SE501439C2 - Sätt och anordning för analys av polynukleotidsekvenser - Google Patents

Description

501 439 10 15 20 25 30 35 WO 90/09455 beskriver en metod där en specifik polynukleotidsekvens detekteras i ett material genom behandling av materialet med startsekvens (s.k. primer) i form av en oligonukleotid som är komplementär till och binder till en del av polynukleotidsekvensen. Den bundna startsekvensen byggs därefter pà, dvs extenderas, så att den extenderade produkten innefattar ett element som medger detektion och/eller separation. Den extenderade produkten separeras sedan till en fraktion som analyseras med avseende på den extenderade produkten. Närvaro av den sistnämnda indikerar närvaro av den specifika polynukleotidsekvensen i materialet.

Föreliggande uppfinning syftar till att tillhandahålla ett sätt att analysera kända polynukleotidsekvenser med avseende pà mutationer, vilken saknar nackdelarna hos de tidigare kända metoderna, ger kvantitativa resultat och specifika signaler samt kan göras robust och idiotsäker.

Enligt uppfinningsmetoden uppnås detta syfte genom att man detekterar en enbasextensionshändelse hos en uppsättning specifika startsekvenser bundna till en poly- nukleotid som skall analyseras, eller fragment av denna, i definierade positioner på en bärare, så att positionen för varje separat extensionshändelse definierar en basposition i polynukleotidsekvensen. Närmare bestämt fäster man på en fastfasbärare en eller flera uppsättningar av oligonukleotider, som innefattar fràn en till mánga konsekutiva oligonukleotider, vilka inom varje uppsättning skiljer sig med ett baspar och som motsvarar åtminstone en del av en sträng av den polynukleotid som skall bestämmas, som kan vara DNA eller RNA, med varje oligonukleotid i en känd position, och binder en enkelsträng av polynukleotiden som skall analyseras, eller fragment av denna, till den ordnade uppsättningen av oligonukleotider.

Hela strukturen utsätts därefter för extensionsreaktioner med kedjeterminering genom användning av ett nuklein- syrapolymeras och de fyra terminerande deoxinukleotiderna (dNTP'er), varvid de terminerande dNTP'erna kan särskiljas inbördes med lämpliga markörer. Samtliga oligonukleotider 10 15 20 25 30 35 501 439 får därigenom en basparsaddition, varvid positionen för varje separat addition på bäraren direkt definierar sekvenspositionen för varje bas i den polynukleotid som analyseras.

I en aspekt avser föreliggande uppfinning därför ett sätt att analysera en polynukleotidsekvens, vilket innefattar att man tillhandahåller en fastfasbärare, på vilken det i definierade lägen är fästa en eller flera uppsättningar av konsekutiva oligonukleotid- startsekvenser, som inom varje uppsättning skiljer sig med en bas vid den växande änden, under hybridiserings- betingelser tillför en enkelsträng av polynukleotiden, eller fragment av denna, till startsekvenserna så att den bildar en mall för varje startsekvens, utsätter startsekvenserna för enbasextensionsreaktioner med ett polymeras och respektive terminerande nukleotider som motsvarar de fyra baserna och som kan särskiljas inbördes, och observerar läget och identiteten för varje bunden terminerande nukleotid på bäraren för att därigenom bestämma sekvensen för åtminstone en del av polynukleotiden.

I en annan aspekt avser föreliggande uppfinning en anordning för att analysera en polynukleotidsekvens, innefattande en fastfasbärare och, fästa i definierade lägen pä en yta hos denna, en eller flera uppsättningar av konsekutiva oligonukleotid-startsekvenser baserade pà åtminstone en del av sekvensen för den polynukleotid som skall analyseras, varvid dessa konsekutiva startsekvenser inom varje uppsättning skiljer sig med en bas vid den växande änden.

Som kommer att beskrivas närmare nedan ger inte analys av en enkelsträng av en polynukleotid fullständig sekvensinformation i en mutationsregion, och i en föredragen utföringsform av sättet enligt uppfinningen analyserar man därför bägge strängarna, dvs (+)- och (-)- strängarna, av samma DNA-duplex för att làta de konsekutiva startsekvenserna annalkas mutationspunkten från tvà riktningar, vilket också kommer att beskrivas 501 439 10 15 20 25 närmare nedan. Genom analys av bägge polynukleotid- strängarna kommer dessutom även basbestämningar i de icke muterade regionerna att bekräftas.

Man inser att man i fallet med analys av en enkelsträng av en polynukleotid bör märka minst tre av de terminerande dNTP'erna, medan det i fallet med analys av båda strängarna kan vara tillräckligt med två markörer, om man inte behöver fullständig sekvensinformation. Lämpliga markörer är t ex fluorescerande ämnen och färgämnen.

Följande enkla exempel illustrerar att två märkta terminerande dNTP'er kan ge fullständig normal, mutant och heterozygot sekvensinformation.

Antag att man har en normal DNA-sekvens med följande basparssammansättning: + A C T G (2 T T A G - T G A (2(3 A A T C och en motsvarande mutant DNA-sekvens med baspars- sammansättningen: -+.A C C G C T T A G - T G G C G A A T C Om man t ex i ett fluorescerande signalsystem använder en röd markör ("R") för terminerande A och en grön markör ("G") för terminerande C och ingen märkning ("N") för de återstående baserna T och G, skulle man få följande "binära" koder, som medger sekvenstolkning, för de normala, mutanta respektive heterozygota sekvenserna: + N- G- R- N- G- R- R- N- N- Normal - R- N- N- G- N- N- N- R- G- + N- G- G- N- G- R- R- N- N- Mutant - R- N- N- G- N- N- N- R- G- 10 15 20 25 30 501 439 + N- G- G- N- G- R- R- N- N- - R- N- N- G- N- N- N- R- G- Heterozygot Den ordnade uppsättningen av oligonukleotid- startsekvenser kan vara bunden till fastfasbäraren, som t ex kan vara en platta eller ett "chip" av glas, kisel- dioxid eller annat material eller en belagd struktur, t ex med guld, via ett specifikt bindningspar, såsom biotin - avidin eller streptavidin. Exempelvis kan biotin-märkta startsekvenser enkelt fästas på en bärare belagd med streptavidin. Alternativt kan startsekvenserna bindas via en länkarm, t ex en kovalent bunden C1Q-20kolvätekedja.

Startsekvenserna kan även bindas direkt till den fasta bäraren, t ex via känd epoxid/aminkopplingskemi. För ytterligare detaljer hänvisas till Eggers, M.D. et al, "cenosensorsz microfabricated devices for automated DNA sequence analysis." Advances in DNA Sequencing Technology.

SPIE conference proceedings, January 21, 1993.

De oligonukleotider som används som startsekvenser har lämpligen en längd fràn ca 10 till ca 30 nukleotider, t ex 20 till 24 nukleotider, och kan framställas med konventionella metoder.

De terminerande dNTP'erna är företrädesvis dideoxinukleotider (ddNTP'er), men andra terminerande dNTP'er som är uppenbara för fackmannen kan givetvis också användas.

Om man endast är intresserad av att analysera polynukleotiden med avseende på möjliga mutationer i en eller flera specifika positioner i polynukleotidsekvensen, kan den nödvändiga ordnade uppsättningen av oligonukleotider för att täcka endast mutationsregionerna givetvis vara ganska liten. Om à andra sidan hela eller en större del av polynukleotiden skall analyseras med avseende på möjliga mutationer i varierande positioner, så blir den nödvändiga uppsättningen oligonukleotider betydligt större. Exempelvis kan hela HPRT-genen täckas 501 459 10 15 20 25 30 35 med 900 startsekvenser, t ex ordnade i en gruppering om 30 x 30. För att täcka hela p53-genen skulle det krävas 700 startsekvenser.

Detekteringen av mönstret av märkta terminerande dNTP'er bundna till startsekvenserna i de olika positionerna för startsekvens-uppsättningen kan utföras med konventionella anordningar, lämpligtvis en s.k. "charged coupled device" (CCD).

I en fördelaktig utföringsform kan de adderade terminerande nukleotiderna avlägsnas från fastfasbäraren efter avslutad analys, så att fastfasytan kan prepareras med immobiliserade oligonukleotider för en ny analys, dvs att bäraren görs àteranvändningsbar, såsom kommer att beskrivas längre fram.

I det följande kommer föreliggande uppfinning att beskrivas närmare, enbart som exempel, med hänvisning till de bifogade ritningarna, där Fig. 1 är en schematisk illustration av en enkelsträngmall bunden till en startsekvens, som i sin tur är fäst pä en fast fas: Fig. 2 visar en uppsättning konsekutiva startsekvenser för en del av mallsekvensen som följer omedelbart efter startsekvensen i Fig. 1: och Fig. 3 visar erhållna enkla basparsadditioner till samtliga startsekvenser i Fig. 2, liksom motsvarande additioner för motsvarande startsekvenser relaterade till den andra strängen (ej visade i Fig. 1).

För att analysera ett känt DNA-fragment med avseende pà närvaro av möjliga mutationer i enlighet med uppfinningsmetoden framställer man konsekutiva startsekvenser som skiljer sig genom ett baspar vid den växande änden och har förmåga att hybridisera successivt längs hela eller åtminstone den eller de intressanta delarna av DNA-fragmentet. Startsekvenserna för detta ändamål kan lämpligen ha en längd av 20-24 baser. De olika startsekvenserna fästs därefter på en fast fas, såsom ett glaschip, i definierade lägen pà bäraren, med hjälp av metoder som i sig är kända inom tekniken. 10 15 20 25 30 35 501 439 En enkelsträng av det DNA-fragment som skall bestämmas binds därefter till varje startsekvens under hybridiserande betingelser för bildning av mallar för respektive startsekvenser, såsom schematiskt visas i Fig. 1. Separation av de båda DNA-strängarna kan utföras antingen före eller efter deras bindning till startsekvenserna. I det illustrerade fallet är startsekvenserna bundna till fastfasbäraren via biotin - streptavidinkopplingar. Detta kan, som är i och för sig känt inom tekniken, ske genom att man förser startsekvenserna med biotinhandtag i anslutning till framställningen av startsekvenserna och därefter för startsekvenserna i kontakt med den fasta fasen som är belagd med streptavidin.

I Fig. 1 illustreras en del av sekvensen för DNA- strängmallen, som följer omedelbart efter den bundna startsekvensen, som TGCAACTA. Sex motsvarande konsekutiva startsekvenser visas i Fig. 2, dvs startsekvenser som slutar med de parande baserna A, AC, ACG, etc. Som exempel skulle en uppsättning om t ex 900 sådana konsekutiva startsekvenser anordnas på ett fastfaschip i en gruppering om 30 x 30 för att täcka samtliga exoner hos HPRT-genen. Även om det inte visas i Fig. 1, är motsvarande startsekvenser för den andra strängen av det DNA-fragment som skall analyseras också fästa på fastfaschipet i kända positioner.

Den erhållna strukturen utsätts därefter för en reaktionsblandning innefattande ett DNA-polymeras, t ex T7-polymeras, och fyra olika märkta terminerande dNTP'er, såsom ddNTP'er. De olika markörerna är lämpligtvis fluorescerande.

Som resultat av extensionsreaktionerna får samtliga startsekvenser i en enda körning en basparsaddition, såsom visats schematiskt för båda DNA-strängarna i Fig. 3; den startsekvensuppsättníng som är relaterad till den Fig. 1 illustrerade strängen visas till vänster i Fig. 3, och den andra strängen visas till höger. Enbasextensionerna visas med fetstil. Den nukleotid som adderats till varje 501 439 10 15 20 25 30 35 startsekvens är således en bas som basparar med mallbasen omedelbart intill den växande änden pà respektive startsekvens.

Eftersom positionen för varje skild startsekvens är känd, och eftersom identiteten för varje terminerande dNTP kan bestämmas via dess specifika markör, så kan den önskade sekvensen för DNA-fragmentet bestämmas från det observerade markörmönstret (t ex den "binära" kod som beskrivits tidigare), exempelvis med hjälp av en CCD- kamera. Med andra ord kommer positionerna på fastfas- chipet att direkt definiera sekvenspositionen för varje bas i DNA-fragmentet. Eftersom bägge strängarna körs, måste mönstret för de olika markörerna matcha varandra för att godkännas.

Antag nu att den nukleotidsekvens som visas i Fig. 1 innehåller en mutation, t ex att den tredje basen C från vänster är ersatt med ett G. Den översta startsekvensen i Fig. 2 kommer fortfarande att förlängas med ett C, såsom visas i Fig. 3, medan nästa startsekvens kommer att förlängas med ett C i stället för ett G. Eftersom denna nya bas C kan identifieras genom sin speciella markör och respektive startsekvensläge är känt, identifieras motsvarande basmutation som ett G.

Emellertid kommer närvaron av en sådan punktmutation att påverka basparningen av de närmast följande startsekvenserna med mallen och därigenom de erhållna extensionerna av startsekvenserna, så att de följande baserna i närheten av mutationen, sett i extensionsriktningen för startsekvensen, inte kan identifieras exakt. Dessa baser, liksom den ändrade basen G, kan á andra sidan identifieras genom basextensionerna av startsekvenserna för den andra polynukleotidsträngen, som när mutationsstället från motsatt riktning. De baser som följer efter mutationen i extensionsriktningen kommer emellertid, att, pà samma sätt som för den första strängen, påverkas av mutationen, så att de inte kan identifieras exakt av angränsande startsekvenser i denna uppsättning startsekvenser för den andra strängen. I de 10 15 20 25 30 35 501 439 närmaste regionerna på vardera sidan om mutationen ges därför sekvensbestämningen endast av startsekvenserna för den ena av de båda strängarna, och ingen matchning med baser i den andra strängen blir därför möjlig för dessa baser. Även om det antagits ovan att varje skild terminerande dNTP försetts med en specifik markör, inses utan vidare att det faktiskt kan vara tillräckligt med tre markörer, varvid den fjärde terminerande dNTP'n identifieras genom att den är omärkt.

Om man endast är intresserad av att screena med avseende på närvaro av en basmutation och inte med avseende pá den fullständiga bassekvensen i muta- tionsomràdet, är det tillräckligt att analysera en enkelsträng av DNA. Även i detta fall kan det vara tillräckligt med tre markörer.

Likartad begränsad sekvensinformation kan erhållas vid analys av bägge DNA-strängarna men med användning av bara tvâ markörer för de terminerande dNTP'erna, t ex så att T och C är märkta, medan A och C är omärkta.

Som redan antytts ovan kan fastfasbäraren, t ex ett glaschip, vara àteranvändningsbar genom att de adderade terminatorresterna avlägsnas efter avslutad analys och lämnar chipytan med immobiliserade oligonukleotid-start- sekvenser redo för en ny analys. Sådant avlägsnande kan exempelvis åstadkommas genom användning av terminerande nukleotider som kan genomgå enzymatisk eller kemisk klyvning eller nedbrytning.

Som exempel på enzymatisk klyvning kan nämnas användning av RNA-dideoxiaddition av T eller C med omvänt transkriptas eller annat polymeras med DNA-startsekvenser för RNA-addition för utveckling av sekvenssignalen. Ett C/T-klyvningsenzym som RNas A skulle då kunna användas för att "rensa" chipet för nästa användning. Ett annat exempel skulle vara användning'av svavelinnehállande dideoxi A eller G för signalsekvensen och ett svavelspecifikt esteras (som inte klyver fosfater) för avklyvning av 501 439 10 15 20 25 30 10 dideoxiterminatorn för att preparera chipet för förnyad användning.

Ett exempel på en kemiskt nedbrytbar terminerande nukleotid är en modifierad ribonukleotid med sina 2'- och 3'-hydroxylgrupper förestrade med t ex acetylgrupper.

Efter bindning av terminatorn till den immobiliserade startsekvens-oligonukleotiden avlägsnas acetylgrupperna genom behandling med en bas för exponering av 2'- och 3'- hydroxylgrupperna. Ribosresten kan sedan nedbrytas genom perjodatoxidation, och den kvarvarande fosfatgruppen avlägsnas från startsekvens-oligonukleotiden genom behandling med en bas och alkaliskt fosfatas. Chipet med immobiliserade startsekvens-oligonukleotider har därigenom iordningställts för förnyad användning.

Den föreslagna sekvensanalysmetoden enligt uppfinningen torde ha generell användning vid detektering av mutationer, deletioner, expanderade oligo- nukleotidupprepningar och andra genetiska abnormiteter.

Exempelvis torde den ge möjlighet att identifiera ramskiftmutationer orsakade av insertioner eller deletioner. Vidare kan man bestämma bärarstatus för humana ärftliga sjukdomar (t ex cystisk fibros, beta-talassemi, alfa 1, Gaucher's sjukdom, Tay Sach's sjukdom) eller blandningar av DNA-molekyler, såsom uppträder i HIV- infekterade patienter med läkemedelsresistens, eftersom både den normala signalen och mutantsignalen kan detekteras, dvs en tvetydighet i linjär sekvensaddition i regionen.

Uppfinningen är givetvis inte begränsad till de ovan beskrivna utföringsformerna, utan många modifieringar och ändringar kan göras inom ramen för föreliggande uppfinningstanke sådan den definieras i de efterföljande patentkraven.

Claims (11)

10 15 20 25 30 35 501 439 ll PATENTKRAV

1. Sätt att analysera en polynukleotidsekvens, kännetecknat av att man tillhandahåller en fastfasbärare, pá vilken det i definierade lägen är fästa en eller flera uppsättningar av konsekutiva oligonukleotid-start- sekvenser, som inom varje uppsättning skiljer sig med en bas i den växande änden, under hybridiseringsbetingelser tillför en enkelsträng av polynukleotiden, eller fragment därav, till startsekvenserna så att den bildar en mall för varje startsekvens, utsätter startsekvenserna för enbasextensionsreaktioner med ett polymeras och respektive terminerande nukleotider som motsvarar de fyra baserna och som kan särskiljas inbördes, och observerar läget och identiteten för varje bunden terminerande nukleotid på bäraren för att därigenom bestämma sekvensen för åtminstone en del av polynukleotiden.

2. Sätt enligt patentkravet 1, kännetecknat av att polynukleotiden innefattar två strängar och bägge stràngarna analyseras.

3. Sätt enligt patentkravet 1 eller 2, kännetecknat av att tre av de fyra terminerande nukleotiderna är olika märkta, t ex med fluorescerande ämnen.

4. Sätt enligt något av patentkraven 1-3, kännetecknat av att de terminerande nukleotiderna är dideoxinukleotider.

5. Sätt enligt något av patentkraven 1-4, kännetecknat av att startsekvenserna är 10-30merer, företrädesvis 20-24- merer.

6. Sätt enligt nàgot av patentkraven 1-5, kännetecknat av att observationen av läget och identiteten för de bundna terminerande nukleotiderna innefattar användning av en "charge coupled device" (CCD). 5.01 439 10 15 20 25 12

7. Sätt enligt något av patentkraven 1-6, kännetecknat av att extensionsreaktionerna utförs genom att man utsätter de med startsekvens försedda mallarna för en reaktionsblandning innefattande polymeraset och de fyra terminerande nukleotiderna.

8. Sätt enligt något av patentkraven 1-7, kännetecknat av att man avlägsnar de terminerande nukleotiderna från de immobiliserade startsekvenserna efter avslutad analys för att göra i ordning fastfasbäraren för förnyad användning.

9. Anordning för att analysera en polynukleotidsekvens, kännetecknad av att den innefattar en fastfasbärare och, fästa i definierade lägen pà en yta hos denna, en eller flera uppsättningar av konsekutiva oligonukleotid- startsekvenser baserade på åtminstone en del av sekvensen för en polynukleotid som skall analyseras, varvid de konsekutiva startsekvenserna inom varje uppsättning skiljer sig med en bas vid den växande änden.

10. Anordning enligt patentkravet 9, kännetecknad av att startsekvenserna är fästa på fastfasbäraren via ett specifikt bindningspar, såsom biotin - avidin eller streptavidin.

11. Anordning enligt patentkravet 9 eller 10, kännetecknad av att fastfasytan uppbär startsekvenser för bägge strängarna av polynukleotiden.