit einem oder mehreren Reagenzien, um 5-Position-nicht-methylierte Cytosinbasen in Uracil oder eine andere Base umzuwandeln, die nachweisbar im Hinblick auf die Hybridisierungseigenschaften von Cytosin verschieden ist; c) Amplifizieren eines oder mehrerer Fragmente der behandelten DNA, so daß nur DNA, die aus Colonzellen oder proliferativ erkrankten Colonzellen abstammt amplifiziert wird, und d) Nachweisen der Amplifikate oder Eigenschaften davon, und dadurch Schließen auf die Anwesenheit oder Abwesenheit einer proliferativen Erkrankung von Colonzellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei in Schritt a) die biologische Probe, die von dem Subjekt erhalten wurde, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus histologischen Trägern, Biopsien, Paraffin-eingebettetem Gewebe, Körperflüssigkeiten, Serum, Plasma, Stuhl, Urin, Blut und Kombinationen davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 8, wobei in Schritt b) das Behandeln der genomischen DNA oder des Fragments davon die Verwendung einer Lösung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bisulfit, Hydrogensulfit, Disulfit und Kombinationen davon umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei einer oder mehrere der Primer ein oder mehrere CpG, TpG oder CpA Dinukleotide umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die in Schritt d) erhaltenen Amplifikate mindestens eine 20 Basenpaar-Sequenz umfassen, die drei oder mehr CpG, TpG oder CpA Dinukleotide umfaßt.
Verfahren zum Nachweis von proliferativen Erkrankungen von Colonzellen nach Anspruch 6, umfassend: a) Erhalten, von einem Subjekt, eine biologische Probe, die genomische DNA des Subjekts aufweist; b) Extrahieren der genomischen DNA; c) in Kontakt bringen der genomischen DNA, oder eines Fragments davon, umfassend SEQ ID NO: 1 oder eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen an SEQ ID NO: 1 hybridisiert, mit einem oder mehreren Methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen, wobei die genomische DNA entweder dadurch verdaut wird, um so Restriktionsfragmente zu produzieren oder dadurch nicht verdaut wird; und d) Nachweisen, basierend auf der Anwesenheit oder der Abwesenheit von oder auf einer Eigenschaft von mindestens einem solchen Fragment, des Methylierungszustands der mindestens einen CpG Dinukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder eines Durchschnitts oder eines Wertes, der einen durchschnittlichen Methylierungszustand einer Vielzahl von CpG Dinukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 1 widerspiegelt, wodurch der Nachweis der proliferativen Erkrankungen von Colonzellen zumindest teilweise ermöglicht wird.
Verwendung eines EYA4 Polypeptids oder eines EYA4-kodierenden Polynukleotids zur Herstellung eines Medikaments zur Repression der Transformation in einer Colonzelle durch in Kontakt bringen der Zelle mit dem EYA4 Polypeptid oder durch Einführen des EYA4-kodierenden Polynukleotids in einer Menge, die effektiv ist, um einen transformierten Phänotyp zu inhibieren.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Transformation eine proliferative Erkrankungen von Colonzellen ist.
Verwendung eines von dem EYA4 Gen exprimierten Polypeptids zum Nachweis von proliferativen Erkrankungen von Colonzellen.
Verwendung eines Oligomers wobei das Oligomer eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden umfaßt, die komplementär ist zu oder unter stringenten Bedingungen an eine chemisch vorbehandelte genomische DNA nach einer der SEQ ID NO: 2 bis SEQ ID NO: 5, und dazu komplementären Sequenzen hybridisiert, zum Nachweis einer proliferativen Erkrankung von Colonzellen.
Verwendung nach Anspruch 16; wobei die Basensequenz des Oligomers mindestens ein CpG, TpG oder CpA Dinukleotid einschließt.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Oligomer als ein Primer-Oligonukleotid für die Amplifikation von DNA Sequenzen einer der SEQ ID NO: 2 bis SEQ ID NO: 5 und dazu komplementären Sequenzen verwendet wird.
Verwendung eines Kits zum Nachweis von proliferativen Erkrankungen von Colonzellen, wobei das Kit umfaßt: a) ein Bisulfitreagenz; und b) mindestens ein Nukleinsäuremolekül oder Peptid Nukleinsäuremolekül umfassend in jedem Fall eine kontinuierliche Sequenz von mindestens 9 Nukleotiden Länge, die komplementär ist zu, oder unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOS: 1 bis 5 hybridisiert, und Komplementen davon.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei der Kit weiter Standardreagenzien zur Durchführung eines Methylierungsassays ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MS-SNuPE, MSP, MethylLight^TM, HeavyMethyl^TM, COBRA, Nukleinsäuresequenzierung und Kombinationen davon umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 19 oder 20 zum Nachweis von proliferativen Erkrankungen von Colonzellen durch Nachweisen einer Abnahme der Menge oder der Expression eines Polypeptids, das von dem EYA4 Gen exprimiert wird oder der Anwesenheit oder Abwesenheit von mRNA, die für ein EYA4 Polypeptid kodiert.