CN105378108A - 用于分离核酸的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容涉及用于核酸分离的系统和方法。特别地,本公开内容提供用于从体液(例如,血浆)分离低分子量循环核酸的系统和方法。
Description
本申请要求于2013年3月13日提交的临时专利申请序列号61/780,236的优先权,该临时申请通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本公开内容涉及用于核酸分离的系统和方法。特别地,本公开内容提供用于从体液(例如,血浆)分离低分子量循环核酸的系统和方法。
发明背景
细胞中存在的核酸可为脱氧核糖核酸或核糖核酸,并且可为基因组DNA、染色体外DNA (例如,质粒和附加体)、线粒体DNA、信使RNA、miRNA和转移RNA。核酸还可为对于宿主外源的并作为传染剂,例如细菌、病毒、真菌或单细胞有机体和传染性多细胞有机体(寄生虫)污染细胞。近来,核酸存在情况的检测和分析对单核苷酸多态性(SNP)、染色体重排、外源基因插入和核酸甲基化状态变更的鉴定变得重要。这些包括传染性病毒例如HIV和其它反转录病毒、跳跃基因例如转座子以及经重组工程改造的包含外源基因的有机体,例如Roundup
Ready植物的核酸的鉴定。
核酸分析具有一系列广泛的用途。例如,外源剂的存在情况可用作医学诊断工具。癌组织基因组成的鉴定也可用作医学诊断工具,证实该组织为癌性的,并确定癌组织的侵袭性质。染色体重排、SNP和基因表达中的异常变更可用作特定疾病状态的医学诊断。此外,遗传信息可用于查明特定药物的效力,这是药物基因组学领域所知的。
从细胞提取核酸的方法为本领域技术人员所熟知。细胞壁可通过多种方法削弱,以允许核酸从细胞挤出并允许其进一步纯化和分析。核酸提取的具体方法取决于待分离核酸的类型、细胞类型和用于分析核酸的具体应用。本领域技术人员已知多种分离DNA的方法,参见例如通用参考资料Sambrook和Russell, 2001, "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. (分子克隆:实验室手册)"。例如,现有技术包括用于从体液提取和分离DNA的化学浸渍和脱水固体-基质的例子,其使用溶解盐和洗涤剂并包含用于DNA样品长期储存的额外试剂,例如详述FTA纸的美国专利号5,807,527和详述Isocard纸的美国专利号6,168,922。现有领域还包括颗粒分离方法的例子,例如,U.S.
RE 37,891。
尽管许多核酸纯化程序已为人所熟知并且存在多年,但这些程序可为耗时的并且可能使用对进行纯化的人存在危险的试剂。例如,人们早已知道DNA可以使用有机提取程序以纯化的形式从检验样品容易地获得,但这样的程序可需要若干次提取因此可为耗时的。此外,一些有机溶剂的使用是不合需要的,并且如果没有遵照适当的防护措施是有危险的。
因此,存在对高效、有力和方便的用于从细胞分离核酸和(例如,从体液)制备用于分析的无细胞核酸的方法的需求。
发明概述
本公开内容涉及用于核酸分离的系统和方法。特别地,本公开内容提供用于从体液(例如,血浆)分离低分子量循环核酸的系统和方法。
因此,在一些实施方案中,本发明提供分离核酸的方法,包括:a) 使包含核酸的样品与包含35%以上体积乙醇的缓冲液接触;和b) 分离所述核酸。在一些实施方案中,核酸在细胞中,并且所述缓冲液裂解所述细胞。在一些实施方案中,缓冲液中的乙醇浓度为按体积计30%或更大(例如,35%、40%、45%、50%、55%、60%;+/- 1%、2%、3%、4%、5%或其小数或更高)。例如,在一些实施方案中,所述缓冲液包含约35%与40%之间、约35%与45%之间、约35%与50%之间、约35%与55%之间、约35%与60%之间、约35%与65%之间、约40%与45%之间、约40%与50%之间、约40%与55%之间、约40%与60%之间、约40%与65%之间、约50%与55%之间、约50%与60%之间、约55%与60%之间、约55%与60%之间以及约55%与65%之间、前述范围的+或– 1%、2%、3%、4%或5%的乙醇。在一些实施方案中,所述缓冲液包含约50% (例如,+/- 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或其小数)的乙醇。在一些实施方案中,乙醇浓度为约60%或更少。在一些实施方案中,分离核酸包括步骤i) 使核酸与固体载体结合;ii) 用洗涤缓冲液洗涤固体载体;和iii) 从固体载体洗脱核酸。在一些实施方案中,所述核酸为循环DNA。在一些实施方案中,所述循环DNA为低分子量DNA (例如,长度小于约1000、500或200个碱基)。在一些实施方案中,所述样品为血液、血液制品(例如,血浆)、血清或尿液。在一些实施方案中,所述样品来自受试者并且样品中核酸的存在情况、修饰或水平指示受试者的疾病状态(例如,癌症)。在一些实施方案中,所述方法进一步包括分析样品中核酸存在情况的步骤。在一些实施方案中,所述分析包括进行选自,例如,扩增测定(例如,实时PCR)、杂交测定、甲基化检测测定(例如,甲基化特异性PCR或heavy methyl PCR)或测序测定的核酸检测测定。
在一些实施方案中,本发明提供分离核酸的方法,包括:a) 使包含核酸的样品与包含约40%-60%体积乙醇的缓冲液接触;和b) 分离所述核酸。
本发明进一步提供分离核酸的方法,包括:a) 使包含核酸的样品与包含35%以上体积乙醇的缓冲液接触;和b) 通过i) 使核酸与固体载体结合;ii) 用洗涤缓冲液洗涤固体载体;和iii) 从固体载体洗脱核酸分离所述核酸。
本发明此外提供分离低分子量循环DNA的方法,包括a)
使包含低分子量循环DNA的样品与包含35%以上体积乙醇的缓冲液接触;和b) 从样品中分离所述低分子量DNA。
本发明还提供分离低分子量循环DNA的方法,包括:a)
使包含低分子量循环DNA的样品与包含35%以上体积乙醇的缓冲液接触;b) 从样品中分离所述低分子量DNA;和c) 使用扩增测定检测样品中低分子量DNA的存在情况,其中样品中核酸的存在情况、修饰或水平指示样品所获自的受试者的疾病。
本发明,在一些实施方案中,提供试剂盒,含有:a) 包含约35%或更多体积乙醇的缓冲液;b) 洗涤缓冲液;c)
固体载体;和d) 洗脱缓冲液。在一些实施方案中,所述固体载体为树脂、柱、颗粒或小珠。额外的实施方案提供试剂盒,含有:a) 包含约45%-65%体积乙醇的缓冲液;和b) 固体载体。
进一步的实施方案提供试剂盒,含有:a) 包含约50%体积乙醇的缓冲液;和b) 固体载体。
在一些实施方案中,所述试剂盒进一步包含用于核酸分析(例如,通过测序、扩增、杂交或甲基化特异性检测分析)的试剂。示例性的试剂包括,但不限于,一个或多个测序引物、检测试剂、缓冲液、一个或多个核酸探针、一个或多个扩增引物、核酸聚合酶、脱氧核苷酸、亚硫酸氢盐、甲基化特异性阻断探针或一个或多个甲基化特异性扩增引物。
本发明某些实施方案提供组合物,包含:循环DNA;和包含35%或更多体积乙醇的缓冲液。在一些实施方案中,所述核酸与固体载体结合。
基于本文所包含的教导,其它实施方案对于相关领域技术人员将是显而易见的。
发明详述
本公开内容涉及用于核酸分离的系统和方法。特别地,本公开内容提供用于从体液(例如,血浆)分离低分子量循环核酸的系统和方法。
定义
为了便于理解本技术,下文定义了多个术语和短语。其它的定义贯穿整个详述说明。
如本文所使用的,“一个”或“一种”或“所述”可意指一个或一个以上。例如,“一个”部件可意指一个部件或多个部件。
如本文所使用的,术语“核酸分子”指任何包含核酸的分子,包括但不限于,DNA或RNA。该术语包括含有DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列,所述类似物包括,但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮杂环丙基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D甘露糖基queosine、5'-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基N6异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5羟乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
术语“基因”指包含多肽、前体或RNA(例如,rRNA、tRNA)产生所必需的编码序列的核酸(例如,DNA)序列。所述多肽可由全长编码序列或由该编码序列的任何部分编码,只要保留全长或片段的期需活性或功能性质(例如,酶活性、配体结合、信号转导、免疫原性,等)。该术语还包括结构基因的编码区和位于编码区5’和3’末端附近距任一端约1 kb或以上的序列,这样,基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5’并存在于mRNA上的序列被称为5’非翻译序列。位于编码区3’或下游并存在于mRNA上的序列被称为3’非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式二者。基因的基因组形式或克隆包含被称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列间断的编码区。内含子为转录为核RNA (hnRNA)的基因片段;内含子可包含调节元件例如增强子。内含子从核或初级转录物上被除去或“拼接除去”;因此内含子在信使RNA (mRNA)转录物上不存在。mRNA在翻译期间起规定新生多肽的氨基酸序列或顺序的作用。
如本文所使用的术语“循环核酸”,是指循环系统(例如,血液或血液制品例如血浆)中存在的核酸。循环核酸可通过从细胞直接分泌、通过细胞坏死或通过细胞凋亡进入血流。在一些实施方案中,循环核酸为细胞游离核酸或“循环游离核酸(cfDNA)”。
术语“引物”是指当放置在诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(即,在核苷酸和诱导剂例如DNA聚合酶的存在下以及在合适的温度和pH下),能够充当合成起始点的寡核苷酸,无论是在纯化的限制酶消化产物中天然存在的还是合成产生的。为了在扩增中达到最大效率,所述引物优选为单链的,但也可为双链的。若为双链,首先处理引物以分开其两条链,然后用于制备延伸产物。优选地,所述引物为寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以便在诱导剂存在下引发延伸产物合成。引物的确切长度将取决于多个因素,包括温度、引物来源和所使用的方法。
术语“靶”,当关于聚合酶链反应使用时,是指用于聚合酶链反应的引物所结合的核酸区域。因此,“靶”寻求从其它核酸序列中分选出。“片段”定义为靶序列内的核酸区域。
如本文所使用的,术语“扩增子”是指经由扩增反应产生的核酸。扩增子通常为双链DNA;然而,其可为RNA和/或DNA:RNA。扩增子包括与样品核酸互补的DNA。在一些实施方案中,引物对配置为从样品核酸产生扩增子。正因如此,任何给定扩增子的碱基组成可包括引物对、引物对的补体和扩增产生扩增子的样品核酸区域。为本领域技术人员所理解的是,所设计引物对序列掺入扩增子中可替代引物结合位点的天然序列及其补体。在某些实施方案中,使用引物扩增靶区域后,得到的具有引物序列的扩增子被用于后续分析(例如碱基组成测定)。在一些实施方案中,扩增子进一步包含与后续分析相容的长度。
术语“扩增(amplifying)”或“扩增(amplification)”在核酸的语境中是指多核苷酸或多核苷酸的一部分的多个拷贝的产生,通常从小量的多核苷酸(例如,仅有单个多核苷酸分子)开始,其中扩增产物或扩增子一般为可检测的。多核苷酸的扩增包括多个化学和酶过程。在聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)期间从靶或模板DNA分子的一个或少数拷贝产生多个DNA拷贝为扩增的形式。扩增并不限于起始分子的严格复制。例如,使用反转录(RT)-PCR从样品中有限量的RNA产生多个cDNA分子为扩增的一种形式。此外,在转录过程中从单个DNA分子产生多个RNA分子也是扩增的一种形式。
如本文所使用的,术语“固体载体”是指核酸纯化或分离中利用的在水溶液中不溶解的基质或其它固体材料。例如,在一些实施方案中,固体载体为核酸纯化和分离中利用的基质。实例包括,但不限于,小珠、颗粒、树脂、色谱柱等。在一些实施方案中,固体载体用增强核酸结合的物质包覆或功能化。
如本文所使用的,术语“受试者”和“患者”是指任何动物,例如狗、猫、鸟、牲畜,特别地哺乳动物,优选人。
如本文所使用的,术语“样品”以其最广泛的含义使用。在某种意义上,其意味着包括代表性部分或获自任何来源的培养物,包括生物和环境来源。生物样品可从动物(包括人)获得并且包括液体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品,例如血浆、血清等。然而这些例子不解释为限制适用于本发明的样品类型。
本技术的实施方案
尽管本文的公开内容涉及某些说明性的实施方案,应理解的是这些实施方案以举例的方式而非以限制的方式呈现。
在一些疾病状态(例如结直肠癌)中,循环DNA的水平随癌症阶段上升。因此,1阶段(最易治愈的阶段)的患者,具有最低量的可分析的循环DNA。所以,从血浆中分离/回收尽可能多的该循环DNA是非常重要的。因此,需要用于增加循环DNA下游测定(例如,扩增或测序测定)所使用的DNA的得率的方法。
本公开内容实施方案的开发过程中所进行的实验期间,使用自动样品处理装置(Abbott m2000sp仪器)或使用DNA样品制备试剂盒手动从血浆分离DNA,所述试剂盒的裂解或分离缓冲液和洗涤缓冲液中包含33.3%乙醇。用模拟样品研究了40%-66% (40%、45%、50%、55%、60%和66%)的乙醇浓度,模拟样品为加入10 pg/ml甲基化septin9
DNA的阴性稀释液。用分离缓冲液中66%乙醇检验的模拟样品为混浊的、粘稠的并且不能捕获微粒。用分离缓冲液中60%和55%乙醇检验的样品看起来仍然混浊但能够捕获微粒,所述缓冲液中50%的乙醇提供良好的结果。
本发明的实施方案提供用于使用具有增加的乙醇浓度的裂解/分离和/或结合缓冲液从生物样品(例如,含水样品如血浆、血液、尿液、血液制品等)分离核酸的试剂盒、系统和方法。在一些实施方案中,血浆或其它样品无细胞或细胞材料。本文所述试剂盒、系统和方法可用于研究、筛查、诊断、临床和治疗应用。
因此,在一些实施方案中,本发明提供用于从生物样品(例如,血浆)分离无细胞低分子量DNA的试剂盒、系统和方法。本发明并不限于特定的样品。适用于所述方法的生物样品(例如,含水样品)的实例包括,但不限于,全血、血液制品(例如,血浆)、尿液、精液、淋巴液、唾液、眼泪、粘液等。
本发明不限于分离特定来源的核酸。在一些实施方案中,核酸为哺乳动物的。在其它实施方案中,分离来自外来病原体(例如,病毒、细菌、真菌等)的核酸。在一些特别的实施方案中,分离低分子量循环核酸并任选进行检测。本发明不限于分离特定分子量的DNA。在一些实施方案中,使用本文所述系统和方法分离的DNA小于约20,000个碱基(例如,小于15,000、小于10,000、小于5000、小于4000、小于3000、小于2000、小于1000、小于500个碱基、小于400个碱基、小于300个碱基、小于250个碱基、小于200个碱基、小于150、小于100个碱基、小于50个碱基或小于20个碱基)。
在一些实施方案中,本发明提供用于改善低分子量循环(例如,细胞游离)核酸回收率的组合物(例如,反应混合物)、系统和方法。在一些实施方案中,增加用于从样品(例如,血液或血浆样品)裂解或分离核酸的缓冲液和/或结合缓冲液中的醇(例如,乙醇)浓度。在一些实施方案中,缓冲液中的乙醇浓度为按体积计30%或更大(例如,35%、40%、45%、50%、55%、60%;+/- 1%、2%、3%、4%、5%或其小数或更高)。例如,在一些实施方案中,所述缓冲液包含约35%与40%之间、约35%与45%之间、约35%与50%之间、约35%与55%之间、约35%与60%之间、约35%与65%之间、约40%与45%之间、约40%与50%之间、约40%与55%之间、约40%与60%之间、约40%与65%之间、约50%与55%之间、约50%与60%之间、约55%与60%之间、约55%与60%之间以及约55%与65%之间、前述范围的+或– 1%、2%、3%、4%或5%的乙醇。在一些实施方案中,所述缓冲液包含约50% (例如,+/- 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或其小数)的乙醇。在一些实施方案中,乙醇浓度为约60%为更少。
在一些实施方案中,利用市售核酸纯化试剂盒和系统。这样的系统通过使核酸与固体载体(例如,柱、小珠、颗粒等)结合起作用。通过用洗涤缓冲液洗涤除去污染物。然后将纯化的核酸从载体上洗脱。在一些实施方案中,核酸分离的一个或多个步骤为自动化的(例如,使用自动化样品处理或机器人)。
分离后,可使用任何合适的方法分析核酸。在一些实施方案中,检测病原体的存在情况(例如,血源性或尿源性病原体)。在其它实施方案中,检测核酸变体、多态性、突变、甲基化状态等的存在情况(例如,与癌症相关的循环核酸)。
在一些实施方案中,分离与癌症相关的循环核酸并使用本文所述方法分析。多种循环或循环游离核酸(cfDNA)已经显示与癌症相关(参见例如,Fleischhacker, Biochim Biophys Acta. 2007 Jan;1775(1):181-232. Epub 2006
Oct 7和Chan等,
British Journal of Cancer (2007) 96, 681–685 2007年2月20日在线出版; Schwarzenbach等,
Nature 11:426 [2011]; 其各自通过引用结合到本文中)。
在一些实施方案中,分离了可用于产前诊断的循环核酸并使用本文所述方法检测。循环在孕妇血液中的无细胞胎儿核酸为早期无创产前基因检测提供了机会(参见例如,Sayres,
Obstet Gynecol Surv. 2011 Jul;66(7):431-42; 通过引用结合到本文中)。
在一些实施方案中,检测微小RNA(例如,与疾病相关的微小RNA)。
在一些实施方案中,循环核酸为甲基化的并且所述检测方法包括甲基化-特异性检测方法(例如,下文所描述的那些)。
核酸检测方法的实例包括,但不限于,测序、扩增、微阵列、探针结合等。示例性方法在下文中描述。
A. 测序
在一些实施方案中,使用测序方法进一步分析用本文所述系统、组合物和方法(例如,包含至少35%体积(例如,40-60%、45-55%或约50%)乙醇的分离/裂解缓冲液)分离的核酸。
核酸测序技术的说明性非-限制实例包括,但不限于,链终止剂(Sanger)测序和染料终止剂测序。
考虑了多种核酸测序方法用于本公开内容的方法,包括例如,链终止剂(Sanger)测序、染料终止剂测序和高通量测序方法。参见,例如,Sanger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467
(1997); Maxam等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564 (1977);
Drmanac,等, Nat. Biotechnol. 16:54-58
(1998); Kato, Int. J. Clin. Exp. Med. 2:193-202 (2009); Ronaghi等, Anal. Biochem. 242:84-89 (1996); Margulies等, Nature 437:376-380 (2005); Ruparel等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5932-5937
(2005)以及Harris等, Science 320:106-109 (2008); Levene等, Science 299:682-686 (2003); Korlach等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:1176-1181
(2008); Branton等, Nat. Biotechnol. 26(10):1146-53
(2008); Eid等, Science 323:133-138 (2009);其各自通过引用以其整体结合到本文中。
在一些实施方案中,所述技术用于该领域所理解的自动化测序技术。在一些实施方案中,本技术用于分段扩增子的并行测序(Kevin McKernan等的PCT公布号WO2006084132,通过引用以其整体结合到本文中)。在一些实施方案中,所述技术用于通过并行寡核苷酸延伸的DNA测序(参见,例如,Macevicz等的美国专利号5,750,341和Macevicz等的美国专利号6,306,597,二者通过引用以其整体结合到本文中)。所述技术用于的测序技术的其它实例包括Church polony技术(Mitra等, 2003, Analytical Biochemistry 320, 55-65; Shendure等, 2005 Science 309, 1728-1732; 美国专利号6,432,360,
美国专利号6,485,944, 美国专利号6,511,803;
通过引用以其整体结合到本文中)、454
picotiter焦磷酸测序技术(Margulies等, 2005
Nature 437, 376-380; US 20050130173; 通过引用以其整体结合到本文中)、Solexa单碱基添加技术(Bennett等, 2005, Pharmacogenomics, 6, 373-382; 美国专利号6,787,308;
美国专利号6,833,246; 通过引用以其整体结合到本文中)、Lynx大规模并行标记测序技术(Brenner等 (2000). Nat. Biotechnol. 18:630-634; 美国专利号5,695,934; 美国专利号5,714,330; 通过引用以其整体结合到本文中)和Adessi PCR集落技术(Adessi等 (2000). Nucleic Acid Res. 28, E87; WO 00018957; 通过引用以其整体结合到本文中)。
在一些实施方案中,本文所提供的技术用于第二代(又称下一代或Next-Gen)、第三代(又称Next-Next-Gen)或第四代(又称N3-Gen)测序技术,包括但不限于,焦磷酸测序、连接法测序(sequencing-by-ligation)、单分子测序、合成法测序(sequence-by-synthesis) (SBS)、大规模并行克隆、大规模并行单分子SBS、大规模并行单分子实时、大规模并行单分子实时纳米孔技术等。Morozova和Marra在Genomics, 92: 255 (2008)中提供了一些此种技术的综述,通过引用以其整体结合到本文中。本领域普通技术人员将认识到由于RNA在细胞中不太稳定并且实验中更易被核酸酶攻击,因此测序前通常将RNA反转录为DNA。
下一代测序(NGS)方法共享大规模并行、高通量策略这一普遍特征,以比旧测序方法低成本为目标(参见,例如,Voelkerding等, Clinical
Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean等, Nature
Rev. Microbiol., 7: 287-296; 各自通过引用以其整体结合到本文中)。NGS方法可大致分为通常使用模板扩增的那些和不使用的那些。需要扩增的方法包括作为454技术平台(例如,GS20和GS FLX)由Roche商业化的焦磷酸测序、由Illumina商业化的Solexa平台和由Applied Biosystems商业化的Supported
Oligonucleotide Ligation and Detection (SOLiD)平台。非扩增方法,也称为单分子测序,通过由Helicos BioSciences商业化的HeliScope平台以及分别由VisiGen、Oxford Nanopore Technologies Ltd., Life
Technologies/Ion Torrent和Pacific Biosciences商业化的新兴平台例示。
B. 杂交
在一些实施方案中,使用杂交方法进一步分析用本文所述系统、组合物和方法(例如,包含至少35%体积(例如,40-60%、45-55%或约50%)乙醇的分离/裂解缓冲液)分离的核酸。
核酸杂交技术的说明性非-限制实例包括,但不限于,微阵列,其包括但不限于:DNA微阵列(例如,cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列)。DNA微阵列,通常称为基因芯片、DNA芯片或生物芯片,为附着在固体表面(例如,玻璃、塑料或硅片)为表达谱或同时监测数千个基因表达水平的目的形成阵列的微小DNA斑点的集合。附着的DNA片段称为探针,单个DNA微阵列中可使用数千个探针。微阵列可用于通过比较疾病与正常细胞中的基因表达鉴定疾病基因或转录物。微阵列可使用多种技术制作,包括但不限于:使用细尖针(fine-pointed pins)打印在载玻片上、使用预制的掩膜光刻、使用动态微镜装置光刻、喷墨打印或微电极阵列上的电化学。
Southern和Northern印迹分别被用于检测特定DNA或RNA序列。将从样品中提取的DNA或RNA片段化,在基质凝胶上电泳分离并转移到滤膜上。使结合滤膜的DNA或RNA与目的序列互补性标记探针杂交。检测结合到滤膜上的杂交探针。该程序的一个变更为反向Northern印迹,其中附着在膜上的底物核酸为所分离DNA片段的集合并且探针为从组织提取并标记的RNA。
C. 扩增
在一些实施方案中,使用扩增方法进一步分析用本文所述系统、组合物和方法(例如,包含至少35%体积(例如,40-60%、45-55%或约50%)乙醇的分离/裂解缓冲液)分离的核酸。
核酸可在检测前或与检测同时扩增。核酸扩增技术的说明性非-限制实例包括,但不限于,聚合酶链反应(PCR)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、转录-介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、甲基化特异性PCR
(MSP)、MethylLight PCR和HeavyMethyl
PCR。本领域普通技术人员将认识到某些扩增技术(例如,PCR)需要在扩增前将RNA反转录为DNA (例如,RT-PCR),而其它扩增技术直接扩增RNA (例如,TMA和NASBA)。
聚合酶链反应(美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159和4,965,188,其各自通过引用以其整体结合到本文中),通常称为PCR,使用变性、引物对与相反链的退火和引物延伸的多个循环,以指数增加靶核酸序列的拷贝数。在称为RT-PCR的变更中,使用反转录酶(RT)从mRNA制备互补DNA
(cDNA),然后通过PCR扩增cDNA产生DNA的多个拷贝。对于PCR的其它不同变换,参见,例如,美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159; Mullis等, Meth. Enzymol.
155: 335 (1987); 和Murakawa等, DNA 7: 287 (1988), 其各自通过引用以其整体结合到本文中。
转录介导的扩增(美国专利号5,480,784和5,399,491,其各自通过引用以其整体结合到本文中),通常称为TMA,在基本上恒定的其中靶序列的多个RNA拷贝自动催化产生额外拷贝的温度、离子强度和pH的条件下自动催化合成靶核酸序列的多个拷贝。参见,例如,美国专利号5,399,491和5,824,518,其各自通过引用以其整体结合到本文中。在美国公布号20060046265 (通过引用以其整体结合到本文中)中所述的一个变更中,TMA任选结合阻断部分、终止部分和其它改善TMA方法灵敏度和准确度的修饰部分的使用。
连接酶链反应(Weiss, R., Science 254: 1292 (1991), 通过引用以其整体结合到本文中),通常称为LCR,使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。所述DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复循环中通过DNA连接酶共价连接产生可检测的双链的连接寡核苷酸产物。
链置换扩增(Walker, G.等, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 392-396 (1992); 美国专利号5,270,184和5,455,166,其各自通过引用以其整体结合到本文中),通常称为SDA,使用引物对序列与靶序列的相反链退火、引物在dNTPαS存在下延伸产生双螺旋半硫代磷酸化引物延伸产物、内切核酸酶介导的半修饰限制性内切核酸酶识别位点的缺口产生以及聚合酶-介导的引物从缺口3’末端延伸以置换现有链并产生用于下一轮引物退火、产生切口和链置换的链的循环,导致产物的几何扩增。嗜热SDA (tSDA)在基本上相同的方法中以较高的温度使用嗜热内切核酸酶和聚合酶(欧洲专利号0 684
315)。
其它扩增方法包括,例如:基于核酸序列的扩增(美国专利号5,130,238,通过引用以其整体结合到本文中),通常称为NASBA;使用RNA复制酶扩增探针分子本身的方法(Lizardi等, BioTechnol.
6: 1197 (1988), 通过引用以其整体结合到本文中),通常称为Qβ复制酶;基于转录的扩增方法(Kwoh等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989));和,自我-持续序列复制(Guatelli等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87: 1874 (1990), 其各自通过引用以其整体结合到本文中)。对于已知扩增方法的进一步讨论参见Diagnostic Medical Microbiology: Principles and
Applications (Persing等编辑), pp. 51-87 (美国微生物学会, Washington, DC (1993))中的Persing, David H., “In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques (体外核酸扩增技术)”。
D. 检测方法
非-扩增或扩增的核酸可通过任何常规方法检测。例如,核酸可通过与可检测标记的探针杂交并测量所得的杂交体检测。检测方法的说明性非-限制实例在下文中描述。
一个说明性的检测方法,杂交保护测定(HPA)涉及使化学发光寡核苷酸探针(例如,吖啶酯标记(AE)探针)与靶序列杂交、有选择地水解未杂交探针上存在的化学发光标记和在光度计中测量剩余的探针所产生的化学发光。参见,例如,美国专利号5,283,174和Norman
C. Nelson等, Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing,
ch. 17 (非同位素探查、印迹和测序,第17章)
(Larry J. Kricka编辑, 第2版. 1995, 其各自通过引用以其整体结合到本文中)。
另一个说明性的检测方法提供扩增过程的实时定量评估。扩增过程的“实时”评估涉及在扩增反应期间连续或周期性地测定反应混合物中扩增子的量和使用所测定的值计算样品中初始存在的靶序列的量。本领域已熟知多种用于基于实时扩增测定样品中初始存在的靶序列的量的方法。这些包括美国专利号6,303,305和6,541,205中所公开的方法,其各自通过引用以其整体结合到本文中。另一个用于测定样品中初始存在的靶序列的量但并非基于实时扩增的方法在美国专利号5,710,029中公开,该专利通过引用以其整体结合到本文中。
扩增产物可通过使用多个自我-杂交的探针实时检测,所述探针的多数具有茎-环结构。这样的自我-杂交探针标记为使其根据探针是自我-杂交状态还是通过与靶序列杂交改变的状态发射不同的可检测信号。举非限制性实例来说,“分子火炬(molecular torches)”为一种含有通过连接区(例如,非核苷酸接头)连接并在预定的杂交测定条件下互相杂交的自我-互补的不同区域(称为“靶结合结构域”和“靶关闭结构域”)的自我-杂交探针。在一个优选的实施方案中,分子火炬在靶结合结构域中包含1-约20个碱基长并且为可在链置换条件下与扩增反应中存在的靶序列的杂交的单链碱基区域。在链置换条件下,分子火炬的两个互补区域(可为完全或部分互补的)的杂交为有利的,除非存在靶序列,其将与靶结合结构域中存在的单链区域结合并置换所有或部分靶关闭结构域。分子火炬的靶结合结构域和靶关闭结构域包含放置的可检测标记或一对相互作用的标记(例如,发光剂/猝灭剂)以便该分子火炬自我-杂交时产生与该分子火炬与靶序列杂交时不同的信号,从而允许在未杂交分子火炬存在下检测所检验样品中的探针:靶双链体。分子火炬和多种类型的相互作用标记对在美国专利号6,534,274中公开,该专利通过引用以其整体结合到本文中。
具有自我-互补性的检测探针的另一个实例为“分子信标”。分子信标包含具有靶互补序列、使探针在无扩增反应中所存在的靶序列时保持为闭合构象的亲和对(或核酸臂)和当探针为闭合构象时相互作用的标记对的核酸分子。靶序列与靶互补序列的杂交将亲和对的成员分离,从而使探针转变为开放构象。由于标记对的相互作用减少,向开放构象的转变是可检测的,标记对可为,例如,荧光团和猝灭剂(例如,DABCYL和EDANS)。分子信标在美国专利号5,925,517和6,150,097中公开,这些专利通过引用以其整体结合到本文中。
其它自我-杂交的探针为本领域普通技术人员所熟知。举非限制性实例说明,具有相互作用标记的探针结合对,例如美国专利号5,928,862 (通过引用以其整体结合到本文中)中公开的那些,可经适应用于本发明中。本发明中还可利用用于检测单核苷酸多态性(SNP)的探针系统。其它的检测系统包括“分子开关”,如美国公布号20050042638中所公开的,通过引用以其整体结合到本文中。其它探针,例如包含嵌入染料和/或荧光染料的那些,也可用于本发明扩增产物的检测。参见,例如,美国专利号5,814,447 (通过引用以其整体结合到本文中)。
在一些实施方案中,核酸通过使用质谱分析(例如,Abbott PLEX-ID系统, Abbot Ibis
Biosciences, Abbott Park, Illinois)鉴定独特的碱基组成标记(BCS)检测和表征,如美国专利7,108,974、8,017,743和8,017,322中所表述的,其各自通过引用以其整体结合到本文中。
E. 甲基化-特异性检测
在一些实施方案中,使用甲基化-特异性检测方法进一步分析用本文所述系统、组合物和方法(例如,包含至少35%体积(例如,40-60%、45-55%或约50%)乙醇的分离/裂解缓冲液)分离的核酸。
在一些实施方案中,甲基化分析利用亚硫酸氢盐转化或甲基化敏感性限制酶(MSRE)。亚硫酸氢盐转化方法利用测序、引物-探针、引物-凝胶或引物-阵列分析。
用于分析DNA 5-甲基胞嘧啶的一个方法基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特异反应,其在随后的碱水解时转化为在碱基配对行为中与胸腺嘧啶对应的尿嘧啶。5-甲基胞嘧啶在这些条件下保持不变。因此,原始DNA以这样的方式转化使得原本在其杂交行为中不能与胞嘧啶区分的甲基胞嘧啶此刻可以,例如,通过扩增和杂交或测序检测。这些技术基于目前已充分利用的碱基配对。
检测5-甲基胞嘧啶的方法的综述可从下列调查文章中获悉:Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic
Acids Res. 1998, 26, 2255。
亚硫酸氢盐技术涉及已知基因的短特异性片段,该片段在亚硫酸氢盐处理之后扩增并完全测序(Olek, A.和Walter, J.,
Nat Genet. 1997, 17, 275-276)或通过引物延伸反应(Gonzalgo, M. L.,和Jones, P. A., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2529-2531, WO 9500669)或通过酶消化(Xiong, Z.和Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 1997, 25, 2532-2534)检测单个胞嘧啶的位置。此外,通过杂交检测也已经有描述(Olek等, WO 99 28498)。
进一步的论述使用亚硫酸氢盐技术用于个体基因中甲基化检测的出版物为:Xiong, Z.和Laird, P. W.
(1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L.和Jones, P. A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S.和Clark, S. (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M.等 (1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R.等 (1994), Nucl. Acids Res. 22, 695; Martin, V.等 (1995), Gene 157, 261; WO 97 46705; WO 95 15373和WO 45560,通过引用以其整体结合到本文中。使用亚硫酸氢盐技术检测DNA样品中胞嘧啶甲基化在7,524,629中描述,其通过引用以其整体结合到本文中。
其它的用于检测甲基化状态的方法在,例如,Lombaerts, M.等 (2006) British Journal of Cancer. 94:661-671; Yoshiura, K.等 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:7416-7419;
Lind, G. E.等 (2004) Molecular Cancer 3:28; Kumagai, T.等 (2007) Int. J. Cancer. 121:656-665; Hennig,
G.等 (1996) J.
Biol. Chem. 271(1):595-602; Marchevsky, A. M.等 (2004). Journal of Molecular Diagnostics
6:28-36; Reinhold, W. C.等 (2007). Mol. Cancer. Ther. 6:391-403; Hu, X-C.等 (2002) Life Sciences 71:1397-1404; 或Nakata, S.等 (2006) Cancer 106(10):2190-2199中描述,其各自通过引用以其整体结合到本文中。市售试剂盒也可用于测定肿瘤细胞中的启动子甲基化状态(例如,Panomics,
Redwood City, Calif的启动子甲基化PCR试剂盒)。
本领域已知多种甲基化测定程序并且根据本技术可与亚硫酸氢盐处理联合使用。这些测定允许测定核酸序列内一个或多个CpG二核苷酸(例如,CpG岛)的甲基化状态。在其它技术中,这样的测定涉及亚硫酸氢盐-处理核酸的测序、PCR(序列-特异性扩增)、Southern印迹分析和甲基化-敏感性限制酶的使用。
“HeavyMethyl™”测定技术为用于基于亚硫酸氢盐-处理DNA的甲基化-特异性扩增评估甲基化差异的定量方法。甲基化-特异性阻断探针(阻断剂)覆盖扩增引物之间或被扩增引物覆盖的CpG位置,使核酸样品的甲基化-特异性选择扩增成为可能。
术语“HeavyMethyl™
MethyLight™”测定是指MethyLight™测定的变更HeavyMethyl™ MethyLight™测定,其中将MethyLight™测定与覆盖扩增引物之间的CpG位置的甲基化特异性阻断探针结合。HeavyMethyl™测定还可与甲基化特异性扩增引物组合使用。
用于HeavyMethyl™分析的典型试剂(例如,如可存在于典型的基于MethyLight™的试剂盒中的)可包括,但不限于:特异性位点(例如,特异性基因、标志、DMR、基因区、标志区、亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛等)的PCR引物、阻断寡核苷酸、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸以及Taq聚合酶。
术语“MSP”(甲基化-特异性PCR)是指Herman等 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821–9826和美国专利号5,786,146所描述的本领域所公认的甲基化测定。
MSP (甲基化-特异性PCR)允许评估CpG岛内几乎任何CpG位点群的甲基化状态,而不依赖于甲基化-敏感性限制酶的使用(Herman等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; 美国专利号5,786,146)。简言之,DNA通过亚硫酸氢钠修饰,这将尽管是未甲基化的但是未经过甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,产物随后用相比未甲基化DNA对甲基化DNA特异的引物扩增。MSP仅需要小量DNA,对给定CpG岛位点的0.1%甲基化等位基因敏感,并且可在从石蜡包埋样品提取的DNA上进行。用于MSP分析的典型试剂(例如,如可存在于典型的基于MSP的试剂盒中的)可包括,但不限于:特异性位点(例如,特异性基因、标志、DMR、基因区、标志区、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的甲基化和未甲基化PCR引物、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸以及特异性探针。
MethyLight™测定为利用PCR步骤后无需进一步处理的基于荧光的实时PCR (例如,TaqMan®)的高通量定量甲基化测定(Eads等, Cancer Res. 59:2302-2306, 1999)。简言之,MethyLight™过程开始于基因组DNA的混合样品,所述样品根据标准程序在亚硫酸氢钠反应中转化为甲基化-依赖性序列差异的混合池(亚硫酸氢盐过程将未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶)。然后在“偏倚”反应中例如,用与已知CpG二核苷酸重叠的PCR引物进行基于荧光的PCR。序列区分在扩增过程水平和荧光检测过程水平二者发生。
MethyLight™测定被用作核酸,例如基因组DNA样品中甲基化模式的定量检验,其中序列区分在探针杂交水平发生。在一个定量版本中,PCR反应在存在与特定的假定甲基化位点重叠的荧光探针时提供甲基化特异性扩增。通过其中既无引物也无探针覆在任何CpG二核苷酸上的反应提供输入DNA量的无偏对照。或者,通过用不覆盖已知甲基化位点的对照寡核苷酸(例如,基于荧光的HeavyMethyl™版本和MSP技术)或用覆盖潜在甲基化位点的寡核苷酸探查偏倚的PCR池完成基因组甲基化的定量试验。
MethyLight™方法与任何合适的探针(例如,“TaqMan®”探针、Lightcycler®探针,等)一起使用。例如,在一些应用中用亚硫酸氢钠处理双链基因组DNA并使其经受使用TaqMan®探针的两组PCR反应之一,例如,用MSP引物和/或HeavyMethyl阻断剂寡核苷酸以及TaqMan®探针。TaqMan®探针用荧光“报道”和“猝灭剂”分子双重标记并设计为对相对高GC含量的区域特异以便其在PCR循环中在约比正向或反向引物高10℃的温度时熔解。这允许TaqMan®探针在PCR退火/延伸步骤期间保持完全杂交。由于Taq聚合酶在PCR期间酶促合成新链,其将最终达到退火的TaqMan®探针。然后Taq聚合酶的5’到3’外切核酸酶活性将通过消化TaqMan®探针将其置换以释放荧光报道分子用于使用实时荧光检测系统定量检测其此刻未猝灭的信号。
用于MethyLight™分析的典型试剂(例如,如可能存在于典型的基于MethyLight™的试剂盒中的)可包括,但不限于:特异性位点(例如,特异性基因、标志、DMR、基因区、标志区、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物、TaqMan®或Lightcycler®探针、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸以及Taq聚合酶。
F. 数据分析
在一些实施方案中,使用基于计算机的分析程序为临床医生将检测测定所产生的原始数据(例如,给定核酸的存在、不存在或量)翻译为预测值数据。临床医生可使用任何合适的方法访问该预测数据。因此,在一些优选的实施方案中,本发明提供临床医生(不太可能经受遗传学或分子生物学训练)不需理解原始数据这一进一步的益处。数据以其最有用的形式直接呈现给临床医生。然后临床医生能够立即利用该信息以便优化对受试者的护理。
本发明考虑了能够向和从进行测定的实验室、信息提供者、医务人员和受试者接受、处理和传送信息的任何方法。例如,在本发明一些实施方案中,从受试者获得样品(例如,活组织检查或血清或尿液样品)并将其呈交给位于世界任何部分(例如,在与受试者居住或信息最终使用的国家不同的国家)的分析服务(例如,医疗设施的临床实验室、基因组分析业务,等)以产生原始数据。样品包含组织或其它生物样品时,受试者可访问医疗中心获取样品并送至分析中心,或受试者可自己收集样品(例如,尿液样品)并直接送至分析中心。样品包含先前测定的生物信息时,该信息可由受试者直接送至分析服务(例如,可用计算机扫描包含该信息的信息卡并使用电子通信系统将数据传送至分析中心的计算机)。一旦分析服务接收,该样品即被处理并产生对受试者所期需的诊断或预后信息特异性的分析(即,表达数据)。
然后将分析数据制备为适于治疗临床医生判读的格式。例如,制备的格式可以表现为对受试者诊断或风险评估(例如,核酸的存在或不存在),连同对特定治疗方案的建议,而不是提供原始数据。数据可通过任何合适的方法显示给临床医生。例如,在一些实施方案中,分析服务产生临床医生可(例如,在护理点)打印的报告或在计算机监视器上显示给临床医生的报告。
在一些实施方案中,所述信息首先在护理点或区域设施分析。然后将原始数据送至中央处理设施进一步分析和/或将原始数据转化为对临床医生或病人有用的信息。中央处理设施提供隐私(所有数据以统一的安全协议存储在中央设施中)、速度和数据分析的一致性等优点。中央处理设施可然后按照受试者的处理控制数据的命运。例如,使用电子通信系统,中央设施可向临床医生、受试者和研究人员提供数据。
在一些实施方案中,受试者能够使用电子通信系统直接访问所述数据。受试者可基于该结果选择进一步的干预和咨询。在一些实施方案中,该数据为用于研究用途。例如,所述数据可用于进一步优化作为有用的特定疾病状况或阶段的指示物或作为确定治疗的作用进程的伴随诊断的标志的包含或消除。
E. 系统和试剂盒
在一些实施方案中,本发明提供用于分离和分析核酸(例如,低分子量循环DNA)的试剂盒和系统。在一些实施方案中,试剂盒包含核酸检测所必需、足够或有用的试剂(例如,试剂、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、对照、说明书等)。在一些实施方案中,试剂盒包含用于结合核酸的固体载体(例如,小珠、树脂、柱、颗粒等)。在一些实施方案中,试剂盒包含含有至少35%体积(例如,40-60%、45-55%或约50%)乙醇的分离/裂解缓冲液。
例如,在一些实施方案中,本发明提供一种试剂盒,其包含:a) 含有35%或以上体积乙醇的缓冲液;b) 洗涤缓冲液;c)
固体载体;和d) 洗脱缓冲液。在一些实施方案中,乙醇以约40%-60%的浓度存在于所述缓冲液中。在一些实施方案中,乙醇以约45%-55%的浓度存在于所述缓冲液中。在一些实施方案中,乙醇以约50%的浓度存在于所述缓冲液中。在一些实施方案中,所述固体载体选自,例如,树脂、柱、颗粒或小珠。
在一些实施方案中,所述试剂盒进一步包含用于核酸分析的试剂。例如,在一些实施方案中,所述分析选自,例如,测序、扩增、杂交或甲基化特异性检测。在一些实施方案中,所述试剂选自,例如,一个或多个测序引物、检测试剂、缓冲液、一个或多个核酸探针、一个或多个扩增引物、核酸聚合酶、脱氧核苷酸、亚硫酸氢盐、甲基化特异性阻断探针和/或一个或多个甲基化特异性扩增引物。
在一些实施方案中,试剂盒包含用于核酸分离及其通过测序分析的试剂。例如,在一些实施方案中,试剂盒包含用于核酸分离的试剂(例如,包含至少35%体积(例如,40-60%、45-55%或约50%)乙醇的分离/裂解缓冲液、固体载体、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液等)和用于进行序列测定的试剂(例如,一个或多个测序引物、检测试剂、缓冲液、仪器(例如,光谱仪)、对照等)。
在一些实施方案中,试剂盒包含用于核酸分离及其通过杂交分析的试剂。例如,在一些实施方案中,试剂盒包含用于核酸分离的试剂(例如,包含至少35%体积(例如,40-60%、45-55%或约50%)乙醇的分离/裂解缓冲液、固体载体、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液等)和用于进行杂交测定的试剂(例如,一个或多个核酸探针、检测试剂、缓冲液、仪器(例如,光谱仪)、对照等)。
在一些实施方案中,试剂盒包含用于核酸分离及其通过扩增分析的试剂。例如,在一些实施方案中,试剂盒包含用于核酸分离的试剂(例如,包含至少35%体积(例如,40-60%、45-55%或约50%)乙醇的分离/裂解缓冲液、固体载体、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液等)和用于进行扩增测定的试剂(例如,一个或多个扩增引物、核酸聚合酶、脱氧核苷酸、缓冲液、检测试剂、仪器(例如,光谱仪)、对照等)。
在一些实施方案中,试剂盒包含用于核酸分离及其通过甲基化特异性检测方法分析的试剂。例如,在一些实施方案中,试剂盒包含用于核酸分离的试剂(例如,包含至少35%体积(例如,40-60%、45-55%或约50%)乙醇的分离/裂解缓冲液、固体载体、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液等)和用于进行甲基化特异性检测测定的试剂(例如,亚硫酸氢盐、甲基化特异性阻断探针、一个或多个甲基化特异性扩增引物、核酸聚合酶、脱氧核苷酸、缓冲液、检测试剂、仪器(例如,光谱仪)、对照等)。
在一些实施方案中,试剂盒包含一个或多个含有试剂、固体载体、缓冲液(例如,洗涤缓冲液、裂解/分离缓冲液、洗脱缓冲液等)、对照等的容器。在一些实施方案中,所述试剂盒的各个组分包装在单独的容器中。在一些实施方案中,所述容器包装在同一盒或箱中和/或在同一盒或箱中运输以供一起使用。在一些实施方案中,所述试剂盒的一个或多个组分单独运输和/或包装。
在一些实施方案中,系统包括自动化样品和试剂操作装置(例如,机器人)。
实施例
为了证明和进一步说明本发明某些优选的实施方案和方面提供下列实施例,而非解释为限制本发明范围。
实施例1
材料和方法
1. 手动样品提取
进行手动样品制备以提取和浓缩靶DNA分子使靶可被扩增,并使用Abbott mSample Preparation SystemDNA试剂盒去除潜在的抑制剂。该DNA提取试剂盒使用磁性颗粒捕获核酸,然后洗涤颗粒以去除未结合的样品组分。洗脱核酸,然后在热循环仪中经由亚硫酸氢盐处理将非甲基化的胞嘧啶残基转化。使用Abbott mSample
Preparation SystemDNA试剂盒再次分离和纯化核酸。将洗脱的样品连同制备的PCR反应混合物一起转移至96-孔光学反应板中。然后将该板转移至Abbott m2000rt仪器中。
DNA提取和后-亚硫酸氢盐纯化步骤二者均利用向Abbott mSample
Preparation SystemDNA试剂盒的裂解缓冲液添加乙醇来结合DNA。第一个步骤为DNA提取,其涉及DNA与磁性颗粒和裂解缓冲液结合,随后洗涤和洗脱。第二个步骤为亚硫酸氢盐处理,涉及所洗脱DNA用亚硫酸氢盐在下列条件下处理:99℃ 5分钟,50℃ 25分钟,99℃ 5分钟,50℃ 1小时25分钟,99℃ 5分钟,50℃ 4小时55分钟,保持4℃。第三个步骤为后-亚硫酸氢盐纯化,涉及DNA与磁性颗粒和裂解缓冲液结合,随后洗涤和洗脱,然后PCR。
2. 实时PCR
使用由靶向Septin9的1正向引物和1反向引物组成的引物混合物扩增甲基化的Septin9靶,该靶用Septin9-特异性探针检测。引物对Septin9基因位点的未甲基化等位基因的退火被与未甲基化等位基因特异性结合的甲基化-特异性阻断剂寡核苷酸阻止。PCR反应设计为仅扩增甲基化的Septin 9靶并用甲基化特异性探针检测扩增的靶。用靶向β-肌动蛋白序列的引物组产生β-肌动蛋白扩增子并用β-肌动蛋白特异性探针检测。这用作测定的内部控制。β-肌动蛋白的扩增区域不经受甲基化,因此该区域的胞嘧啶始终被亚硫酸氢盐修饰。
除引物和探针外,PCR反应由13单位AmpliTaq
Gold酶、7 mM氯化镁(作为激活剂)和寡核苷酸试剂(包含0.6 mM
dNTP、0.05 uM ROX参比染料、Tris、KCl和抗微生物剂)组成。
实时扩增/检测反应在Abbott m2000rt仪器上用下列循环条件进行:93℃ 30 min
1个循环;93℃ 30 s,62℃ 5 s和58℃ 35 s,50个循环。50个循环的读数步骤(58℃)期间记录荧光测量结果。
实施例2
DNA裂解/结合缓冲液中的乙醇滴定
在裂解缓冲液中利用了一系列乙醇浓度(45%、50%或55%),在步骤1 (DNA提取)和步骤3 (后-亚硫酸氢盐纯化)二者中与裂解缓冲液中33%的乙醇(通常使用的乙醇浓度)比较。样品在阴性血浆中以低靶水平(10 pg/ml、25
pg/ml和100 pg/ml)包含稀释的超声处理的甲基化Septin9 DNA。这些低水平靶的每个均以10个重复检验,每个研究中总共30个样品。总体样品阳性定义为所检测阳性样品在所检验样品总数上的百分比。
本实施例证明增加DNA样品制备试剂盒中裂解缓冲液的乙醇浓度增加从血浆的DNA得率。
表1. Septin9 %样品检测
裂解缓冲液中的%乙醇 | N | 总体样品阳性(%) |
33% | 30 | 67% |
45% | 30 | 87% |
50% | 30 | 80% |
55% | 30 | 77% |
实施例3
对结直肠癌样本的灵敏度
用CRC阳性样品进一步检验裂解缓冲液中50%的乙醇浓度,与33%的乙醇浓度比较对患者样品的灵敏度。用增加的裂解缓冲液中的乙醇检验16个结直肠癌样本并与用Abbott实时mS9结直肠癌测定检验的同一样本对比。Abbott实时mS9结直肠癌测定使用Abbott m2000sp仪器自动化处理血浆样品并且其通常在裂解缓冲液中含有33%乙醇。
本实施例证明裂解缓冲液中乙醇浓度从33%增加至50%能够增加对3阶段结直肠癌的灵敏度。
表2 对结直肠癌样本的灵敏度的性能
实施例4
对患者样本的特异性
用从具有正常结肠镜检查结果的50岁以上的人中收集的阴性样品评估了裂解缓冲液中增加的乙醇对特异性的影响。总共检验了50个样品,由于Abbott
m2000rt仪器错误1个样品无效。在该群体中,测定的特异性为93.9%。
表3 特异性性能
N | 未检测到的数目 | 特异性% |
49 | 46 | 93.9 |
对于所有目的,上述说明书中提及的所有出版物和专利通过引用以其整体结合到本文中。在不脱离所述技术的范围和精神的情况下,所述组合物、方法和技术的用途的多种修饰和变更将对本领域技术人员显而易见。尽管所述技术已经结合具体的示例性实施方案进行描述,应理解的是如所要求的本发明不应被过度限制在这样的具体实施方案中。实际上,对相关领域技术人员显而易见的所述实施本发明的模式的多种修饰意在随附权利要求的范围内。
Claims (34)
1. 一种分离核酸的方法,包括:
a) 使包含核酸的样品与包含大于35%体积的乙醇的缓冲液接触;和
b) 从所述样品分离所述核酸。
2. 权利要求1的方法,其中所述乙醇以约40%-60%的浓度存在于所述缓冲液中。
3. 权利要求1的方法,其中所述乙醇以约45%-55%的浓度存在于所述缓冲液中。
4. 权利要求1的方法,其中所述乙醇以约50%的浓度存在于所述缓冲液中。
5. 权利要求1的方法,其中所述分离所述核酸包括步骤i) 使所述核酸与固体载体结合;ii) 用洗涤缓冲液洗涤所述固体载体;和iii) 从所述固体载体洗脱所述核酸。
6. 权利要求1-5中任一项的方法,其中所述核酸为循环DNA。
7. 权利要求6的方法,其中所述DNA长度小于1000个碱基。
8. 权利要求6的方法,其中所述DNA长度小于500个碱基。
9. 权利要求6的方法,其中所述DNA长度小于200个碱基。
10. 权利要求1-8中任一项的方法,其中所述样品选自血液、血液制品、血清和尿液。
11. 权利要求9的方法,其中所述血液制品为血浆。
12. 权利要求1-11中任一项的方法,其中所述样品来自受试者并且所述样品中所述核酸的存在情况指示所述受试者的疾病状态。
13. 权利要求12的方法,其中所述疾病状态为癌症。
14. 权利要求1-13中任一项的方法,进一步包括分析所述样品中所述核酸的存在情况的步骤。
15. 权利要求14的方法,其中所述分析包括进行选自扩增测定、杂交测定、甲基化状态检测测定和测序测定的核酸检测测定。
16. 权利要求15的方法,其中所述扩增测定为实时PCR。
17. 权利要求15的方法,其中所述甲基化状态检测测定为甲基化特异性PCR或heavy methyl PCR。
18. 一种试剂盒,包含:
a) 包含35%或以上体积的乙醇的缓冲液;
b) 洗涤缓冲液;
c) 固体载体;
d) 洗脱缓冲液。
19. 权利要求18的试剂盒,其中所述乙醇以约40-60%的浓度存在于所述缓冲液中。
20. 权利要求18的试剂盒,其中所述乙醇以约45-55%的浓度存在于所述缓冲液中。
21. 权利要求18的试剂盒,其中所述乙醇以约50%的浓度存在于所述缓冲液中。
22. 权利要求18的试剂盒,其中所述固体载体选自树脂、柱、颗粒和小珠。
23. 权利要求18的试剂盒,其中所述试剂盒进一步包含用于核酸分析的试剂。
24. 权利要求23的试剂盒,其中所述分析选自测序、扩增、杂交和甲基化特异性检测。
25. 权利要求24的试剂盒,其中所述试剂选自一个或多个测序引物、检测试剂、缓冲液、一个或多个核酸探针、一个或多个扩增引物、核酸聚合酶、脱氧核苷酸、亚硫酸氢盐、甲基化特异性阻断探针和一个或多个甲基化特异性扩增引物。
26. 一种组合物,包含:循环DNA;和包含35%或以上体积的乙醇的缓冲液。
27. 权利要求26的组合物,其中所述核酸与固体载体结合。
28. 权利要求26的组合物,其中所述乙醇以约40%-60%的浓度存在于所述缓冲液中。
29. 权利要求26的组合物,其中所述乙醇以约45%-55%的浓度存在于所述缓冲液中。
30. 权利要求26的组合物,其中所述乙醇以约50%的浓度存在于所述缓冲液中。
31. 权利要求26的组合物,其中所述固体载体选自树脂、柱、颗粒和小珠。
32. 权利要求26的组合物,其中所述DNA长度小于1000个碱基。
33. 权利要求26的组合物,其中所述DNA长度小于500个碱基。
34. 权利要求26的组合物,其中所述DNA长度小于200个碱基。
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