JP2000501615A

JP2000501615A - 酵素増幅中に生じる変異配列の検出および除去のためのミスマッチ修復系を用いる方法

Info

Publication number: JP2000501615A
Application number: JP9522267A
Authority: JP
Inventors: モドリッチ，ポール・エル; スミス，ジェイン・イー
Original assignee: アマーシャム・ライフ・サイエンス・インコーポレーテッド
Priority date: 1995-12-15
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2000-02-15
Also published as: DE69627189D1; ATE236270T1; US5922539A; CA2240346A1; EP0870060A1; CA2240346C; WO1997021837A1; DE69627189T2; EP0870060B1

Abstract

(57)【要約】酵素増幅DNA二本鎖集団において、ポリメラーゼ誘発性変異を１またはそれ以上含むDNA分子を除去する方法であって、このDNA二本鎖集団を変性および再アニーリングさせ、再アニーリングしたDNA二本鎖をミスマッチ修復系と接触させて、これにより塩基対ミスマッチを含むDNA二本鎖中の各鎖を開裂させ、そして開裂したDNA二本鎖を開裂していないDNA二本鎖から分離することを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】酵素増幅中に生じる変異配列の検出および除去のためのミスマッチ修復系を用いる方法発明の分野本発明は、酵素増幅の生成物であるDNA分子中の変異配列を検出および除去するための方法に関する。発明の背景以下に関連技術につき述べるが、それらはいずれも本発明の先行技術とは認められない。 PCR増幅中に起きるDNAポリメラーゼエラーの結果、増幅生成物中に変異が存在する。この問題は、プルーフリーディングエキソヌクレアーゼを欠如し、PCR条件下で重合したヌクレオチドの１/10⁴〜１/10⁵のオーダーの塩基置換エラー率をもつTaq DNAポリメラーゼにつき、特に重大である（Eckert and Kunkel，Nuclei c Acids Res .,18：3739，1990；Mattila et al.，Nucleic Acids Res.，19：496 7，1991；Saiki et al.，Science，239：487，1988；Tindall and Kunkel，Bioc hemistry ，27：6008，1988）。この規模のエラー率の重大さはKeohavongおよびT hillyが指摘し（Keohavong and Thilly，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，86： 9253，1989）、２/10⁴の取込み違い率で、100塩基対配列の10⁶倍（20サイクル）の増幅により、それぞれその配列のどこかに変異を含む確率80％の生成物分子集団が得られると述べている（Keohavong and Thilly，前掲）。PCRに際してのポｆ＝２ｌＮａ（方程式１）式中、ｆはそれらの配列中のどこかに変異を含む生成物分子の予想画分、ｌは増幅したセグメントの長さ（bp）、Ｎはサイクル数、ａは取り込まれたヌクレオチド当たり発現したポリメラーゼエラー率である。この問題は、熱安定性PfuおよびTli(Vent、登録商標)DNAポリメラーゼが確認されたことにより、ある程度軽減した。これらはプルーフリーディング活性をもち、Taqと比較して２〜10倍の忠実度改良を示す（Lundberg et al.，Gene，108：1，1991；Nattila et al.，前掲）。しかし、サイクル当たりのポリメラーゼ取込み違い事象の確率も増幅される配列のサイズに比例することを考えると、ポリメラーゼ誘発性変異はkb領域の大幅な配列増幅については依然として重大な問題である。発明の概要本発明は、酵素増幅の生成物であるDNA分子中の変異を検知および除去することに関する。これはミスマッチ修復反応、たとえば細菌のメチル指向性ミスマッチ修復の開始に関与する大腸菌（E．coli）MutHLS反応の利用に基づく。DNA分子内にミスマッチが存在すると、MutH、MutＬ、MutSおよびATPに依存する反応で、ミスペア付近に位置するＧＡＴＣ配列における開裂が誘発される（Au et al.，J ．Biol．Chem .，267：12142，1992）。ヘミメチル化ＧＡＴＣは、メチル化されていない鎖上で切断される。ＧＡＴＣメチル化されていないヘテロ二本鎖DNAはそのような部位でミスマッチ誘発による一本鎖および二本鎖開裂を受け、後者の反応は長時間のインキュベーション後、またはMutH、MutL、MutSタンパク質濃度を高めることにより顕著になると報告されている（Au et al.，前掲）（図１参照）。本発明においては、一本鎖および二本鎖開裂を利用して、酵素増幅の結果生じた変異の存在を検知する。二本鎖開裂反応は、増幅分子集団から変異配列を除去するためにも利用できる。本発明は、酵素増幅したDNA分子集団に適用される。このような方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT/PCR）が含まれる。本発明を酵素増幅の結果生じた変異の除去に利用したい場合、目的配列をＮ回増幅させる（たとえばPCRにより）。この場合Ｎは、予想変異画分（用いたポリメラーゼの忠実度および増幅する配列のサイズから方程式１に従って推定されるか、または後記に詳述するように実験により推定される）が適切に小さくなるように、後記に概説する基準により選ばれる。次いで小さな変異画分を含む分子の増幅集団を変性および再アニーリングさせると、大部分の変異鎖は野生型生成物とハイブリダイズする。こうして変性および再アニーリングにより得られた材料を、必要に応じて予めPCRプライマーおよびdNTPを除去した後（たとえばゲル濾過により）、たとえば大腸菌MutHLS開裂反応により二本鎖開裂反応させる（図２参照）。開裂しない画分は、ミスマッチを含まない分子からなり、したがって変異を含まない配列が著しく富化される。Ｎ回のサイクルで分析に十分な材料が得られれば、開裂しなかった画分を開裂した変異含有フラグメントから、サイズ分離により（たとえば非変性条件下でのポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により）分離できる。 PCRエラーは原則として、増幅を行う配列のいかなる位置においても起きる可能性があるので、増幅生成物の変異画分は種々の変異の集団からなると予想される（この節において変異または変異体という用語は、PCRにより生じた配列変化を意味する）。この集団は、増幅を行っている配列のそれぞれの位置で起きる可能性のある可能な一組の塩基対変化を示すであろう。したがって、特定の変異（たとえば特定の塩基対におけるポリメラーゼエラーにより生じるもの）を含む生成物分子は、一般に全変異集団のごく小さな画分であるにすぎないであろう。よって、PCR生成物を変性させ、それ自体、再アニーリングさせると、変異画分が比較的高い場合（たとえば50％）ですら、大部分の変異鎖が非変異鎖または異なる変異を含む鎖のいずれかにハイブリダイゼーションするであろう。前者のクラスのハイブリッド分子は１つのミスマッチ、後者は２以上のミスペアを含み、両クラスのハイブリッドともMutH、MutL、およびMutSによる攻撃に対し感受性であろう。したがって両クラスとも、そこに含まれる変異配列が前記方法で除去されるであろう。大腸菌のメチル指向性修復系はＣ-Ｃミスマッチをプロセシングしないと思われるので（Su，S.-S.，Lahue，R．S.，Au，K.G．and Modrich，P.，J ．Biol．Chem .，263：68299-6835，1988；Lahue，R．S.，Au，K．G．and Modric h，P.，Science，245：160-164，1989）、この方法では対応するハイブリッド分子がＣ-Ｃミスペアのみを含む配列は除去されないであろう。特定の条件下では、変異画分をより少なくするために（たとえば10％）サイクル数を制限することが望ましいことがある。あるタイプの増幅反応は、特定の配列変化の“ジャックポット”が起きやすい（Luria，S．E．and Delbruck，J.，G enetics 28：491-511，1943）。たとえば１分子PCR（たとえば１分子のみ、または数分子の鋳型から開始する増幅反応）に際して最初のサイクルで特定のPCR誘発性配列変化が起きると、その変異配列はその後のサイクルで自然に増幅されるので、最終生成物中での特定の変異は高い画分となるであろう。本明細書に記載するPCR誘発性変異配列の除去方法は、半数体ゲノム由来の増幅生成物に限定されない。本方法は、起源細胞が当該領域内（たとえば対立遺伝子Ａとａ）で１またはそれ以上の配列相異性につき偶然にヘテロ接合性であった場合ですら、二倍体ゲノム由来のPCR生成物についても利用できる。Ａａヘテロ接合体に由来するＡ配列の増幅により、ほぼモル当量のＡ生成物およびａ生成物、ならびに各対立遺伝子由来のPCR誘発性変異配列が得られると予想される。この生成物を変性および再アニーリングさせると、変異配列を含むハイブリッド分子のほか、鎖遺伝子型Ａ:Ａ、ａ:ａ、Ａ:ａおよびａ:Ａを含むヘテロ二本鎖が予想比率１:１:１:１で得られると予想される。PCR誘発性変異を含むハイブリッド分子と同様に、Ａ:ａおよびａ:Ａヘテロ二本鎖もMutH-、MutL-、およびMutS-依存性のミスマッチ誘発性二本鎖開裂を受けるであろう。しかし目的生成物（Ａ: Ａおよびａ:ａ二本鎖DNA、これらは全生成物のほぼ半分以下であると予想される）はミスマッチを含まず、これらの活性による攻撃に耐えるであろう。 PCRの最初のＮ回のサイクルでMutHLS開裂後の変異減少集団（mutation-deplet ed population）を物理的に単離するのに十分な材料が得られず、さらに増幅の必要がある場合、本発明にはポリメラーゼ誘発性エラーがその後の増幅で増加しないように変異配列を処理する別法が２つある。これらの方法は、開裂生成物のプライマー活性の不活性化、またはエキソヌクレアーゼ類の組合わせを用いた酵素法による開裂生成物の除去に基づく。ＧＡＴＣ配列におけるMutHLS仲介開裂はＧに対し５′側で起きる（↓ｐＧｐＡｐＴｐＣ）。したがってこの反応により生成した二本鎖生成物は、多くの制限エンドヌクレアーゼにより生成したものと類似する４ヌクレオチドの５′-オーバーハングをもつ。MutHLS反応生成物を、ジデオキシグアノシン-５′-三リン酸およびDNAポリメラーゼ（ミスマッチ誘発性開裂で生じた３′末端にデオキシヌクレオシドを付加しうるもの）で不活性化すると、後続PCRサイクルにおけるプライミング活性が不活性化されるであろう。変異配列はその集団中に残るが、それらは後続PCRサイクルで指数的にではなく直線的に増幅するであろう。他の生物はMutH と異なる開裂特異性をもつエンドヌクレアーゼを用いることがあり、したがってジデオキシグアノシン-５′-三リン酸以外のジデオキシヌクレオシド-５′-三リン酸を用いる必要がある。他の酵素法では、変異配列を含むミスマッチ修復反応の開裂生成物を物理的に除去する。この方法は、５′-ホスホリル末端をもつ二本鎖DNAに対する特定のエキソヌクレアーゼ類、たとえばλエキソヌクレアーゼの高特異性に基づく（Litt le，J ．Biol．Chem.，242：679，1967）。５′-ヒドロキシル末端を含むプライマーを用いて、最初のＮ回のPCR増幅を行う。増幅後に、変性および再アニーリングの生成物を前記のMutH、MutLおよびMutSのようなミスマッチ修復酵素で処理する。ミスマッチを含む分子のＧＡＴＣ開裂により５′-ホスホリル末端をもつ生成物が得られるので、二本鎖開裂生成物それぞれのうち一方の鎖はλエキソヌクレアーゼによる加水分解に対し感受性になる。５′-ヒドロキシル末端を含むプライマーを用いると、非開裂生成物のエキソヌクレアーゼ攻撃が阻止される。次いで残された一本鎖を、一本鎖特異性エキソヌクレアーゼ、たとえばエキソヌクレアーゼＩで加水分解することにより除去する（Lehman and Nussbaum，J ．Bi ol．Chem .，339：2628，1964）。これら２つのエキソヌクレアーゼ活性を不活性化または除去した後（たとえばフェノール抽出により）、この変異減少画分につきPCRの追加サイクルを行い、次いで変異配列を除去するためのMutHLS開裂工程を行うことができる。本発明はまた、ポリメラーゼ誘発性変異を含むPCR生成物分子の画分を直接に推定する方法である。変性および再アニーリング、次いでMutHLSのようなミスマッチ修復酵素による開裂後に、開裂したDNA二本鎖と開裂していないものとを、たとえばゲル電気泳動により分離し、DNA定量に用いられる標準法によりそれぞれの画分中に存在するDNA二本鎖の相対量を測定する。この時点でMutHLS開裂の程度から、ポリメラーゼ誘発性変異を１またはそれ以上含むPCR生成物分子の画分を直接に推定できる。本発明方法には、分析される配列中にミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受ける配列、たとえばｄＧＡＴＣ部位が存在し、これによりエンドヌクレアーゼ分解性開裂が起きうることが必要である。増幅する配列中にこのような部位が存在しない場合、この配列を含むプライマーを用いて、ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受ける配列を導入することができる。したがって本発明はまた、ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受ける配列を含まない配列中のエラーを検知または除去する方法である。ｄＧＡＴＣ部位を含まない分子は、増幅に用いるプライマー中にｄＧＡＴＣ部位を導入することにより、MutHLS開裂でスクリーニングまたは除去することができる。本発明者らは、変異のスクリーニングには分子の末端から 50〜100bpの位置にｄＧＡＴＣ部位があれば十分であることを見出した。他の生物に由来するミスマッチ修復酵素によってミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受ける、ＧＡＴＣ以外の配列も、本発明に使用できる。ヒトを含めた他の生物はDNAミスペアを認識して修復する系をもつことが知られている。これには当業者に自明のとおり大腸菌のMutHLSタンパク質と機能的に相同なタンパク質が含まれ、これらも本発明に使用できる。したがって第１態様において本発明は、酵素増幅DNA二本鎖集団において、ポリメラーゼ誘発性変異を１またはそれ以上含むDNA分子を除去する方法である。本方法は、DNA二本鎖集団を変性および再アニーリングさせ、再アニーリングしたDNA二本鎖をミスマッチ修復系と接触させて、これにより塩基対ミスマッチを含むDNA二本鎖中の各鎖を開裂させ、そして開裂したDNA二本鎖を開裂していない DNA二本鎖から分離することを含む。 “ポリメラーゼ誘発性変異”とは、DNA増幅中にDNAポリメラーゼによりヌクレオチドが取込み違いされて、これによりDNAの相補鎖上に位置する２つのヌクレオチド間に不適性な対合、すなわちＡ:ＴもしくはＧ:Ｃではない塩基対が生じ、または１本の鎖上に１、２もしくは３つの余分な対合していない隣接ヌクレオチドが存在する（挿入／欠失ミスマッチ）ことを意味する。 “酵素増幅DNA二本鎖”とは、酵素増幅反応により増幅したDNAを意味する。このような反応の例には、ポリメラーゼ連鎖反応、および逆転写とそれに続く発現 RNA配列１またはそれ以上のDNA増幅とを用いる反応が含まれる。 “変性および再アニーリング”とは、当業者に既知の方法であって、DNA二本鎖分子の水素結合を逐次、破壊し、次いで再形成させる方法を意味する。変性および再アニーリングのための好ましい方法は、温度上昇、続いて温度低下および pH上昇（たとえばpH13）、続いて中和および適切な温度でのアニーリングを含む。別法には、RT/PCR法でのRNase Hなどの酵素の使用が含まれる。 “ミスマッチ修復系”とは、ＧＡＴＣエンドヌクレアーゼを含むタンパク質、たとえば大腸菌MutH、または大腸菌MutHと機能的に相同なタンパク質（このタンパク質はＧＡＴＣと異なる部位において開裂させうる）、ミスペア認識タンパク質、たとえば大腸菌MutS、または大腸菌MutSと機能的に相同なタンパク質、およびＧＡＴＣエンドヌクレアーゼの活性化に関与するタンパク質、たとえば大腸菌 MutL、または大腸菌MutLと機能的に相同なタンパク質、ならびに必要な補因子、たとえばMgCl₂およびATPを意味する。 “分離する”とは、物理的分離を達成する方法、たとえば電気泳動またはHPLC により、開裂した分子を開裂していない分子から単離することを意味する。好ましい態様においては、分離法はゲルによる電気泳動により行われ；ミスマッチ修復系は大腸菌のメチル指向性ミスマッチ修復系の成分を含み、これにはMu tS、MutLおよびMutHタンパク質が含まれる。。 “ゲルによる電気泳動”とは、電気泳動による移動によってサイズ分画する方法を意味する。これは当業者に周知の方法である。ゲル電気泳動は慣用法またはパルスフィールドのいずれであってもよい。 “大腸菌のメチル指向性ミスマッチ修復系の成分”には、タンパク質MutH、Mu tLおよびMutS、ならびに補因子MgCl₂およびATPが含まれる。第２態様において本発明は、５′-ヒドロキシル末端を含むプライマーを用いることにより、酵素増幅したDNA二本鎖集団において、ポリメラーゼ誘発性変異１またはそれ以上を含むDNA分子を除去する方法である。本方法は、DNA二本鎖集団を変性および再アニーリングさせ、再アニーリングしたDNA二本鎖をミスマッチ修復系と接触させて、これにより塩基対ミスマッチを含むDNA二本鎖中の各鎖を開裂させて５′-ホスフェート末端を形成させ、再アニーリングしたDNA二本鎖集団をさらにエキソヌクレアーゼ類と接触させて、塩基対ミスマッチを含むDNA二本鎖を酵素分解することを含む。５′-ヒドロキシル末端を含むプライマーを用いることにより、ミスマッチ修復系により形成された開裂部位以外の部位に対するエキソヌクレアーゼ攻撃が阻止される。プライマーは一般にこのような５′-ヒドロキシル末端を含むように構築される。 “エキソヌクレアーゼ類”とは、二本鎖DNAを優先的に分解し、かつ５′-ホスフェートに対する優先性をもつエキソヌクレアーゼ、たとえばλエキソヌクレアーゼと、一本鎖特異性エキソヌクレアーゼ、たとえばエキソヌクレアーゼＩとの組合わせを意味する。 “酵素分解した”とは、単一ヌクレオチドまたはジヌクレオチドにまで分解したことを意味する。好ましい態様においては、ミスマッチ修復系は大腸菌のメチル指向性ミスマッチ修復系の成分を含み、これにはMutS、MutLおよびMutHタンパク質が含まれる。第３態様において本発明は、酵素増幅したDNA二本鎖集団において、ポリメラーゼ誘発性変異を１またはそれ以上含むDNA分子を、それ以上の増幅に対して不活性にする方法である。本方法は、DNA二本鎖集団を変性および再アニーリングさせ、再アニーリングしたDNA二本鎖をミスマッチ修復系と接触させて、これにより塩基対ミスマッチを含むDNA二本鎖中の各鎖を開裂させ、そして開裂したDNA 二本鎖をジデオキシヌクレオシド-５′-三リン酸およびDNAポリメラーゼ（ミスマッチにより誘発された開裂で生じた３′末端にジデオキシヌクレオシド-５′- リン酸部分を付加しうるもの）とさらに接触させることを含む。 “それ以上の増幅に対して不活性”とは、開裂したDNA分子がそれ以上の延長を支持し得ない鎖成長終結性ヌクレオチドを取り込んだため、それ以上の指数的増幅を行えないことを意味する。 “ジデオキシヌクレオシド-５′-三リン酸”とは、３′-ヒドロキシル基が水素で置換されて鎖成長終結性類似体を生じたヌクレオシド-５′-三リン酸を意味する。この類似体はホスホジエステル結合の形成に必要な３′-ヒドロキシルを欠如するので、新たなDNA鎖の成長を遮断するであろう。好ましい態様においては、ミスマッチ修復系は大腸菌のメチル指向性ミスマッチ修復系の成分を含み、これにはMutS、MutLおよびMutHタンパク質が含まれ、かつジデオキシヌクレオシド-５′-三リン酸がジデオキシグアノシン-５′-三リン酸である。第４態様において本発明は、酵素増幅DNA集団のポリメラーゼ誘発性変異を含む画分を測定する方法である。本方法は、DNA二本鎖集団を変性および再アニーリングさせ、再アニーリングしたDNA二本鎖をミスマッチ修復系と接触させて、これにより塩基対ミスマッチを含むDNA二本鎖中の少なくとも一方の鎖を開裂させ、開裂したDNA二本鎖を開裂していないDNA二本鎖から分離し、開裂していない DNA二本鎖に対する開裂したDNA二本鎖の画分を、酵素増幅DNAのポリメラーゼ誘発性変異を含む画分の指標として測定することを含む。 “少なくとも一方の鎖を開裂させる”とは、塩基対ミスマッチを含むDNA分子の一方または両方の鎖に、エンドヌクレアーゼ分解性切断を導入することを意味する。インキュベーションの時間およびミスマッチ修復酵素の濃度により、エンドヌクレアーゼ分解性切断が、１カ所導入されるかまたは２カ所導入されるかが決まる。 “開裂したDNA二本鎖を開裂していないDNA二本鎖から分離する”とは、これら２種類の分子の物理的分離を意味し、変性条件下での電気泳動を含む。 “開裂していないDNA二本鎖に対する開裂したDNA二本鎖の画分を測定する”とは、それぞれの画分中の相対量を測定しうるように、開裂した分子と開裂していない分子を分離した後、DNAを検出および定量することを意味する。DNAの検出および定量は、当業者に慣用される方法で、核酸に関して既知の標識法、染色法および定量法を用いて実施できる。好ましい態様においては、ミスマッチ修復系は大腸菌のメチル指向性ミスマッチ修復系の成分を含み、これにはMutS、MutLおよびMutHタンパク質が含まれる。第５態様において本発明は、酵素増幅DNA二本鎖集団において、DNAポリメラーゼ誘発性変異の存在を検知する方法である。本方法は、DNA二本鎖集団を変性および再アニーリングさせ、再アニーリングしたDNA二本鎖を、二本鎖の少なくとも一方の鎖中にエンドヌクレアーゼ分解性切断を導入することによりポリメラーゼ誘発性変異を含む二本鎖が修飾される条件下で、ミスマッチ修復系と接触させ、そしてエンドヌクレアーゼ分解性切断の生成物をポリメラーゼ誘発性変異の存在の指標として検出することを含む。エンドヌクレアーゼ分解性切断または開裂の生成物は、切断生成物と修飾されていない分子との差を検知するいかなる方法でも検出できる。このような方法には、サイズまたは電気泳動移動度の差を検知する方法が含まれる。好ましい態様においては、エンドヌクレアーゼ分解性切断生成物を変性条件下での電気泳動移動度の変化により検出し；ミスマッチ修復系は大腸菌のメチル指向性ミスマッチ修復系の成分を含み、これにはMutS、MutLおよびMutHタンパク質が含まれる。 “電気泳動移動度の変化”とは、ゲル上において、修飾されていない、すなわち開裂していない分子と対比して異なる移動度を意味する。変性条件は当業者に既知であり、尿素の使用が含まれる。第６態様において本発明は、ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受ける配列を含まないDNA二本鎖から生成した酵素増幅DNA二本鎖集団のDNAポリメラーゼ誘発性変異の存在を検知する方法である。本方法は、ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受ける配列を含むプライマーを用いてDNA分子集団を酵素増幅させ、DNA二本鎖集団を変性および再アニーリングさせ、再アニーリングしたDNA二本鎖を、ポリメラーゼ誘発性変異を含む二本鎖の少なくとも一方の鎖中にエンドヌクレアーゼ分解性切断が導入される条件下で、ミスマッチ修復系と接触させ、そしてエンドヌクレアーゼ分解性切断の生成物をポリメラーゼ誘発性変異の存在の指標として検出する工程を含む。 “ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受ける配列を含むプライマー”とは、ミスマッチの存在に応答してミスマッチ修復系の成分によって特異的に開裂する配列を含むように工学的に作成したプライマーを意味する。このような部位を含むプライマーは、当業者に既知の標準クローニング法により構築できる。本発明はまた、ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受ける配列を含むDNA二本鎖から生成した酵素増幅DNA二本鎖集団において、ポリメラーゼ誘発性変異を１またはそれ以上含むDNA分子を除去するための、ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受ける配列を含むプライマーの使用である。本方法は、ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受ける配列を含むプライマーを用いてDNA分子集団を酵素増幅させ、DNA二本鎖集団を変性および再アニーリングさせ、再アニーリングしたDNA二本鎖を、ポリメラーゼ誘発性変異を含むDNA二本鎖の各鎖が開裂する条件下で、ミスマッチ修復系と接触させ、そして開裂したDNA二本鎖を開裂していないDNA二本鎖から分離する工程を含む。好ましい態様においては、エンドヌクレアーゼ分解性開裂を受ける配列はｄ（ＧＡＴＣ）部位であり；エンドヌクレアーゼ分解性切断生成物を変性条件下での電気泳動移動度の変化により検出し；ミスマッチ修復系は大腸菌のメチル指向性ミスマッチ修復系の成分を含み、これにはMutS、MutLおよびMutHタンパク質が含まれる。第７態様において本発明は、酵素増幅DNA二本鎖集団において、ポリメラーゼ誘発性変異を１またはそれ以上含むDNA分子を検出し、除去し、またはそれ以上の増幅に対して不活性にするための各種キットである。酵素増幅DNA二本鎖集団において、DNA分子を増幅し、かつポリメラーゼ誘発性変異を１またはそれ以上含むDNA分子を除去するのに有用なこのようなキットのひとつは、５′-ヒドロキシル末端を含むプライマー、ミスマッチ修復系の成分、およびエキソヌクレアーゼ類を含む。酵素増幅DNA二本鎖集団において、ポリメラーゼ誘発性変異を１またはそれ以上含むDNA分子を除去するための他のキットは、ミスマッチ修復系の成分、およびエキソヌクレアーゼ類を含む。本発明はまた、酵素増幅DNA二本鎖集団において、ポリメラーゼ誘発性変異を１またはそれ以上含むDNA分子をそれ以上の増幅に対して不活性にするためのキットであって、ミスマッチ修復系の成分、ジデオキシヌクレオシド-５′-三リン酸、およびDNAポリメラーゼを含むキットである。他のキットは、ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受ける配列を含まないDNA分子を増幅するのに有用な、かつこの酵素増幅DNA二本鎖集団からポリメラーゼ誘発性変異を１またはそれ以上含むDNA分子を検出または除去するのに有用である。このキットは、ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受ける配列を含むプライマー、およびミスマッチ修復系を含む。本発明は、増幅反応においてポリメラーゼ誘発性変異を検知および／または除去するために用いられる他の方法より優れたいくつかの利点をもたらす。変異検知のための分子的方法の信頼性や利用性は、技術的な制約があること、完全に対合したDNA配列に関するバックグラウンド信号水準が高いこと、すべての変異を検知できないことなどにより支配される。ポリアクリルアミドゲル中におけるDNAフラグメントの分離差のみに依存する方法は、サイズによって著しく制約される。変異検知のための化学的方法は、完全に対合した配列に関するバックグラウンド反応性に支配される。酵素法は種々の変異に対するそれらの感度が低く、場合によっては完全に対合したDNAに関するバックグラウンド信号に支配されることが分かった。ミスマッチ修復系、たとえばMutHLS依存性ｄ（ＧＡＴＣ）開裂反応は、ミスマッチの存在に対してきわめて感受性であり、精度が高いので、これらの制約の多くを回避する。ポリメラーゼ取込み違い事象の確率は増幅サイクル数が増すのに伴って増大し、かつ増幅される配列のサイズに比例するので、高い効率および／またはプルーフリーディング能をもつポリメラーゼは、ポリメラーゼ誘発性エラー回数を低下させる能力に限界がある。これに対し本発明方法は増幅事象後に用いられるので、これらの制約を受けない。さらに、本発明方法は感受性および精度のきわめて高いミスペア認識タンパク質の使用に基づくので、サイクル数または増幅配列のサイズと関係なく、大部分のエラーを検知し、除去する。明記すべき例外はＣ- Ｃミスマッチである。これは大腸菌のメチル指向系によっては認識されない。本発明の他の特色および利点は以下の本発明の好ましい態様の記載および請求の範囲から明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、MutHLS二本鎖開裂反応の模式図である。図２は、酵素処理集団の変性および再アニーリング、次いで塩基対ミスマッチを含む分子のMutHLS二本鎖開裂反応の模式図である。図３Ａは、Pfuポリメラーゼを用いて10、20または30サイクルのPCR増幅を行った後に得られた1169bpファージf1遺伝子VIIホモハイブリッドのMutHLS開裂結果を示すグラフである。ｘ軸はPCRサイクル数を表す。ｙ軸は開裂したホモハイブリッド（％）を表す。誤差を表す棒は４回の独立した実験についての標準誤差を示す。図３Ｂは、Taq、VentまたはPfuポリメラーゼを用いて25サイクルの増幅を行った後に得られた1360bp lacＩホモハイブリッドのMutHLS開裂結果を示す。ｘ軸は用いたポリメラーゼの種類を表す。ｙ軸は開裂したホモハイブリッド（％）を表す。誤差を表す棒は４回の独立した実験についての標準誤差を示す。図４は、dNTPプール組成に対するMutHLS開裂の依存性を示すグラフである。ｘ軸はdNTPプールの偏りを表す。ｙ軸は開裂したホモハイブリッド（％）を表す。用いたポリメラーゼは以下のものであった：Pfu（◆）、Vent（●）およびTaq（ ■）。図５Ａは、塩基対ミスマッチおよび導入したｄＧＡＴＣ部位を含むヘテロハイブリッドの模式図である。単一ヌクレオチドの挿入／欠失変異の位置およびｄ（ＧＡＴＣ）部位を示す。これらは約1,000bp離れている。図５Ｂは、ｄＧＡＴＣ部位と近位DNA末端との距離に対するMutHLS開裂の依存性を示すグラフである。ｘ軸は塩基対中における距離を表す。ｙ軸はｄ（ＧＡＴＣ）開裂（％）を表す。図６は、PCRプロセス中に起きるポリメラーゼ誘発性変異を含む配列を除去するためのMutHLS処理の効率を評価する実験計画の模式図である。好ましい実施態様の説明本発明は、核酸を酵素増幅させる間に起こるポリメラーゼエラーの結果である変異の検出および除去に関する方法を包含する。方法は、ミスマッチ修復システムの構成成分の使用を基本としている。そのようなシステムの構成成分および使用法は、「ミスマッチ修復システムを用いるＤＮＡの分析および取り扱い方法」（"Methods of Analysis and Manipulation of DNA Utilizing mismatch Repair Systems"）、WO95/12688、に詳細に記載されており、ここにその全体を参考文献として採用する。ほとんどの場合、配列は、請求の範囲に記載の方法の適用以前に、当業者らに周知の技術によって増幅されるであろう。ＤＮＡのＰＣＲ増幅実施例１−３に記載の実験で用いる基質を作るために、PCR反応を行った。使用したPCRプライマーは、実施例内に具体的に示している。別に記載しない限り、反応（100μl）には、20mM Tris-HCl（pH8.2）、10mM KCl、６mM(NH₄)₂SO₄、４mM MgCl₂、0.1％ Triton X-100、10μg/ml ウシ血清アルブミン（BSA）、１ml のそれぞれのデオキシリボヌクレオシド-５'-三リン酸（dNTP）（Pharmacia Bio tech）、100pmolのそれぞれのプライマー、５μg T4遺伝子32タンパク質（Boehr inger Mannheim）、100ngの鋳型DNAおよび2.5単位の天然型Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）が含まれた。また、合成生成物を均一に標識する反応には、70μ Ciの［α³²P］dTTP（3000Ci/mmol、DuPont／New England Nuclear）が含まれていた。合成生成物を末端標識する反応には、Sambrookら、Molecular Cloning a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harb or，NY，1989、に記載のように、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（Amersham）および［γ³²］ATP（3000Ci/mmol、DuPont/New England Nuclear）で標識した100pmo lの適当なプライマーが含まれていた。PCR反応（15サイクル）は、Perkin Elmer Gene Amp 96000 熱循環器(thermocycler)を用いて、94°Ｃに15秒、60°Ｃに15 秒、そして、400bpの配列を増幅するためには72°Ｃに90秒、1.3kbの増幅には３分、1.7kbには４分および2.5kb配列には６分、インキュベーションすることによって行われた。 Pfu、Vent（New England Biolab）およびTaq（Amersham）ポリメラーゼを比較するPCR反応で用いられるバッファー条件は、製造者らに委ねられた。反応には、それぞれのポリメラーゼならびにそれぞれ200μMのdNTP、それぞれ100pmolのプライマー、５μgのT4遺伝子32タンパク質、15ngの鋳型DNAおよび2.5単位のポリメラーゼを添加した１Ｘバッファーが含まれた。それぞれの反応の容量は、10 0μlであった。DNAを均一に標識する反応には、80μCiの［α³²P］dTTPが含まれた。反応は、25サイクル行ない、それぞれのサイクルは、94°Ｃで15秒、55°Ｃで15行および72°Ｃで30秒からなる。 PCR反応への混入DNAの導入を避けるため、バッファー成分を毎日新しく作成し、反応は、フィルター付ピペットチップを用いて薄膜フローフード内で行った。生成物をフェノールおよびエーテルで抽出し、エタノールで沈殿させ、臭化エチジウムドット法で定量した。サンプル（0.5mlの適当な希釈液）および既知濃度のDNAを、１μg/mlの臭化ブロミド８μlに加え、プラスチックラップ上にスポットした。紫外線誘導蛍光を、CCD冷却画像光度計（Photometrics cooled CCD ima ger）を用いて測定した。PCR生成物濃度は、標準の蛍光との比較によって定量した。ＭｕｔＨＬＳ反応 MutHLS反応は、実施例１−３に記載の実験内で、以下のように行った。変性／再アニーリング(reannealing)反応（20μl）には、2.5μgの標識されていないPCR生成物0.5μgの³²Pで一様に標識したPCR生成物、10mM NaCl、１mM EDT Aおよび50mM Hepes-KOH（pH8.0）が含まれた。新たに調製した10N NaOH（0.6μl ）を最終濃度が300mMになるように加え、混合物を、室温で５分間インキュベートした。酢酸を最終濃度が300mMになるように、KClを100mMになるように、およびリン酸カリウム（pH7.4）を100mMになるように加えることによって、溶液を中和し、そしてDNAを、65°Ｃで30分、次いで37°Ｃで30分、ハイブリダイズした。次に、反応物をシリカマトリックススピンカラム（Pierce Xtreme DNA精製カラム）に結合させ、dH₂Oで溶出して、PCRプライマー、dNTPsおよび塩を除去した。反応（10μl）（Auら、上記）には、50mM Hepes-KOH（pH8.0）、20mM KCl、４ mM MgCl₂、１mM ジチオスレイトール（DTT）、50μg/ml BSA、２mM ATP、おおよそ 10,000cpmのPCR DNA（50-200ng）、250ngのMutS（Suら、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，83，5057，1986）、600ngのMutL（Grilleyら、J．Biol．Chem.，264，10 00，1989）および0.9ngのMutH（Welshら、J．Biol．Chem.，262，15624，1987）が含まれた。DNAおよびバッファー成分を37°Ｃに８分間、プレインキュベート( preincubate)し、前もって混合しておいたMutH、MutLおよびMutS溶液を加えることによって、反応を開始し、インキュベーションを37°Ｃで15分間続けて、一本鎖切断生成物を作製した。DNA生成物は、0.5μlの0.5M EDTAならびに0.05％のブロモフェノールブルーおよび0.05％のキシレンシアノールを含む20μlの脱イオン化したホルムアミドを加えた後、89mM Tris、89mMホウ酸、２mM EDTA（最終pH 8.5）および８Ｍ尿素中、６％のポリアクリルアミド電気泳動によって、分析された。DNA片をオートラジオグラフィーによって可視化し、Molecular Dynamics Phosphorimagerを用いて定量した。実施例１：増幅中のポリメラーゼエラーはホモハイブリッド生成物のｄ（ＧＡＴＣ）の切断を説明するハイブリッドで見られるMutS-依存性ｄ（ＧＡＴＣ）切断が、DNA調製中に受けた損傷によるものか、またはPCR増幅中に導入された遺伝子変異によるものかを決定するために、そのような切断レベルのPCR反応条件による依存性について試験した。 1169bpのファージf1遺伝子VII配列は、Ivey-Hoyleら（Ivey-Hoyleら、J．Mol ．Biol.，224：1039，1992）のプラスミド鋳型から、Pfuポリメラーゼを用いて1 0、20または30サイクル、増幅させた。長さ1360bpの野生型lacＩ配列は、Mattes onら（Mattesonら、Nucleic Acids Res.，19，3499，1991）のプラスミドクローンから、Pfu、VentまたはTaqポリメラーゼを用いて、25サイクル、増幅させた。 lacＩおよびファージf1遺伝子VII配列は両方とも、前方プライマー（foward pri mer）としてＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴ（配列番号：１）を、および逆プライマー（reverse primer）としてＡＴＧＣＡＧＣＡＡＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡＣＧ（配列番号：２）を用いて、増幅させた。PCR生成物は、興味ある遺伝子フラグメントならびに周辺のベクター配列からなる。ファージf1遺伝子 VI I配列およびlacＩハイブリッド分子の両方を、変性および再アニーリング段階によって調製した。 MutHによって切断された増幅されたファージf1遺伝子VIIホモハイブリッドの画分は、サイクルの数で増加し（図３Ａを参照のこと）、その結果は、サイクルに依存するDNA損傷またはポリメラーゼが誘導する変異と一致した。しかしながら、ホモハイブリッドの切断の程度は、また、PCR増幅に用いられたポリメラーゼにも依存することが分かった。このように、増幅されたlacＩホモハイブリッドの切断は、増幅にTaqポリメラーゼを用いた場合に最も高く、Ventポリメラーゼでは中間、Pfuポリメラーゼでは最も低かった（図３Ｂを参照のこと）。これらの結果は、３’から５’に編集するエキソヌクレアーゼの不在によるTaqポリメラーゼのより低い忠実度と共に、これらの酵素によるエラー率に相当する（Lu ndbergら、上記；Mattilaら、上記：Tindallら、上記）。熱循環に関連する低レベルの鋳型損傷を排除することはできないが、これらの見識は、ホモハイブリッドバックグラウンドシグナルの大部分が、増幅中に起こるポリメラーゼエラーによることを、示している。実施例２：ＰＣＲ増幅中に偏ったｄＮＴＰプールを使用することによるヌクレオチド−置換エラーの検出能の測定 dNTPプールの不均衡は、DNAポリメラーゼによるインビトロでの合成中のエラー率を増加へと導く（Kunkelら、J．Biol．Chem.，254，5718，1979；Fersht，P roc．Natl．Acad．Sci．USA，76，4946，1979）。この発見は、PCRエラーを検出するMutHLS反応の有効性を試験するために用いられた。これらの実験のために、長さ1360bpの野生型lacＩ配列は、Pfu、VentまたはTaqポリメラーゼを用い、dGT Pプールの不均衡条件下で、15サイクル、増幅させた。野生型lacＩ配列は、Matt esonら（Mattesonら、Nucleic Acids Res.，19，3499，1991）のプラスミドクローンから、前方プライマーとしてＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴ（配列番号：１）および逆プライマーとしてＡＴＧＣＡＧＣＡＡＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡＣＧ（配列番号：２）を用いて、増幅させた。PCR生成物は、興味ある遺伝子フラグメントならびに周辺のベクター配列からなっていた。等モル条件下では、個々のdNTPは、１mMで存在させた。dGTPの濃度は、その他の反応ではすべて２mMであり、その他の３つのdNTPsの濃度は、それぞれ667μM、200μMおよび20 μMであった。PCR生成物を変性させ、再アニーリングし、MutHLS切断にかけ、そして生成物を前記の方法に従って分析した。図４に示したように、ホモハイブリッドのｄ（ＧＡＴＣ）切断は、dGTO濃度バイアスに依存した。Taqポリメラーゼを用いた増幅から誘導されたホモハイブリッドは、PfuおよびVentポリメラーゼを用いて同条件下で増幅させたホモハイブリッドより大きく、MutHLS-依存性ｄ（ＧＡＴＣ）切断を受けた。dGTPがその他のdNTPsより100倍モル過剰に存在させてTaqポリメラーゼを用いる反応では、無視できる程度のPCR生成物が得られた。酵素は、３'エキソヌクレアーゼ活性を欠矢しているので、取り込み違いによるd NTPが高レベルになると、読み終わりが導入される（Innisら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，85：9436，1988）。同様に、Ventポリメラーゼを用いて増幅させたホモハイブリッドは、Pfuポリメラーゼを用いて増幅させたホモハイブリッドより、より広範囲に切断された（図４参照）。ポリメラーゼの取り込み違いによるエラーは、それ故、MutS-依存ｄ（ＧＡＴＣ）切断によって、容易に検出できる。実施例３：活性化ＭｕｔＨによる切断効率の、ｄ（ＧＡＴＣ）サイトとＤＮＡヘテロハイブリッド末端との間の距離への依存性不適正塩基対に高い感受性を持つにもかかわらず、MutHLS反応は、興味ある配列がｄ（ＧＡＴＣ）サイトを含む場合にのみ変異のスクリーニングに用いることができる。ｄ（ＧＡＴＣ）サイトの欠損した配列をスクリーニングするためにPC Rプライマー内へｄ（ＧＡＴＣ）サイトを導入する可能性を測定するために、DNA 末端からｄ（ＧＡＴＣ）サイトへの距離による反応依存性について評価した（図５Ａを参照のこと）。ファージf1MR21および（ファージf1MR21と関連する一つの外部ヌクレオチドを含む）f1MR22の複製形を、以下の逆PCRプライマー：ＧＡＴＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＴＴＴＴＧＣＧＧ（配列番号：３）（1470bpのPCR生成物）；ＡＧＡＣＣＧＧＡＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＡＡＣ（配列番号：４）（1528bpの PCR生成物）；ＧＣＣＣＣＡＡＡＧＡＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣ（配列番号：５）（1578bpのPCR生成物）；ＴＴＡＴＡＧＴＣＡＧＡＡＧＣＡＡＡＧＣＧＧ（配列番号：６）（1624bpのPCR生成物）；ＧＧＡＴＡＧＣＧＴＣＣＡＡＴＡＣＴＧＣＧＧ（配列番号：７）（1743bpのPCR生成物）；ＡＴＣＡＴＡＡＣＣＣＴＣＧＴＴＴＡＣＣＡＧ（配列番号：８）（1845bpの生成物）および同一の前方プライマーＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＴＡＧＴＴＴＧＡ（配列番号：９）：を用いて、15サイクル増幅させた後、ヘテロハイブリッドを調製した。ファージf1MR 22は、複製型ファージf1MR1（Suら、上記）内に合成オリゴヌクレオチド二本鎖（Parsonら、Cell，75，1227，1993）を挿入することによって構築された。PCR 生成物を増幅し、変異体および野生型DNAから得られたPCR生成物の混合物を変性し再アニーリングすることによって、ヘテロハイブリッドを調製した。ヘテロハイブリッドをMutHLS反応にかけ、前記の方法に従って分析した。これらのヘテロハイブリッドで認められた最大の切断は、多分、変異体とｄ（ＧＡＴＣ）サイトの間の距離の大きさ（1,000bp）を反映して、20％であった。図５Ｂに示すように、誤対合により刺激される切断効率は、50-150bpの範囲では、先端末端からｄ（ＧＡＴＣ）サイト、の距離の増加と共に増加し、それより大きい距離では最大に達する。これらの結果は、末端から50-100ヌクレオチドにｄ（ＧＡＴＣ）サイトを持つPCRプライマーは、増幅目的およびそれに続くMutH、MutLおよびMutSを用いた変異体のスクリーニングに提供するのに充分であろうことを、示唆している。実施例４：ＭｕｔＨＬＳ反応、次いでゲル電気泳動を用いたポリメラーゼ−生成変異体を含む分子の除去酵素増幅させた分子の集団を、変性／再アニーリング反応にかける。10mM NaC l、１mM EDTAおよび50mM Hepes-KOH（pH8.0）の濃度を持つ、増幅生成物溶液（2 0μl）を作成した。新たに調製した10N NaOHを最終濃度が300mMになるように加え、混合液を、室温で５分間インキュベートする。最終濃度が300mMになるように酢酸を、100mMになるようにKClを、100mMになるようにリン酸カリウム（pH7.4 ）を加えることによって溶液を中和し、そして、DNAを、65°Ｃで30分間、次いで37°Ｃで30分間、ハイブリダイズさせた。次いで、反応物をシリカマトリックススピンカラム（Pierce Xtreme DNA精製カラム）に結合させ、dH20で溶出して、PCR プライマー、dNTPsおよび塩を除去した。 MutHLS反応は、50mM Hepes-KOH（pH8.0）、20mM KCl、４mM MgCl₂、１mMジチオスレイトール（DTT）、50mg/ml BSA、２mM ATP、PCR DNA（50-200ng）、500ng MutS、1200ng MutLおよび1.8ng MutHを含む10μlで行うか、または、必要とされる容量に調製する。DNAおよびバッファー成分を、37°Ｃに８分間プレインキュベートし、前もって混合したMutH、MutLおよびMutSの溶液を加えることによって反応を開始し、インキュベーションを、37°Ｃで45分間、続けた。さらにMutS （500ng）、MutL（1200ng）およびMutH（1.8ng）を加えることによって反応を補足し、37°Ｃでさらに45分間インキュベートする。二本鎖切断生成物を作成する。 EDTA（最終濃度６mM）およびSDS（最終濃度0.1％）で反応を消光した後、未変性アガロースまたはポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって、変異を含まない配列を多く含む未切断画分を、DNAの大きさによって、単離することが出来る。この技術分野で周知の方法（Ausubel，F．M．ら、Current Protocols in Mole cular Biology,John Wiley and Sons Inc.）に従って、ゲルから所望のフラグメントを単離することができる。実施例５：さらなる増幅に不活発なポリメラーゼ生成変異を含む分子の除去実施例４に記載の方法に従って、DNA分子の集団を酵素増幅し、変性、再アニーリング、およびMutHLS二本鎖切断にかける。DNA生成物（約250ng）を、50mM T ris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl₂、１mM DTT、50μg/ml BSA、25μMのそれぞれのジデオキシヌクレオシド-５'-三リン酸（ddGTP、ddATP、ddCTPおよびddTTP）およびエキソヌクレアーゼを含まないクレノーDNAポリメラーゼ（１単位）中、37 °Ｃで３時間、インキュベートする。EDTAを20mMになるように加え、フェノール次いでエーテルで抽出することによって、反応を消光する。シリカマトリックススピンカラムを用いて取り込まれなかったddNTPsを除去した後（実施例４を参照のこと）、得られたDNA分子の集団を、要求に応じて、さらにPCR反応にかけることもできる。実施例６：ＭｕｔＨＬＳ反応、次いで酵素分解を用いる、ポリメラーゼ生成変異を含む分子の除去５'-OH末端を持つプライマーを用いてDNA分子の集団を酵素増幅し、実施例４記載の方法に従って、変性、再アニーリングそしてMutHLS二本鎖切断にかける。次に、DNA生成物（50ng）を、67mMのグリシン-NaOH（pH9.4）、25mM MgCl₂、50 μg/ml BSA、および2.5単位のλエキソヌクレアーゼを含む100μlの反応物中、3 7°Ｃで60分間、インキュベートする。次いで、エキソヌクレアーゼ（0.1単位）を加え、37°Ｃでさらに30分間、反応を続けた。EDTAを20mMになるように加えることによって、反応を終結させ、フェノール次にエーテルで抽出して、エキソヌクレアーゼを除去する。次いで、要求に応じて、集団をさらなる増幅にかける。実施例７：ポリメラーゼ生成変異を含む酵素増幅ＤＮＡ集団の画分の定量具体的なプライマー、PCRサイクルおよび条件ならびに用いられるポリメラーゼは、増幅される具体的配列、および当業者らに親しまれた技術および方法に基づいた増幅方法の目的によって、決定される。MutHLS反応（一本鎖または二本鎖切断）、切断および未切断分子の分離、および定量は、前記の方法に従って、行うことができる。蛍光標識および臭化エチジウムでの染色のような、その他の標識化、可視化、および核酸に用いられた定量技術は、当業者らに周知であり、本発明の態様での使用に適している。実施例８：ＰＣＲ生成物のプールから変異を含む分子を除去するＭｕｔＨＬＳ処理効率の測定繊維状バクテリオファージは、その全体が必須遺伝子からなる：しかしながら、遺伝子IIとIVの間に、外来DNAを挿入できる非コード領域が存在する。この領域は、バクテリオファージ粒子内でのDNAのパッケージングおよび方向付けのためのシス−活性化シグナル、DNA合成の開始および終結部位、ならびに転写のρ −非依存性終結シグナルを含む。この領域内に外来DNAセグメントが存在すると、複製を調節するシス−活性化エレメントを崩壊させることができる。共通に用いられる繊維状ファージベクターはすべて、それ故、そのような崩壊を補償する変異を、遺伝子IIまたはＶに含む。 Messingおよび共同研究者ら（Messing，J．New M13 Vector for Cloning，Met hods Enzymol.，101：20-78，1983）は、M13の遺伝子IIとIVの遺伝子内領域に、調節配列および大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacＺ）の最初の146アミノ酸のコード情報を挿入することによって、一連のバクテリオファージM13-lacハイブリッドベクターを作り出した。これらM13ハイブリッドファージの宿主細胞は、アミノ酸11-41を欠損した酵素的に不活性なポリペプチドをコードすると言う事実により欠失しているβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を持つＦ'プラスミドを含んでいる。M13-lacハイブリッドベクターを感染させた細胞内で生成されたβ-ガラクトシダーゼのアミノ酸末端フラグメントは、欠失した宿主のポリペプチドと提携して、酵素的に活性なタンパク質が形成される（これは、α-相補性と呼ばれる）。このことは、遺伝的に不活性なβ−ガラクトシダーゼ遺伝子フラグメントとは対照的に、機能性を持つベクターを識別する色素試験を発色させた。適当なＦ’エピソームを持つ宿主上に塗布した場合、野生型のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子フラグメントをコードするベクターは、培地が誘発物質IPTGおよび色素を形成するβ-ガラクトシダーゼ基質であるX-GALを含む場合、青色のプラークを形成するであろう。これとは対照的に、変異によるか、または外来DNAの挿入によるファージlacＺ領域の崩壊は、α-相補性をブロックし、結果として淡い青色または無色のプラークを生ずる。この原理は、DNAポリメラーゼの複製忠実性を評価するアッセイの開発に利用された（Benenek，K．およびKunkel，T．A.，Analyzing Fidelity of DNA Polym erases．Method Enzymol.，262：217-232，1995）。この方法では、ファージlac Ｚ配列に及ぶ一本鎖のギャップを含むM13の基質が構築された。次いで、興味あるポリメラーゼによってギャップを満たし、反応生成物を、α-相補性を補う大腸菌宿主細胞内に導入し、X-GALおよびIPTGの存在内に塗布した。ギャップを満たしているDNA合成に誤りがないならば、生成されたβ-ガラクトシダーゼペプチドは、宿主の欠失したβ-ガラクトシダーゼを補足し、X-GALは、これらの細胞内で加水分解されて青色のプラークを生ずるであろう。淡い青色または透明なプラークは、キャップを満たす反応中に作られる間違いが、結果として相補能力を持たないアミノ酸配列の変化したβ-ガラクトシダーゼポリペプチドを生成させる場合に、生ずる。この忠実度のアッセイの変更を用いて、PCR段階の間に起こるポリメラーゼ誘導変異を含む配列を除去するMutHLSの処理効率を評価した。図６に概説するように、β-ガラクトシダーゼ遺伝子フラグメントに及ぶM13mp18領域をポリメラーゼ鎖反応を用いて増幅させ、生成物を変性させ、再アニーリングした。次いで、ポイントミューテーションまたは小さな挿入および欠損を含む分子の両鎖を切断するために、MutHLS処理を行い、そのような分子の二本鎖切断を行った。次いで、全長の生成物を単離し、そしてPCR生成物に関連する領域の除去されたM13mp18分子内に連結させ、こうすることにより、野生型のM13mp18フラグメントを、関連するPCR生成物で置き換えた。次いで、連結生成物を大腸菌細胞内にトランスフェクトし、IPTG、X-GALおよび適当な宿主株の存在下で塗布した。暗青色のプラークの存在は、野生型のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子フラグメントを含むクローンを示し、淡青色または透明なプラークはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子内に変異を含むクローンを示す。MutHLSで処理した分子内のプラーク全体に対する淡青色および透明のプラークの割合を未処理分子内の相当する割合と比較すると、変異体配列の存在の減少程度が示される。ＤＮＡのＰＣＲ増幅興味ある390bpのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子セグメントに及ぶM13mp18の1611 塩基対（bp）フラグメントを増幅させた。ウイルスストランド配列に関しては、 DraIIIサイトをPCR生成物の５'末端から25bpに置き、BglIIサイトをPCR生成物の３'末端から134bpに置く（図６参照）。PCR反応（100μl）には、50mM KCl、10m M Tris-HCl（pH8.3）、２mM MgCl₂、200μMのそれぞれのdNTP（Pharmacia）、10 0pmolのそれぞれのプライマー（５'-OH末端を持つ長さ21のヌクレオチド；Oligo s Etc.，Guliford，CT）、５μgのT4遺伝子32タンパク質（Boehringer Mannheim ）、50μgの鋳型DNA（M13mp18）、および2.5単位のAmpliTaq DNAポリメラーゼ（ Perkin Elmer）が含まれた。前方プライマーの配列は、M13mp18内のヌクレオチド5458-5478に相当する５'-ＴＴＡＴＡＣＧＴＧＣＴＣＧＴＣＡＡＡＧＣＡ-３’（配列番号：１０）であり、逆プライマーの配列は、M13mp18のヌクレオチド7048-7069に相当する５'-ＡＡＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡＡＴＧＴＧＴＡＧＧ-３’（配列番号：１１）であった。反応（30サイクル）は、94°Ｃで15秒、60°Ｃで15秒、および72°Ｃで１分間インキュベーションするPerkin E lmer Gene Amp 9600熱循環器を用いて行われた。95°Ｃで１分間加熱し、65°Ｃで60分間インキュベーションし、次いで37°Ｃで30分間インキュベーションすることによって、生成物を変性させ、すぐに再アニーリングし、次いで増幅させた。次いで、EDTAを20mMになるように加え、反応物をフェノールで抽出し、次に、シリカマトリックススピンカラム（Pierce Xtreme DNA精製カラム）に結合させ、蒸留水で溶出して、PCRプライマー、dNTPsおよび塩を除去した。生成物を、以下のような臭化エチジウムドット法によって定量した：サンプル（2.0μlの適当に希釈した液）および既知濃度のDNAsを１μg/mlの臭化エチジウム８μlに加え、プラスチックラップ上にスポットした。UV-誘導蛍光は、光度計（photometric cooled charge coupled device imager）を用いて測定した。ＰＣＲ生成物の濃度は、標準の蛍光と比較することによって、定量した。ＭｕｔＨＬＳ反応反応（全体で50μl）を、以下のように組み立てた：20μlの125mM HEPES（pH8 .0）、50mM KCl、2.5mMジチオスレイトール（DTT）、125μl/mLウシ血清アルブミン（BSA）、５mM ATP、10mM MgCl₂、および１μgのPCR DNAを37°Ｃに８分間プレインキュベートした。次いで、あらかじめ混合しておいた、５μg MutS（Su ，S.-S．およびModrich，P.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，83，5057-5061 ，1986）、12μg MutL（Grilley，M.，Welch，K．M.，Su，S.-S．およびModrich ，P.，J．Biol．Chem.，264，1000-1004，1989）および18ngのMutH（Welsh，K． M.，Lu，A.-L.，Clark，S．およびModrich，P.，J．Biol．Chem.，262，15624-1 5629.，1987）の溶液30μlを、20mMのリン酸カリウム（pH7.4）、50mM KCl、0.1 mM EDTA、１mM DTTおよび１mg/ml BSA中に加えることによって、反応を開始した。インキュベーションを37°Ｃで45分間続けた。次に、上記のバッファーと同一バッファー中に５μg MutS、12μg MutLおよび18ng MutHをあらかじめ混合しておいたさらなる溶液30μl、ならびに500mM HEPES（pH8.0）、200mM KCl，10mM D TT、20mM ATPおよび40mM MgCl₂を含む３μlの10Ｘバッファー溶液を加えた。インキュベーションを、さらに37°Ｃで45分間続けた。次いで、上記のバッファーと同一バッファー中に５μ g MutS、12μg MutLおよび18ng MutHをあらかじめ混合しておいたさらなる溶液3 0μl、ならびに500mM HEPES（pH8.0）、200mH KCl、10mM DTT、20mM ATPおよび4 0mM MgCl₂を含む３μlの10Ｘバッファー溶液を加えた。インキュベーションを、さらに37°Ｃで45分間続けた。EDTAが10mMになるように加えることによって、反応を終結させ、フェノールで抽出し、次いでエーテルで抽出した。次いで、DNA をQiagenカラム（QIAquickスピンカラム）に結合させ、蒸留水で溶出して、DNA を濃縮し、タンパク質、塩およびその他の反応成分のすべてを除去した。制限消化およびゲル精製 MutHLS処理後、１μg DNA、100μM NaCl、50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgC l₂、１mM DTT、100μg/mlのウシ血清アルブミン、４単位のBglII（New England Biolabs）および10単位のDraIII（Amersham）を含む20μlの反応液中のDraIIIおよびBglＩで、DNAを消化した。反応成分を37°Ｃで２時間インキュベートし、そしてEDTAを10mMになるように加えることによって、反応を停止させた。生成物をエタノールで沈殿させ、次いで40mM Tris-アセテート、１mM EDTA（最終pH7.5）中、１％アガロースで電気泳動を行った。全長のバンド（M13mp18のDraIII/BglI Iフラグメントに相当する）は、製造者の推薦に従って、Gene Clean Kit（Bio 1 01）を用いて回収した。回収したDNAは、上記の臭化エチジウムドット法を用いて定量した。連結反応 M13mp18のDraIII/BglIIフラグメントに相当するPCR生成物を、MutHLS処理し、 DraIII/BglII消化し、そしてゲル精製した後回収し、DraIII/BglIIフラグメントが除去されたM13mp18誘導体内に連結した。連結反応（20μl）は、50ng PCR DNA フラグメント、50ng M13mp18（DraIII/BglIIフラグメントを含まない）、66mM T ris-HCl（pH7.6）、6.6mM MgCl₂、10mM DTT、66μM ATPおよび0.5Weiss単位のT4 DNAリガーゼを含んでいた。反応を16°Ｃで12-16時間インキュベートした。トランスフェクション以下のプロトコールに次いで、連結反応生成物を、XL2-Blue Ultracompetent Cells（Stratagene）内にトランスフェクトした。トランスフェクション反応のアリコート（50μl）を、４mlのLuria-Bertani軟寒天、４mgのX-GAL（Amersham ）および800μgのIPTG（Amersham）を含む49°Ｃのチューブに加えた。次いで、 200μlの対数増殖培養物のXLI-Blueを加えた。軟寒天混合物をLuria-Bertaniプレート上に注ぎ、凝固させた。プレートを37°Ｃで12-16時間インキュベートすると、3,000から12,000のプラークが、変異体または野生型として、色で記録された。３つの独立したPCR増幅DNAサンプルから得られた結果を表１に要約した。上記したように、暗青色のプラークは、野生型のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子フラグメントを含むクローンの存在を示し、淡青色または透明のプラークは、この領域内のどこかに変異を含むクローンの存在を示す。このアッセイから、390bpのβ- ガラクトシダーゼフラグメントの内114の位置の単一の塩基が置換された変異、ならびに150の位置に単一のヌクレオチドフレームシフトが検出される（Eckert ，K．A．およびKunkel，T．A.，Nucl．Acids Res.，18，3739-3744，1990）。表１に示すように、MutHLS二本鎖切断反応は、変異プラークの発生を88-93％程度まで、減少させた。変異頻度＝100Ｘ（変異プラーク数／全プラーク数）その他の実施態様は、以下の請求の範囲の内にある。

Claims

【特許請求の範囲】１．酵素により増幅されたDNA二本鎖の集団中の、ひとつまたはそれ以上のポリメラーゼ誘発性変異を含むDNA分子を除去する方法であって、 DNA二本鎖集団を変性して再アニーリングし、再アニーリングしたDNA二本鎖をミスマッチ修復系と接触させて、各々の鎖を塩基対のミスマッチを含むDNA二本鎖において分断し、そして分断したDNA二本鎖を未分断DNA二本鎖から分離することからなる、除去方法。２．分離をゲル電気泳動により行う、請求項１記載の方法。３．酵素により増幅されたDNA二本鎖の集団中の、ひとつまたはそれ以上のポリメラーゼ誘発性変異を含むDNA分子を、５'-ヒドロキシル末端を含むプライマーを用いて除去する方法であって、 DNA二本鎖集団を変性して再アニーリングし、再アニーリングしたDNA二本鎖をミスマッチ修復系と接触させて、塩基対のミスマッチを含むDNA二本鎖中の各々の鎖を分断し、そしてさらに、再アニーリングしたDNA二本鎖集団をエキソヌクレアーゼと接触させて、塩基対ミスマッチを含むDNA二本鎖を酵素により分解することからなる、除去方法。４．ミスマッチ修復系が大腸菌のメチル指向性ミスマッチ修復系の成分を含み、そしてMutS，MutLおよびMutH蛋白質を含む、請求項１または３記載の方法。５．酵素により増幅されたDNA二本鎖の集団中の、ひとつまたはそれ以上のポリメラーゼ誘発性変異を含むさらなる増幅DNA分子を、さらなる増幅に対して不活性化する方法であって、 DNA二本鎖集団を変性して再アニーリングし、再アニーリングしたDNA二本鎖をミスマッチ修復系と接触させて、塩基対のミスマッチを含むDNA二本鎖において各々の鎖を分断し、そしてさらに、分断したDNA二本鎖集団をジデオキシヌクレオシド-５'-三リン酸およびDNAポリメラーゼと接触させることからなる、不活性化方法。６．ミスマッチ修復系が大腸菌のメチル指向性ミスマッチ修復系の成分を含み、そしてMutS，MutLおよびMutH蛋白質を含み、そしてジデオキシヌクレオシド- ５'-三リン酸がジデオキシグアノシン-５'-三リン酸である、請求項５記載の方法。７．DNAポリメラーゼ誘発性変異を含む、酵素により増幅された集団の画分を測定する方法であって、以下の工程： DNA二本鎖集団を変性して再アニーリングし、再アニーリングしたDNA二本鎖をミスマッチ修復系と接触させて、塩基対のミスマッチを含むDNA二本鎖において少なくとも一方の鎖を分断し、そして分断したDNA二本鎖を未分断DNA二本鎖から分離し、そして未分断DNA二本鎖に対する分断したDNA二本鎖の画分を、ポリメラーゼ誘発性変異を含む酵素により増幅したDNAの画分の指標として測定することからなる、測定方法。８．ミスマッチ修復系が大腸菌のメチル指向性ミスマッチ修復系の成分を含み、そしてMutS，MutLおよびMutH蛋白質を含む、請求項７記載の方法。９．酵素により増幅されたDNA二本鎖の集団中の、ポリメラーゼ誘発性変異の存在を検出する方法であって、 DNA二本鎖集団を変性して再アニーリングし、再アニーリングしたDNA二本鎖をミスマッチ修復系と接触させて、二本鎖の少なくとも一方の鎖においてエンドヌクレアーゼ分解性切断の導入によりポリメラーゼ誘発性変異を含む二本鎖を修飾し、そしてポリメラーゼ誘発性変異の存在の指標としてエンドヌクレアーゼ分解性切断による産物を検出することからなる、検出方法。 10．エンドヌクレアーゼ分解性切断の産物の検出を変性条件下の変更された電気泳動移動度により行う、請求項９記載の方法。 11．ミスマッチ修復系が大腸菌のメチル指向性ミスマッチ修復系の成分を含み、そしてMutS，MutLおよびMutH蛋白質を含む、請求項９記載の方法。 12．ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受けやすい配列を欠くDNA二本鎖から生成した、酵素により増幅されたDNA二本鎖の集団中の、ポリメラーゼ誘発性変異の存在を検出する方法であって、ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受けやすい配列を含むプライマーを利用してDNA分子集団を酵素により増幅し、 DNA二本鎖集団を変性して再アニーリングし、ポリメラーゼ誘発性変異を含む二本鎖の少なくとも一方の鎖中にエンドヌクレアーゼ分解性切断を導入する条件下で、再アニーリングしたDNA二本鎖をミスマッチ修復系と接触させ、そしてポリメラーゼ誘発性変異の存在の指標としてエンドヌクレアーゼ分解性切断による産物を検出することからなる、検出方法。 13．ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受けやすい配列がｄ（ＧＡＴＣ）部位である、請求項12記載の方法。 14．エンドヌクレアーゼ分解性切断の産物の検出を変性条件下の変更された電気泳動移動度により行う、請求項12記載の方法。 15．ミスマッチ修復系が大腸菌のメチル指向性ミスマッチ修復系の成分を含み、そしてMuts，MutLおよびMutH蛋白質を含む、請求項12記載の方法。 16．５'-ヒドロキシル末端を有するプライマー、ミスマッチ修復系の成分、およびエキソヌクレアーゼを含む、DNA分子を増幅して、酵素により増幅されたDNA二本鎖の集団内のひとつまたはそれ以上のポリメラーゼ誘発性変異を含むDNA分子を除去するためのキット。 17．ミスマッチ修復系の成分、ジデオキシヌクレオシド-５'-三リン酸、および DNAポリメラーゼを含む、酵素により増幅されたDNA二本鎖の集団内のひとつまたはそれ以上のポリメラーゼ誘発性変異を含むDNA分子をさらなる増幅に対して不活性にするためのキット。 18．ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受けやすい配列を含むプライマー。およびミスマッチ修復系の成分を含む、ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受けやすい配列を欠くDNA二本鎖分子を増幅して、酵素により増幅されたDNA二本鎖の集団中のひとつまたはそれ以上のポリメラーゼ誘発性変異を含むDNA分子を検出または除去するためのキット。 19．ミスマッチ修復系、およびエキソヌクレアーゼを含む、酵素により増幅されたDNA二本鎖の集団内のひとつまたはそれ以上のポリメラーゼ誘発性変異を含むDNA分子を除去するためのキット。 20．ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受けやすい配列を欠くDNA二本鎖から生成された酵素により増幅されたDNA二本鎖の集団中の、ひとつまたはそれ以上のポリメラーゼ誘発性変異を含むDNA分子を除去する方法であって、ミスマッチにより誘発されるエンドヌクレアーゼ分解性開裂を受けやすい配列を含むプライマーを利用してDNA分子集団を酵素により増幅し、 DNA二本鎖集団を変性して再アニーリングし、再アニーリングしたDNA二本鎖をミスマッチ修復系と接触させて、各々の鎖を塩基対のミスマッチを含むDNA二本鎖において分断し、そして分断したDNA二本鎖を未分断DNA二本鎖から分離することからなる、除去方法。