CN101743326A - 筛选核酸中的单核苷酸变异的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了检测核酸中的变异的方法和组合物。所公开的方法对目标核酸序列与对照核酸序列进行比较，以灵敏地识别目标核酸序列和对照核酸序列之间的变异。所公开的方法通常包括切除和替换与其他链杂交的核酸链中的选定核酸。在所述方法中，如果所切除的核苷酸与另一杂交链中的核苷酸错配，那么所述替代核苷酸就不会错配。如果所切除的核苷酸与另一杂交链中的核苷酸不错配，那么所切除的核苷酸就不被替代。这种不同使得可对目标核酸中的变异进行检测。在所述方法的某些形式中，通过用耐核酸酶的核苷酸替代被切除的核苷酸，其中被切除核苷酸被替代的链可耐受核酸酶消化，而其中被切除核苷酸未被替代的链将对核酸酶的消化敏感。在替代被切除核苷酸后，将所述杂交核酸与核酸酶接触，被切除核酸未被替代的链可被所述核酸酶破坏，而被切除核苷酸被替代的链则可被保留。然后可检测剩下的链并注意所述链是否可以经受住核酸酶消化。经受住核酸酶消化的链说明在所述目标核酸中存在变异。

Description

筛选核酸中的单核苷酸变异的方法

相关专利申请的交叉引用

本申请要求以2007年5月14日提交的美国临时申请No.60/917,763作为优先权基础。美国临时申请No.60/917,763的全部内容以援引的方式纳入本文。

背景技术

已经许多药物的效力与基因中的特异突变或多态性联系起来。个性化基因药品的时代已经实现。现在医生正在根据基因信息来开药方。传染病医生基于在从患者身上分离的人类免疫缺陷病毒中发现抗性突变来开治疗AIDS的药物(Rhee SY，et al.Antimicrob Agents Chemother 2004；48(8)：3122-6)。细胞色素p450基因的多态性正被用于确定患者的药物代谢物状态(Ingelman-Sundberg M.Trends Pharmacol Sci 2004；25(4)：193-200)。表皮生长因子受体基因中的突变在10％的非小细胞肺癌患者中激活对药物吉非替尼(gefitinib)的严重临床反应(Lynch TJ，et al.N EnglJMed2004；350(21)：2129-39)。

此外，癌症的早期检测和治疗显著地减少痛苦和死亡。实际上，大多数癌症在及早发现时都是可医治的。对基因组DNA进行分子分析以检测体液中的少量癌症细胞是一种有前途的早期检测癌症的方法。

肿瘤细胞会短暂地流入到邻近的体液中。局部肿瘤的恶性细胞已在血液、痰液、尿液和粪便中被检测到。由于这些体液中存在大大过量的正常细胞，因此灵敏地检出这些稀少的细胞是非常困难的。从这些细胞的正常或野生型DNA产生的分子信号压倒或远超过所述微小的突变部分的信号。

随着人类基因组序列得以阐明，与基因突变相关的疾病数目持续增加。已出现许多技术来正向选择这些微小突变从而可以对其信号进行扩增以超过野生型信号。这些技术可分为两种：检测已知突变的技术和检测未知突变的技术。

对DNA中已知位点处的突变的灵敏检测可用现有技术容易地完成。可设计等位基因特异引物来靶向已知位置的突变，从而使其信号可被优先于野生型DNA扩增。遗憾的是，这对于可发生在目标序列的任何位置(碱基)上的未知突变是不可能的。大多数癌症基因突变都不位于限定位置。Kras基因在癌症中是高度突变的。突变集中发生于热点区的外显子12和13，但也可发生在整个基因中。

核酸测序是检测核苷酸变异的最终标准。核酸测序也适于检测可发生在目标核酸节段内任何碱基处的未知突变或多态性。最常用的方法酶法DNA测序的化学自从其概念产生开始本质上一直相同(Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74，5463(1977))。然而，其在费用、读出长度和突变检测方面具有限制。该领域已经通过可实现其自动化的技术(如荧光染料、机器人技术和自动检测的电泳系统的引入)而得以提高。然而，如果基因变异在样本群中以低频率发生，自动化所需的花费对大多数实验室来说都太高。即使在手工模式下，测序也是非常昂贵的因为其是劳动密集的。这限制了它作为检测工具的广泛应用，尤其是当所述变异在待测样本群中以低频率发生时。此外，读出长度受到电泳分离分辨能力的限制。用DNA测序检测突变不总是明显的，尤其是突变与野生型序列相比少于20％时。

DNA微阵列，也称为基因芯片和寡核苷酸微阵列，在检测已知和未知变异中都逐渐获得更多的主流应用(Hacia JG.Nat Genet 1999；21(1Suppl)：42-7)。它们特别适于对通常来自少数个体的特定基因序列的高密度分析。然而，由于高昂的设备和生产花费，其不适于对未知变异的大批量筛选。芯片在检测插入和缺失突变上也是非常低效的。还成问题的是，通过加入寡核苷酸来检测这些突变会使芯片的复杂度增到2-4倍。此外，如同测序一样，微阵列没有足够的灵敏度来检测可能以微小比例存在于大量野生型DNA中的突变。因此，对与药物效力有关的基因变异的发现和检测受到现有技术的不足所阻碍。因此本领域中需要简单经济的方法来在测序前筛选核苷酸中的未知变异核酸。

发明内容

本文公开的方法涉及检测核酸中核苷酸变异的领域。应理解并且本文涵盖，本文公开的方法允许在存在过量正常DNA的情况下对稀有突变的快速和灵敏检测，所述稀有突变包括包含单核苷酸变异的突变。

本文公开了检测核酸中变异的方法和组合物。所公开的方法对目标核酸序列与对照核酸序列进行比较，以灵敏地识别目标核酸序列和对照核酸序列之间的变异。所公开的方法通常包括在与其他链杂交的核酸链中切除和替代选定核酸。杂交核酸中的核酸链之一为目标核酸或源自目标核酸，杂交核酸中的另一核酸链为对照核酸或源自对照核酸。此安排使得可对所述目标核酸序列与所述对照核酸序列进行比较。在所述方法中，如果所切除的核苷酸与另一杂交链中的核苷酸错配，那么所述替代核苷酸就不会错配。如果所切除的核苷酸与另一杂交链中的核苷酸不错配，那么所切除的核苷酸就不被替代。这种不同使得可对目标核酸中的变异进行检测。

在本方法的某些形式中，通过用耐核酸酶核苷酸替代被切除的核苷酸，其中切除的核苷酸被替代的链会耐核酸酶消化，而其中所切除核苷酸未被替代的链会对核酸酶消化敏感。通过在替代所切除核苷酸后将所述杂交核酸与核酸酶接触，其中所切除核酸未被替代的链可被所述核酸酶破坏，而其中所切除核苷酸被替代的链则可被保留。然后可检测剩余的链并且注意链是否可以经受住核酸酶消化。经受住核酸酶消化的链说明在目标核酸中存在变异。

在本方法的某些形式中，所切除的核苷酸是已插入从模板核酸产生的核酸链中的被修饰核苷酸。所述模板核酸可为目标核酸或对照核酸。所述被修饰核苷酸可以各种频率插入，但最有用的频率是以平均每条合成链一个被修饰核苷酸的频率插入。通过限制被修饰核苷酸的类型和/或用于所述被修饰核苷酸的碱基的类型可帮助区分含有错配的被切除核苷酸的链和不含错配的被切除核苷酸的链。因此，例如，使用只含有某些类型碱基的被修饰核苷酸意味着核苷酸只会在由用于所述被修饰核苷酸中的碱基类型表征的位置处被切除。这种对可被切除的核苷酸的鉴别的受限制范围使得也限制了对所述替代核苷酸的鉴别。因此，例如，使用含有不同于所述被修饰核苷酸的碱基类型的替代核苷酸，可只使与所述杂交链错配的被修饰核苷酸发生替代。在本方法的特别有用的形式中，可使用含有单一类型碱基的被修饰核苷酸和总共含有三种其他类型碱基的替代核苷酸。这使得当检测到变异时可识别变异的核苷酸的类型。

根据本发明的目的，如本文具体和广泛描述的，本发明的一个方面涉及检测目标核酸内的核苷酸变异的方法，包括以下步骤：(a)从第一种核酸生成一套延伸产物并且使被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中，其中所述被修饰核苷酸包含单一类型的碱基；(b)使所述延伸产物与第二种核酸杂交；(c)使所述杂交核酸与一或多种共同去除所述被修饰核苷酸的试剂接触；(d)在存在三种类型的耐核酸酶核苷酸和不存在碱基类型与所述被修饰核苷酸相同的核苷酸的情况下，将所述杂交核酸与延伸所述延伸产物的第一种酶接触，其中所述三种类型的耐核酸酶核苷酸的每一种都包含不同类型的碱基；(e)将所述杂交核酸与从所述延伸产物的3’末端去除核苷酸的第二种酶接触，其中所述第二种酶不去除所述耐核酸酶核苷酸；(f)在存在核苷酸的情况下，使所述杂交核酸与延伸所述延伸产物的第三种酶接触；(g)区别那些包含耐核酸酶核苷酸的延伸产物和那些不含耐核酸酶核苷酸的延伸产物，其中所述第一种核酸是对照核酸，所述第二种核酸是目标核酸，或者其中所述第一种核酸是目标核酸，所述第二种核酸是对照核酸，从而检测目标核酸中的核苷酸变异。从所述第一种核酸产生的延伸产物可为单链或双链。可在存在含单一类型碱基的被修饰核苷酸的情况下，通过生成所述延伸产物使所述被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中，其中所述延伸产物包含所述被修饰核苷酸。可通过修饰所述延伸产物中的核苷酸以产生所述被修饰核苷酸，从而使所述被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中。所述核苷酸可在所述延伸产物中被选择性地修饰。所述核苷酸可在所述延伸产物中被有限地修饰。所述核苷酸可在所述延伸产物中通过化学修饰、酶法修饰或其组合而被修饰。

所公开的方法和组合物的其他优点将在下文描述中部分地阐述，并可根据下文描述部分理解，或通过实行所公开的方法和组合物而知晓。所公开的方法和组合物的优点将通过所附权利要求中特别指出的元件和组合实现和获得。应理解前文的一般性描述和下文的细节描述都只是为了示例和解释，而不是限制所要求保护的本发明。

附图说明

纳入并成为本说明书一部分的附图，图释了若干所公开方法和组合物的实施方案，并和本文的描述一起用于阐释所公开方法和组合物的原理。

图1示出了5’生物素化的PCR产物在位点特异性缺失尿嘧啶后在同源双链或异源双链DNA上的延伸。用dNTP(全部)、匹配的核苷酸(U)、不匹配的核苷酸(A、C、G)在同源双链或异源双链DNA上进行的TEER。异源双链G泳道中的突变用箭头(＜)标识。

图2示出了在固相微量滴定板上检测所述延伸产物所用的步骤。

图3示出了所公开的应用实时PCR检测的检测方法的实例的示意图。

图4示出了三聚寡核苷酸模型。

具体实施方式

在公开和描述本发明的化合物、组合物、物品、设备和/或方法之前，应理解，除非另外指出，否则它们不限于具体的合成方法或具体的重组生物技术方法，或特定试剂，因为这些当然可能有所变化。还应理解本文所用的术语只是为了描述具体实施方案，而不意欲进行限制。

除非上下文明确地另外指出，否则本说明书和所附权利要求所用的单数形式“a(一个)”、“an(一种)”、“the(该)”包括复数指代对象。因此，例如，“a pharmaceutical carrier(一个药用载体)”的说法包括两个或更多这种载体的混合物，如此类推。

本文的范围可表示为从“大约”一个具体值，和/或到“大约”另一个具体值。当表示了这样一个范围时，另一个实施方案包括从所述一个具体值和/或到另外那个具体值。类似地，当用先行词“大约”近似地表示数值时，应理解为所述具体数值形成另一个实施方案。应进一步理解每个范围的端点明显地既与另一个端点有关，又独立于另一个端点。还应理解本文公开了若干数值，其中除了所述数值自身以外，每个数值还以“大约”该具体数值的形式被公布。例如，如果公开了数值“10”，则也公开了“大约10。”还应理解当公开一个数值时，则也公开了“小于或等于所述数值”，“大于或等于所述数值”和数值之间可能的范围，如本领域技术人员合适地理解的。例如，如果公开了数值“10”，则也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解在整个申请中，以多种不同的形式提供了数据，此数据代表终点和起点，以及所述数据点的任意组合的范围。例如，如果公开了具体数据点“10“和具体数据点15，应理解除了10和15之间以外，还认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15。

在本说明书和随后的权利要求中，会提到若干定义为具有如下含义的术语：

“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，且所述描述包括所述事件或情况发生或不发生的情况。

“引物”是探针的子集，其可支持某种类型的酶反应并且可与目标核酸杂交，从而使所述酶反应得以发生。引物可用本领域可获得的不干扰所述酶反应的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合来制备。

“探针”是能够通常以序列特异方式(例如通过杂交)与目标核酸相互作用的分子。本领域对核酸杂交有良好的理解和并在本文中对其进行了讨论。通常探针可用本领域可获得的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合来制备。

由于测序技术尤其是灵敏度的限制，多年来已经发展了若干筛选未知突变的技术：变性高效液相色谱(dHPLC)(Xiao W，Oefher PJ.HumMutat 2001；17(6)：439-74)、碱基切除序列扫描(BESS)、单链构型多态性(SSCP)(Orita M，et al.Genomics 1989；5(4)：874-9)、异源双链分析(HA)(Nagamine CM，et al.Am J Hum Genet 1989；45(2)：337-9)、构象敏感凝胶电泳(CSGE)(Ganguly A，Prockop DJ.Electrophoresis 1995；16(10)：1830-5；Ganguly A，et al.Proc Natl Acad Sd USA 1993；90(21)：10325-9)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Fodde R，Losekoot M.Hum Mutat 1994；3(2)：83-94)、恒定变性凝胶电泳(CDGE)(Hovig E，et al.Mutat Res 1991；262(1)：63-71)、时间温度梯度凝胶电泳(TTGE)(Chen TJ，et al.Clin Chem 1999；45(8 Pt1)：1162-7)、错配化学切割(Cotton RG，et al.Proc Natl Acad Sci USA1988；85(12)：4397-401，Novack DE，et al.Proc Natl Acad Sci USA1986；83(3)：586-90)、错配的酶切割(Winter E，et al.Proc Natl Acad Sci USA1985；82(22)：7575-9；Myers RM，et al.Science 1985；230(4731)：1242-6)和错配修复酶(Oldenburg MC，et al.Biotechniques 2000；28(2)：351-7；BabonJJ，et al.Electrophoresis 1999；20(6)：1162-70；Youil R，et al.Genomics1996；32(3)：431-5；Brow MA，et al.J Clin Microbiol 1996；34(12)：3129-37；Lu AL，Hsu IC.Genomics 1992；14(2)：249-55)。这些技术尚未被广泛应用，因为它们具有一种或多种以下限制：费力、难以自动化(低通量)、低灵敏度或难以再现。

从被开发来筛选未知突变的方法的数目可明显看出本领域的这种需要。单链构象多态性(SSCP)通过在非变性凝胶中比较未知样品与已知样品在单链状态下的迁移速率来检测未知样品中的突变，如Orita et al.，Genomics，5：874-879(1989)所公开。核苷酸序列的改变影响DNA分子的二级结构或构象，所述结构或构象可在电泳中改变所述分子的迁移速率。然而，此技术限于小于200bp的小目标，灵敏度有限，并且需要严格的电泳条件来再现。SSCP分析的提高如双脱氧指纹识别，包括单向(Sarkaret al.，Genomics，13：441-443(1992))和双向(Liu et al.，Hum.MoI.Genet.，5：107-114(1996))，和限制性核酸内切酶指纹识别(Liu and Sommer，Biotechniques，18：470-477(1995))可检测跨度在1kb以上的突变，但为简化而牺牲了灵敏度，因为这些方法产生的DNA带的复杂模式使得难以容易地检测突变。

另一种用于筛选核酸中核苷酸变异的方法基于当异源双链分子迁移通过凝胶基质时的差别流动性。在其称为异源双链分析的最简单形式中，一个通常为扩增或PCR产物的未表征的DNA区段与对应的野生型区段混合、加热并缓慢复性，如首先被Nagamine等人(Am.J.Hum.Genet.，45，337-339(1989))所描述的。如果所述未表征的核酸具有与野生型不同的序列，则形成异源双链分子。异源双链分子中的碱基错配改变了其迁移速率，使其可在非变性凝胶中部分地从同源双链中分辨出来。

一种称为变性梯度凝胶电泳(DGGE)的更灵敏方法将异源双链分子置于梯度凝胶中浓度增加的变性剂中，如首先被Fisher和Lerman(Am.J.Hum.Genet.，45，337-339(1989))所描述的。随着所述异源双链分子迁移通过所述变性剂，它们开始解链或变性。在这点上迁移变慢并且不再是线性的。所述解链点略微不同于同源双链分子，使得可部分分辨出异源双链分子。场强、温度和时间的精确控制对获得可重复结果很重要，因此难以连续再现。

用恒定变性凝胶电泳(CDGE)，这些变量的重要性变低因为变性剂的浓度在整个凝胶中都是相同的(Hovig et al.，Mut.Res.，262：63-71(1991))。此技术的明显限制是核酸区段可具有一个以上的解链区域，因此必须运行不同变性剂浓度的分离凝胶。

时间温度梯度凝胶电泳(TTGE)旨在通过逐步增加电泳中的温度来避免此问题，如Borresen等人(Bioradiations，99：12-113(1997))所述。这是一种介于CDGE和温度梯度凝胶电泳之间的杂交技术，其中温度只用作变性因素(Rosenbaum and Riesner，Biophys.Chem.，26：235-246(1987))。然而，如预期的，此技术也难以实施并也难以重现。

最近引入的称为碱基切除序列扫描(BESS)的技术通过避免对单独测序反应的需要来用ddTTP改进了双脱氧指纹识别(Epicentre Technologies，Madison，WI.)。用标记引物和限量的dUTP通过PCR扩增目的目标。扩增后，用尿嘧啶DNA糖基化酶处理所述产物以在尿嘧啶位点切割。然后所述片段的变性凝胶电泳产生几乎等同于双脱氧T测序阶梯(sequencingladder)的阶梯。所述技术可用于筛选最长至1kb的DNA区段中的突变，但受到凝胶电泳的分辨率限制，并且不检测G到C的转变，反之亦然。

另一个最近引入的技术使用一种称为裂解酶的结构特异的核酸内切酶来消化链内结构并产生片段长度多态性(CFLP)，此技术被Brow et al.，J.Clin.Microbiol.，34：3129-3137(1996)所描述。通过变性DNA区段，然后将其快速冷却至消化温度并加入所述酶来建立所述结构。给定区段的折叠模式可通过序列变异来改变，所述变异经过所述酶的消化在变性凝胶上产生独特的条带模式。然而，此技术受到所述凝胶电泳的分辨率和所述方法产生的DNA条带的复杂模式的严重限制，这使得所述技术难以检测突变。

通过对异源双链DNA中的碱基对错配的化学或酶切割来检测突变已被Noack et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83：586-590(1986)、Cotton etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：4394-4401(1988)、Cotton et al.，U.S.Pat.No.5,202,231、(Winter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：7575-7579(1989)、Myers et al.，Science，230：1245-1246(1985))、(Luand Hsu，Genomics，14：249-255(1992)，)和美国专利No.5,698,400所描述。这些技术的许多种都因为切割试剂不能识别所有类型的碱基对错配而受到限制，而其他技术可通过对DNA区段的两条链都进行分析而克服此限制。至今，还未看到这些技术的广泛应用，部分是因为他们需要高毒性试剂并且这些方法难以实施。

将DNA杂交方法小型化到小固体表面上(称为DNA芯片或微阵列)，使得可不用凝胶电泳而进行DNA区段的分析。参见Macevicz的美国专利No.5,002,867、Drmanac的美国专利5,202,231、Lipshutz et al.，Biotechniques，9(3)：442-447(1995)和Chee et al.，Science，274：610-614(1996)。然而，凝胶电泳的分辨率，严格限制了所有前述突变检测技术(包括DNA测序)可分析的DNA区段的大小，并且此过程所用的设备和芯片的高额费用也限制它的广泛应用。

最近，引入和改进了一种用于检测未知突变的称为endoV突变筛选的技术(Pincas H，et al.Nucl.Acid Res 2004；32(19)：e148)。在其改进形式中，其能够分别针对p53和K-ras基因检测以1∶50和1∶100的比例(突变体∶野生型)存在的未知突变。尽管比现有技术有所改进，但其检测倚赖于凝胶电泳并且难以解释。

所公开的方法和组合物通过提供可检测所有可能的碱基变异(包括单碱基替代和多碱基替代、插入和缺失)的方法而提供对这些其他方法所需的改进。这些变异可发生在给定基因座的一个或多个位点上并影响每个位点上的一个或多个核苷酸。第二，作为一种筛选方法，这些方法提供清楚的阳性或阴性结果。第三，此方法不受凝胶电泳的分辨能力限制并因此可分析大小超过1kb的DNA区段。最后，通过避免电泳检测，其非常易于自动化并因此适于高通量检测。

所公开的方法为检测核酸中核苷酸变异的方法。应理解并且本文涵盖，本文公开的方法允许在存在过量正常DNA的情况下，对稀有突变的快速和灵敏检测，所述突变包括但不限于含有单核苷酸变异的突变。因此，例如，本文公开的是检测目标核酸中核苷酸变异的方法，包括如下步骤：

(a)从第一种核酸生成一套延伸产物并且使被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中，其中所述被修饰核苷酸包含单一类型的碱基；

(b)使所述延伸产物与第二种核酸杂交；

(c)使所述杂交核酸与一或多种共同去除所述被修饰核苷酸的试剂接触；

(d)在存在三种类型的耐核酸酶核苷酸和不存在碱基类型与所述被修饰核苷酸相同的核苷酸的情况下，将所述杂交核酸与延伸所述延伸产物的第一种酶接触，其中所述三种类型的耐核酸酶核苷酸的每一种都包含不同类型的碱基；

(e)将所述杂交核酸与从所述延伸产物的3’末端去除核苷酸的第二种酶接触，其中所述第二种酶不去除所述耐核酸酶核苷酸；

(f)在存在核苷酸的情况下，使所述杂交核酸与延伸所述延伸产物的第三种酶接触；

(g)区别那些包含耐核酸酶核苷酸的延伸产物和那些不含耐核酸酶核苷酸的延伸产物，从而检测目标核酸中的核苷酸变异，其中所述第一种核酸是对照核酸，第二种核酸是目标核酸，或者其中所述第一种核酸是目标核酸，所述第二种核酸是对照核酸。从所述第一种核酸产生的延伸产物可为单链或双链。

可在存在含单一类型碱基的被修饰核苷酸的情况下通过例如生成所述延伸产物使所述被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中，其中所述延伸产物包含所述被修饰核苷酸。本方法特别有用的形式是在一个延伸产物链中平均产生一个或几个修饰的核苷酸。所修饰的核苷酸通常可被随机插入从而延伸产物的集合总共在许多、大部分或所有所述被修饰核苷酸可被引入的位置上具有被修饰核苷酸。这使得可对目标核酸中的许多、大部分或所有相关核苷酸位置进行检测。可通过例如修饰所述延伸产物中的核苷酸以产生所述被修饰核苷酸而使所述被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中。例如所述核苷酸可在所述延伸产物中通过化学修饰、酶修饰或其组合而被修饰。实施例3中描述了一个这种实例。已知多种可修饰核苷酸的化学试剂。类似地，已知可修饰核苷酸的酶。可用的修饰使得和/或意图将所修饰的核苷酸从所述延伸链上去除。

所述延伸产物中的核苷酸可选择性地被修饰。选择性地是指只有某些类型的核苷酸和/或某些类型的碱基被修饰或作为修饰目标。最有用的是单一类型碱基被修饰和/或作为修饰目标。所述延伸产物中的核苷酸可被有限地修饰。有限地修饰是指只有部分核苷酸被修饰。例如，当修饰是在例如包含单一类型碱基的核苷酸上选择性地进行时，有限地修饰是指只有部分包含选定类型的碱基的核苷酸被修饰。因此有限地修饰是一种有限反应或操作。通常，有限修饰是通过进行修饰反应或将所述延伸产物暴露于修饰条件下有限的时间或有限条件下完成的，从而只使部分能被修饰的核苷酸被修饰。有限修饰的特别有用的形式在一个延伸产物链中平均产生一个或几个被修饰的核苷酸。核苷酸通常可随机被修饰而使得延伸产物的集合总共在许多、大部分或所有其中核苷酸可被修饰的位置上具有被修饰核苷酸。这使得可对目标核酸中的许多、大部分或所有相关核苷酸位置进行评估。

本文公开的检测核苷酸变异的方法具有许多用途，包括但不限于检测或诊断疾病或病情例如癌症的存在、评估与核苷酸变异有关的疾病或病情的敏感度或风险、监测疾病进程和测定对治疗性处理的敏感度或抵抗。因此，例如，本文公开了包括检测目标核酸中核苷酸变异的用于检测癌症存在的方法，包括如下步骤：

(a)从第一种核酸生成一套延伸产物并使被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中，其中所述被修饰核苷酸包含单一类型的碱基；

(b)使所述延伸产物与第二种核酸杂交；

(c)使所述杂交核酸与一或多种共同去除所述被修饰核苷酸的试剂接触；

(d)在存在三种类型的耐核酸酶核苷酸并且不存在碱基类型与所述被修饰核苷酸相同的核苷酸的情况下，将所述杂交核酸与延伸所述延伸产物的第一种酶接触，其中所述三种类型的耐核酸酶核苷酸的每一种都包含不同类型的碱基；

(e)将所述杂交核酸与从所述延伸产物的3’末端去除核苷酸的第二种酶接触，其中所述第二种酶不去除所述耐核酸酶核苷酸；

(f)在存在核苷酸的情况下，使所述杂交核酸与延伸所述延伸产物的第三种酶接触；

(g)区别那些包含耐核酸酶核苷酸的延伸产物和那些不含耐核酸酶核苷酸的延伸产物，从而检测目标核酸中的核苷酸变异，其中所述第一种核酸是对照核酸，第二种核酸是目标核酸，或者其中所述第一种核酸是目标核酸，第二种核酸是对照核酸，其中所述目标核酸相对所述对照核酸的变异的存在指示癌症的存在。从所述第一种核酸产生的延伸产物可为单链或双链。可在存在含单一类型碱基的被修饰核苷酸的情况下，通过生成所述延伸产物使所述被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中，其中所述延伸产物包含所述被修饰核苷酸。可通过修饰所述延伸产物中的核苷酸以产生所述被修饰核苷酸，而使所述被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中。所述核苷酸可在所述延伸产物中被选择性地修饰。所述核苷酸可在所述延伸产物中被有限地修饰。所述核苷酸可在所述延伸产物中通过化学修饰、酶修饰或其组合而被修饰。

所公开的方法可建立如下情况：其中基本不存在不包含耐核酸酶核苷酸的延伸产物。因此，区分包含耐核酸酶核苷酸的延伸产物与不含耐核酸酶核苷酸的延伸产物的步骤可通过例如仅检测延伸产物的存在而完成。例如，其中耐核酸酶核苷酸不插入延伸产物的样品在耐核酸酶核苷酸的存在下延伸导致所述延伸产物暴露于酶(例如诸如核酸外切酶III的核酸外切酶)而被消化。相反，其中耐核酸酶核苷酸插入延伸产物的样品在耐核酸酶核苷酸的存在下延伸导致所述延伸产物耐受酶(例如核酸外切酶)的消化。应理解第二种酶可包括任何本领域已知的可沿3’到5’方向去除核苷酸的酶。因此，例如，所述酶可为核酸外切酶如核酸外切酶III。本文涵盖可作为第二种酶应用的其他酶包括但不限于Trex I、Trex II、T7和核酸外切酶T。因此，本文公开了其中第二种酶为核酸外切酶的方法。本文还公开了其中第二种酶可为核酸外切酶III的方法。还应理解，在其中酶为沿3’到5’方向消化的核酸外切酶的方法中，在所述延伸产物中所述耐核酸酶核苷酸5’侧的任何核苷酸都会被保护免于被所述酶去除。类似地，其中不含耐核酸酶核苷酸的延伸产物可被所述酶消化。因此，本文公开了如下方法：其中在使用从所述延伸产物的3’末端去除核苷酸的酶之后基本不存在不含耐核酸酶核苷酸的延伸产物，其中区分包含耐核酸酶核苷酸的延伸产物和不含耐核酸酶核苷酸的延伸产物包括检测延伸产物的存在。

本文公开的方法涵盖这样的情况，其中如果耐核酸酶核苷酸插入延伸产物中，那么在核酸酶消化之后只存在延伸产物。“耐核酸酶核苷酸”是指任何耐给定核酸酶的核苷酸。应理解并且本文涵盖，这种“耐核酸酶核苷酸”可为天然的或合成的。应理解，存在许多本领域技术人员已知的这种核苷酸并且任何一种耐核酸酶核苷酸的应用都依赖所用的核酸酶。耐核酸酶核苷酸的实例包括但不限于硫代修饰的脱氧核苷酸和硼烷(borano)修饰的核苷酸。因此，例如，本文公开了其中所述耐核酸酶核苷酸包括α硫代脱氧核苷酸的方法。本文公开了检测核苷酸变异的方法，其中只有当目标核酸存在核苷酸变异时，耐核酸酶核苷酸才在耐核酸酶核苷酸的存在下插入延伸产物中。本文还公开了如下方法，其中基本只有当目标核酸存在核苷酸变异时，耐核酸酶核苷酸才在耐核酸酶核苷酸的存在下插入延伸产物中。

所公开的方法涵盖，作为实行本文所公开步骤的结果，所公开方法的被修饰核苷酸会插入从第一种核酸或以第一种核酸为模板产生的核酸中，其中所述第一种核酸可为目标核酸或对照核酸。本文还涵盖，其中被修饰核苷酸在对应于一个或多个核苷酸变异发生位点的一个或多个位置上的插入会揭示核苷酸变异发生的位点。因此，本文公开了如下方法：其中所述核苷酸变异存在于目标核酸中对应于所述延伸产物中被修饰核苷酸位置的位点上。应理解并且本文涵盖，在所公开的方法中可使用任何数量的本领域技术人员已知的被修饰核苷酸。本领域技术人员将知晓如何确定给定的被修饰核苷酸的合适度。如本文公开的方法中所用的，被修饰核苷酸包括但不限于7，8-二氢-8-氧鸟嘌呤(8-氧鸟嘌呤)、8-氧腺嘌呤、甲酰胺嘧啶鸟嘌呤(fapy-guanine)、甲基甲酰胺嘧啶鸟嘌呤、甲酰胺嘧啶腺嘌呤、黄曲霉毒素B1-甲酰胺嘧啶鸟嘌呤、5-羟基-胞嘧啶、5-羟基-尿嘧啶和开环N-7鸟嘌呤加合物(7-甲基鸟嘌呤)。通常，可选择可用一种或多种试剂选择性地从核酸链上去除的核苷酸作为被修饰核苷酸。去除被修饰核苷酸或修复DNA的可用试剂包括，例如，尿嘧啶DNA糖基化酶、APE I(人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶)、FPG(甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶也称作8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶)、核酸内切酶IV和激酶、Endo III、Endo VIII、hOGGl、T7 Endo I、T4 PDG和afu尿嘧啶DNA糖基化酶。被修饰核苷酸也可经，例如，通过在PCR中随机插入α硫代核苷酸或核糖核苷酸然后化学切割的碱基特异性切割而去除。

选择性去除基本只允许被修饰核苷酸发生选择性替代。这使得可实行所公开方法以识别目标核酸链中变异的核苷酸类型。选择性去除是指基本只有靶向或意欲去除的核苷酸可通过试剂作用被去除。形成选择性去除并不要求全部、大部分或者甚至许多所述被修饰核苷酸被去除。而是不靶向或不意欲去除的核苷酸不被去除就形成选择性去除。通常，被修饰核苷酸的性质和类型和试剂的性质和类型会决定哪些核苷酸被去除。

所公开的检测核苷酸变异的方法可利用试剂来去除被修饰核苷酸。本文涵盖，所述试剂可通过单一试剂的作用或多种试剂的作用去除所述被修饰核苷酸。因此，一种试剂可建立另一种试剂可起作用的条件。例如，一种试剂可去除所述被修饰核苷酸的碱基，提供一个只在待去除核苷酸上切割的核酸内切酶的作用位点。因此，本文公开了其中一种或多种试剂从所述被修饰核苷酸上去除碱基的方法。本领域已知许多可单独或组合用于所公开方法的试剂。本领域技术人员知晓可用于所公开方法的试剂。应理解并且本文涵盖，所述试剂可包括酶如核酸酶和糖基化酶。因此，本文公开了其中所述试剂包括一种核酸内切酶的方法。本文还公开了其中所述一种或多种试剂包括核酸内切酶IV的方法。本文还公开了所述一种或多种试剂包括甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(FPG)的方法。

在本文所公开的方法中，在耐核酸酶核苷酸的存在下所述被修饰核苷酸的去除和延伸产物的延伸可相继或同时进行。

本文公开的方法涵盖，可用酶来去除所述被修饰核苷酸并用标记核苷酸替代它。能够用标记核苷酸替代所述被修饰核苷酸的酶的一个实例是聚合酶。因此，本文公开了其中第一种酶包括聚合酶的方法。应理解，在一个方面，所述聚合酶可为DNA聚合酶。还应理解并且本文公开了，所述聚合酶可为热稳定的。因此，本文公开了第一种酶为热稳定聚合酶的方法。应理解并且本文涵盖，在所公开的方法中可使用任何数量的热稳定聚合酶。因此，例如，第三种酶可包括热测序酶。

应理解并且本文涵盖，本领域技术人员已知区分含耐核酸酶核苷酸的延伸产物和不含耐核酸酶核苷酸的延伸产物的若干方法。如上所述，一种这样的方法是通过仅存在或不存在延伸产物来区分。例如，这可为如下情况：只有含耐核酸酶核苷酸的延伸产物存在并且只有含核苷酸变异的延伸产物才包含耐核酸酶核苷酸。耐核酸酶核苷酸可表示核苷酸变异的存在，因为在所述方法中耐核酸酶核苷酸可替代延伸产物中的被修饰核苷酸，此时所替代核苷酸对应所述变异的位置。

所述延伸产物也可通过PCR被区分。实时PCR(rtPCR)对此特别有用。任何形式的PCR或实时PCR都可配合所公开方法使用。已知并可使用多种PCR形式和方案。例如，PCR可用两种或多种引物调节，其中一种或多种引物包含荧光标记。例如，所述引物可包含荧光变化引物。可将所述引物设计为与存在于所述延伸产物和/或杂交核酸中的特定序列杂交。因此，本文涵盖了如下方法：其中第一种核酸包含一段引物序列，其中包含耐核酸酶核苷酸的延伸产物的至少一部分至少针对第一种核酸中的引物序列延伸。即，所述延伸产物可被延伸从而使与第一种核酸中的引物序列互补的序列存在。然后所述引物的互补序列可用作用于所述延伸产物扩增或复制的引物的引物结合位点。

也可使用核酸和信号扩增的其他形式。通常，PCR或其他扩增方法是从所述待检测的延伸产物中建立和/或增加信号。在所公开方法的某些形式中，包含或不包含标记核苷酸或耐核酸酶核苷酸的延伸产物的不同扩增能力(或检测能力)提供了区分这些延伸产物的基础。

区分延伸产物的另一种方法是通过使用标记核苷酸。例如，本文公开了所述耐核酸酶核苷酸也被标记的方法。因此，例如，本文公开了其中所述延伸产物的延伸将一种或多种标记耐核酸酶核苷酸插入到所述延伸产物中的方法。作为另一个实例，从延伸产物中去除的被修饰核苷酸可被标记核苷酸替代。

还公开了以下方法：其中所述延伸产物被可检测标记标记并且通过进行对所延伸的延伸产物的凝胶电泳来区分所述延伸产物，其中所述电泳的分辨率足以区分未进一步被延伸的标记延伸产物和全长核酸。

应理解并且本文涵盖以下情况的存在：其中需要考虑每种类型的碱基以确定核苷酸突变的存在或区分可能的突变。本文还公开了以下检测核苷酸变异的方法，还包括每次用包含不同类型碱基的不同类型被修饰核苷酸将所述方法的步骤再进行一或多次。还公开了以下方法：其中用四种不同的被修饰核苷酸的每一种进行所述方法至少一次，其中所述四种不同的被修饰核苷酸的每一种包括所述四种不同类型碱基之一。这使得，例如，可在目标核酸中评估或考虑每种类型的碱基。这使得，例如，可在目标核酸中评估或确定任何位置的核苷酸变异和任何同一性(identity)。

本文公开的方法也可与DNA测序技术结合使用以识别所述核苷酸变异的位置。因此本文公开了如下检测核苷酸变异的方法，进一步包括对具有核苷酸变异的延伸产物测序并将该序列与对照序列进行比较，从而特异性地识别第一种核酸中的核苷酸变异。

本文公开的方法可用于检测如下核苷酸变异，其中核苷酸变异是单核苷酸变异。此外，所公开的方法可检测如下核苷酸变异，其中所检测的核苷酸变异是单核苷酸中的核苷酸变异。

本文还公开了检测第一种核酸中核苷酸变异的方法，包括：

(a)从对照核酸生成一套延伸产物并使被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中，其中所述被修饰核苷酸包括单一类型的碱基；

(b)使所述延伸产物与所述第一种核酸杂交；

(c)使所述杂交核酸与一或多种共同去除所述被修饰核苷酸的试剂接触；

(d)在存在三种类型的标记核苷酸并且不存在碱基类型与所述被修饰核苷酸相同的核苷酸的情况下，将所述杂交核酸与延伸所述延伸产物的第一种酶接触，其中所述三种类型的标记核苷酸的每一种都包含不同类型的碱基；并且

(e)区分那些含标记核苷酸的延伸产物和那些不含标记核苷酸的延伸产物，从而检测所述第一种核酸中的核苷酸变异。从所述第一种核酸产生的延伸产物可为单链或双链。可在存在含单一类型碱基的被修饰核苷酸的情况下，通过生成所述延伸产物使所述被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中，其中所述延伸产物插入有被修饰核苷酸。可通过修饰所述延伸产物中的核苷酸以产生所述被修饰核苷酸而使所述被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中。所述核苷酸可在所述延伸产物中被选择性地修饰。所述核苷酸可在所述延伸产物中被有限地修饰。所述核苷酸可在所述延伸产物中通过化学修饰、酶修饰或其组合而被修饰。

所公开的方法利用酶。在本方法中，这些酶行使某些功能，任何可行使所需功能的酶都可被使用。通常，这些功能是广为人知的涉及核酸和核苷酸的反应。许多合适的酶是已知的并可用于催化所需反应，并且这些酶用于这些反应的模式和方法是广为人知的。所公开方法的若个部分需要核酸的延伸。可使用任何可延伸链的核酸聚合酶。可用的聚合酶可基于模板核酸延伸核酸并复制核酸。所述方法中的其他步骤需要去除核苷酸。通常核苷酸去除可使用任何合适的核酸酶来完成。核酸外切酶在所公开方法中特别有用。在所公开方法的某些步骤中，需要去除被修饰核苷酸。酶和/或化学试剂可用于完成此目的，如本文在别处充分描述的。选择性核酸内切酶和核苷酸糖基化酶特别有用。

A.核酸

所公开的方法和组合物利用多种核酸。通常，任何核酸都可用于所公开方法。例如，可基于所需分析以及待获得或评估的信息选择所公开的目标核酸和所公开的对照核酸。所公开的方法也产生新的和改变的核酸。这些核酸的性质和结构会通过其中它们在所述方法中被产生和加工的方式而确定。因此，例如，在所公开方法中产生延伸产物和杂交核酸。如本文所用，杂交核酸是延伸产物和第二种核酸的杂合物。

应理解并且本文涵盖，目标核酸可为任何要测定其中是否存在核苷酸变异的核酸。因此，例如，目标核酸可包括对应于所述对照核酸的野生型序列的序列。本文还公开了，所公开方法可在如下情况下进行：其中第一种核酸是对照核酸且第二种核酸是目标核酸，或者第一种核酸是所述目标核酸且第二种核酸是所述对照核酸。

应理解并且本文涵盖，对照核酸可为任何用于与目标核酸相比较的核酸。通常，所述对照核酸具有已知序列(和/或已知其具有作为对照的目标序列)。尽管不是必需的，但所述对照序列与目标序列具有已知或可能的密切关系是有用的。例如，如果要检测单核苷酸变异，对照序列可选择为与所述目标核酸同源或紧密匹配的序列，如来源于相同或相关的生物体或个体的相同基因或遗传元件的核酸。因此，例如，本文涵盖，所述对照核酸可包括野生型序列或者可包括已知突变，所述突变包括，例如，其存在与否与疾病或对治疗性处理的抵抗有关的突变。因此，例如，本文涵盖所公开的方法可用于通过比较目标核酸与包含野生型序列(即已知不含所述突变)的对照核酸并且检查目标核酸中是否存在变异，来检测或诊断目标核酸中已知突变的存在，其中不存在变异则指示不存在突变。或者，所述对照核酸可具有已知突变。因此，例如，本文涵盖所公开的方法可用于通过比较所述目标核酸和对照核酸并且检查是否存在突变来检测对疾病或病情的易感性，所述对照核酸包含指示疾病易感性的已知突变，其中所述突变的存在指示疾病。

本文中的术语“核苷酸变异”是指目标核酸的核苷酸序列相对于对照核酸的核苷酸序列的任何变化或不同。因此，当所述对照核酸和目标核酸(或其根据上下文合适的互补序列)之间的序列不同时，就说发生了核苷酸变异。因此，例如，如果所述对照核酸在相应位置上包含腺嘌呤(A)，那么核酸特定位置上的腺嘌呤(A)被鸟嘌呤(G)替代就是核苷酸变异。应理解并且本文涵盖，确定变异是基于所述对照核酸并且不指示序列是否为野生型。因此，例如，当用具有已知突变的核酸作为所述对照核酸时，则认为不具有所述突变的核酸(包括野生型核酸)具有核苷酸变异(相对于所述对照核酸)。

B.核苷酸

所公开的方法和组合物利用多种核苷酸。在整个本申请和本文所公开的方法中，提及了核苷酸的碱基类型。应理解并且本文涵盖，提到碱基类型之处是指核酸链中的核苷酸中的碱基能够与一种或多种标准碱基的限定集合杂交(结合)。因此，例如，当提到延伸产物在存在三种类型的耐核酸酶核苷酸和不存在包含与所述被修饰核苷酸相同类型碱基的核苷酸的情况下延伸时，是指如果，例如所述被修饰核苷酸是腺嘌呤(A)，则所述耐核酸酶核苷酸可为，例如鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。这些碱基(指4种标准碱基)的每一种都能够与所述4种标准碱基中不同的一种碱基杂交，并因此每一种都符合本文定义的不同类型的碱基。作为另一个实例，肌苷碱基主要与(DNA中的)腺嘌呤和胞嘧啶配对并因此可被认为是一种与腺嘌呤和胞嘧啶——其分别与胸腺嘧啶和鸟嘌呤配对——不同类型的碱基，但不是一种与鸟嘌呤或胸腺嘧啶——其分别于胞嘧啶和腺嘌呤配对——不同类型的碱基，因为鸟嘌呤和胸腺嘧啶的碱基配对重叠于(即非不同于)肌苷的杂交模式。

任何类型的修饰或改变的碱基都可用于所公开的方法和组合物，所述方法和组合物通常只受到用于这些碱基的酶的能力的限制。许多修饰和改变核苷酸和碱基是已知的，其中一些在下面和本文别处被描述。这些修饰和改变碱基代表的碱基类型可通过如本文所述的该碱基的碱基配对模式确定。因此，例如，如果所述被修饰核苷酸为腺嘌呤，则主要与胸腺嘧啶进行碱基配对的任何类似、衍生、修饰或变种碱基都被认为是与腺嘌呤类型相同的碱基。换言之，只要所述类似、衍生、修饰或变种碱基具有与另一种碱基相同的碱基配对模式，则就可被认为是相同类型的碱基。可对核苷酸的糖或磷酸基团进行修饰。通常这种修饰不会改变所述碱基的碱基配对模式。然而，核酸链中的核苷酸的碱基配对模式决定所述核苷酸中的碱基的类型。

待插入延伸产物中和待用所公开方法中的所公开试剂选择性去除的被修饰核苷酸可为如本文别处所述行使所公开方法中所需功能的任何被修饰核苷酸。也可通过，例如，化学修饰、酶修饰或其组合在已有核酸链如延伸产物中产生被修饰核苷酸。

许多类型的耐核酸酶核苷酸是已知的并可用于所公开方法。例如，具有修饰磷酸基团和/或修饰糖基团的核苷酸可耐受一种或多种核酸酶。核酸酶耐受性在本文中被定义为对由任何一种或多种核酸酶从核酸中去除的抵抗力。通常，特定核苷酸的核酸酶耐受性可根据相关核酸酶来定义。因此，例如，如果特定核酸酶用于所公开方法，所述耐核酸酶核苷酸只需耐受该特定核酸酶。可用的耐核酸酶核苷酸的实例包括硫代修饰的核苷酸和硼烷修饰的核苷酸。

本文公开了多种基于核酸的分子。本文讨论了这些分子和其他分子的非限制性的实例。应理解，例如，核苷酸是一种含有一个碱基、一个糖基和一个磷酸基的分子。核苷酸可通过它们的磷酸基和糖基形成一个核苷间连接从而连接在一起。核苷酸的碱基可为腺嘌吟-9-基(腺嘌吟，A)、胞嘧啶-1-基(胞嘧啶，C)、鸟嘌呤-9-基(鸟嘌呤，G)、尿嘧啶-1-基(尿嘧啶，U)和胸腺嘧啶-1-基(胸腺嘧啶，T)。核苷酸的糖基是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸基是5价磷酸基。一个核苷酸的非限制性实例可为3′-AMP(3′-腺苷一磷酸)或5′-GMP(5′-鸟苷一磷酸)。

核苷酸类似物是一种含有某种类型的碱基、糖基或磷酸基上的修饰的核苷酸。对所述碱基的修饰包括A、C、G和T/U以及不同的嘌呤或嘧啶碱基(如尿嘧啶-5-基(ψ)、次黄嘌呤-9-基(肌苷，I)和2-氨基腺嘌呤-9-基)的天然或人工修饰。修饰碱基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8位替代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴代、5-三氟甲基和其他5位替代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-偶氮鸟嘌呤和8-偶氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他碱基修饰可在例如美国专利No.3,687,808，Englisch et al.，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613和Sanghvi，Y.S.，Chapter 15，Antisense Research and Applications，pages289-302，Crooke，S.T.and Lebleu，B.ed.，CRC Press，1993中找到。某些核苷酸类似物如5位替代的嘧啶、6-偶氮嘧啶和N-2、N-6和O-6替代嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶可增加双链信息的稳定性。碱基修饰经常可与例如糖修饰(如2’-O-甲氧基乙基)结合以获得独特性质，如提高的双链稳定性。若干美国专利如4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；和5,681,941详细说明和描述了多种碱基修饰。这些专利的每一篇都以引用的方式纳入本文中。

核苷酸类似物也可包括所述糖基的修饰。糖基的修饰包括核糖和脱氧核糖的天然修饰以及人工修饰。糖修饰包括但不限于以下2’位置上的修饰。OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可为替代或非替代的C1-C10烷基或C2-C10烯基和炔基。2’糖修饰还包括但不限于-O[(CH₂)nO]mCH₃、-O(CH₂)nOCH₃、-O(CH₂)nNH₂、-O(CH₂)nCH₃、-O(CH₂)n-ONH₂和-O(CH₂)nON[(CH₂)nCH₃)]2，其中n和m为从1到约10。

2’位置上的其他修饰包括但不限于：C1-C10低碳烷基，替代的低碳烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、氯、溴、CN、CF₃、OCF3、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环烷芳基、胺烷胺基、聚烷胺基、替代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、提高寡核苷酸的药代动力学特性的基团和其他具有类似性质的其他取代基。类似修饰也可在所述糖的其他位置上进行，特别是3’末端核苷酸上或2’-5’连接寡核苷酸中的糖的3’位置以及5’末端核苷酸的5′位置。被修饰的糖也可包括在桥环氧原子上包含修饰如CH2和S的糖。核苷酸糖类似物也可含有环丁基替代的戊呋喃糖基的糖模拟物。若干美国专利如4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920教导了这些被修饰糖结构的制备，这些专利的每一篇都以引用的方式整体纳入本文中。

核苷酸类似物也可在所述磷酸基上被修饰。被修饰的磷酸基包括但不限于可被修饰从而使两个核苷酸之间的键连接包含以下基团的磷酸基：硫代磷酸基(phosphorothioate)、手性硫代磷酸基、二硫代磷酸基、磷酸三基(phosphotriester)、氨基烷基磷酸三基、甲基和其他烷基膦酸基包括3′-烷撑膦酸基和手性膦酸基、磷酸基(phosphinate)、氨基磷酸基包括3′-氨基磷酸基和氨基烷基氨基磷酸基、硫羰氨基磷酸基(thionophosphoramidates)、硫羰烷基膦酸基(thionoalkylphosphonates)、硫羰烷基膦酸三基(thionoalkylphosphotriesters)和硼烷磷酸基(boranophosphates)。应理解，两个核苷酸之间的这些磷酸基或被修饰磷酸基键可为3’-5’键或2’-5’键，并且所述键可包含反向极性如3′-5′到5′-3′或2′-5′到5′-2′。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。包括但不限于3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361和5,625,050的若干美国专利教导了如何制备和使用包含被修饰磷酸基的核苷酸，这些专利的每一篇都以引用的方式整体纳入本文中。

应理解，核苷酸类似物只需要包含单个修饰，但也可包含所述基团之一内的或不同基团之间的多个修饰。

核苷酸替代物是具有与核苷酸类似的功能性质的分子，但其不含有磷酸基，如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物是以Watson-Crick或Hoogsteen方式识别核酸的分子，但其通过一个不是磷酸基的基团连接在一起。核苷酸替代物与合适的目标核酸分子相互作用时能形成双螺旋型结构。

核苷酸替代物是其中磷酸基和/或糖基被替代的核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸替代物不含标准磷原子。磷酸基的替代物可为，例如，短链烷基或环烷基核苷酸间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷酸间键，或一种或多种短链杂原子或杂环核苷酸间键。这些包括具有吗啉键(从核苷的糖部分部分地形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸基骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸基和氨磺酰骨架；酰胺基骨架；以及其他具有混合N、O、S和CH2组分的那些。包括但不限于5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439的若干美国专利教导了如何制备和使用这些类型的磷酸替代，这些专利的每一篇都以引用的方式纳入本文中。

应理解，在核苷酸替代物中，所述核苷酸的糖和磷酸基都可被例如酰胺类的键(氨基乙基甘氨酸)(PNA)替代。美国专利5,539,082、5,714,331和5,719,262教导了如何制备和使用PNA分子，这些专利的每一篇都以引用的方式纳入本文中(也参见Nielsen et al.，Science，1991，254，1497-1500。)。

其他类型的分子(共轭物)也可能连接到核苷酸或核苷酸类似物上。共轭物可化学连接到所述核苷酸或核苷酸类似物。这些共轭物包括但不限于脂质基团如胆固醇基团(Letsinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)、胆酸(Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1994，4，1053-1060)、硫醚如己基-S-三苯甲硫醇(Manoharan et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)、硫代胆固醇(Oberhauser et al.，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)、脂肪族链如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.，EMBO J.，1991，10，1111-1118；Kabanov et al.，FEBS Lett.，1990，259，327-330；Svinarchuk et al.，Biochimie，1993，75，49-54)、磷脂如双十六烷基-rac-甘油或1，2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸三乙基铵(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea et al.，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.，Nucleosides&Nucleotides，1995，14，969-973)或金刚烷乙酸(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)、棕榈酰基(Mishra et al.，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)，或者十八胺或己基氨基-羰基-氧代胆固醇基团(Crooke et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923-937)。包括但不限于4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717，5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241，5,391,723、5,416,203，5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941的若干美国专利教导了这些共轭物的制备，这些专利的每一篇都以引用的方式纳入本文中。

Watson-Crick相互作用是与核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的Watson-Crick面的至少一种相互作用。核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的Watson-Crick面包括嘌呤基的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的C2、Nl和C6位和嘧啶基的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的C2、N3和C4位。

Hoogsteen相互作用是发生在核苷酸或核苷酸类似物的Hoogsteen面上的相互作用，其裸露于双链DNA的大沟中。Hoogsteen面包括嘌呤核苷酸的N7位和在C6位的反应基团(NH2或O)。

C.引物和探针

本文公开了包含引物和探针的组合物，所述引物和探针能够与所公开的核酸如本文公开的三聚寡核苷酸模型相互作用。在某些实施方案中，所述引物用于支持核酸延伸反应、核酸复制反应和/或核酸扩增反应。通常所述引物能够以序列特异的方式延伸。引物以序列特异的方式延伸包括任何以下方法：其中与引物杂交或关联的核酸分子的序列和/或组成指导或影响由所述引物的延伸产生的产物的组成或序列。因此引物以序列特异的方式延伸包括但不限于：PCR、DNA测序、DNA延伸、DNA聚合、RNA转录或反转录。以序列特异的方式扩增引物的技术和条件是优选的。在某些实施方案中，所述引物用于DNA扩增反应，如PCR或直接测序。应理解，在某些实施方案中，也可用非酶学技术延伸所述引物，其中例如，用于延伸所述引物的核苷酸或寡核苷酸被修饰从而它们发生化学反应以按照序列特异的方式延伸所述引物。通常所公开的引物与所公开的核酸或所述核酸的区域杂交，或者它们与所述核酸的互补链或所述核酸的区域的互补链杂交。作为引物应用的实例，一种或多种引物可用于从第一种核酸和以其为模板创建延伸产物。

与核酸相互作用的引物或探针的大小可为支持所述引物所需酶反应如DNA扩增或所述探针或引物简单杂交的任何大小。典型的引物或探针长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸。

在另一个实施方案中，引物或探针的长度可小于或等于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸。

目标核酸的引物通常可用于产生含有目标核酸区域的延伸产物和/或其他复制或扩增产物。所述产物的大小可使其大小被精确确定在3、2或1个核苷酸之内。

在某些实施方案中，所述产物的长度可为，例如，至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸。

在其他实施方案中，所述产物的长度可为，例如，小于或等于20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸

1.荧光变化探针和引物

荧光变化探针和荧光变化引物是指涉及荧光密度或波长变化的所有探针和引物，所述变化基于所述探针或引物以及要检测、分析或复制核酸的形式或构造的变化。荧光变化探针和引物的实例包括分子信标、Amplifluor、FRET探针、可切割FRET探针、TaqMan探针、蝎型引物、包括但不限于三聚分子信标或三聚FRET探针的荧光三聚寡核苷酸、荧光水溶性共轭聚合物、PNA探针和QPNA探针。

荧光变化探针和引物可根据它们的结构和/或功能分类。荧光变化探针包括发夹淬灭探针、切割淬灭探针、切割激活探针和荧光激活探针。荧光变化引物包括茎淬灭引物和发夹淬灭引物。Schweitzer and Kingsmore，Curr.Opin.Biotech.12：21-27(2001)中对几类荧光变化探针和引物的使用进行了综述。Hall et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：8272-8277(2000)描述了在Invader检验中使用荧光变化探针。

发夹淬灭探针是如下探针：当所述探针不与目标序列结合时就形成一个使荧光标记和淬灭基团接近的发夹结构(并且通常是一个环)从而使所述标记发出的荧光淬灭。当所述探针与目标序列结合时，所述茎被中断，所述淬灭基团不再与所述荧光标记接近，从而使荧光增加。发夹淬灭探针的实例是分子信标、荧光三聚寡核苷酸、三聚分子信标、三聚FRET探针和QPNA探针。

切割激活探针是所述探针的切割可使荧光增加的探针。切割激活探针可包含彼此接近的荧光标记和淬灭基团从而使所述标记发出的荧光淬灭。当所述探针被切断或消化(通常是用扩增过程中被聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性)时，所述淬灭基团就不再与所述荧光标记接近，从而使荧光增加。TaqMan探针(Holland et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7276-7280(1991))是切割激活探针的一个实例。

切割淬灭探针是所述探针的切割可使荧光减少或改变的探针。切割淬灭探针可包含受体荧光标记和供体基团从而当所述受体和供体接近时，荧光共振能量从所述供体转移到所述受体，使所述受体发出荧光。因此，例如，所述探针当与目标序列杂交时发出荧光。当所述探针被切断或消化(通常是用扩增过程中被聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性)时，所述供体基团就不再与所述受体荧光标记接近，从而使所述受体发出的荧光减少。如果所述供体基团自身是荧光标记，那么它可在不与受体接近时以荧光的形式(通常与所述受体荧光的波长不同)释放能量。因此综合效果为受体荧光的减少和供体荧光的增加。对于切割淬灭探针的供体荧光等价于带有作为淬灭基团的受体和作为荧光标记的供体的切割激活探针所产生的荧光。可切割FRET(荧光共振能量转移)探针是切割淬灭探针的实例。

荧光激活探针是以下探针或探针对：其中荧光被探针与目标序列的杂交增加或改变。荧光激活探针可包括受体荧光标记和供体基团从而当所述受体和供体接近时(当所述探针与目标序列杂交时)，荧光共振能量从所述供体转移到所述受体，使所述受体发出荧光。荧光激活探针通常是旨在与邻近的序列杂交从而使所述受体和供体接近的探针。荧光激活探针也可为既含有供体又含有受体的单一探针，其中当所述探针不与目标序列杂交时所述供体不与受体接近，但当所述探针与目标序列杂交时，所述供体与受体接近。这可，例如，通过将所述供体和受体置于所述探针的相反末端并将目标互补序列置于以下探针的每个末端：其中所述目标互补序列与目标序列的邻近序列互补。如果荧光激活探针的供体基团自身是荧光标记，那么当它不与受体接近时(即当所述探针不与所述目标序列杂交时)，则以荧光的形式(通常与所述受体的荧光不同)释放能量。当所述探针与目标序列杂交时，综合效果为供体荧光的减少和受体荧光的增加。FRET探针为荧光激活探针的实例。

茎淬灭引物是如下引物：当所述引物不与互补序列杂交时，则形成一个茎结构(分子内茎结构或分子间茎结构)以使得使荧光标记和淬灭基团接近从而使所述标记发出的荧光淬灭。当所述引物与互补序列结合时，所述茎被中断，所述淬灭基团不再与所述荧光标记接近并且荧光增加。在所公开的方法中，茎淬灭引物被用作核酸合成的引物并因此插入所合成或扩增的核酸中。茎淬灭引物的实例为肽核酸淬灭引物和发夹淬灭引物。

肽核酸淬灭引物是与肽核酸淬灭剂或肽核酸荧光剂发生联系以形成茎结构的引物。所述引物含有荧光标记或淬灭基团，并分别与肽核酸淬灭剂或肽核酸荧光剂发生联系。这使所述荧光标记与所述淬灭基团接近。当所述引物被复制时，所述肽核酸被置换，因此使所述荧光标记可产生荧光信号。

发夹淬灭引物是如下引物：当所述引物不与互补序列杂交时就形成一个使荧光标记和淬灭基团接近的发夹结构(并且通常是一个环)从而使所述标记发出的荧光淬灭。当所述引物与互补序列结合时，所述茎被中断，所述淬灭基团不再与所述荧光标记接近并且荧光增加。发夹淬灭引物通常被用作核酸合成的引物并因此插入所合成或扩增的核酸中。发夹淬灭引物的实例为Amplifluor引物(Nazerenko et al.，Nucleic Acids Res.25：2516-2521(1997))和蝎型引物(Thelwell et al.，Nucleic Acids Res.28(19)：3752-3761(2000))。

切割激活引物类似于切割激活探针，除了它们是插入复制链并继而被切割的引物之外。Little et al.，Clin.Chem.45：777-784(1999)描述了切割激活引物的应用。

D.标记

为帮助检测和定量用所公开方法产生的核酸，标记可直接插入核苷酸和核酸中或可与检测分子如探针和引物连接。如本文所用，标签是可直接或间接与核苷酸或核酸联系并且直接或间接产生可测量、可检测信号的任何分子。本领域技术人员已知许多这些插入核苷酸和核酸或者与核酸探针偶联的标记。适用于所公开方法的标记的实例为放射性同位素、荧光分子、磷光分子、酶、抗体和配体。荧光标记，尤其是对于荧光变化探针和引物的荧光标记，可用于扩增的实时检测。

合适的荧光标记的实例包括荧光素异硫氰酸盐(FITC)、5，6-羧甲基荧光素、德克萨斯红、硝基苯-2-氧杂-1，3-重氮-4-基(NBD)、香豆素、丹磺酰氯、若丹明、氨基甲基香豆素(AMCA)、曙红(Eosin)、赤藓红(Erythrosin)、

Cascade

Oregon

芘、丽丝胺(lissamine)、叶黄素(xanthenes)、吖啶、嗪、藻红素(phycoerythrin)、镧系元素离子的大环螯合物如quantum dye^TM、荧光能量转移染料如噻唑橙-乙锭异二聚体以及花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。其他特异性荧光标记的实例包括3-羟基芘5，8，10-三磺酸、5-羟色胺(5-HT)、酸性品红、茜素氨羧络合剂、茜素红、别藻蓝蛋白、氨基香豆素、硬脂酸蒽酰、Astrazon Brilliant Red 4G、Astrazon Orange R、Astrazon Red 6B、Astrazon Yellow 7 GLL、阿的平(Atabrine)、金胺槐黄(Auramine)、Aurophosphine、Aurophosphine G、BAO 9(双氨苯基恶二唑)、BCECF、硫酸黄连素、二苯甲酰胺、Blancophor FFG溶液、Blancophor SV、BodipyFl、Brilliant Sulphoflavin FF、Calcien Blue、Calcium Green、CalcofluorRW溶液、Calcofluor White、Calcophor White ABT溶液、CalcophorWhite标准溶液、Carbostyryl、Cascade Yellow、Catecholamine、Chinacrine、Coriphosphine O、Coumarin-Phalloidin、CY3.18、CY5.18、CY7、Dans(1-二甲基氨基萘-5-磺酸)、Dansa(二氨基萘磺酸)、丹酰NH-CH3、二氨苯基恶二唑(Diamino Phenyl Oxydiazole，DAO)、二甲基氨基-5-磺酸、二氟硼二吡咯(Dipyrrometheneboron Difluoride)、二苯基亮黄素7GFF、多巴胺、赤藓红ITC、Euchrysin、FIF(甲醛诱发荧光)、Flazo Orange、Fluo 3、荧光胺、Fura-2、Genacryl Brilliant Red B、GenacrylBrilliant Yellow 10GF、Genacryl Pink 3G、Genacryl Yellow 5GF、GloxalicAcid、Granular Blue、血卟啉(Haematoporphyrin)、Indo-1、Intrawhite Cf液、Leucophor PAF、Leucophor SF、Leucophor WS、丽丝胺若丹明B200(RD200)、Lucifer Yellow CH、Lucifer Yellow VS、Magdala Red、MarinaBlue、Maxilon Brilliant Flavin 10GFF、Maxilon Brilliant Flavin 8GFF、MPS(Methyl Green Pyronine Stilbene)、光神霉素(Mithramycin)、NBD胺、Nitrobenzoxadidole、去甲肾上腺素、核快红、Nuclear Yellow、NylosanBrilliant Flavin E8G、恶二唑、Pacific Blue、副品红(Feulgen)、PhorwiteAR溶液、Phorwite BKL、Phorwite Rev、Phorwite RPA、Phosphine 3R、酞菁、藻红蛋白R、藻红蛋白B、Polyazaindacene Pontochrome Blue Black、卟啉、樱草黄(Primuline)、Procion Yellow、派若宁(Pyronine)、派若宁B、Pyrozal Brilliant Flavin 7GF、喹吖因氮芥(Quinacrine Mustard)、若丹明123、若丹明5GLD、若丹明6G、若丹明B、若丹明B 200、若丹明B Extra、若丹明BB、若丹明BG、若丹明WT、血清素、Sevron Brilliant Red 2B、Sevron Brilliant Red 4G、Sevron Brilliant Red B、Sevron Orange、SevronYellow L、SITS(Primuline)、SITS(Stilbene Isothiosulphonic acid)、芪、Snarf 1、磺基若丹明B Can C、磺基若丹明G Extra、四环素、噻嗪红R、硫磺素S、硫磺素TCN、硫磺素5、Thiolyte、Thiozol Orange、Tinopol CBS、True Blue、Ultralite、荧光素钠B、Uvitex SFC、二甲苯橙(Xylene Orange)和XRITC。

优选的荧光标记是荧光素(5-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯)、若丹明(5，6-四甲基若丹明)以及花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。这些荧光剂的吸收和发射最大值分别为：FITC(490nm；520nm)、Cy3(554nm；568nm)、Cy3.5(581nm；588nm)、Cy5(652nm：672nm)、Cy5.5(682nm；703nm)饥饿Cy7(755nm；778nm)，因此允许对它们同时检测。荧光素的其他实例包括6-羧基荧光素(6-FAM)、2′，4′，1，4，-四氯荧光素(TET)、2′，4′，5′，7′，1，4-六氯荧光素(HEX)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基若丹明(JOE)，2′-氯-5′-氟-7′，8′-融合苯基-1，4-二氯-6-羧基荧光素(NED)和2′-氯-7′-苯基-1，4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)。荧光标记可从多种商业来源获得，包括Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ、MolecularProbes，Eugene，OR和Research Organics，Cleveland，Ohio。

其他感兴趣的标记包括只有当所述标记连接的探针特异性结合于目标分子时才发出信号的标记，其中所述标记包括：如Tyagi&Kramer，Nature Biotechnology(1996)14：303和EP 0 070 685 Bl所述的“分子信标”。其他感兴趣的标记包括在美国专利No.5,563,037；WO 97/17471和WO 97/17076中描述的标记。

被标记核苷酸是标记的优选形式，因为它们可在合成过程中直接插入所述扩增产物。可插入述扩增核酸的标记的实例包括核苷酸类似物如BrdUrd(5-溴脱氧尿苷，Hoy and Schimke，Mutation Research 290：217-230(1993))、氨基烯丙基脱氧尿苷(aminoallyldeoxyuridine)(Henegariu et al，Nature Biotechnology 18：345-348(2000))、5-甲基胞嘧啶(Sano et al.，Biochim.Biophys.Acta 951：157-165(1988))、溴尿苷(Wansick et al.，J.Cell Biology 122：283-293(1993))以及用生物素修饰的核苷酸(Langer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：6633(1981))或合适的半抗原如地高辛(Kerkhof，Anal.Biochem.205：359-364(1992))修饰的核苷酸。合适的荧光标记的核苷酸为荧光素-异硫氰酸-dUTP、青色素-3-dUTP和青色素-5-dUTP(Yu et al.，Nucleic Acids Res.，22：3226-3232(1994))。一种优选的用于DNA的核苷酸类似物标记为BrdUrd(溴脱氧脲苷、BrdUrd、BrdU、BUdR，Sigma-Aldrich Co)。其他优选的用于将标记插入DNA的核苷酸类似物为AA-dUTP(氨基5-烯丙基脱氧尿苷三磷酸Sigma-Aldrich Co.)和5-甲基-dCTP(Roche Molecular Biochemicals)。一种优选的用于将标记插入RNA的核苷酸类似物为生物素-16-UTP(生物素-16-尿嘧啶-5′-三磷酸，Roche Molecular Biochemicals)。荧光素、Cy3和Cy5可与dUTP连接以直接标记。Cy3.5和Cy7可作为抗生物素蛋白或抗地高辛共轭物用于生物素或地高辛标记探针的二级检测。

插入扩增核酸的标记(如生物素)随后可用本领域众所周知的灵敏方法检测出来。例如，生物素可用链生物素-碱性磷酸酶共轭物(Tropix，Inc.)检测，所述共轭物与所述生物素结合并随后被合适底物(例如，化学发光底物CSPD：3-(4-甲氧螺-[1，2，-二氧杂环丁烷-3-2′-(5′-氯)三环[3.3.1.1^3，7]癸烷]-4-基)苯基磷酸二钠；Tropix，Inc.)的化学荧光检测出来。标记也可为酶，如碱性磷酸酶、大豆过氧化物酶、辣根过氧化物酶和聚合酶，它们可通过化学信号扩增或使用产生光或荧光信号的所述酶的底物(例如，化学发光1，2-二氧杂环丁烷底物)检测。

两种或更多种这些标记结合形成的分子也可作为标记。任何已知标记都可与所公开的探针、标签和方法配合使用以标记和检测用所公开方法扩增的核酸。本领域技术人员也知晓检测和测量由标记产生的信号的方法。例如，放射性同位素可通过闪烁计数或直接成像检测；荧光分子可用荧光分光光度计检测；磷光分子可用分光光度计或用相机直接成像检测；酶可通过由所述酶催化的反应的产物的检测或成像检测；抗体可通过检测与所述抗体偶联的二级标记检测。如本文所用，检测分子是与扩增核酸相互作用并与一种或多种标记偶联的分子。

E.序列相似性

应理解，如本文所讨论，使用的术语同源性和同一性等同于相似性。因此，例如，如果在两个非天然序列之间使用同源性一词，那么应理解这不必然说明这两个序列之间的进化关系，而是着眼于它们的核酸序列之间的相似性或相关性。许多测定两个进化相关的分子之间同源性的方法可例行用于任何两个或多个核酸或蛋白，以测量序列相似性而不管它们是否是进化相关的。

通常，应理解一种定义本文所公开的基因和蛋白的任何已知的或可能出现的变种和衍生物的方法，是通过根据与具体已知序列的同源性来定义所述变种和衍生物。本文所公开的具体序列的同一性也在本文别处进行了讨论。通常，本文所公布基因和蛋白的变种通常与所述序列或天然序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。本领域技术人员容易理解如何确定两个蛋白或核酸(如基因)的同源性。例如，可在排列两个序列使其同源性处于其最高水平之后计算同源性。

另一种计算同源性的方法可利用公开的算法进行。用于比较的序列最优比对可通过以下算法进行：Smith and Waterman Adv.Appl.Math.2：482(1981)的本地同源性算法；Needleman and Wunsch，J.MoL Biol.48：443(1970)的同源性比对算法；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.85：2444(1988)的查找相似性方法；这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI中的GAP，BESTFIT，FASTA，and TFASTA)或者观察。

可通过，例如，Zuker，M.Science 244：48-52，1989，Jaeger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7706-7710，1989，Jaeger et al Methods Enzymol.183：281-306，1989中公开的算法获得相同类型的核酸同源性，所述文献中至少与核酸比对有关的内容以引用的方式纳入本文中。应理解，通常可使用所述方法的任何一种，在某些情况下，这些不同方法的结果可能不同，但本领域技术人员理解如果用这些方法中的至少一种发现了同一性，所述序列就可称为具有所述同一性并被本文公开。

例如，如本文所用，一个称为与另一序列具有特定百分比同源性的序列是指具有通过上述计算方法的一种或多种计算的所述同源性的序列。例如，如本文所定义，如果用Zuker计算方法计算出第一个序列与第二个序列具有80％同源性，则所述第一个序列就与所述第二个序列具有80％同源性，即使用任何其他计算方法计算出所述第一个序列与所述第二个序列没有80％同源性。作为另一个实例，如本文所定义，如果用Zuker计算方法和Pearson and Lipman计算方法都计算出第一个序列与第二个序列具有80％同源性，则所述第一个序列就与所述第二个序列具有80％同源性，即使用Smith and Waterman计算方法、Needleman and Wunsch计算方法、Jaeger计算方法或任何其他计算方法计算出所述第一个序列与所述第二个序列没有80％同源性。作为另一个实例，如本文所定义，如果用每一种计算方法都计算出第一个序列与第二个序列具有80％同源性(尽管，在实践中，不同的计算方法经常会计算得到不同的同源性百分比)，则所述第一个序列就与所述第二个序列具有80％同源性。

F.杂交/选择性杂交

术语杂交通常是指一种序列驱动的至少两个核酸分子如一个引物或一个探针和一个基因之间的相互作用。序列驱动的相互作用是指一种两个核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸衍生物之间以核苷酸特异的方式发生的相互作用。例如，G与C相互作用或A与T相互作用是序列驱动的相互作用。通常序列驱动的相互作用发生在核苷酸的Watson-Crick面或Hoogsteen面。两种核酸的杂交受本领域技术人员所知的若干条件和参数影响。例如，所述反应的盐浓度、pH和温度都影响两种核酸分子是否杂交。

两种核酸分子之间的选择性杂交的参数对本领域技术人员是众所周知的。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件可被定义为严格杂交条件。例如，杂交的严格性由杂交和/或洗涤步骤中的温度和盐浓度所控制。例如，实现选择性杂交的杂交条件可包括在比Tm(解链温度，此时一半分子与其杂交对象解链)低约12-25℃的温度下在高离子强度溶液(6XSSC或6X SSPE)中杂交，然后在选定温度和盐浓度的组合下洗涤从而使所述洗涤温度比Tm低约5-20℃。所述温度和盐条件容易在初步实验中凭经验确定，在所述初步实验中固定在滤膜上的对照DNA样品与被标记的目标核酸杂交，然后在不同严格度的条件下洗涤。DNA-RNA和RNA-RNA杂交的杂交温度通常更高。可用如上所述或本领域已知的条件以实现严格性。(Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989；Kunkel et al.Methods Enzymol.1987：154：367，1987，此文献中关于核酸杂交的内容以引入的方式纳入本文中)。优选的DNA:DNA杂交的严格杂交条件可为在6X SSC或6X SSPE的水溶液中在68℃下杂交，然后在68℃下洗涤。杂交和洗涤的严格性，如果需要，可随所需互补性程度的降低而降低，并且还取决于查找变异性的任何区域的G-C或A-T的富集程度。类似地，杂交和洗涤的严格性，如果需要，可随所需同源性的增加而增加，并且还取决于需要高同源性的任何区域的G-C或A-T的富集程度，这些都如本领域所知的。

限定选择性杂交的另一种方法是观察所述核酸之一与另外一种核酸结合的量(百分比)。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件是，当至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的有限核酸与无限核酸结合时的条件。通常，所述无限引物为，例如，10或100或1000倍过量。这种类型的试验可在所述有限和无限引物都，例如，比其k_d低10或100或1000倍的条件下，或者在只有一种所述核酸分子比其k_d低10或100或1000倍的条件下，或者在一或两种核酸分子比其k_d高的条件下进行。

另一种限制选择性杂交的方法是通过查找在需要杂交促进所需酶反应的条件下进行酶反应的引物的百分比。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件是，当至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的所述引物在促进酶反应的条件下进行所述酶反应时的条件，例如，如果所述酶反应是DNA延伸，则选择性杂交条件是当至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的所述引物分子被延伸时的条件。优选的条件也包括那些由厂商建议的或本领域中已知的对所述酶进行所述反应合适的条件。

与同源性一样，应理解本文公开了多种用于测定两种核酸分子之间的杂交水平的方法。应理解，这些方法和条件可在两种核酸分子之间得到不同的杂交百分比，但除非另外指出，满足任何所述方法的参数都是足够的。例如，如果需要80％杂交，并且只要杂交在这些方法中的任何一种所需的参数内发生，那么就被认为是被本文公开的。

应理解，本领域技术人员理解如果一个组合物或方法满足用于一起或单独测定杂交的这些标准的任何一个，那么它就是被本文公开的组合物或方法。

G.试剂盒

本文公开了包含可用于实行本文所公开方法的试剂的试剂盒。所述试剂盒可包含本文讨论的任何试剂或试剂组合，或可理解的实施所公开方法时必需的或有益的试剂或试剂组合。例如，所述试剂盒可包括引物以进行所述方法的某些实施方案中讨论的延伸、复制和扩增反应，以及按照目的使用所述引物所需的缓冲液和酶。其他试剂可包括被被修饰核苷酸、耐核酸酶核苷酸和/或被标记核苷酸。所述试剂盒还可包含一种或多种所述试剂和/或酶以用于所公开的方法。

除非另外指出，本文公开的组合物和实行所公开方法必需的组合物可用任何本领域技术人员已知的用于该特定试剂或化合物的方法制备。

H.核酸合成

所公开的核酸如要用做引物的寡核苷酸可用标准化学合成方法制备或可用酶法或任何其他已知方法制备。这些方法可包括从标准酶消化后分离核苷酸片段(参见，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)Chapters 5，6)到纯粹的合成方法，例如，通过使用Milligen或Beckman System lPlus DNA合成器(例如Milligen-Biosearch，Burlington，MA的8700型自动合成器或ABI38OB型合成器)的氰乙基亚磷酰胺法。用于制备寡核苷酸的合成方法也在Ikuta et al.，Ann.Rev.Biochem.53：323-356(1984)，(磷酸三酯和亚磷酸三酯法)和Naranget al.，Methods Enzymol.，65：610-620(1980)(磷酸三酯法)中被描述。蛋白核酸分子可使用已知方法制备，如在Nielsen et al.，Bioconjug.Chem.5：3-7(1994)中所描述的方法。

实施例

给出下列实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制备和评估本文所要求保护的化合物、组合物、物品、设备和/或方法的完整公开和描述，完全是出于例示的目的而非意图限制本公开。本文已努力保证数字(如量、温度等)的精确性，但应考虑到某些误差和偏差。除非另外指出，份数为重量份数，温度以℃表示或为环境温度，并且压力为大气压或接近大气压。

A.实施例1：模板交换延伸反应(TEER)

模板交换延伸反应(TEER)是指可比较未知或未测序核酸模板与已测序模板以确定它们是否相同的一类方法。这种方法是基于测序产物对于用于生成它们的模板是唯一的。所公开的方法和组合物包括TEER的特定形式。图1示出了5’生物素化的PCR产物在位点特异性除去尿嘧啶后在同源双链或异源双链DNA上的延伸。将与正常dNTP相比较少量的dUTP用于PCR以生成含尿嘧啶的扩增子的子集，尿嘧啶代表胸腺嘧啶在所述序列中的每次出现。这基本上是缺少末端ddT的双脱氧T测序阶梯。用(全部)4种dNTP的延伸显示如何容易地将切割产物延伸至全长。用ddUTP(U)的延伸将所述阶梯延伸出一个匹配的或野生型的核苷酸。用ddGTP(G)、ddCTP(C)或ddATP(A)的单个碱基延伸表示可能的突变。异源双链中的突变参见G泳道并以箭头(＜)标识。

最初开发所述模板交换延伸反应(TEER)是为了检测以纯合子或杂合子状态存在的未知种系和体细胞突变。这是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳然后进行化学发光检测显示的。所述方法演变为一种基于微量滴定的检测形式。在微量滴定板形式中，其具有高得多的通量并且可用于在DNA测序前快速筛选DNA中的突变。作为一种序列筛选方法，其可用于筛选其中一个给定样品的特定基因的突变率非常低的大量样品。TEER快速筛选所述样品并标识包含突变的样品从而使它们可被测序以识别所述突变。

TEER被证明可以在微量板形式下检测突变。这被用于检测kars基因中不论是在T还是G核苷酸上的已知突变。图2示出了在固相微量滴定板上检测所述延伸产物所用的步骤。链亲合素包被的微量滴定板孔用于将生物素化的PCR产物吸附到固相上。在所述固相上经杂交形成同源和异源双链分子。所述方法的每一步都可以在微量滴定板上容易地完成，这大大简化了样品处理和加工。

表1所示数据是8个重复反应的平均值。当所述突变被保护和延伸至下个匹配碱基时，其显示了异源双链DNA中信号的增加。使用α硫代核苷酸来保护所述突变，然后用核酸外切酶III负向选择，降低背景并使得同源双链和异源双链模板可被区分开。此序列中保护硫代核苷酸后的下一核苷酸为尿嘧啶。当针对T核苷酸时，异源双链信号(2158 RLU)相对同源双链(573 RLU)有大约4倍的增加。

用地高辛标记的双脱氧NTP(A、G和C)的混合物的延伸显示，存在由所述聚合酶驱动的非特异性延伸或从非特异酶切位点的延伸。观察到向全长模板的非特异性添加被标记ddATP；此活性通常见于Taq聚合酶中，是PCR克隆试剂盒的基础。所述反应中DNA的量与无Exo III的对照所显示的(第3行)双链的量大致相同。当用Exo III处理所述双链时(第1行和第2行)，可通过延伸信号的剧烈下降看出匹配DNA的降解。

表1.TEER的微量滴定板检测

	ExoIII	同源双链(RLU)	异源双链(RLU)	变化(异/同)
					ddU-dig	+	573	2158	3.8x
ddA、G和C-dig	+	1345	2365	1.8x
					ddU-dig	-	134316	156078	1.2x

B.实施例2：杂交灵敏度

本方法避免了由于高丰度野生型DNA与其自身的杂交优先于与低丰度突变DNA的杂交导致的突变检测灵敏度的问题。尽管这在某些固相杂交中或在温度高到足以分辨同源和异源双链DNA的温度下进行的杂交中是一个问题，但是在本文所采用的条件下没有问题。将等量的正常PCR产物与等量的试验DNA混合。通过在95℃下将所述样品变性2分钟，然后快速冷却至72℃，再在30分钟期间慢慢冷却至40℃，形成所述异源双链。考虑到所述PCR产物的大小(300bp)和非严格杂交条件(时间和温度)，野生型DNA与突变DNA的杂交不被阻碍。这两种分子的杂交基于随机碰撞和偶然性。由于异源双链分子的形成不再被选择，形成的异源双链分子的比例直接关系到输入浓度。如果杂交前每100个正常模板中存在1个突变模板，那么该比例会在杂交后的产物中被保留。

C.实施例3：未知突变

所有4种核苷酸都被定向以检测未知突变。胸腺嘧啶和鸟嘌呤核苷酸可被直接定向。用化学方法将鸟嘌呤核苷酸随机转化为8-羟基尿嘧啶，然后用FPG和Endo IV切割。通过分析胞嘧啶和腺嘌呤在相对链上的互补物鸟嘌呤和胸腺嘧啶，间接定向胞嘧啶和腺嘌呤。应理解并且本文涵盖，其他方法可用于直接定向胞嘧啶和腺嘌呤，并且这些方法与本文所公开的方法是相容的。

例如，当用Promega的Wizard PCR Purification试剂盒纯化含有α-硫代的PCR产物时，可观察到生成对每个α-硫代核苷酸特异的测序阶梯。所述个α-硫代核苷酸对硫氰酸胍(一种用于将DNA与硅结合的促溶剂)是敏感的。这种对化学水解的敏感性已用2-碘乙醇充分证实并已被用作一种DNA测序的方法。用碘乙醇切割后剩下的3’末端是3’磷酸基基团和3′羟基基团的混合物。所述3’羟基末端可易于延伸并用于TEER。因此，这种化学方法可直接和一致地定向每个核苷酸。

D.实施例4：检测插入和缺失

TEER可容易地检测插入和缺失。这些突变在插入/缺失点上或只在所述突变的3’末端(在所述野生型延伸链上)创建一个错配，其中在所述位置处序列框架发生改变。在存在大段相同核苷酸或重复序列的地方，这些突变的检测受到阻碍。例如，当序列段足够长时，可开始形成发夹环从而使所述插入或缺失被挤出并且不可检测。与对末端的插入或缺失的检测相比，对这些序列段中部附近的插入或缺失的检测更容易出问题。

E.实施例5：TEER选择突变的实时PCR检测

在微量滴定板法的化学转变过程中，TEER显然会选择相对于正常或者野生型信号的突变信号。其从60个“正常”单碱基延伸中的1个“突变”生成信号。异源双链信号相对于同源双链信号的增加并不剧烈，大约为4倍，但表明了此方法在起作用。除了需要提高微量滴定板检测的信噪比外，这还需要确定PCR是否可用于扩增所述突变，从而可通过DNA测序来进一步表征。利用PCR来扩增所述突变首先使得可对稀有突变进行快速和灵敏地检测。可对阳性样品进行测序以定向和识别所述突变。

以下描述是指图3所示的步骤。简言之，kras基因中的已知突变被定向以证明TEER选择突变的可行性。这一被良好表征的已知突变是第12密码子上G到T的转变。它是证明所述选择过程起作用的理想目标。因此描述了用实时PCR检测形式来扩增和检测kras基因中的已知单碱基突变的可行性。特别地图示了U核苷酸的定向。其余3种碱基的每一种都在独立反应中被定向从而对所述序列中的每种碱基都进行分析。当TEER选择发生时，可将一个样品中的四种反应产物混合在一起，并且将其在一个实时PCR检测反应中分析。

TEER中的第一步是模板交换。将PCR扩增的已经在特定碱基上被随机修饰的野生型DNA与从可能具有突变的样品扩增而来的DNA杂交。所述双链DNA在一个末端含有错配以防止Exo III造成的降解，并且在另一末端含有3′凹端(recessed end)以允许连接用于固相吸附的接头探针。所述接头确保所述目标的全部都与其互补链(complement)杂交，并且确保所述目标为全长延伸产物。任何不完整的延伸产物都不会被连接，并且可通过使用严格洗涤而将其从所述板中容易地除去。用只在野生型链中特异性切割所述被修饰核苷酸(尿嘧啶)的酶或化学试剂处理所述异源双链DNA。可能含有突变的互补链不受影响。这创建了代表所述碱基在所述序列中每次出现的脱碱基位点的一个子集。这基本上是在完整全长模板基础上缺乏所定向碱基的测序阶梯。

TEER中的下一步是用耐核酸外切酶的核苷酸进行的延伸反应。这里使用了α-硫代核苷酸(Pincas H，et al.Nucleic Acids Res 2004；32(19)：el48；Nakamaye KL，et al.Nucleic Acids Res 1988；16(21)：9947-59；Labeit S，etal.Methods Enzymol 1987；155：166-77；Labeit S，et al.DNA 1986；5(2)：173-7)。应理解并且本文涵盖，也可使用硼核苷酸(Boron nucleotides)(Porter KW，et al.Nucleic Acids Res 1997；25(8)：1611-7)。代表所述三种可能的核苷酸突变的三种α-硫代脱氧三磷酸核苷(dNTP)的混合物与测序酶配合用于所述延伸反应。不存在与所定向碱基匹配的dNTP。例如，当胸腺嘧啶(通过尿嘧啶)是所定向碱基时，那么所述延伸核苷酸就是α-硫代dATP、dCTP和dGTP。

核酸外切酶III可用于选择突变，末端为硫代核苷酸的延伸产物代表突变并耐受核酸外切酶III。未被保护的野生型模板被降解。

所编辑的野生型链现在包含所述突变的一个拷贝。当所述聚合酶延长所述DNA时，它使用链置换或依赖于所述聚合酶的5′到3′核酸外切酶，前进到所述突变模板的末端。此过程从所述固相上释放所述突变双链。所释放的DNA可从所述微量滴定板上被直接转移到实时PCR反应中。

使用实时荧光正向引物和反向引物特异性地扩增所选突变模板。例如，可使用SYBR绿色染料或只在被延伸后发荧光的荧光发夹引物(如LUX引物(Invitrogen，Carlsbad，CA))。不推荐使用用于实时PCR的内部杂交探针如Taqman或双标记FRET探针，因为所述突变的位点是未知的。

F.实施例6：三聚体模型

为监测和优化所述方法的每一步，可使用由3个寡核苷酸构成的寡核苷酸杂合体(图4)。所述三聚寡核苷酸(oligotriplex)是缺少间插序列(intervening sequence)的完整产物的小型形式。LamMM-krasB含有5’FAM标记以使得可通过毛细凝胶电泳检测延伸/连接产物。上部构建体产生了一个切口，而下部构建体有一个缺口。使用此方法，可研究多种聚合酶和连接酶在任一位点上激发活性的能力。还可研究固相抓取和释放的效力。

对所述方法的每一步来说，都需要对若干条件进行优化。所述三聚寡核苷酸促进对这些步骤的每一步的优化。在此模型中存在若干会影响突变选择特异性的技术风险。核酸外切酶III消化只在3’末端为α-硫代核苷酸时非常有效。任何不完整的消化产物都会造成所述实时PCR中的背景。优化此反应的时间、浓度和缓冲条件对保持低背景起重要作用。

另外，用UDG和APE进行的切割必须是高度特异的。任何随机或非特异切割都会产生背景。再次，优化此反应的时间、浓度和缓冲条件对保持低背景起重要作用。所述酶在优化条件下是非常特异的。DNA连接酶可用于解决任何非特异性切口。

可在所述同源双链DNA和异源双链之间被观察到至少10个循环的差异。这是50∶50混合或1∶2比例的突变体比野生型。因此，所述突变的至少1∶100稀释可被检测到。使用图3上部所示的方法，观察到异源双链DNA相对同源双链DNA在平均交点(average crossing point)上有4个循环的下降。作为背景对照，异源和同源双链产物的不同组合被检测。两条异源双链都具有G:T错配，但为彼此的反相互补序列。异源双链SW/K5在检测的合适链上具有所述被定向的核苷酸(经由尿嘧啶定向的T)。背景交点高于期望值，如由低交点证明的那样。同一TEER产物的重复扩增之间的标准偏差相当高。基于所述SYBR绿色荧光染料实时PCR的高扩增效力(3.33)，这是令人惊奇的。用高纯度阳性模板的10倍梯度稀释系列优化此试验。应理解，也可优化其他因素如引物浓度、退火温度/时间、延伸温度/时间、MgCl2浓度，以及在大量、少量和无模板存在的情况下的引物浓度，以使重复试验之间的标准偏差小于0.5。

	平均交点(n＝5)	交点标准偏差	Δ同源双链-异源双链
				同源双链K5/K5	14.6	1.63
异源双链K5/SW	15.0	1.46	-0.45个循环
				同源双链SW/SW	17.2	1.71
异源双链SW/K5	13.5	1.69	+3.76个循环

G.实施例7：检测灵敏度

在此模型系统中，检测已知突变的能力对于TEER检测DNA中的未知突变是重要的。这是一个滴定实验，其中将突变kras模板的量相对于正常或野生型序列进行稀释以确定检测灵敏度。突变kras模板相对正常模板的稀释梯度被设置为不稀释、1∶2、1∶5、1∶10、1∶50、1∶100、1∶500和1∶1000。优化反应条件以增加灵敏度。优选地，最少可以检测到50个正常模板中的1个突变模板。此方法的定量性质也将被评估。定量相对于正常DNA的稀有未知突变的能力可建立用于癌症治疗和监测的重要干预值。

在本申请通篇中，参考了多种出版物。这些出版物的公开内容以引用的方式整体纳入本申请中，从而更全面地描述本申请所属技术领域的情况。所公开的参考文献包含的作为所述文献的依据而讨论的内容也独立和具体地以引用的方式纳入本文中。

本领域技术人员清楚，可对本发明进行多种改进和改变而不偏离本发明的范围或精神。根据本文公开的本发明的说明和实践，本发明的其他实施方案对本领域技术人员也是清楚的。本说明书和实施例只是出于例示的目的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指明。

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应理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可变化。也应理解本文所用的术语只是为了描述具体实施方案而并非意图限制本发明的范围，所述范围只由附加的权利要求所限定。

在本说明书的整个描述和权利要求中，单词“包含”和该词的变化形式如“包括”和“含有”意指“包括但不限于”，而并非意图排除，例如，其他添加剂、组分、整数或步骤。

本领域的技术人员仅使用常规实验就可认识或能够确定本文所述方法和组合物的具体实施方案的许多等价方案。这些等价方案意图由附加的权利要求所包括。

Claims (46)

1.一种检测目标核酸中的核苷酸变异的方法，包括以下步骤：

(a)从第一种核酸生成一套延伸产物并且使被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中，其中所述被修饰核苷酸包含单一类型的碱基；

(b)使所述延伸产物与第二种核酸杂交；

(c)使所述杂交核酸与一或多种共同去除所述被修饰核苷酸的试剂接触；

(d)在存在三种类型的耐核酸酶核苷酸并且不存在碱基类型与所述被修饰核苷酸相同的核苷酸的情况下，将所述杂交核酸与延伸所述延伸产物的第一种酶接触，其中所述三种类型的耐核酸酶核苷酸的每一种均包含不同类型的碱基；

(e)将所述杂交核酸与从所述延伸产物的3’末端去除核苷酸的第二种酶接触，其中所述第二种酶不去除所述耐核酸酶核苷酸；

(f)在存在核苷酸的情况下，使所述杂交核酸与延伸所述延伸产物的第三种酶接触；

(g)区别那些包含耐核酸酶核苷酸的延伸产物和那些不含耐核酸酶核苷酸的延伸产物，从而检测目标核酸中的核苷酸变异，其中所述第一种核酸是对照核酸，所述第二种核酸是目标核酸，或者其中所述第一种核酸是目标核酸，所述第二种核酸是对照核酸。

2.权利要求1的方法，其中所述对照核酸包括野生型序列。

3.权利要求2的方法，其中所述目标核酸包括对应于所述对照核酸的野生型序列的序列。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中在步骤(g)中基本没有不含耐核酸酶核苷酸的延伸产物，其中区分那些包含耐核酸酶核苷酸的延伸产物与那些不含耐核酸酶核苷酸的延伸产物，包括检测延伸产物的存在。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中如果耐核酸酶核苷酸在步骤(d)中插入延伸产物中，则延伸产物只存在于步骤(g)中。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中只有当核苷酸变异存在于目标核酸中时，耐核酸酶核苷酸才在步骤(d)中插入延伸产物中。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中基本上只有当核苷酸变异存在于目标核酸中时，耐核酸酶核苷酸才在步骤(d)中插入延伸产物中。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述核苷酸变异存在于目标核苷酸中与所述延伸产物中被修饰核苷酸的位置相对应的位点上。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述延伸产物中的耐核酸酶核苷酸的5’端的核苷酸受到保护免于被所述第二种酶去除。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中不含耐核酸酶核苷酸的延伸产物被所述第二种酶消化。

11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述第一种核酸包含一段引物序列，其中至少一些其中包含耐核酸酶核苷酸的延伸产物至少针对所述第一种核酸中的引物序列在步骤(f)中被延伸。

12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述被修饰核苷酸为7，8-二氢-8-氧鸟嘌呤(8-氧鸟嘌呤)、8-氧腺嘌呤、甲酰胺嘧啶-鸟嘌呤、甲基-甲酰胺嘧啶-鸟嘌呤、甲酰胺嘧啶-腺嘌呤、黄曲霉毒素B1-甲酰胺嘧啶-鸟嘌呤、5-羟基-胞嘧啶、5-羟基-尿嘧啶、开环N-7鸟嘌呤加合物(7-甲基鸟嘌呤)、核糖、尿嘧啶或其组合。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中步骤(c)和(d)同时进行。

14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述一种或多种试剂从所述被修饰核苷酸中去除碱基。

15.权利要求1-14任一项的方法，其中所述一种或者多种试剂包括核酸内切酶。

16.权利要求1-15任一项的方法，其中所述一种或者多种试剂包括核酸内切酶IV。

17.权利要求1-16任一项的方法，其中所述一种或者多种试剂包括甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶(FPG)。

18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述第一种酶用被标记核苷酸替代所述被修饰核苷酸。

19.权利要求1-18任一项的方法，其中所述第一种酶包括聚合酶。

20.权利要求1-19任一项的方法，其中所述第一种酶是DNA聚合酶。

21.权利要求1-20任一项的方法，其中所述第一种酶是一种热稳定聚合酶。

22.权利要求1-21任一项的方法，其中所述耐核酸酶核苷酸包括硫代修饰的脱氧核苷酸。

23.权利要求1-22任一项的方法，其中所述耐核酸酶核苷酸包括硼烷(borano)修饰的核苷酸。

24.权利要求1-23任一项的方法，其中所述第二种酶包括核酸外切酶。

25.权利要求1-24任一项的方法，其中所述第二种酶包括核酸外切酶III。

26.权利要求1-25任一项的方法，其中所述延伸产物通过实时PCR(rtPCR)来区分。

27.权利要求26的方法，其中PCR由两种或多种引物介导，其中一种或多种所述引物包含荧光标记。

28.权利要求27的方法，其中一种或多种所述引物包括荧光变化引物。

29.权利要求1的方法，其中所述延伸产物在步骤(f)中的延伸将一种或多种被标记核苷酸插入到所述延伸产物中。

30.权利要求29的方法，其中一种或多种所述被标记核苷酸包含生物素。

31.权利要求30的方法，其中所述延伸产物是通过检测所述被标记核苷酸而被区分。

32.权利要求1-31任一项的方法，其中所述延伸产物是通过探针杂交、引物延伸或其组合而被区分。

33.权利要求1-32任一项的方法，其中所述延伸产物是通过所述延伸产物与固体基质的连接而被区分。

34.权利要求1-33任一项的方法，进一步包括每次用一种包含不同类型碱基的不同类型被修饰核苷酸再进行步骤(a)到(g)一或多次。

35.权利要求1-34任一项的方法，其中用四种不同的被修饰核苷酸中的每一种进行步骤(a)到(g)至少一次，其中所述四种不同的被修饰核苷酸的每一种都包含所述四种类型碱基中不同的一种。

36.权利要求1-35任一项的方法，进一步包括对含有核苷酸变异的延伸产物进行测序并将该序列与对照序列进行比较，从而特异性地识别所述第一种核酸中的核苷酸变异。

37.权利要求1-36任一项的方法，其中所述核苷酸变异是单个核苷酸变异。

38.权利要求1-37任一项的方法，其中被检测的核苷酸变异是单个核苷酸中的核苷酸变异。

39.权利要求1-38任一项的方法，其中将所述延伸产物用一个可检测的标记标记，并且所述区分步骤(g)包括对来自步骤(f)的反应物进行凝胶电泳，其中所述电泳具有足够的分辨率来区分没有进一步延伸的被标记延伸产物和全长核酸。

40.权利要求1-39任一项的方法，其中在存在包含单一类型碱基的被修饰核苷酸的情况下，通过生成所述延伸产物来使被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中，其中所述延伸产物包含所述被修饰核苷酸。

41.权利要求1-39任一项的方法，其中通过修饰所述延伸产物中的核苷酸以产生所述被修饰核苷酸，从而使被修饰核苷酸存在于所述延伸产物中。

42.权利要求41的方法，其中核苷酸在所述延伸产物中是被选择性地修饰。

43.权利要求41或42的方法，其中核苷酸在所述延伸产物中是以一种受限的方式被修饰。

44.权利要求41-43任一项的方法，其中核苷酸在所述延伸产物中是通过化学修饰被修饰。

45.权利要求41-44任一项的方法，其中核苷酸在所述延伸产物中是通过酶修饰被修饰。

46.一种检测第一种核酸中的核苷酸变异的方法，包括以下步骤：

a.在存在包含单一类型碱基的被修饰核苷酸的情况下，从对照核酸生成一套延伸产物，其中所述延伸产物包含所述被修饰核苷酸，

b.使所述延伸产物与所述第一种核酸杂交，

c.使所述杂交核酸与一或多种共同去除所述被修饰核苷酸的试剂接触，

d.在存在三种类型的被标记核苷酸且不存在碱基类型与所述被修饰核苷酸相同的核苷酸的情况下，将所述杂交核酸与延伸所述延伸产物的第一种酶接触，其中所述三种类型的被标记核苷酸的每一种均包含一种不同类型的碱基，

e.区分那些包含被标记核苷酸的延伸产物和那些不含被标记核苷酸的延伸产物，从而检测所述第一种核酸中的核苷酸变异。

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