JP7123050B2 - 自動反応カートリッジにおける統合された、DNAメチル化の精製及び測定並びに変異及び/又はmRNA発現レベルの同時測定 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年12月12日に出願した先の米国仮出願第62/433,165号の優先権を主張し、それは、参照により全体が取り込まれる。
i)核酸を含む生物学的試料を第1のカラム又はフィルターを含む第1のマトリックス材料に接触させる工程であって、当該マトリックス材料が、当該試料中の核酸と結合及び/又は濾過し、これにより、DNAを精製する、工程;
ii)結合したDNAを第1のマトリックス材料から溶出し、DNAを変性して、溶出された変性したDNAを生成する工程;
iii)溶出されたDNAを亜硫酸水素塩試薬の存在下で加熱して、脱アミノ化された核酸を生成する工程;
iv)当該脱アミノ化された核酸を第2のカラムを含む第2のマトリックス材料に接触させて、当該脱アミノ化された核酸を当該第2のマトリックス材料に結合させる工程;
v)脱アミノ化された核酸をアルカリ溶液と接触させて、変換された(例えば、亜硫酸水素塩で変換された)核酸を生成することにより、結合した脱アミノ化された核酸を脱スルホン化する工程及び/又は核酸を同時に溶出し、脱スルホン化する工程;
vi)当該亜硫酸水素塩変換された核酸を当該第2のマトリックス材料から溶出する工程;並びに
Vii)当該変換された核酸上でメチル化特異的PCR及び/又は核酸配列決定、及び/又は高分解能融解解析(HRM)を行い、当該核酸のメチル化を決定する工程
を含み、少なくとも工程iv)~vi)が、単一の反応カートリッジにおいて行われる、方法。
試料を含有する第1のチャンバー;
グアニジニウムチオシアネート-エタノール(GTC-EtOH)溶液を含有する第2のチャンバー;
亜硫酸水素塩試薬を含有する第3のチャンバー;
バッファーを含有する第4のチャンバー;
リンス溶液を含有する第5のチャンバー;及び
溶出/脱スルホン化試薬を含有する第6のチャンバー
を含む、実施形態11~22のいずれか1つに記載の方法。
試料を含有する第1のチャンバー;
グアニジニウムチオ硫酸エタノール(GTC-EtOH)溶液を含有する第2のチャンバー;
亜硫酸水素塩試薬を含有する第3のチャンバー;
バッファーを含有する第4のチャンバー;
リンス溶液を含有する第5のチャンバー;及び
溶出/脱スルホン化試薬を含有する第6のチャンバー
を含むように構成される、実施形態92~111のいずれか1つに記載のカートリッジ。
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー(248b);
ヌクレオチド配列:AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー(249b);
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー(250);
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー(251);及び
ヌクレオチド配列 蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号268)を含むプローブ(252a)
を含有する、実施形態128のカートリッジ。
実施形態130:ネステッドPCR反応を使用してACTB(例えば、対照として)のメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
ヌクレオチド配列:GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー(102);
ヌクレオチド配列:CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー(103);
ヌクレオチド配列:GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー(148);
ヌクレオチド配列:CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー(149);及び
ヌクレオチド配列:蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号179)を含むプローブ(178)
を含有する、実施形態128~129のいずれか1つに記載のカートリッジ。
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー(248b);
ヌクレオチド配列AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー(249b);
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー(250);
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー(251);及び
ヌクレオチド配列 蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号268)を含むプローブ(252a)
を含有する、実施形態225のカートリッジ。
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー(102);
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー(103);
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー(148);
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー(149);及び
ヌクレオチド配列 蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号179)を含むプローブ(178)
を含有する、実施形態225~226のいずれか1つに記載のカートリッジ。
血清又は血漿のプロテアーゼKで処理した試料を実施形態169~171のいずれか1つに記載の溶解溶液及びアルコールと合わせて、試料溶液を形成する工程;
当該試料溶液を実施形態143~154のいずれか1つに記載のカートリッジ中の試料を受け取るチャンバー、又は実施形態155~168のいずれか1つに記載のカートリッジ中の試料を受け取るチャンバーにロードする工程;並びに
当該カートリッジを操作して、当該試料中のDNAを当該親和性マトリックスに結合させ、次に、当該DNAを洗浄し、当該マトリックスから放出させる工程
を含む方法。
ホルマリン固定したパラフィン包埋試料を実施形態172~174のいずれか1つに記載の溶解溶液と合わせる工程;
当該試料を含有する当該溶解溶液を加熱する工程;アルコールを当該試料に加えて、試料溶液を形成する工程;当該試料溶液を実施形態143~154のいずれか1つに記載のカートリッジ中の試料を受け取るチャンバー、又は実施形態155~168のいずれか1つに記載のカートリッジ中の試料を受け取るチャンバーにロードする工程;並びに
当該カートリッジを操作して、当該試料中のDNAを当該親和性マトリックスに結合させ、次に、当該DNAを洗浄し、当該マトリックスから放出させる工程
を含む方法。
当該対象由来の生物学的試料を用意する工程であって、当該生物学的試料はDNAを含む、工程;
当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化における増大が、癌若しくは癌の素因の存在又は癌若しくは前癌の進行度の指標である場合、請求項190~225のいずれか1項に記載のカートリッジを利用して、メチル化状態が癌のマーカーである当該DNA中の1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出する工程
を含む方法。
DNAを含む試料をDABSOと接触させて、当該DNAを変換する工程;
変換されたDNAを脱スルホン化して、シトシン残基がウラシルに変換されるDNAを生成するが、5-メチルシトシン残基は実質的に影響されない、工程
を含む方法。
DNA試料を用意する工程;
実施形態286~296のいずれか1つの方法に記載の当該試料中のDNAを変換する工程;及び
変換された核酸上でメチル化特異的PCR及び/又は核酸配列決定、及び/又は高分解能融解解析(HRM)を行い、当該核酸のメチル化を決定する工程
を含む方法。
DABSOを含む変換試薬を含有する容器;及び
脱スルホン化試薬を含有する容器
を含むキット。
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー;
ヌクレオチド配列AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー;
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー;
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー;及び
ヌクレオチド配列 蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号268)を含むプローブ
を含む、セット。
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー(102);
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー(103);
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー(148);
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー(149);及び
ヌクレオチド配列 蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号179)を含むプローブ(178)
を含む、セット。
MGMT遺伝子のプロモーター領域を含有する変換された(例えば、亜硫酸水素塩変換された)DNAを用意する工程;
次のプライマー及びプローブ:
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー;
ヌクレオチド配列AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー;
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー;
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー;及び
ヌクレオチド配列 蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号268)を含むプローブ
を含むネステッドPCR反応を使用してMGMTメチル化についてメチル化特異的PCRを行う工程;並びに
PCR増幅産物を検出して及び/又は定量して、当該MGMT遺伝子のメチル化の決定をもたらす工程
を含む方法。
ACTB遺伝子(例えば、対照として)のプロモーター領域を含有する変換された(例えば、亜硫酸水素塩変換された)DNAを用意する工程;
次のプライマー及びプローブ:
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー;
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー;
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー;
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー;並びに
ヌクレオチド配列 蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号179)を含むプローブ
を含むネステッドPCR反応を使用してACTBメチル化についてメチル化特異的PCRを行う工程;並びに
PCR増幅産物を検出して、及び/又は定量して、当該ACTB遺伝子のメチル化の決定をもたらす工程
を更に含む、実施形態310の方法。
試料を受け取るチャンバー;
第1のマトリックス材料を含むカラム;
温度制御チャネル又はチャンバー;
試料除去チャンバー;並びに
試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバー
を含む第1のカートリッジであって、使用時に、当該チャンバーの少なくとも1つが、亜硫酸水素塩試薬を含有する、第1のカートリッジ;並びに
試料を受け取るチャンバー;
第2のマトリックス材料を含むカラム;
温度制御チャネル又はチャンバー;並びに
試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバー
を含む第2のカートリッジであって、使用時に、当該チャンバーの少なくとも1つが、脱スルホン化及び/又は溶出試薬を含有する、第2のカートリッジ
を含む、カートリッジのセット。
当該第1のカートリッジにおいて、当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、当該試料除去チャンバー、及び当該温度制御された加熱チャネル若しくはチャンバーが、選択的に流体連通にあり;並びに/又は
当該第2のカートリッジにおいて、当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、及び当該温度制御された加熱チャネル若しくはチャンバーが、選択的に流体連通にある、
実施形態317~342のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
当該第1のカートリッジにおいて、当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、当該試料除去チャンバー、及び当該温度制御チャネル若しくはチャンバーが、マイクロ流体チャネル及びバルブにより選択的に流体連通にあり;並びに/又は
当該第2のカートリッジにおいて、当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、及び当該温度制御チャネル若しくはチャンバーが、マイクロ流体チャネル及びバルブにより選択的に流体連通にある
、実施形態343のカートリッジのセット。
当該第1のカートリッジにおいて、当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、当該試料除去チャンバー、及び当該温度制御チャネル若しくはチャンバー又は当該温度制御チャネル若しくはチャンバーへのポートが、中心バルブの周囲に設けられ、当該中心バルブ中のチャネルと選択的に流体連通にあり、当該中心バルブが、当該中心バルブと流体連通にあるチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納する;並びに/或いは
当該第2のカートリッジにおいて、当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、及び当該温度制御チャネル若しくはチャンバー又は当該温度制御チャネル若しくはチャンバーへのポートが、中心バルブの周囲に設けられ、当該中心バルブ中のチャネルと選択的に流体連通にあり、当該中心バルブが、当該中心バルブと流体連通にあるチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納する
、実施形態343のカートリッジのセット。
試料を含有する第1のチャンバー;
グアニジニウムチオ硫酸エタノール(GTC-EtOH)溶液を含有する第2のチャンバー;
亜硫酸水素塩試薬を含有する第3のチャンバー;
トリスバッファーを含有する第4のチャンバー;
ポリエチレングリコール(PEG)を含有する第5のチャンバー;及び
KOHを含有する第6のチャンバー
を含むように、当該第1のカートリッジが構成される、実施形態317~345のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
試料を含有する第1のチャンバー;
グアニジニウムチオ硫酸エタノール(GTC-EtOH)溶液を含有する第2のチャンバー;
トリスバッファーを含有する第3のチャンバー;
ポリエチレングリコール(PEG)を含有する第4のチャンバー;
KOHを含有する第5のチャンバー;及び
PCR酵素ビーズを含有する第6のチャンバー
を含むように構成される、実施形態317~336のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー(248b);
ヌクレオチド配列:AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー(249b);
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー(250);
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー(251);及び
ヌクレオチド配列 蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号268)を含むプローブ(252a)
を含有する、実施形態362のカートリッジのセット。
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー(102);
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー(103);
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー(148);
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー(149);及び
ヌクレオチド配列 蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号179)を含むプローブ(178)
を含有する、実施形態362~363のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー(248b);
ヌクレオチド配列AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー(249b);
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー(250);
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー(251);及び
ヌクレオチド配列 蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号268)を含むプローブ(252a)
を含有する、実施形態397のカートリッジのセット。
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー(102);
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー(103);
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー(148);
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー(149);及び
ヌクレオチド配列:蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号179)を含むプローブ(178)
を含有する、実施形態397~398のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
1つ又は複数の試料処理モジュールを含有するように構成されたエンクロージャーを含み、それぞれの試料処理モジュールが、実施形態317~399のいずれか1つに記載のカートリッジの当該セットの、取り外し可能なカートリッジである第1のカートリッジ及び/又は第2のカートリッジを保持するように構成され;
当該システムが、カートリッジの当該セットの第1のカートリッジを操作して、当該第1のカートリッジに導入された試料において核酸の亜硫酸水素塩変換を行うために、試料処理モジュールを操作して試料処理を行うよう;並びに/又は
対応する取り外し可能な試料カートリッジ内の1つ又は複数の標的核酸の脱スルホン化を行うよう、及びメチル化を決定するよう
構成される、システム。
試料をカラムに結合させ;
DNAをカラムから溶出し、当該DNAを変換試薬と合わせ;
反応チャンバー又はチューブにおいてDNA/変換試薬溶液を加熱して、変換されたDNAを生成し;及び
変換されたDNAを第1のカートリッジ中の試料除去チャンバーに運ぶ
ように構成されている、実施形態400~406のいずれか1つに記載のシステム。
変換されたDNAをカラムに結合させ;
変換されたDNAを洗浄し、すすぎ、溶出し;
DNAをカラムから溶出し;
変換されたDNAを脱スルホン化する
ように構成されている、実施形態400~407のいずれか1つに記載のシステム。
当該試料中のDNAを当該第1のマトリックス材料に結合させ;
結合したDNAを洗浄し;マトリックス材料から結合したDNAを溶出させ;溶出されたDNAを当該亜硫酸水素塩試薬と合わせ;
当該温度制御チャネル又はチャンバーにおいてDNAと亜硫酸水素塩試薬の混合物を加熱して、当該DNAの亜硫酸水素塩変換を行い;亜硫酸水素塩で変換されたDNAを当該第1のカートリッジの試料除去チャンバーに移す
工程を含む方法。
実施形態317~399のいずれか1つに記載のカートリッジのセットにおける第2のカートリッジの試料チャンバーにおいて亜硫酸水素塩変換されたDNAを用意する工程;及び
当該第2のカートリッジを操作して:
当該亜硫酸水素塩変換されたDNAを当該第2のマトリックス材料に結合させ;
結合した亜硫酸水素塩で変換されたDNAを洗浄し;
洗浄された亜硫酸水素塩で変換されたDNAを当該第2のマトリックス材料から溶出し;
亜硫酸水素塩変換されたDNAを脱スルホン化する
工程を更に含む、実施形態410の方法。
当該対象由来の生物学的試料を用意する工程であって、当該生物学的試料がDNAを含む、工程;
実施形態317~399のいずれか1つに記載のカートリッジのセットを利用する工程を含み、カートリッジの当該セットの当該第1のカートリッジを使用して、当該DNAの亜硫酸水素塩変換が行われ;カートリッジの当該セットの当該第2のカートリッジを使用して、変換されたDNAが脱スルホン化され、メチル化状態が癌についてのマーカーである当該DNAにおける1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化が検出され、当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化における増大が、癌若しくは癌の素因の存在又は癌若しくは前癌の段階の指標である、方法。
本発明の理解を促進するために、多数の用語及び語句が以下で定義される。
本明細書において記載されるカートリッジベースの方法は、同じ試料からもたらされたmRNAの測定を追加で可能にする。DNAメチル化に関与する対応する上流及び/又は下流のmRNAの測定は、エピジェネティック修飾の機序及び活性を理解するのに重要であり得る。例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)mRNAの測定は、いくつかの癌についてのDNAメチル化と共に研究されている(Table 1(表1)を参照)。
ある特定の実施形態において、DNAの抽出、亜硫酸水素塩変換、及びメチル化特異的PCRは、全て、カートリッジにおいて行われる。1つの例示的な実施形態において、使用者は、試料を溶解/結合試薬に加え、次に、試薬を簡単に混合/ボルテックスし、次に、試料をカートリッジ中の試料ポート又はチャンバーに加える。例示的だが、非限定的な溶解試薬(FFPE切片に特に十分に適した試薬を含む)が、PCT特許公開第WO/2014/052551号(PCT/US2013/061863)に記載され、そこに記載される試薬は、参照により本明細書に組込まれる。
1)DNA精製;
2)DNA変性;
3)DNA変換(例えば、亜硫酸水素塩脱アミノ);及び
4)アルカリ脱スルホン化
を含む。
i)核酸を含む生物学的試料を第1のカラム又はフィルターを含む第1のマトリックス材料に接触させる工程であって、当該マトリックス材料が、当該試料中の核酸と結合及び/又は濾過し、これにより、DNAを精製する、工程;
ii)結合したDNAを第1のマトリックス材料から(例えば、アルカリ溶液を使用して)溶出し、DNAを変性して、溶出された変性したDNAを生成する工程;
iii)溶出されたDNAを変換試薬(例えば、亜硫酸水素イオンをもたらす試薬)の存在下で加熱して、変換された(例えば、脱アミノ化した)核酸を生成する工程;
iv)変換された核酸を第2のマトリックス材料を含む第2のカラムに接触させ、当該脱アミノ化した核酸を当該第2のマトリックス材料に結合させる工程(ある特定の実施形態において、第2のカラムは、第1のカラムと異なり得るか、又は他の実施形態において、同じカラムが二度使用され得ることに注意);
v)脱アミノ化された核酸をアルカリ溶液と接触させて、変換された(例えば、亜硫酸水素塩で変換された)核酸を生成することにより、結合した脱アミノ化された核酸を脱スルホン化する工程及び/又は核酸を同時に溶出し、脱スルホン化する工程;並びに
vi)変換された核酸を当該第2のマトリックス材料から溶出する工程
を含み、少なくとも工程iv)~vi)が、1つの反応カートリッジにおいて行われる。
vii)変換された核酸上でメチル化特異的PCR及び/又は核酸配列決定、及び/又は高分解能融解解析(HRM)を行い、核酸のメチル化を決定する工程
を更に含み、少なくとも工程iv)~vi)が、単一の反応カートリッジにおいて行われる。
ある特定の実施形態において、カートリッジベースのアッセイ(例えば、GENEXPERT(登録商標)カートリッジを利用する)におけるDNAメチル化(MSP)と共に遺伝子の変化したRNA発現両方の同時精製及び検出の方法が提供される。ある特定の実施形態において、これらのアッセイは、例えば、同じ試料調製物由来の腫瘍特異的メチル化と相関するDNMTの変化した発現を同定する。ある特定の実施形態において、これらのアッセイを使用して、発現及びメチル化状況を検証することができる。
多数の解析方法を、カートリッジにおいて行い、DNAメチル化が評価され得る。或いは、ある特定の実施形態において、カートリッジは、変換された(例えば、亜硫酸水素塩若しくはDABSOで変換された)DNAのさらなる解析のための別の装置及び/又はシステムに連結され得る。例示的な方法は、メチル化特異的PCR(MSP)、直接的配列決定、高分解能融解解析(HRM)、パイロシークエンシング(追加の配列決定)、塩基特異的な切断解析(例えば、塩基特異的MALDI-TOF)等を含むが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、メチル化特異的PCRを使用して、標的DNAのメチル化状態を評価することができる。MSPは、変換されていない5-メチルシトシンのみに相補的である配列を含むことにより、「メチル化特異的」、又は逆に、メチル化されていないシトシンから変換されたチミンに相補的である、「非メチル化特異的」であるよう設計されたプライマー及び/又はプローブセットを利用した。次に、メチル化は、増幅を達成する特異的なプライマーの能力により決定される。増幅されるべき標的内の増大した数の変換されていないメチルシトシンは、PCRの特異性を増大するので、この方法は、高いメチル化密度の領域におけるCpGアイランドを調べるのに特に有効である。ある特定の実施形態において、プライマーの3'末端にCpG対を入れることも、特異性を改善する。
ある特定の実施形態において、メチル化されたDNAは、当業者に周知のPCR方法を使用して検出され得る。ある特定の実施形態において、ネステッドPCR反応を使用して、メチル化標的が検出される。1つの代表的だが、非限定的な実施形態(例えば、実施例4を参照)において、ネステッドPCRプロトコールが使用され、ここで、第1の15~20サイクルのPCR反応は、メチル化に特異的ではないが、変換されたDNA配列にのみ特異的である(すなわち、それらは、CpGに渡らないか、又はそれらが、R=プリン又はY=ピリミジンである場合、メチル化された鋳型配列とメチル化されていない鋳型配列の両方を捕捉するため使用される)。第2のqPCR反応(例えば、45サイクルのqPCR反応)は、典型的な2~3個のメチル化されたCpGに特異的であるプライマーとプローブの両方を含有し得る。
ある特定の実施形態において、DNAのメチル化状態は、直接的な配列決定方法を使用して決定され得る。ある特定の実施形態において、方法は、亜硫酸水素塩変換に抵抗性のヌクレオチドを直接決定するためのPCR及び標準的ジデオキシヌクレオチドDNA配列決定を利用することができる(例えば、Frommerら、(1992)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89(5):1827~1831頁を参照)。様々な実施形態において、目的のメチル化部位に隣接する(が、含まない)、鎖特異的並びに亜硫酸水素塩特異的であるプライマー(例えば、それらが、亜硫酸水素塩で処理されていないDNAに相補的でないように、非CpGシトシンを含有するプライマー)が、設計される。それ故、それは、メチル化特異的PCRと対照的に、メチル化された配列とメチル化されていない配列の両方を増幅する。メチル化されていないシトシンの全ての部位は、センス鎖の生じた増幅された配列中のチミンとして、及び増幅されたアンチセンス鎖中のアデニンとして提示される。ある特定の実施形態において、ネステッドPCR方法を使用して、配列決定のため産物が増強され得る。
ある特定の実施形態において、高分解能融解解析(HRM)を使用して、変換されていない亜硫酸水素塩で処理されたDNAから変換されたものが区別され得る。HRMは、PCR増幅産物が、温度ランピング、及び融解中に挿入蛍光色素の生じた遊離により直接解析される定量的PCR技術である(例えば、Wojdacz及びDobrovic、(2007)、Nucleic Acids Res.、35(6):e41を参照)。増幅産物におけるTに対するCの含有量により表される、メチル化の程度は、融解の速度及び結果として生じる色素の放出を決定する。この方法により、直接的な定量を可能になるが、特異的なCpG部位でよりむしろ全体として増幅された領域におけるメチル化を評価することを可能になる。
ある特定の実施形態において、パイロシークエンシング(合成による配列決定)を使用して、メチル化特異的PCRを使用することなく、亜硫酸水素塩で処理されたDNAが解析され得る(例えば、Colellaら、(2003)、BioTechniques35(1):146~150頁;Tostら、(2003)、BioTechniques35(1):152~156頁;等を参照)。合成による配列決定は、ジデオキシヌクレオチドでの連鎖停止反応よりむしろ、ヌクレオチド取り込み上でのリン酸塩放出の検出を利用するサンガー配列決定と異なる。DNA配列は、典型的には、可能性のあるA/T/C/Gヌクレオチドの4つのうち1つのみが、加えられ、1文字のみが、1本鎖の鋳型(決定されるべき配列である)上で取り込まれ得る時に入手可能であるという事実により、次の相補的なヌクレオチドの取り込みの際に放出される光により決定することができる。
ある特定の実施形態において、塩基特異的な切断/MALDI-TOFは、塩基特異的な切断工程を加えて、ヌクレオチド変化から得られた情報を増強することにより、亜硫酸水素塩変換を利用する(Ehrichら、(2005)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、102(44):15785~15790頁)。まず、目的の領域のRNAへのインビトロ転写を使用することにより(最初の増幅産物においてRNAポリメラーゼプロモーター部位をPCRプライマーに加えることにより)、RNase Aを使用して、塩基特異的な部位でのRNA転写産物が切断され得る。RNase Aは、シトシン及びウラシルリボヌクレオチドで特異的にRNAを切断し、シトシン特異的な(C特異的な)切断が所望されるとき、取り込まれる切断抵抗性dTTPを、ウラシル特異的な(U特異的な)切断が所望されるとき、取り込まれるdCTPを加えることにより、塩基特異性が達成される。次に、切断されたフラグメントは、MALDI-TOF又は他の方法により解析され得る。亜硫酸水素塩処理は、CからUへの変換による切断部位の導入/除去、又は増幅されたリバースの鎖におけるGからAへの変換によるフラグメント質量におけるシフトのいずれかをもたらす。C特異的な切断は、全てのメチル化されたCpG部位で特異的に切断する。得られたフラグメントのサイズを(例えば、MALDI-TOF、キャピラリー電気泳動、マイクロチップ電気泳動等を使用して)解析することにより、全体としての領域のメチル化の程度を決定することよりむしろ、領域内のCpG部位のDNAメチル化の特定のパターンを決定すること可能である。
メチル化感受性1本鎖立体構造解析(MS-SSCA)は、一塩基多型(SNP)解析のため開発された1本鎖立体構造多型解析(SSCA)方法に基づく(Biancoら、(1999)、Hum. Mutat.14(4):289~293頁)。SSCAは、非変性電気泳動における異なる泳動に基づき、同一のサイズだが、異なる配列の1本鎖DNAフラグメント間を区別する。MS-SSCAにおいて、これを使用して、目的のCpG部位を含有する亜硫酸水素塩で処理されたPCR増幅された領域間を区別する。単一のみのヌクレオチドの相違が存在するとき、SSCAは感度を欠くが、亜硫酸水素塩処理は、目的の大部分の領域において多数のCからTへの変換を生じ、得られた感度は高くなり得る。ある特定の実施形態において、MS-SSCAはまた、バンド強度の比に基づきDNAメチル化の程度の半定量的な解析をもたらし得る。しかしながら、典型的には、MS-SSCAは、個々のメチル化部位よりむしろ、目的の領域中の全体として全てのCpG部位を評価する。
上で示された通り、DNAメチル化は、広範な数の文脈において関心の対象である。ある特定の実施形態において、DNAメチル化の量は、特に腫瘍学において臨床上の関心の対象である。異常なDNAメチル化パターン(正常組織と比較して過剰メチル化及び低メチル化)は、多数のヒト悪性腫瘍と関連している。過剰メチル化は、典型的には、プロモーター領域中のCpGアイランドで生じ、遺伝子不活性化と関連する。より低レベルの白血球DNAメチル化は、多くの種類の癌と関連する(Zhangら、(2011)、Epigenetics、6(3):293~299頁)。全体的な低メチル化はまた、異なる機序を通じて癌の発生及び進行に関与する。典型的には、腫瘍抑制遺伝子の過剰メチル化及び癌遺伝子の低メチル化が存在する(例えば、Lundら、(2004)、J. Biol. Chem.279(28):29147~29154頁を参照)。
ある特定の実施形態において、メチル化状態は、メチル化状態が、膵臓癌の存在及び/又は予後のマーカーである1つ又は複数のプロモーターについて決定される。ADAMTS1、又はBNC1の1つ又は複数のメチル化の頻度を使用して、膵臓癌が検出及び/又は段階分けされ得ることが決定された。したがって、膵臓癌の例示的だが、非限定的なメチル化マーカーは、ADAMTS1及び/又はBNC1を含むが、これらに限定されない。これらの遺伝子のプロモーターでのメチル化の検出のための例示的なプライマー及びプローブが、以下のTable 4(表4)(特定の配列についてTable 5(表5)を参照)、及び実施例4のTable 12(表12)に示される。ある特定の実施形態において、プライマー及びプローブは、変換されたDNAのフォワード鎖におけるメチル化及び/又は変換されたDNAのリバース鎖におけるメチル化の検出のため提供される。
ある特定の実施形態において、メチル化状態は、メチル化状態が、乳癌の存在及び/又は予後のマーカーである1つ又は複数のプロモーターについて決定される。乳癌の例示的なメチル化マーカーは、ASSF1A、及び/又はAKR1B1、及び/又はHOXB4、及び/又はHIST1H3C、及び/又はRASGRF2、及び/又はTM6SF1を含むが、これらに限定されない。これらの遺伝子のプロモーターでのメチル化の検出のための例示的なプライマー及びプローブが、以下のTable 4(表4)(特定の配列についてTable 5(表5)を参照)、及び実施例4のTable 11(表11)に示される。
様々な実施形態において、本明細書に記載される方法は、ネステッドPCR反応を含み得、本明細書に記載されるカートリッジは、かかるネステッドPCR反応のための試薬(例えば、プライマー及びプローブ)を含有し得る。例えば、ある特定の実施形態において、メチル化は、1、2、3、4、5、又は6つの遺伝子(遺伝子プロモーター)について検出される。DNAの亜硫酸水素塩変換は、シトシン残基をウラシルに変えるが、5-メチルシトシン残基には影響を与えないので、変換された(亜硫酸水素塩で変換された)DNAのフォワード及びリバース鎖は、もはや相補的でない。したがって、フォワード及びリバース鎖を独立して(例えば、マルチプレックスPCR反応において)調べて、メチル化検出に対する追加の特異性及び感度をもたらすことが可能である。かかる場合では、単一の標的のアッセイは、2-プレックスのマルチプレックスアッセイを含み得、一方、2、3、4、5、又は6つの標的遺伝子のアッセイは、4-プレックス、6-プレックス、8-プレックス、10-プレックス、又は12-プレックスのマルチプレックスアッセイを含み得る。ある特定の実施形態において、アッセイを、2つのマルチプレックス反応液に分けて、例えば、フォワード及びリバース鎖を独立してアッセイし得る。しかしながら、複数のマルチプレックスアッセイに分けるとき、アッセイのグループ化は、フォワード又はリバースによるものであることを必要とせず、単に特定のPCR反応条件に最も適合するプライマー/プローブセットを含み得ることは、理解される。
1)FAM、TMR、Texas red、及びCy5;
2)FAM、TET、TMR、及びTexas Red;
3)FAM、HEX、Texas red、及びCy5;並びに
4)FAM、Cy3、Texas red、及びCy5
を含むが、これらに限定されない。
1)FAM、TET、HEX、TMR、ROX、及びTexas red;並びに
2)FAM、HEX、LC red 610、LC red 640、LC red 670、及びLC red 705
を含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、カートリッジは、本明細書において記載される方法を行うために提供される(例えば、DNAメチル化、及び場合により、RNA発現の決定)。ある特定の実施形態において、カートリッジは、第1のマトリックス材料を含むカラム、試料を受け取るチャンバー、温度制御チャネル又はチャンバー、試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバーを含み、使用時には、当該チャンバーの少なくとも1つが、DNA変換試薬(例えば、DABSO及び/又は亜硫酸水素塩試薬)を含有し、脱スルホン化/溶出バッファーを含有し、当該カートリッジは、場合により、当該第2のマトリックス材料を含む第2のカラムを含む。ある特定の実施形態において、カートリッジは、使用時に、カートリッジが、グアニジニウムチオシアネートエタノール(GTC-EtOH)を含む試薬を含有するチャンバーを含むように、構成される。ある特定の実施形態において、第2のカラムは、存在せず、一方、他の実施形態において、第2のカラムは、存在する。ある特定の実施形態において、温度制御チャネル又はチャンバーは、単に、加熱チャネル又はチャンバーであり得るか、又はそれは、熱サイクリングチャネル又はチャンバーであり得る。ある特定の実施形態において、カートリッジは、第2の加熱チャネル又はチャンバー(例えば、第2の熱サイクリングチャネル若しくはチャンバー)を更に含む。ある特定の実施形態において、カートリッジは、DNA変換工程(例えば、亜硫酸水素塩インキュベーション)及び/又は脱スルホン化工程が、1つ若しくは複数のPCR反応が後に行われる同じ反応チューブ又はチャンバーにおいて生じるように、構成される。
様々な実施形態において、カートリッジは、大きな試料体積の調製のため提供される。ある特定の実施形態において、試料調製カートリッジは、多量試料調製のため改変されたGENEXPERT(登録商標)カートリッジを含む(例えば、図20に示される通り)。ある特定の実施形態において、例えば、カートリッジが、GENEXPERT(登録商標)ベースであるとき、カートリッジは、DNAを結合する親和性マトリックスを含む1つ若しくは複数のチャネル又はチャンバー、中心バルブアセンブリの周囲に設けられ中心バルブと選択的に流体連通にある複数のチャンバーを含み、当該中心バルブアセンブリが、中心バルブと流体連通にあるチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納するように構成されており、当該複数のチャンバーは、それぞれが、最大約4ml(又は最大約5ml)の試料溶液を受け取るように構成された少なくとも2つの異なるチャンバー(ある特定の実施形態において、チャンバー2は、約4mlの最大体積を有し、一方、チャンバー3は、約4.5mlの最大体積を有する)、PEG(例えば、PEG200)を含有するチャンバー、アルカリ溶液(例えば、KOH溶液)を含有するチャンバー、及びバッファー(例えば、トリス)を含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、複数のチャンバーは、それぞれが、最大約4ml(又は最大約5ml)の試料溶液を受け取るように構成された少なくとも3つの異なるチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、複数のチャンバーは、洗浄溶液(例えば、典型的には、1.25Mグアニジニウムチオシアネート、25mMトリスpH7.0、50%エタノールであるGTCエタノール洗浄溶液)を含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、カートリッジは、処理された試料の除去用に構成されたチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、試料チャンバーは、使用時に、試料溶液、GTC及びアルコール(例えば、イソプロパノール)を含有する。ある特定の実施形態において、試料チャンバーは、使用時に、試料溶液、GTC及びアルコールを実施的に等しい体積で含有する。ある特定の実施形態において、カートリッジは、使用時に、試料を受け取るように構成された当該チャンバーのそれぞれに配置された、試料溶液4ml、GTC及びイソプロパノ
ールを含む。ある特定の実施形態において、カートリッジは、試料の試料体積0.5mlから約4mlの間と実質的に相関するDNA又はRNA回収率をもたらす。
様々な実施形態において、本明細書に記載されるメチル化解析方法は、例えば、図20Bに説明される、2つのカートリッジシステム(「第1の」カートリッジ(例えば、多量試料調製カートリッジ)、及び「第2の」カートリッジ(例えば、qPCRカートリッジ)のような2つのカートリッジ)を使用して行われる。この図において説明される通り、ある特定の実施形態において、試料調製及び亜硫酸水素塩変換は、第1のカートリッジにおいて行われ得る。次に、変換されたDNAは、第2のカートリッジに移され、そこで、洗浄され、脱スルホン化される。ある特定の実施形態において、第2のカートリッジを加えて利用し、例えば、PCR(例えば、メチル化特異的PCR)を介して変換された(又は変換されていない)DNAを解析する。
ある特定の実施形態において、提供される血漿又は血清由来の核酸の調製(及び場合により、解析)に十分に適した関節である試料の調製カートリッジが、提供される。1つの例示的だが、非限定的な実施形態が、図17に示される。そこで説明される通り、ある特定の実施形態において、カートリッジは、DNAを結合する親和性マトリックスを含むチャネル又はチャンバー、中心バルブアセンブリの周囲に設けられ中心バルブアセンブリと選択的に流体連通にある複数のチャンバーを含み、中心バルブアセンブリが、中心バルブと流体連通にあるチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納するように構成されており、複数のチャンバーが:試料溶液最大約5ml又は最大約4mlを受け取るように構成されたチャンバー;PEG(例えば、PEG200)を含有するチャンバー;GTC-EtOHを含有するチャンバー;アルカリ溶液(例えば、KOH)を含有するチャンバー;及びバッファー(例えば、トリス)を含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、複数のチャンバーは、変換試薬(例えば、亜硫酸水素塩試薬)を含有するチャンバーを更に含む。ある特定の実施形態において、複数のチャンバーは、洗浄溶液(例えば、GTCエタノール洗浄液(典型的には、1.25Mグアニジニウムチオシアネート、25mMトリスpH7.0、50%エタノール))を含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、複数のチャンバーは、1つ若しくは複数のPCRプライマー及び/又はプローブを含むビーズを含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、PEGを含有するチャンバーは、PEG約1mlを含有する。ある特定の実施形態において、アルカリ溶液を含有するチャンバーは、溶液約500μLを含有する。ある特定の実施形態において、GTC-EtOHを含有するチャンバーは、GTC-EtOH約2mlを含有する。ある特定の実施形態において、バッファーを含有するチャンバーは、バッファー約2mLを含有する。
DABSOを使用して、DNAの変換及びメチル化の検出のための亜硫酸水素塩の使用と類似する方法で、DNAの変換を行い得ることは、驚くべき発見であった。したがって、ある特定の実施形態において、5-メチルシトシン残基には実質的に影響を与えずに、DNA中のシトシン残基をウラシルに変換するためDABSOを利用する方法が、提供される。ある特定の実施形態において、方法は、DNAを含む試料をDABSOと接触させて、DNAを変換する工程、及び変換されたDNAを脱スルホン化して、DNAを生成する工程であって、シトシン残基が、ウラシルに変換されるが、5-メチルシトシン残基は実質的に影響されない、工程を含む。ある特定の実施形態において、DABSOは、約2M~最大約5Mの範囲にある濃度で提供される。ある特定の実施形態において、DABSOは、約2.5Mの濃度で提供される。ある特定の実施形態において、DABSOは、アルカリ水溶液(例えば、KOH溶液)において溶解される。ある特定の実施形態において、DABSOを含む試薬は、KOHを含む溶液において溶解されたDABSOを含む。
メチル化検出用のキット
ある特定の実施形態において、本明細書において記載される方法を行うためのキットが提供される。1つの例示的な実施形態において、キットは、本明細書に記載される反応カートリッジを含有する容器、本明細書に記載される試料処理試薬を含有する容器、及び本明細書に記載される変換試薬(例えば、亜硫酸水素塩試薬)を含有する容器を含む。ある特定の実施形態において、亜硫酸水素塩試薬は、カートリッジのチャンバーにおいて提供される。ある特定の実施形態において、亜硫酸水素塩試薬は、カートリッジと別の容器において提供される。ある特定の実施形態において、試料処理試薬は、カートリッジのチャンバーにおいて提供される。ある特定の実施形態において、具体的には、試料処理試薬が、グアニジニウムチオシアネートを含む場合、試料処理試薬は、カートリッジと別の容器において提供される。
ある特定の実施形態において、キットは、例えば、DNAのメチル化状態の検出において、変換試薬としてのDABSOの使用のため提供される。ある特定の実施形態において、キットは、DABSOを含む変換試薬を含有する容器、及び脱スルホン化試薬を含有する容器を含む。ある特定の実施形態において、キットは、親和性マトリックス(例えば、シリカマトリックス材料)を含むカラムを含む。ある特定の実施形態において、キットは、結合バッファーを含有する容器及び/又は溶出バッファーを含有する容器を含む。ある特定の実施形態において、キットは、洗浄バッファーを含有する容器を含む。
方法を立証するために、ヒトゲノムDNA(HGDNA)を開始試料として使用して、Cepheid GENEXPERT(登録商標)カートリッジにおける試料調製、亜硫酸水素塩変換、試料精製、及びメチル化特異的qPCRをモニターした。亜硫酸水素塩変換効率を測定するために、亜硫酸水素塩変換工程中に50μLのカートリッジチューブにおいて、DNAと亜硫酸水素塩の混合物の半分をロードし、加熱した。それ故、最適な変換条件下で、HGDNAのおよそ半分を変換し、他の半分を変換しないままにした。
図6A及び図6Bは、変換したACTBの直線性を示す。特に、図6Aは、hgDNAを使用した、ACTBについての15サイクルのネステッドqPCRの結果を示す。右のパネルから見ることができる通り、シグナル(Ct値)は、約25,000コピーから約100コピーの間で実質的に直線である。図6Bは、hgDNAを使用した、ACTBについての20サイクルのネステッドqPCRの結果を示す。これらのプロットは、hgDNAについてのカートリッジの感度を示す。ドロップアウトは、約25コピーの変換したDNAの感度で20~50コピー辺りで生じ始めた。
図8は、変換効率の決定の結果を説明する。変換効率は、変換していないHMBSと変換したACTBの間で約66%(約1Ct)の相違である。100%結合/溶出、100%変換、及び100%結合溶出での理想的なCtは、約24~25である。実験は、10分の1の低減及びCt約27について50%結合/溶出、50~66%変換、及び50%結合/溶出を示すように思われる。
乳癌モニタリングのためのマーカーの検出
材料及び方法:
MBA-453細胞1000個又はヒト血清(HS)DNA25ngを、結合バッファー(2.25Mグアニジンチオシアネート、22.5mMトリスpH7.0、0.5%Tween20、50%エタノール、及び0.005%SE-15消泡剤)2.5mLに加えた。細胞又はDNA溶液2.5mLを、Cepheidメチル化カートリッジのチャンバー2に加えた(図13Aの配置)。メチル化カートリッジ中の残るチャンバーを以下の通り充填した:チャンバー3-洗浄バッファー(1.25Mグアニジンチオシアネート、25mMトリスpH7.0、50%エタノール)3.2mL、チャンバー4-7M亜硫酸水素アンモニウム90μL、チャンバー5-50mMトリスpH8.5 4mL、チャンバー8-PEG200リンス1mL、チャンバー9-EZR(Taq)及びTSR(RASSF1A、AKR1B1、HOXB4、HIST1H3C、RASGRF2、TM6SF1についての6種の標的乳癌マルチプレックス、以下のTable 11(表11)を参照)を含む定量的PCRビーズ、チャンバー10-15mM KOH500μL、並びにチャンバー11-EZR(Taq)及びTSR(RASSF1A、AKR1B1、HOXB4、HIST1H3C、RASGRF2、TM6SF1についての6種の標的乳癌マルチプレックス、以下のTable 11(表11)を参照)を含むネステッドビーズ。次に、メチル化カートリッジを、Cepheid GeneXpertにロードし、メチル化アッセイの全体を、GeneXpert-第1のDNA試料調製、亜硫酸水素塩変換、第2の変換後DNA試料調製、脱スルホン化、並びに20サイクルのネステッド及び定量的PCR反応により完了した。
亜硫酸水素塩あり及びなしでのMBA-453細胞1000個(図15A~図15B)、並びにHIST1H3Cを除き、それぞれの遺伝子プロモーターで主にメチル化していない亜硫酸水素塩ありのHS DNA25ng(図15C)を使用して、メチル化カートリッジを実行した。亜硫酸水素塩なし又はメチル化していないHS DNA対照反応(図15A、図15C)のどちらかにおいて、標的のいずれかのわずかな増幅が存在したか、又は存在しなかった。亜硫酸水素塩の添加で、メチル化カートリッジは、MBA-453細胞1000個由来の複数の遺伝子プロモーター、具体的には、AKR1B1、RASSF1A、HOXB4、及びRASGRF2での高レベルのメチル化を取り上げた。
血漿及びFFPE試料についての試料調製
図17は、PCR及び/又はメチル化検出のためDNA試料を調製するため使用することができるカートリッジの1つの配置を説明する。血清若しくは血漿から得た試料、又はFFPE試料を、単に、カートリッジの試料チャンバー(例えば、チャンバー3)に導入し得、本明細書において提供するカートリッジの操作が、PCR及び/又はメチル化検出する準備が整った試料をもたらす。
1つの例示的だが、非限定的な実施形態において、血清又は血漿をプロテアーゼKで処理することにより、血清又は血漿試料を調製する(例えば、cfDNAの解析のため)。次に、プロテアーゼKで処理した血清/血漿を、グアニジニウムチオシアネート(GTC)、バッファー(例えば、トリスpH7.0)、界面活性剤(例えば、Tween20)、及び場合により、消泡剤(例えば、消泡剤SE15)を含む溶解溶液と混合する。アルコール(例えば、イソプロパノール)を溶液に加え、次に、それを、試料処理用カートリッジに導入する。1つの実施形態において、溶解溶液を、Table 13(表13)に示す通り製剤する。プロテアーゼKで処理した血清/血漿1.3mL、溶解溶液2.2mL、及びアルコール1.5mlに対応する割合で、プロテアーゼKで処理した血清/血漿を、溶解溶液及びアルコールと混合し得る。ある特定の実施形態において、血清/血漿試料を、プロテアーゼKで約15分間処理する。溶解溶液を加え、約10分間、冷却し、保持/混合する。次に、イソプロパノールを、混合物に加え、次に、それを処理用カートリッジにロードする。
cfDNAを調製するとき、ある特定の実施形態において、DNA調製の質をモニタリングすることを可能にする抽出対照を含むことが可能になる。図18において説明する通り、2種の異なるビーズセットが存在する。一方のビーズセットは、SAC(試料アッセイ対照)についての内在性HMBSプライマー及びプローブセット、並びにSPC(試料調製対照)についての外在性BGプライマー及びプローブセットを含有する。他方は、SAC(並びにBG SPC)についての内在性ベータ-グロビンPPセットを含有する。
多量試料調製カートリッジの試験
ある特定の実施形態において、多量試料調製(HSVP)カートリッジを、多量の試料(例えば、最大約12ml~15ml)の調製のため提供する。これは、試料が、低濃度のDNA(例えば、血清又は血漿中のcfDNA)を含有する場合、特に有用である。1つのかかるカートリッジを図20Aにおいて模式的に説明する。そこで示す通り、カートリッジは、試料を受け取るため使用し得る3つのチャンバー(チャンバー2、3、及び5)を提供する。説明した実施形態において、これらのチャンバーのそれぞれは、試料約4mLを受け取ることができ、ある特定の実施形態において、試料は、GTC4mL、及びアルコール(例えば、イソプロパノール)4mLと合わせた血漿/血清4mLを含む。
亜硫酸水素塩変換の最適化
ある特定の実施形態において、本明細書に記載するメチル化解析用のカートリッジを使用するとき、1つの潜在的な問題は、可能性のある最も小さい体積を使用して溶出効率を最適化することである。小さな溶出体積は、スピンカラムを使用して扱うのをより容易にする。より大きな試料体積を処理するための複数の加熱工程を使用することにより、この問題に取り組むことができる。
亜硫酸水素塩-DNA 75~80μLを引き抜き;95℃で10秒間、65℃で300秒間×8加熱し;
残り+5~10μLを引き抜き;加圧し;95℃で480秒間、65℃で1800秒間×1加熱する
行った。
チューブベースの市販のキットとのDNAメチル化カートリッジの比較
図23Aは、市販のキット(QIAamp MinElute Virus Spin Kit(Qiagen、Inc社)及びEZ DNA Methylation-Lightning(商標)Kit(Zymo Research, Inc社))を使用して、同じ解析を行うときに要求される工程と比較して、本明細書に記載するカートリッジを使用してメチル化解析を行うとき(左)要求されるユーザー工程の比較を示す。容易に分かるように、カートリッジベースのメチル化解析は、ずっと少ないユーザー工程を要求し、これは、キットを使用して要求される労働時間2~3時間と比較して、労働時間約5分間を伴う。
DNA変換のためのDABSOの使用
これは、H2O5mLにおいてDABSO5gを溶解する初めての試みであった。最後に、10M KOH数mL及び水1mLを加え、加熱して、DABSOを溶解し、推定最終DABSO濃度約2.5Mで約pH5からpH5.5の間の最大pHまで上昇させた。
1)DABSO120μL/DNA30μL;
2)Zymo120μL/DNA30μL;及び
3)Zymo70μL/DNA30μL(カートリッジにおける現在の比)
であった。
メチル化したDNAの検出感度
DNAメチル化の検出感度を評価するために、変換したACTB遺伝子プロモーターを、本明細書に記載するカートリッジを使用したコピー数の関数として検出した。目標は、25コピーより少ない、変換し、メチル化していないDNAを検出することであった。既に示した通り、約10~50コピーで降下を観察した(それぞれ1回の降下)。血清バックグラウンドにおいて、メチル化DNA標的について、同様の感度を観察した。
両方の鎖についての逆相補マルチプレックスアッセイ
図26は、両方のDNA鎖についての逆相補マルチプレックスアッセイについての結果を説明する。亜硫酸水素塩変換後、両方の鎖は、それらの相補性を失う。したがって、プライマー及びプローブセットは、一方の鎖又は他方について設計し、固有の増幅産物をもたらさなければならない。「より多くの機会」をよりもたらすことに加えて、このアプローチは、感度に役立ち得る(LODで、一方の鎖のみ又は他方の鎖がチューブに留まってしまう場合、このアプローチは、シグナルが取り上げられることを確実にする)。
単一のカートリッジにおけるDNAメチル化及び変異の検出
ある特定の実施形態において、マルチプレックスPCR反応は、同じカートリッジでのメチル化に加えて変異の検出を可能にするプライマー及びプローブを含有し得る。図27Aは、対照BGと共にKRAS G12D変異と共にメチル化したBNC1及びADAMTS1の検出(上部のパネル)、並びに対照BGと共にKRAS野生型と共にメチル化したBNC1及びADAMTS1の検出(下部のパネル)を説明する。
膵臓癌のマルチプレックス最適化
ADAMTS1、BNC1、(及びある特定の他の遺伝子)のメチル化解析が、膵臓癌の検出及び/又は段階分けを可能にすると決定した。したがって、BNC1及びADAMTS1についての最終マルチプレックスアッセイを最適化して、他の遺伝子についてのプローブの取り込みを促進した。このアッセイを最適化するために、温度勾配を、フォワード/リバース亜硫酸水素塩で変換した鎖についての外部及び内部PCRにおいて実行した。シングルプレックス(それぞれの遺伝子についてフォワード/リバース)を、外部温度56℃、58℃、及び60℃並びに内部温度64℃、66℃、及び68℃で実行した(例えば、図28を参照)。ある特定の実施形態において、BNC1及びADAMTS1並びに2つの他の遺伝子について2つの4-プレックス、フォワード鎖のメチル化解析について1つの4-プレックス、並びにリバース鎖のメチル化解析について1つの4-プレックスとして、アッセイを開発した。
MGMTメチル化の検出
O(6)-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)遺伝子は、テモゾロミドのようなアルキル化化学療法の効果を抑制し得るDNA修復酵素をコードする。MGMT遺伝子が活性であるなら、損傷は容易に修復される。悪性グリオーマが、そのプロモーター領域のメチル化に起因して不活性化されたMGMT遺伝子を有し得ると考えられる。メチル化したMGMT遺伝子は、化学療法に応答したBETTER応答の予想指標である(腫瘍は、アルキル化剤により誘導されたDNA損傷を修復するための手段を有しないので)。
BRCA1メチル化の検出
BRCA1は、DNAを修復するのに関与するケアテイカー遺伝子である。BRCA1は、相同組換え、非相同な末端結合、及びヌクレオチド除去修復に関与すると考えられる。異常BRCA1遺伝子を有する女性は、乳癌を発症する80%の確率を有する。
肺癌と関連する遺伝子メチル化の検出
メチル化が肺癌と関連する遺伝子(SOX17、CD01、TAC1)について3つの標的メチル化アッセイを、ACTB対照遺伝子と共に試験した。図34に示すデータは、予想通り、3つの標的は、正常血漿のバックグラウンドにおいて出現しないが、3種の異なる肺癌細胞株においてある程度まで存在することを示す。
Claims (16)
- 核酸のメチル化状態を決定するためのカートリッジのセットであって:
試料を受け取るチャンバー;
第1のマトリックス材料を含むカラム;
温度制御され得るチャネル又はチャンバー;
試料除去チャンバー;並びに
試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバー
を含む第1のカートリッジであって、使用時に、前記チャンバーの少なくとも1つが、変換試薬を含有する、第1のカートリッジ;並びに
試料を受け取るチャンバー;
第2のマトリックス材料を含むカラム;
温度制御され得るチャネル又はチャンバー;並びに
試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバー
を含む第2のカートリッジであって、使用時に、前記チャンバーの少なくとも1つが、脱スルホン化及び/又は溶出試薬を含有する、第2のカートリッジ
を含む、カートリッジのセット。 - 前記変換試薬が、亜硫酸水素アンモニウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、及びDABSOからなる群から選択される化合物を含む、請求項1に記載のカートリッジのセット。
- 前記変換試薬が、亜硫酸酸化を防ぐためのスカベンジャー及び/又は触媒を含む試薬混合物において提供される、請求項1又は2に記載のカートリッジのセット。
- 前記変換試薬が、Trolox及びヒドロキノンからなる群から選択されるスカベンジャーを含む試薬混合物において提供される、請求項3に記載のカートリッジのセット。
- 前記変換試薬が、ポリアミンを触媒として含む試薬混合物において提供される、請求項3又は4に記載のカートリッジのセット。
- 変換試薬が、前記第1のカートリッジ中の前記複数のチャンバーの1つにおいてコンポーネントとして提供される、請求項1から5のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
- 前記第2のカートリッジ中の複数のチャンバーの少なくとも1つのチャンバーが、PCRプライマー、及び/又はPCRプローブ、及び/又はPCRマスターミックスを含有する、請求項1から6のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
- 前記第2のカートリッジ中の複数のチャンバーが、メチル化特異的PCRプライマー、メチル化特異的PCRプローブ、PCR酵素、及びPCR反応バッファーからなる群から選択される1つ又は複数の試薬を含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
- 前記PCRプライマー、及び/又はプローブ、及び/又は酵素が、ビーズとして提供される、請求項8に記載のカートリッジのセット。
- 前記第2のカートリッジが、配列番号2から390に示される1つ又は複数のプライマー、及び/或いは配列番号2から390に示される1つ又は複数のプローブを含有する、請求項1から9のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
- 前記第2のカートリッジが、ネステッドPCR反応を使用してMGMTのメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号:263)を含む外部フォワードプライマー(248b);
ヌクレオチド配列:AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号:265)を含む外部リバースプライマー(249b);
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号:266)を含む内部フォワードプライマー(250);
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号:267)を含む内部リバースプライマー(251);及び
ヌクレオチド配列 蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号:268)を含むプローブ(252a)
を含有する、請求項10に記載のカートリッジのセット。 - 前記第2のカートリッジが、ネステッドPCR反応を使用してACTB(例えば、対照として)のメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号:103)を含む外部フォワードプライマー(102);
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号:104)を含む外部リバースプライマー(103);
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号:149)を含む内部フォワードプライマー(148);
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号:150)を含む内部リバースプライマー(149);及び
ヌクレオチド配列 蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号:179)を含むプローブ(178)
を含有する、請求項10又は11に記載のカートリッジのセット。 - 生物学的試料において核酸のメチル化を決定するためのシステムであって:
1つ又は複数の試料処理モジュールを含有するように構成されたエンクロージャーを含み、それぞれの試料処理モジュールが、請求項1~12のいずれか一項に記載のカートリッジの前記セットの、取り外し可能な第1のカートリッジ及び第2のカートリッジを保持するように構成され;
前記システムが、カートリッジの前記セットの第1のカートリッジを操作して、前記第1のカートリッジに導入された試料において変換試薬による核酸の変換を行うために、試料処理モジュールを操作して試料処理を行うよう、並びに
対応する取り外し可能な試料カートリッジ内の1つ又は複数の標的核酸の脱スルホン化を行うよう、及びメチル化を決定するよう構成される、システム。 - 核酸のメチル化状態を決定する方法であって:
請求項1から12のいずれか一項に記載のカートリッジのセットにおける第1のカートリッジの試料チャンバーにおいて生物学的試料を用意する工程;及び前記第1のカートリッジを操作して、
前記試料中のDNAを前記第1のマトリックス材料に結合させ;
結合したDNAを洗浄し;
結合したDNAをマトリックス材料から溶出し;
溶出したDNAを前記変換試薬と組合せ;
前記温度制御され得るチャネル又はチャンバーにおいてDNAと変換試薬の混合物を加熱して、前記DNAの変換を行い;
変換されたDNAを前記第1のカートリッジの試料除去チャンバーに移す工程;及び、
請求項1から12のいずれか一項に記載のカートリッジのセットにおける第2のカートリッジの試料チャンバーにおいて前記変換されたDNAを用意する工程;及び前記第2のカートリッジを操作して、
前記変換されたDNAを前記第2のマトリックス材料に結合させ;
結合した変換されたDNAを洗浄し;
洗浄された変換されたDNAを前記第2のマトリックス材料から溶出し;
変換されたDNAを脱スルホン化する工程を含む、方法。 - 前記第2のカートリッジを操作して、前記変換されたDNA上でメチル化特異的PCR及び/又は核酸配列決定、及び/又は高分解能融解解析(HRM)を行い、前記DNAのメチル化を決定する工程を含む、請求項14に記載の方法。
- 対象において癌又は癌の素因を検出する方法であって:
前記対象由来の生物学的試料を用意する工程であって、前記生物学的試料はDNAを含む、工程;
請求項1から12のいずれか一項に記載のカートリッジのセットを利用する工程を含み、カートリッジの前記セットの前記第1のカートリッジを使用して、変換試薬による前記DNAの変換が行われ;カートリッジの前記セットの前記第2のカートリッジを使用して、変換されたDNAが脱スルホン化され、メチル化状態が癌についてのマーカーである前記DNAにおける1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化が検出され、前記1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化における増大が、癌若しくは癌の素因の存在又は癌若しくは前癌の段階の指標である、方法。
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