CN105358709A - 用于检测基因组拷贝数变化的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测基因组拷贝数变化的系统和方法。具体而言,本发明涉及用于检测拷贝数变化的下一代测序方法。拷贝数改变(CNV)是大小范围为500个碱基以上(经常介于5千和5百万个碱基之间)的基因组区域的获得或丢失。全基因组研究已经揭示了在人类中大量CNV区域的存在,和在普通人群中的广泛的遗传多样性。
Description
本申请要求2013年3月15日提交的临时专利申请系列号61/787,419的优先权,其通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本发明涉及用于检测基因组拷贝数变化的系统和方法。具体而言,本发明涉及用于检测拷贝数变化的下一代测序方法。
背景
拷贝数改变(CNV)是大小范围为500个碱基以上(经常在五千和五百万个碱基之间)的基因组区域的获得或丢失。全基因组研究已显示,在人类中存在大量的CNV区域,和在普通人群之间存在广泛范围的遗传多样性。因为其在人类遗传病症中的作用,CNV已经成为许多新近研究的焦点。参见例如Iafrate等,2004,NatGenet36:949-951;Sebat等,2004,Science305:525-528;Redon等,2006,Nature444:444-454;Wong等,2007,AmJHumGenet80:91-104;Ropers,2007,AmJHumGenet81:199-207;Lupski,2007,NatGenet39:S43-S47,上述各文献通过引用予以结合。非整倍性,例如三体性或全染色体缺失,是与多种人类疾病相关的拷贝数改变的限制类型。
比较基因组杂交(CGH)是一种用于检测拷贝数变化和其它基因组畸变的技术。在CGH中,通常将试验样品与参考样品比较,以测定基因组畸变的存在。通常,将来自试验样品的核酸与来自参考样品的核酸差异标记,并通常将来自两种样品的核酸杂交至探针的微阵列。然后自杂交至微阵列的核酸检测信号。自试验和参考核酸的标记产生的信号的对数比率(log比率)与期望值(例如,对于二倍体区域为0)的偏差经检测和可用作拷贝数差异的指示。
目前可用的CGH技术仍具有明显的局限性。例如,通常称为"GC波"(其可由于用于CGH的探针的鸟嘌呤/胞嘧啶(GC)含量所致)的某些泛基因组的人工产物可引起对数比率偏离其期望值,产生假阳性。GC-波可加入大范围的变异性至探针信号比率,并干扰数据分析算法,这是因为它们可使信号对数比率数据偏斜远离期望值。GC-波人工产物可增加在特定的基因组区域中的假阳性畸变调用的可能性,并还可遮掩真实的畸变调用(参见Marioni等,(2007),GenomeBiology,8:R228)。
荧光原位杂交(FISH)、实时PCR和数字PCR(ddPCR)方法已用于检测基因拷贝数变化,然而使用这些技术,可多重检测(样品、目的区域和变体类型)的程度受到限制。与FISH、实时PCR和数字PCR技术相比,下一代测序具有进行明显更高程度的多重检测(全部在单个测定中进行样品多重检测、靶区域多重检测和变体类型多重检测)的能力(参见例如,(Castle等,(2010)BMCGenomics,11:244;Wood等,NucleicAcidsResearch,第38卷,第14期,e151;Conway等,(2012)TheJournalofMolecularDiagnostics,第14卷,第2期,pl04-111)。
此外,具体而言,FISH缺乏区分密切存在的局部改变的“精微”的分辨力。测序方法例如全基因组测序已用于检测拷贝数改变(Xi等,PNAS108:E1128(2011);Zong等,Science(2012)第338卷第114期第1622-1626页)。然而,这样的方法是耗时和昂贵的,并需要大量的生物信息学分析以确定拷贝数改变。
需要用于检测CNV的另外的方法。
简述
本发明涉及用于检测基因组拷贝数变化的系统和方法。具体而言,本发明涉及用于检测拷贝数变化的下一代测序方法。
例如,在一些实施方案中,本发明提供确定目的核酸区域的染色体拷贝数变化(例如,增加或减少(例如缺失))或基因表达变化(例如增加或减少)的方法,其包括:a)从目的区域和至少一个对照区域扩增核酸以产生靶和对照扩增子;b)将靶和对照扩增子测序以产生测序读出;和c)比较靶扩增子的水平与对照扩增子的水平。在一些实施方案中,从靶核酸产生2个或更多个扩增子(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。在一些实施方案中,目的区域是少于全基因组的核酸区域(例如,染色体、染色体的臂、染色体的区域、一个或多个基因或非编码区)。在一些实施方案中,至少一个对照区域包含在与目的区域相同的染色体上的第一对照区域和在不同于目的区域的核酸(例如染色体)上的第二对照区域。在一些实施方案中,所述比较包括将第一对照扩增子和第二对照扩增子的比率与靶扩增子和第二对照扩增子的比率进行比较。在一些实施方案中,大于或小于第一对照扩增子和第二对照扩增子的比率的靶扩增子和第二对照扩增子的比率指示目的区域的染色体拷贝数变化或基因表达变化。在一些实施方案中,拷贝数变化为至少2倍(例如,至少5、10、20、30、40或更多倍)。在一些实施方案中,目的区域的染色体拷贝数变化或基因表达变化指示在受试者中的疾病(例如癌症)的诊断或预后。在一些实施方案中,预后是疾病发展的可能性、疾病对治疗的反应、或疾病复发的可能性。在一些实施方案中,所述方法还包括根据诊断或预后确定起作用的疗程。在一些实施方案中,目的区域是基因组DNA,和染色体拷贝数变化是位于所述基因组DNA中的基因的增加或减少(例如缺失)。在一些实施方案中,目的区域是mRNA,和基因表达变化是增加或减少的mRNA表达(例如,由于基因融合所致)。在一些实施方案中,所述方法还包括在扩增期间或在扩增后加入核酸衔接头至扩增子。在一些实施方案中,衔接头在扩增后连接或在扩增期间加入(例如,作为扩增引物的一部分)。在一些实施方案中,测序是下一代测序。在一些实施方案中,进行45或更少(例如40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、20、15、10或更少)个扩增循环。本发明不受限于引物的具体类型。实例包括但不限于化学修饰的引物、荧光修饰的引物、功能引物(融合引物)、序列特异性引物、随机引物、具有特异性和随机序列两者的引物、和DNA和RNA引物。
在进一步的实施方案中,本发明提供确定目的核酸区域的染色体拷贝数变化(例如,增加或减少)或基因表达变化的方法,其包括:a)从目的区域以及第一和第二对照区域扩增核酸以产生靶和对照扩增子;b)将靶和对照扩增子测序以产生测序读出;和c)比较靶扩增子的水平和对照扩增子的水平。
在另外的实施方案中,本发明提供确定目的核酸区域的染色体拷贝数变化(例如,增加或减少)或基因表达变化的方法,其包括:a)从目的区域以及第一和第二对照区域扩增核酸以产生靶以及第一和第二对照扩增子;b)将靶和对照扩增子测序以产生测序读出;和c)将第一对照扩增子和第二对照扩增子的比率与靶扩增子和第二对照扩增子的比率进行比较。
在仍其它的实施方案中,本发明提供确定目的核酸区域的染色体拷贝数变化(例如,增加或减少)或基因表达变化的方法,其包括:a)从目的区域和至少一个对照区域扩增核酸以产生靶和对照扩增子,其中所述扩增利用衔接核酸;b)将靶和对照扩增子测序以产生测序读出;和c)比较靶扩增子的水平和对照扩增子的水平。
在另外的实施方案中,本发明提供确定目的核酸区域的染色体拷贝数变化(例如,增加或减少)或基因表达变化的方法,其包括:a)从目的区域以及第一和第二对照区域扩增核酸以产生靶以及第一和第二对照扩增子;b)将靶和对照扩增子测序以产生测序读出;和c)将第一对照扩增子和第二对照扩增子的比率与靶扩增子和第二对照扩增子的比率进行比较;和d)当检出大于或小于第一对照扩增子和第二对照扩增子的比率的靶扩增子和第二对照扩增子的比率时,确定目的区域的拷贝数变化或表达改变。
本发明还提供试剂盒,其包含以下的一种或多种或全部,基本上由以下的一种或多种或全部组成,或由以下的一种或多种或全部组成:a)用于扩增靶核酸的第一组引物对;b)用于扩增对照核酸的至少一组第二组引物;c)多个核酸衔接头;和任选地d)与核酸衔接头特异性杂交的至少一种测序引物。在一些实施方案中,至少一组第二引物包含用于扩增两个对照核酸(例如,在与靶核酸相同的染色体上的第一对照和在不同核酸(例如,不同的染色体)上的第二对照)的两组引物。在一些实施方案中,所述第一组引物与目的基因特异性杂交。在一些实施方案中,试剂盒还包含数据分析软件。
本发明的实施方案提供测序靶扩增子和对照扩增子的方法,其包括:a)从靶和对照核酸区域扩增靶和对照扩增子的文库;和b)使用大规模平行测序技术测序扩增子的文库,以产生多个测序读出。在一些实施方案中,所述方法还包括当相对于对照区域,从靶区域产生增加数量的测序读出时,检测靶核酸区域的拷贝数或表达的改变的步骤。
本发明进一步提供试剂盒,其包含以下的一种或多种或全部,基本上由以下的一种或多种或全部组成,或由以下的一种或多种或全部组成:a)用于扩增靶核酸的至少一组第一组引物对;b)用于扩增第一和第二对照核酸的至少两组引物;c)多个核酸衔接头;和d)与核酸衔接头特异性杂交的至少一种测序引物。
本发明进一步提供试剂盒,其包含以下的一种或多种或全部,基本上由以下的一种或多种或全部组成,或由以下的一种或多种或全部组成:a)用于扩增靶核酸的至少一组第一组引物对;b)用于扩增第一和第二对照核酸的至少两组引物,其中第一对照核酸在与靶相同的染色体上,和第二对照在与对照不同的核酸(例如不同的染色体)上;c)多个核酸衔接头;和d)与核酸衔接头特异性杂交的至少一种测序引物。
本发明另外提供组合物,其包含反应混合物,基本上由反应混合物组成,或由反应混合物组成,所述反应混合物包含靶核酸、用于扩增靶核酸的至少一组第一组引物对、用于扩增对照核酸的至少一组第二组引物、多个核酸衔接头和与核酸衔接头特异性杂交的至少一种测序引物。
根据本文包含的教导,对相关领域的技术人员而言,其它实施方案将是显而易见的。
附图简述
图1显示用于本发明的实施方案的CNV检测测定的示例性测定设计。
图2显示用于本发明的实施方案的CNV检测测定的示例性测定设计。
图3显示EGFR拷贝数扩增的理论结果。
图4显示用包含不同量的肿瘤细胞的样品进行的EGFR拷贝数扩增为40的理论结果。
图5显示用包含不同量的肿瘤细胞的样品进行的EGFR拷贝数扩增为10的理论结果。
图6显示用包含不同量的肿瘤细胞的样品进行的EGFR拷贝数扩增为5的理论结果。
图7显示使用本公开内容的实施方案的方法的在测序后EGFR的CNV的检测。
图8显示使用本公开内容的实施方案的方法的在测序后EGFR的CNV的检测。
图9显示使用本公开内容的实施方案的方法的基因融合和/或表达水平变化的检测。
图10显示为产生涵盖EGFR(外显子18、19、20和21)、KRAS(外显子2和3)、BRAF(外显子11和15)和NRAS(外显子2)的扩增子而进行的多重PCR(9丛)的结果。
图11显示使用多重PCR和NGS的拷贝数改变检测。
详述
本发明涉及用于检测基因组拷贝数变化的系统和方法。具体而言,本发明涉及用于检测拷贝数变化的下一代测序方法。
定义
为便于理解本发明的技术,下文定义了许多术语和短语。在详述全文中阐明了其它定义。
如本文所使用的,“一个”或“一种”或“该”可意指一个或超过一个。例如,“一个”小部件可意指一个小部件或多个小部件。
如本文所使用的术语"标记"是指可用于提供可检测的(优选可计量的)作用并且可与核酸或蛋白连接的任何原子或分子。标记包括但不限于染料;放射标记,例如32P;结合部分例如生物素;半抗原,例如洋地黄毒苷;发光部分、发磷光部分或发荧光部分;和单独的或与可通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或改变发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可提供通过荧光、放射性、比色法、重量分析法、X-射线衍射或吸收、磁、酶活性等可检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷),或者可以是电中性的。标记可包括核酸或蛋白序列或由它们组成,只要包含所述标记的序列是可检测的。在一些实施方案中,在没有标记的情况下直接检测核酸(例如,直接读出序列)。
术语"引物"是指以下寡核苷酸,无论是以纯化的限制性消化物天然存在的还是合成产生的,当置于其中诱导引物延伸产物(其与核酸链互补)的合成的条件下(例如,在核苷酸和诱导剂例如DNA聚合酶的存在下和在合适的温度和pH)时,其能够作为合成的起始点起作用。对于最大扩增效率,引物优选为单链的,但可备选为双链的。如果是双链的,则引物首先经处理以将其链分开,然后用于制备延伸产物。优选地,引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物应该足够长,以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的准确长度将取决于许多因素,包括温度、引物的来源和方法的使用。
在一些实施方案中,引物包含不与目的核酸杂交的另外的序列。例如,在一些实施方案中,引物包含在测序分析中使用的锚序列。术语“引物”包括化学修饰的引物、荧光修饰的引物、功能引物(融合引物)、序列特异性引物、随机引物、具有特异性和随机序列两者的引物、和DNA和RNA引物。
术语"靶"当用于提及聚合酶链反应时,是指由用于聚合酶链反应的引物结合的核酸区域。因此,"靶"被要求从其它核酸序列中选出。"区段"被定义为在靶序列内的核酸区域。
如本文所使用的,术语“受试者”和“患者”是指任何动物,例如狗、猫、鸟、家畜,和特别是哺乳动物,和优选是人类。
如本文所使用的,术语“灵敏度”被定义为测定法(例如,方法、试验)的性能的统计学度量,其通过真阳性的数量除以真阳性和假阴性的总和来计算。
如本文所使用的,术语“特异性”被定义为测定法(例如,方法、试验)的性能的统计学度量,其通过真阴性的数量除以真阴性和假阳性的总和来计算。
如本文所使用的,术语“扩增子”是指通过扩增反应产生的核酸。扩增子通常是双链DNA;然而,其可以是RNA和/或DNA:RNA。扩增子包括与样品核酸互补的DNA。在一些实施方案中,引物对经配制以从样品核酸产生扩增子。因此,任何给定的扩增子的碱基组成可包括引物对、引物对的互补物和经扩增以产生扩增子的样品核酸区域。本领域技术人员理解,设计的引物对序列掺入至扩增子中可置换在引物结合位点上的天然序列和其互补物。在某些实施方案中,在使用引物扩增靶区域后,得到的具有引物序列的扩增子用于后续分析(例如碱基组成测定,例如通过直接测序)。在一些实施方案中,扩增子还包括与后续分析相容的长度。
如本文所使用的,术语“文库”是指多个核酸。例如,在一些实施方案中,本公开内容利用扩增子的文库。在一些实施方案中,文库包含2个或更多个(例如3个或更多个、5个或更多个、7个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个或50个或更多个)核酸(例如,扩增子)。
在核酸的上下文中,术语"扩增"是指产生多个拷贝的多核苷酸、或多核苷酸的一部分,通常自少量的多核苷酸(例如,少至单个多核苷酸分子)开始,其中扩增产物或扩增子通常是可检测的。多核苷酸的扩增包括多种化学和酶过程。在聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)或连接酶链反应(LCR)期间自一个或几个拷贝的靶或模板DNA分子产生多个DNA拷贝是扩增的形式。扩增不限于起始分子的严格复制。例如,使用反转录(RT)-PCR从样品中的有限量的RNA产生多个cDNA分子是扩增的形式。此外,在转录过程期间从单个DNA分子产生多个RNA分子也是扩增的形式。
如本文所使用的,术语“锚”是指用作用于第二核酸的退火的模板的核酸。在一些实施方案中,锚用作测序引物的退火位点(例如,在下一代测序方法中)。
如本文所使用的,术语“目的区域”是指所分析的核酸(例如,使用本文所述的组合物、系统或方法之一)。在一些实施方案中,目的区域是基因组的一部分或基因组DNA的区域(例如,包含一条或多条染色体或一个或多个基因)。在一些实施方案中,分析自目的区域表达的mRNA。在一些实施方案中,目的区域的拷贝数或自目的区域表达的mRNA的水平相对于对照区域的水平而改变(例如,增加、减少或缺失)。在一些实施方案中,改变的拷贝数或表达水平指示在包含核酸的受试者中疾病的存在或风险。
如本文所使用的,术语“至少一个对照区域”是指与目的区域不同的区域。在一些实施方案中,“至少一个对照区域”是指已知表达水平的已知基因组拷贝数的区域。例如,在一些实施方案中,对照区域在与目的区域相同或不同的核酸分子(例如,染色体)上。
如本文所使用的,术语“样品”以其最广泛的意思使用。在一个意思中,它意指包括获自任何来源的有代表性的部分或培养物,所述来源包括生物学来源和环境来源。生物学样品可获自动物(包括人类)和包括流体、固体、组织和气体。生物学样品包括血液制品,例如血浆、血清等。在一些实施方案中,样品包括细胞(例如,肿瘤细胞)或组织(例如,肿瘤或活检组织),或自所述细胞或组织分离的核酸(例如,DNA或RNA)。环境样品包括环境材料例如表面物质、土壤、泥、淤泥、生物膜、水和工业样品。然而,这样的实例不应解释为限制可应用于本发明的样品类型。
技术的实施方案
尽管本文的公开内容提及某些说明性的实施方案,但应理解,这些实施方案以实例的方式而不是以限制的方式呈现。
迄今为止,在下一代测序研究团体中的拷贝数改变检测工作已集中在CNV发现上,而不是在能够检测靶向的临床相关基因组区域的拷贝数变化的测定法的开发上。本公开内容的实施方案描述了基于扩增子的方法以检测来自人类基因组样品的目的靶向区域的拷贝数改变。被这样的目的靶向区域方法占据的下一代测序运行“真实地位(realestate)”的百分比允许每个下一代测序运行更高得多程度的多重检测。
当仅调查几个目的区域的拷贝数改变时,本文所述的方法提供有限量的那些区域的相关信息/数据,这是因为所述数据在那些区域中具有较小/稀释的覆盖度。这描述了与全基因组类型分析方法相比的分析的时间和成本。
本文公开的方法,根据用于输入至NGS的基于扩增子的文库产生,允许在全基因组内仅指定目的区域的CNV检测。目的区域与对照区域(其中拷贝数是已知的/经测定,并不易于改变)一起通过PCR特异性扩增,以提供相对拷贝数差异的精确测定。以这种方式,大部分的输出数据是相关的,因此能够精确计算(由于数据覆盖度的明显增加所致)目的区域的拷贝数改变。此外,样品多重检测的可能性更容易获得,这是由于与全基因组相比,在NGS输入中各扩增子(ROI)仅占据小部分的“空间”。
因此,本公开内容的实施方案提供下一代测序测定法和/或高度多重测定法(例如,在多重测定法中检测2个或更多个、3个或更多个、5个或更多个、7个或更多个、10个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、500个或更多个、或1000个或更多个靶的测定),其能够同时检测在多个靶向基因组区域中的靶向基因拷贝数变化。在一些实施方案中,目的区域(ROI)首先使用PCR制备(例如,扩增子产生)。在一些实施方案中,每个目的区域产生一个或多个扩增子(例如,2、3、4、5或更多个)。
在一些实施方案中,使用有限量的PCR循环以保持拷贝数表现。在一些实施方案中,在初始扩增子产生反应期间或在单独的扩增子产生后步骤(例如连接)期间,将下一代测序平台(例如本文中描述的那些)特异性衔接头掺入至ROI扩增子中。
在一些实施方案中,然后将基于扩增子的NGS文库测序(例如,使用NGS方法),并使用数据输出以确定ROI的相对拷贝数状态。在一些实施方案中,根据与对照相比改变的(例如增加的或减少的)读出数,观察到改变的拷贝数(例如,增加或减少(例如由于基因组缺失所致))。在一些实施方案中,拷贝数比率改变2倍或更多倍(例如,3倍或更多倍、5倍或更多倍、10倍或更多倍、20倍或更多倍、或40倍或更多倍)。观察到的拷贝数改变取决于目的区域。
在一些实施方案中,对在一些个体/肿瘤类型中已知具有拷贝数改变的基因产生扩增子,以及对在与正询问拷贝数改变的基因相同的染色体上的对照区域或对在不同的核酸(例如染色体)上的对照区域产生扩增子。
在一些实施方案中,测定法检测已知的具有临床关联性的拷贝数改变。例如,EGFR拷贝数扩增已显示存在于成胶质细胞瘤样品中,但不存在于对照样品。图3-6显示使用各种拷贝数变化和量的样品中的肿瘤细胞进行的本公开内容的实施方案的分析方法的理论结果。这些图显示取决于拷贝数变化和样品中肿瘤细胞的水平,测定法的灵敏度可变化。
在一些实施方案中,目的区域是对应于一个或多个基因或基因座或染色体的基因组DNA的区域。
在一些实施方案中,目的区域是从目的基因表达的mRNA。在一些实施方案中,目的基因或区域的表达由于基因融合而改变(见例如图9)。基因融合存在于各种癌症中,可导致基因表达水平增加或减少或不正常表达的基因的表达。与癌症相关的基因融合的实例描述于例如美国专利7,718,369和美国专利公布2011-0028336和2012-0015839,其每一个通过引用以其整体结合到本文中。
A.扩增和锚掺入
一些实施方案中,目的区域以及对照区域在测序之前扩增。在一些实施方案中,在与目的区域相同的染色体上的对照包括在内。在一些实施方案中,在不同的染色体上的第二对照包括在内。例如,位于相同的染色体中的对照用于基因座特异性扩增的标准化。位于不同的核酸(例如,已知拷贝数的)(例如,质粒、线粒体DNA、合成DNA或不同的染色体)上的第二对照用于标准化拷贝数或基因表达。在一些实施方案中,将对照1和对照2的核酸比率与目的区域和对照2的核酸比率相比较。相对于与对照2相比的对照1的核酸量,与对照2相比的目的区域的核酸量的增加指示目的区域的基因组扩增(例如,C1/C2vs.ROI/C2),而减少指示拷贝数减少或缺失。
在一些实施方案中,选择已知拷贝数的一个或多个对照。在一些实施方案中,使用多个对照并将读出数平均,或使用读出数的平均值。在一些实施方案中,针对待检测的具体目的区域,将对照优化。例如,在一些实施方案中,在一种类型的癌症中不扩增的对照可能在另一种类型中扩增,因此在其中其扩增的癌症中不是优选的对照。
本发明不限于具体的引物类型。实例包括但不限于化学修饰引物、荧光修饰引物、功能引物(融合引物)、序列特异性引物、随机引物、具有特异性和随机序列两者的引物、和DNA和RNA引物。
在一些实施方案中,用于NGS测序的锚在扩增期间或扩增之后加入。在一些实施方案中,在扩增后锚与扩增子连接。在一些实施方案中,使用锚来测序目的区域。使用对测序技术具有特异性的示例性的锚,并且其根据选择的测序技术而改变。
在一些实施方案中,使用低循环PCR以保持拷贝数表现。例如,在一些实施方案中,进行45个或更少个(例如45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、20、15、10或更少个)扩增循环。
核酸扩增技术的说明性的非限制性实例包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域普通技术人员将认可,某些扩增技术(例如PCR)要求在扩增之前RNA被反转录成DNA(例如RT-PCR),而其它扩增技术直接扩增RNA(例如TMA和NASBA)。
聚合酶链反应(美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159和4,965,188,各自通过引用以其整体结合到本文中),通常称为PCR,使用多个循环的变性、引物对退火至相对链和引物延伸以指数增加靶核酸序列的拷贝数。在称为RT-PCR的变化中,使用反转录酶(RT)从mRNA制备互补DNA(cDNA),然后将cDNA通过PCR扩增来产生多拷贝的DNA。对于PCR的其它各种变化,见例如美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159;Mullis等,Meth.Enzymol.155:335(1987);和Murakawa等,DNA7:287(1988),各自通过引用以其整体结合到本文中。
转录介导的扩增(美国专利号5,480,784和5,399,491,其各自通过引用以其整体结合到本文中),通常称为TMA,在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自动催化性地合成多个拷贝的靶核酸序列,其中靶序列的多个RNA拷贝自动催化性地产生另外的拷贝。参见例如美国专利号5,399,491和5,824,518,其各自通过引用以其整体结合到本文中。在美国公开号20060046265(通过引用以其整体结合到本文中)中描述的变化中,TMA任选结合使用封闭部分、终止部分和其它修饰部分以提高TMA过程的灵敏度和准确度。
连接酶链反应(Weiss,R.,Science254:1292(1991),通过引用以其整体结合到本文中),通常称为LCR,使用与靶核酸的邻近区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复循环中通过DNA连接酶共价连接,产生可检测的双链连接的寡核苷酸产物。
链置换扩增(Walker,G.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:392-396(1992);美国专利号5,270,184和5,455,166,其各自通过引用以其整体结合到本文中),通常称为SDA,使用下列的循环:引物序列对至靶序列的相对链的退火、在dNTP的存在下产生双链体半硫代磷酸酯化的引物延伸产物的引物延伸、半修饰的限制性核酸内切酶识别位点的核酸内切酶介导的切口和自切口的3'末端的聚合酶介导的引物延伸,以置换现有链和产生用于下一轮引物退火、切口和链置换的链,导致产物的几何扩增。嗜热SDA(tSDA)在较高的温度下以基本上相同的方法使用嗜热核酸内切酶和聚合酶(欧洲专利号0684315)。
其它扩增方法包括例如:基于核酸序列的扩增(美国专利号5,130,238,通过引用以其整体结合到本文中),通常称为NASBA;使用RNA复制酶以扩增探针分子本身的扩增方法(Lizardi等,BioTechnol.6:1197(1988),通过引用以其整体结合到本文中),通常称为Qβ复制酶;基于转录的扩增方法(Kwoh等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173(1989));和自持续序列复制(Guatelli等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874(1990),其各自通过引用以其整体结合到本文中)。对于已知扩增方法的进一步论述,参见Persing,DavidH.,DiagnosticMedicalMicrobiology:PrinciplesandApplications(诊断医学微生物学:原理和应用)(Persing等编辑)中的“InVitroNucleicAcidAmplificationTechniques(体外核酸扩增技术)”,第51-87页(AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC(1993))。
在一些实施方案中,扩增是等温扩增方法。在一些实施方案中,扩增方法是固相扩增、polony扩增、集落(colony)扩增、乳液PCR、珠RCA、表面RCA、表面SDA等,如本领域技术人员所公认的。在一些实施方案中,使用导致溶液中的游离DNA分子或通过DNA分子的仅一个末端连接至合适基质的DNA分子扩增的扩增方法。在一些实施方案中,使用依赖于桥接PCR的方法,其中两个PCR引物连接至表面(参见例如,WO2000/018957、U.S.7,972,820、7,790,418和Adessi等,NucleicAcidResearch(2000):28(20):E87;其各自通过引用结合到本文中)。在一些情况下,本发明的方法可产生"聚合酶集落技术"或"polony",其是指保持相同扩增子的空间聚类的多重扩增(参见HarvardMolecularTechnologyGroupandLipperCenterforComputationalGeneticswebsite)。这些包括例如原位polony(Mitra和Church,NucleicAcidResearch27,e34,1999年12月15日)、原位滚环扩增(RCA)(Lizardi等,NatureGenetics19,225,1998年7月)、桥接PCR(美国专利号5,641,658)、皮滴定(picotiter)PCR(Leamon等,Electrophoresis24,3769,2003年11月)和乳液PCR(Dressman等,PNAS100,8817,2003年7月22日)。
适合用于本发明的实施方案的核酸聚合酶的实例包括但不限于,DNA聚合酶(Klenow片段,T4DNA聚合酶)、在多种热稳定细菌中鉴定和克隆的热稳定的DNA聚合酶(PerlerF.B.等,Adv.ProteinChem.1996,48:377-435)(例如Taq、VENT、Pfu、TflDNA聚合酶)以及它们的遗传修饰衍生物(TaqGold、VENTexo、Pfuexo)。优选地,用于集落引物延伸的核酸聚合酶在引物和模板杂交结果足够特异性以避免模板的不完全或虚假扩增的温度下是稳定的。
扩增溶液优选包含脱氧核糖核苷酸三磷酸,例如dATP、dTTP、dCTP、dGTP,其为天然或非天然存在的,例如用荧光或放射性基团修饰的。已开发了各种合成修饰的核酸用于化学和生物学方法,以增加核酸的可检测性和/或功能多样性。这些功能化/修饰的分子(例如核苷酸类似物)可与天然的聚合酶完全相容,保持天然对应物的碱基配对和复制性质,如最近所综述(ThumO等,Angew.Chem.Int.Ed.2001,40(21):3990-3993)。
因此,扩增溶液的其它组分加入到选择的核酸聚合酶,和它们基本上对应于本领域已知的有效支持各聚合酶的活性的化合物。化合物例如二甲基亚砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、甜菜碱、TritonX-100或MgCl2的浓度是本领域熟知的,其对于具有最佳扩增是重要的,因此基于下文提供的实例,操作者可容易调整这样的浓度用于本发明的方法。
B.测序
在一些实施方案中,核酸测序方法用于检测。在一些实施方案中,本文提供的技术用于第二代(即下一代或Next-Gen)、第三代(即Next-Next-Gen)或第四代(即N3-Gen)测序技术,包括但不限于焦磷酸测序、连接测序、单分子测序、合成序列(SBS)、半导体测序、大规模平行克隆、大规模平行单分子SBS、大规模平行单分子实时、大规模平行单分子实时纳米孔技术等。Morozova和Marra在genomics,92:255(2008)中提供了关于一些这样的技术的综述,其通过引用以其整体结合到本文中。本领域普通技术人员将认识到,因为RNA在细胞中较不稳定和更易于受到核酸酶攻击,因此在实验中RNA通常被反转录成DNA,然后测序。
许多DNA测序技术是本领域已知的,包括基于荧光的测序方法(参见例如,Birren等,GenomeAnalysis:AnalyzingDNA,1,ColdSpringHarbor,N.Y.;其通过引用以其整体结合到本文中)。在一些实施方案中,所述技术用于本领域所了解的自动测序技术。在一些实施方案中,本发明的技术用于分段扩增子的平行测序(KevinMcKernan等的PCT公布号:WO2006084132,通过引用以其整体结合到本文中)。在一些实施方案中,所述技术用于通过平行寡核苷酸延伸进行DNA测序(参见例如,Macevicz等的美国专利号5,750,341和Macevicz等的美国专利号6,306,597,两个专利通过引用以其整体结合到本文中)。所述技术可用于其中的测序技术的其它实例包括Churchpolony技术(Mitra等,2003,AnalyticalBiochemistry320,55-65;Shendure等,2005Science309,1728-1732;美国专利号6,432,360、美国专利号6,485,944、美国专利号6,511,803;通过引用以其整体结合到本文中)、454皮滴定焦磷酸测序技术(Margulies等,2005Nature437,376-380;US20050130173;通过引用以其整体结合到本文中)、Solexa单碱基添加技术(Bennett等,2005,PharmacoGenomics,6,373-382;美国专利号6,787,308;美国专利号6,833,246;通过引用以其整体结合到本文中)、Lynx大规模平行特征测序技术(Brenner等(2000).Nat.Biotechnol.18:630-634;美国专利号5,695,934;美国专利号5,714,330;通过引用以其整体结合到本文中)和AdessiPCR集落技术(Adessi等(2000).NucleicAcidRes.28,E87;WO00018957;通过引用以其整体结合到本文中)。
下一代测序(NGS)方法享有大规模平行高通量策略的共同特征,目的为与较旧测序方法相比较低的成本(参见例如,Voelkerding等,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等,NatureRev.Microbiol.,7:287-296;各自通过引用以其整体结合到本文中)。NGS方法可广泛地分为通常使用模板扩增的方法和不使用模板扩增的方法。需要扩增的方法包括由Roche作为454技术平台(例如GS20和GSFLX)商业化的焦磷酸测序、LifeTechnologies/IonTorrent、由Illumina商业化的Solexa平台、GnuBio和由AppliedBiosystem商业化的SupportedOligonucleotideLigationandDetection(SOLiD)平台。亦称为单分子测序的非扩增方法的实例为由HelicosBioSciences商业化的HeliScope平台和分别由VisiGen、OxfordNanoporeTechnologiesLtd.和PacificBiosciences商业化的显现中的平台。
在焦磷酸测序(Voelkerding等,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等,NatureRev.Microbiol.,7:287-296;美国专利号6,210,891;美国专利号6,258,568;各自通过引用以其整体结合到本文中)中,将模板DNA片段化,末端修复,与衔接头连接,和通过用带有与衔接头互补的寡核苷酸的珠捕获单模板分子进行原位克隆扩增。带有单模板类型的各个珠经区室化至油包水微泡中,和使用称为乳液PCR的技术进行模板克隆扩增。扩增后破坏乳液,和将珠沉积到在测序反应期间起流动池作用的皮滴定板的各个孔中。在测序酶和发光报道物例如萤光素酶的存在下在流动池中有序反复地引入四种dNTP试剂中的每一个。在将合适的dNTP加入测序引物的3′端的事件中,ATP的得到产物引起孔内突发发光,其使用CCD照相机记录。获得大于或等于400个碱基的阅读长度是可能的,和可获得106个序列读出,产生多达5亿个碱基对(Mb)的序列。
在Solexa/Illumina平台(Voelkerding等,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等,NatureRev.Microbiol.,7:287-296;美国专利号6,833,246;美国专利号7,115,400;美国专利号6,969,488;各自通过引用以其整体结合到本文中)中,测序数据以较短长度读出的形式产生。在该方法中,单链片段化DNA经末端修复以产生5′-磷酸化的平末端,接着Klenow介导加入单个A碱基至片段的3′末端。A-加入促进加入T突出端衔接头寡核苷酸,其随后用于在流动池的表面上捕获模板-衔接头分子,所述表面散布有寡核苷酸锚。所述锚用作PCR引物,但因为模板的长度和其与其它邻近锚寡核苷酸接近,通过PCR的延伸导致分子“拱起(archingover)”以与邻近的锚寡核苷酸杂交,以在流动池的表面上形成桥结构。将这些DNA环变性和切割。然后正向链用可逆的染料终止子测序。掺入的核苷酸的序列通过检测掺入后荧光来测定,除去每个荧光团和嵌段后进行下一个dNTP加入循环。序列读出长度范围为36个核苷酸至超过250个核苷酸,每次分析运行总共输出超过十亿个核苷酸对。
使用SOLiD技术(Voelkerding等,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等,NatureRev.Microbiol.,7:287-296;美国专利号5,912,148;美国专利号6,130,073;各自通过引用以其整体结合到本文中)测序核酸分子还包括将模板片段化,与寡核苷酸衔接头连接,与珠连接,和通过乳液PCR克隆扩增。在这之后,将带有模板的珠固定在玻璃流动池的衍生表面上,将与衔接头寡核苷酸互补的引物退火。然而,并非利用该引物进行3′延伸,而是其用于提供5′磷酸基团进行与包含两个探针-特异性碱基接着6个简并碱基和4个荧光标记之一的询问探针连接。在SOLiD系统中,询问探针具有在每个探针的3′端上的两个碱基的16种可能组合和在5′端上的四种荧光团之一。荧光团的颜色和因此每个探针的身份对应于特定的颜色空间编码方案。多轮(通常7轮)探针退火、连接和荧光团检测之后是变性,然后使用相对于起始引物偏离一个碱基的引物进行第二轮测序。以该方式,模板序列可在计算上重建,和模板碱基询问两次,导致准确性增加。序列读出长度平均为35个核苷酸,和每次测序运行总共输出超过40亿个碱基。
在某些实施方案中,该技术在纳米孔测序(参见例如Astier等,J.Am.Chem.Soc.2006年二月8日;128(5):1705–10,通过引用结合到本文中)中找到用途。纳米孔测序的原理涉及当将纳米孔浸入电导液中和电位(电压)横过它施用时发生了什么。在这些条件下,可观察到由于离子通过纳米孔的传导所致的轻微的电流,和电流的量对纳米孔的大小非常敏感。当核酸的各碱基通过纳米孔时,这引起通过纳米孔的电流强度改变,其对于四个碱基中的每个不同,从而允许测出DNA分子的序列。
在某些实施方案中,该技术在HelicosBioSciences的HeliScope(Voelkerding等,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等,NatureRev.Microbiol.,7:287-296;美国专利号7,169,560;美国专利号7,282,337;美国专利号7,482,120;美国专利号7,501,245;美国专利号6,818,395;美国专利号6,911,345;美国专利号7,501,245;各自通过引用以其整体结合到本文中)中找到用途。模板DNA片段化和在3′端多腺苷酸化,最终的腺苷带有荧光标记。变性的多腺苷酸化模板片段与在流动池的表面上的多聚(dT)寡核苷酸连接。捕获的模板分子的起始物理位置通过CCD照相机记录,然后切割标记和洗掉。通过加入聚合酶和连续加入荧光-标记的dNTP试剂实现测序。掺入事件产生对应于dNTP的荧光团信号,和在每轮dNTP加入前通过CCD照相机捕获信号。序列读出长度范围为25–50个核苷酸,每次分析运行总共输出超过10亿个核苷酸对。
IonTorrent技术是基于氢离子检测的DNA测序方法,所述氢离子在DNA聚合期间释放(参见例如Science327(5970):1190(2010);美国专利申请公开号20090026082、20090127589、20100301398、20100197507、20100188073和20100137143,通过引用以其整体结合用于所有目的)。微孔含有待测序的模板DNA链。微孔层的下方是高度敏感的ISFET离子传感器。所有的层包含在类似于电子工业中使用的那些的CMOS半导体芯片内。当dNTP掺入至成长的互补链中时,释放氢离子,其触发高度敏感的离子传感器。如果均聚物重复存在于模板序列中,则多个dNTP分子将在单个循环中掺入。这产生对应数量的释放的氢和按比例更高的电子信号。该技术不同于其它测序技术,因为没有使用修饰的核苷酸或光学。IonTorrent测序仪的全碱基准确度对于50个碱基读出为约99.6%,其中每次运行产生约100Mb至100Gb。读出长度为100-300个碱基对。长度为5个重复的均聚物重复的准确度为约98%。离子半导体测序的益处是快的测序速度和低的预付成本和操作成本。
所述技术在由StratosGenomics,Inc.开发的另一种核酸测序方法中找到用途,并且涉及使用Xpandomer。该测序方法通常包括提供由模板定向合成产生的子链。子链通常包括在对应于所有或部分的靶核酸的连续核苷酸序列的序列中偶联的多个亚单位,其中各个亚单位包括接头、至少一个探针或核碱基残基、和至少一个可选择性切割的键。可选择性切割的键经切割得到长度大于子链的所述多个亚单位的Xpandomer。Xpandomer通常包括接头和报告元件,其用于分析对应于所有或部分的靶核酸的连续核苷酸序列的序列中的遗传信息。然后检测Xpandomer的报告元件。涉及基于Xpandomer的方法的其它细节描述于例如提交于2008年6月19日的标题为“通过Expansion的高通量核酸测序”的美国专利公开号20090035777,所述专利以其整体结合到本文中。
其它显现中的单分子测序方法包括使用VisiGen平台通过合成进行的实时测序(Voelkerding等,ClinicalChem.,55:641–58,2009;美国专利号7,329,492;美国专利申请系列号11/671956;美国专利申请系列号11/781166;各自通过引用以其整体结合到本文中),其中固定的已引发的DNA模板使用荧光修饰的聚合酶和荧光受体分子进行链延伸,在核苷酸加入时产生可检测的荧光共振能量转移(FRET)。
在一些实施方案中,检测方法利用杂交测定。核酸杂交技术的说明性的非限制性实例包括但不限于微阵列,其包括但不限于:DNA微阵列(例如cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列)。DNA微阵列,通常称为基因芯片、DNA芯片或生物芯片,是连接在固体表面(例如玻璃、塑料或硅芯片)上的细微的DNA斑点的集合,为表达概况分析或同时监测数千个基因的表达水平的目的而形成阵列。附着的DNA区段称为探针,数千个探针可用于单个DNA微阵列。微阵列可用于通过比较疾病和正常细胞中的基因表达来鉴定疾病基因或转录物。微阵列可使用多种技术制作,包括但不限于:用细尖的针打印到玻璃载玻片上;使用预制的掩膜的照相平板印刷术;使用动态微镜装置的照相平板印刷术;喷墨印刷;或在微电极阵列上的电化学。
Southern和Northern印迹分别用于检测特定的DNA或RNA序列。将从样品中提取的DNA或RNA片段化,在基质凝胶上电泳分离和转移到膜滤器上。滤器结合的DNA或RNA经过与同目的序列互补的标记探针杂交。检测与滤器结合的杂交的探针。该程序的变体为反向Northern印迹,其中附着到膜上的底物核酸是分离的DNA片段的合集,和探针是从组织提取和标记的RNA。
一种说明性的检测方法,杂交保护测定法(HPA),包括将化学发光寡核苷酸探针(例如吖啶酯-标记的(AE)探针)杂交至靶序列,选择性水解存在于未杂交探针上的化学发光标记,和在发光计中测量自剩余探针产生的化学发光。参见例如美国专利号5,283,174和NormanC.Nelson等,NonisotopicProbing,Blotting,andSequencing(非同位素探测、印迹和测序),第17章(LarryJ.Kricka编辑,第2版1995,其各自通过引用以其整体结合到本文中)。
C.分析
在一些实施方案中,使用基于计算机的分析程序以转换通过检测测定法产生的原始数据(例如,测序读出)成终端用户(例如,医学人员)的预测值的数据。用户可使用任何合适的方式访问预测数据。因此,在一些优选的实施方案中,本发明提供其它益处,即不太可能获得遗传学或分子生物学方面的训练的用户不需要理解原始数据。数据以其最有用的形式直接提供给终端用户。然后用户能直接利用该信息以确定有用的信息(例如,在医学诊断、研究或筛选中)。
本发明考虑了能够接受、处理和传递信息至进行测定的实验室,和接受、处理和传递来自进行测定的实验室的信息,将信息提供给医学人员和受试者的任何方法。例如,在本发明的一些实施方案中,样品(例如,血液、细胞或组织样品)获自受试者和进行位于世界任何部分(例如,在不同于受试者居住的国家或最终使用信息的国家的国家)的概况分析服务(例如,医学设施实验室、基因组概况分析业务等),以产生原始数据。在样品包括组织或其它生物样品时,受试者可访问医学中心以获得样品和送至概况分析中心,或受试者可自己收集样品(例如,颊拭子)和直接将其送至概况分析中心。在样品包括之前测定的生物信息时,可由受试者将所述信息直接送至概况分析服务(例如,包含信息的信息卡可通过计算机扫描,和使用电子通信系统将数据传递至概况分析中心的计算机)。一旦被概况分析服务接受,样品经处理和产生特异针对受试者所需的信息的概况分析(例如,测序数据)。
然后数据以适合于由终端用户(例如医学人员)解译的形式产生。例如,不是提供原始数据,而是产生的形式可为受试者提供结论或评估(例如,疾病的存在情况、发生疾病的风险、存在疾病的可能性或疾病的预后)。可通过任何合适的方法将数据显示给用户。例如,在一些实施方案中,概况分析服务产生可经印刷提供给用户的报告,或在计算机监视器上显示的报告。
在一些实施方案中,信息首先在当地的医学设施中或在区域设施中分析。然后将原始数据送至中心处理设施以进一步分析和/或将原始数据转化成对用户有用的信息。中心处理设施提供数据分析的隐私(所有数据储存在具有统一的安全性协议的中心设施中)、速度和一致性的优势。中心处理设施然后可在受试者的处理后控制数据的命运。例如,使用电子通信系统,中心设施可提供数据给终端用户、受试者或研究者。
D.系统和试剂盒
在一些实施方案中,本发明提供用于扩增和/或分析核酸的试剂盒和系统。在一些实施方案中,试剂盒包括用于分析和检测拷贝数或基因表达变化所必需、足够或有用的试剂(例如,引物、探针、锚、固体支持物、试剂、对照、说明书等)。例如,在一些实施方案中,试剂盒包括用于目的区域和对照区域的扩增和测序的引物和锚。在一些实施方案中,试剂盒包括分析软件(例如,以分析测序数据)。
在一些实施方案中,试剂盒包括一个或多个容器,其包含试剂、引物、探针、锚、固体支持物、缓冲液等。在一些实施方案中,试剂盒的各组分包装在分开的容器中。在一些实施方案中,容器在同一试剂盒或箱内包装和/或运输以一起使用。在一些实施方案中,试剂盒的一个或多个组分分开运输和/或包装。
在一些实施方案中,系统包括自动化样品和试剂处理装置(例如,机器人技术)。
II.用途
本文描述的系统和方法在多种研究、筛选和诊断应用中找到用途。在一些实施方案中,本文描述的扩增和测序方法在疾病(例如癌症)的诊断、预后和筛选中找到用途。在一些实施方案中,本文描述的系统和方法用于在受试者中预测疾病的素因,在受试者中诊断疾病,在受试者中预测疾病复发的可能性,为患病受试者提供预后,或针对用特定疗法的治疗选择患病受试者。这些方法优选包括提供来自受试者的基因组DNA或mRNA样品;和通过上述方法检测基因的扩增或基因的增加表达。在一些实施方案中,目的区域的拷贝数增加或表达增加指示受试者易患疾病,指示受试者患有疾病,指示受试者疾病复发的可能性,指示受试者的存活率,和指示受试者是用特定疗法治疗的候选者。
例如,在一些实施方案中,观察到的改变的染色体拷贝数或基因表达或改变的染色体拷贝数或基因表达变化的水平的结果指示疾病(例如癌症)的存在、不存在或预后。在一些实施方案中,改变的染色体拷贝数或基因表达用于确定起作用的疗程(例如,药物治疗方案的选择)。在一些实施方案中,改变的染色体拷贝数或基因表达用于确定预后(例如,疾病的侵袭性、疾病蔓延的可能性或疾病复发的可能性)。在一些实施方案中,预后用于确定起作用的疗程。在一些实施方案中,观察到的拷贝数或基因表达变化的程度根据疾病严重性或预后而改变,和可用于确定预后或起作用的疗程。
在一些实施方案中,疾病是癌症。例如,EGFR基因座的拷贝数扩增与成胶质细胞瘤和非小细胞肺癌有关(CappuzzoF,Hirsch,等(2005)JournaloftheNationalCancerInstitute97(9):643–655)。此外,CCL3L1的较高拷贝数与对HIV感染的较低易感性有关(GonzalezE,等(2005)."TheInfluenceofCCL3L1Gene-ContainingSegmentalDuplicationsonHIV-1/AIDSSusceptibility".Science307(5714):1434–1440),和FCGR3B(CD16细胞表面免疫球蛋白受体)的低拷贝数可增加对系统性红斑狼疮和类似的炎性自身免疫病症的易感性(AitmanTJ,等(2006)Nature439(7078):851–855)。拷贝数改变还与自闭症(CookEH,SchererSW(2008)Nature455(7215):919–23;PintoJ等(2010)Nature466(7304):368–72;SebatJ等(2007)Science316(5823):445–9;GaiX等(2011)MolPsychiatry17(4):402–11)、精神分裂症(Cook等,同上;StClairD(2008)SchizophrBull35(1):9–12)和自发性学习无能(KnightS等(1999)TheLancet354(9191):1676–81)有关。
实验
以下实施例用于说明本发明的某些优选的实施方案和方面,不应解释为限制其范围。
实施例1
已显示与对照相比,EGFR拷贝数扩增存在于成胶质细胞瘤样品。进行此处描述的实验以确定IonTorrent下一代测序平台是否可用于检测EGFR拷贝数改变。图1和2显示测定设计的图表。
用20ng的对照样品和EGFR扩增样品在M2000RT(AbbottMolecular,AbbottPark,IL)上进行实时PCR,以选择用于产生用于IonTorrent下一代测序文库制备的扩增子的循环总数。低数量的PCR循环用于保持拷贝数呈现。
qPCR结果:
在阶段3(50个循环阶段)期间读出探针。在阶段3之前,在阶段2进行4个循环。根据实时结果,选择27个总循环用于扩增子产生以制备NGSCNV文库。
进行如上文步骤1中的同样PCR设置,但仅27个总循环(阶段2=4个循环;阶段3=23个循环)。探针未包括在该PCR中,因为这些扩增子将继续进行IonTorrent衔接头连接。
-3个反应=20ng的356BR(“非EGFR扩增”样品)
-3个反应=20ng的348BR(“EGFR扩增”样品)
PCR扩增后,扩增子文库按IonTorrent的“短扩增子(<250bp)文库制备”方案制备。因为产生的扩增子量应在EGFR非扩增和扩增样品之间显著不同,因此对IonTorrent文库制备方案进行数个调整。这些方案改变列于下文。
在27个PCR循环后,扩增子用AmpureXP珠(1:1.8;v/v;样品:AmpureXP试剂)净化
-加入90uL的AmpureXP试剂
-用30uL的70%乙醇进行AmpureXP珠洗涤
-加入15uL的不含核酸酶的水以悬浮干的AmpureXP珠
-收集14uL的上清液(AmpureXP纯化的扩增子样品)
末端修复
-对于末端修复,合并三份同样的样品,使得总共两管通过末端修复(一个356BR管和一个348BR管)
-末端修复设置:
-14uLx3=42uL纯化的扩增子
-195uL的不含核酸酶的水
-60uL的5X末端修复缓冲液(IonPlus片段文库试剂盒)
-3uL末端修复酶(IonPlus片段文库试剂盒)
总计:300uL
-20分钟室温
7.末端修复AmpureXP珠纯化
-加入540uL的AmpureXP试剂至各管,混合,脉冲旋转,5分钟室温
-Promega磁架3分钟
-除去上清液(未结合)
-用500uL70%乙醇进行两次乙醇洗涤
-在室温下空气干燥珠5分钟
-用75uL的低TE重悬珠
-将样品置于Promega磁架上3分钟
-从各样品收集上清液
连接衔接头、切口修复和纯化
-对于各样品,测试三个衔接头浓度:0.2X衔接头、1X衔接头和5X衔接头
-对于各样品,使用来自前述步骤的24uL的样品合并液
-连接设置
在连接反应后,转移至1.5-mLLoBind管中用于净化
-AmpureXP珠以1:1.8比率用于净化;将180uL的AmpureXP试剂加入至各100uL连接反应物中。
-AmpureXP珠方案按Ion制备短扩增子文库制备方案的第15页所列进行。
-19uL的最终净化产物收集用于各文库(在该点得到6个文库;3个非EGFR扩增的,其使用0.2X、1X或5X衔接头浓度;和3个EGFR扩增的,其使用0.2X、1X或5X衔接头浓度)。
文库在Agilent生物分析仪高灵敏度DNA芯片上运行。
因为衔接头峰存在于生物分析仪输出,因此对各文库进行另外1:1.6v:v(样品:AmpureXP试剂)(19uL文库:30.4uLAmpureXP试剂)。
因为对于0.2X衔接头文库,部分衔接头掺入存在于生物分析仪输出,因此仅1X和5X衔接头文库继续进行。
各文库的浓度使用IonTorrent的“Ion文库定量试剂盒”测定。来自Ion的定量试剂盒的模板稀释因子用于装载文库到OneTouch上用于乳液PCR。
Ion文库定量结果概述:
进行乳液PCR(OneTouch)和珠富集(富集站(ES))。IonOneTouch200模板试剂盒v2方案如下。
来自Ion文库定量试剂盒的模板稀释因子用于稀释文库,然后装载至OneTouch上。使用模板稀释因子稀释各文库后,将10uL的各1X衔接头文库合并(总共20uL),然后装载至OneTouch仪器上。在使用模板稀释因子稀释各文库后,将10uL的各5X衔接头文库合并(总共20uL),然后装载至OneTouch仪器上。
IonSphere质量控制试剂盒用于测量未富集和富集的IonSphere颗粒(ISP)的质量。
来自各OneTouch/ES运行的最终产物是100uL含富集的IonSphere颗粒(ISP)的IonOneTouch洗涤溶液。
进行PGM测序。按照IonPGM200测序试剂盒方案。进行两次PGM运行。PGM02=两个文库。运行以下样品:
IonXpress条码001=在连接期间使用1XIon衔接头浓度的“非EGFR扩增的”。
IonXpress条码003=在连接期间使用1XIon衔接头浓度的“EGFR扩增的”。
PGM01=两个文库。
IonXpress条码001=在连接期间使用5XIon衔接头浓度的“非EGFR扩增的”。
IonXpress条码003=在连接期间使用5XIon衔接头浓度的“EGFR扩增的”。
结果:
PGM运行概述:
1.来自运行#1,仪器=PGM02,两个文库
-IonXpress条码001=在连接期间使用1XIon衔接头浓度的“非EGFR扩增的”
-IonXpress条码003=在连接期间使用1XIon衔接头浓度的“EGFR扩增的”
2.来自运行#2,仪器=PGM01,两个文库
-IonXpress条码001=在连接期间使用5XIon衔接头浓度的“非EGFR扩增的”
-IonXpress条码003=在连接期间使用5XIon衔接头浓度的“EGFR扩增的”
-IonTorrent套件用于产生文库条码多路解编的.FASTQ文件。
-FASTQ文件输入至CLC基因组工作台。
-读出作图在CLC基因组工作台中使用NGS核心工具“MapReadstoReferenceTool”使用包含104bpEGFR扩增子序列和119bpChr1区域序列的参照进行。
-在进行每扩增子区域比对后的读出计数显示如下
结论:图7-8显示使用上文描述的方法的EGFR的CNV的检测。在测试的两个文库制备条件(1XIon衔接头浓度和5XIon衔接头浓度)下,与EGFR非扩增样品(356BR)相比,具有已知EGFR扩增(348BR)的样品产生>10倍的作图读出。下一代测序可用于使用下一代测序文库制备方案检测基因组拷贝数变化。具体而言,IonTorrent测序仪能够检测基因组拷贝数变化。
实施例2
多路分析
可通过多路PCR使得同时询问多个目的区域能够进行。覆盖目的区域的扩增子可产生和随后与测序相容。在序列“计数”应用中,例如在拷贝数改变检测中,具有在起始PCR中产生的相对相等量的扩增子,对于下游序列分析和准确和清楚的目的区域拷贝数状态的检测而言是重要的。图10显示覆盖4个不同基因(EGFR、KRAS、BRAF和NRAS)的9个不同区域的最佳多路PCR(9-丛)的结果和通过使用NGS计数存在的各个扩增子序列而测定的它们彼此的相对覆盖度。
图10显示进行以产生覆盖EGFR(外显子18、19、20和21)、KRAS(外显子2和3)、BRAF(外显子11和15)和NRAS(外显子2)的扩增子的多路PCR(9-丛)的结果。这些扩增子用作产生的NGS文库的输入,得到的扩增子文库在IonTorrentPGM上运行。各序列(读出)对参比序列(hg19)作图和分析。记录对应于上文9个靶目的区域的各序列的计数。显示了9个靶区域中中值标准化的扩增子序列计数(覆盖度)的图示。人胎盘DNA用作输入样品。
一旦9-丛PCR经优化和测定以产生相对均等量的9个扩增子,则使用人胎盘DNA[对照1,EGFR扩增(-)]、成胶质细胞瘤患者样品#356[对照2,EGFR扩增(-)]和成胶质细胞瘤患者样品#348BR[EGFR扩增(+)]进行最佳的多路PCR。下文图11显示对于不同样品的各目的区域相对扩增子覆盖度。与覆盖其它基因的其它扩增子相比,样品#348BR的EGFR扩增子具有明显增加的覆盖度,这与样品中EGFR基因的拷贝数增加相关。与对应于其它目的区域的其它扩增子相比,不具有EGFR基因扩增的两个对照样品显示相对相同的覆盖度水平。
图11显示使用多路PCR和NGS的拷贝数改变检测。对已知具有EGFR基因扩增的样品(成胶质细胞瘤患者样品#348BR)以及已知不具有EGFR基因扩增的两个对照样品(HP和成胶质细胞瘤患者样品#356),进行9-丛PCR以产生上述扩增子(图10)。NGS数据的扩增子序列分析显示对于样品#348BR(EGFR扩增+),与其它扩增子相比覆盖EGFR的扩增子有明显的覆盖度增加,而对照样品对所有扩增子具有相对均等的覆盖度。
上文说明书中提及的所有出版物和专利通过引用以其整体结合到本文中,用于所有目的。在不背离所述技术的范围和精神的情况下,所述技术的所述组合物、方法和用途的各种修改和改变对本领域技术人员而言是显而易见的。尽管结合具体的示例性实施方案对所述技术进行了描述,但应理解,所要求保护的发明不应过度局限于这样的具体实施方案。事实上,对相关领域技术人员显而易见的用于进行本发明的所述方式的各种修改,意欲落入在随附权利要求书的范围内。
Claims (30)
1.确定目的核酸区域的染色体拷贝数变化或表达改变的方法,其包括:
a)从所述目的区域和至少一个对照区域扩增核酸,以产生靶和对照扩增子的文库;
b)将所述靶和对照扩增子测序以产生测序读出;
c)比较靶扩增子的水平和对照扩增子的水平;和
d)当靶扩增子的水平不同于对照扩增子的水平时,确定所述目的核酸区域的染色体拷贝数变化或表达改变。
2.权利要求1的方法,其中所述至少一个对照区域包括在与所述目的区域相同的染色体上的第一对照区域和在不同于所述目的区域的核酸上的第二对照区域。
3.权利要求2的方法,其中所述第二对照区域在与所述目的区域不同的染色体上。
4.权利要求2或3的方法,其中所述比较包括将第一对照扩增子和第二对照扩增子的比率与靶扩增子和第二对照扩增子的比率进行比较。
5.权利要求1或4的方法,其中所述染色体拷贝数改变达至少2倍。
6.权利要求1或4的方法,其中所述染色体拷贝数改变达至少10倍。
7.权利要求1或4的方法,其中所述染色体拷贝数改变达至少20倍。
8.权利要求1的方法,其中所述扩增包括从所述目的区域扩增至少2个扩增子。
9.权利要求5的方法,其中所述目的区域的染色体拷贝数变化或表达的存在指示疾病的诊断或预后。
10.权利要求9的方法,其中所述疾病是癌症。
11.权利要求8的方法,其中所述预后选自疾病发展的可能性、疾病对治疗的反应和疾病复发的可能性。
12.权利要求9-11中任一项的方法,其中所述方法还包括根据所述诊断或预后确定起作用的疗程。
13.权利要求1-12中任一项的方法,其中所述目的区域是基因组DNA。
14.权利要求10的方法,其中所述染色体拷贝数变化选自一个或多个基因或区域的拷贝数增加和基因组缺失。
15.权利要求1-12中任一项的方法,其中所述目的区域是mRNA。
16.权利要求15的方法,其中所述mRNA表达改变是由于基因融合所致的mRNA表达增加或减少。
17.权利要求1-16中任一项的方法,其中所述方法还包括在扩增期间或扩增之后加入核酸衔接头至所述扩增子。
18.权利要求17的方法,其中在连接后,所述衔接头与所述扩增子连接。
19.权利要求17的方法,其中所述衔接头是扩增引物的一部分。
20.权利要求1-19中任一项的方法,其中所述测序是下一代测序。
21.权利要求1-20中任一项的方法,其中所述扩增包括45个或更少个扩增循环。
22.靶扩增子和对照扩增子的测序方法,其包括:
a)从靶和对照核酸区域扩增靶和对照扩增子的文库;和
b)使用大规模平行测序技术测序所述扩增子的文库,以产生多个测序读出。
23.权利要求22的方法,进一步包括当相对于所述对照区域,从所述靶区域产生增加数量的测序读出时,检出所述靶核酸区域的拷贝数或表达改变的步骤。
24.试剂盒,其包含:
a)用于扩增靶核酸的至少一组第一组引物对;
b)用于扩增在与所述靶核酸相同的染色体上的第一对照核酸的至少一组第二组引物;和
c)用于扩增在与所述靶核酸不同的核酸上的第二对照核酸的至少一组第三组引物;和
d)多个核酸衔接头。
25.权利要求24的试剂盒,其中所述试剂盒还包含与所述核酸衔接头特异性杂交的至少一种测序引物。
26.权利要求24的试剂盒,其中所述第二对照核酸在与所述靶核酸不同的染色体上。
27.权利要求24的试剂盒,其中所述第一组引物与目的基因特异性杂交。
28.组合物,其包含:靶核酸、与所述靶核酸特异性杂交的至少一组第一组引物、与在与所述靶核酸相同的染色体上的第一对照核酸特异性杂交的至少一组第二组引物、和与在与所述靶核酸不同的核酸上的第二对照核酸特异性杂交的至少一组第三组引物。
29.权利要求28的组合物,其中所述第二对照核酸在与所述靶核酸不同的染色体上。
30.权利要求28的组合物,其中所述组合物还包含多个核酸衔接头和与所述核酸衔接头特异性杂交的至少一种测序引物。
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