JPH05308999A - Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅ−Ｃ変異の判定法 - Google Patents

Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅ−Ｃ変異の判定法

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JPH05308999A
JPH05308999A JP4116293A JP11629392A JPH05308999A JP H05308999 A JPH05308999 A JP H05308999A JP 4116293 A JP4116293 A JP 4116293A JP 11629392 A JP11629392 A JP 11629392A JP H05308999 A JPH05308999 A JP H05308999A
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mutation
hepatitis
virus
restriction enzyme
primer
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Takuya Koshizaka
卓也 越坂
Hiroaki Okamoto
宏明 岡本
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Sumitomo Metal Industries Ltd
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

(57)【要約】 【構成】 Ｂ型肝炎ウイルスのpre-C 変異部位を含む一
定領域を増幅することができ、かつ増幅されたＤＮＡに
おいて変異の有無によって異なる制限酵素切断パターン
を与えるよう、変異部位の近傍にミスマッチ塩基を導入
して設計したプライマーセットを用いて、ポリメラーゼ
チェインリアクション法によりＤＮＡ増幅を行い、変異
に特異的な制限酵素による切断のパターンを調べて、Ｂ
型肝炎ウイルスのpre-C 変異の判定あるいは変異したウ
イルスの比率を測定する。 【効果】 簡易な操作により、短時間でしかも正確にＢ
型肝炎ウイルスpre-C 変異の判定が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｂ型急性肝炎の予後を
予測するのに有用な、Ｂ型肝炎ウイルスのpre-C 変異の
判定方法およびそれに用いる試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｂ型肝炎ウイルス感染初期にはＨＢｅ抗
原が血中に検出されるが、持続感染中にＨＢｅ抗原が消
失し、ＨＢｅ抗体が検出されるようになる(seroconvers
ion)。この現象は、従来より感染していたＢ型肝炎ウイ
ルス野生株が徐々に減少し、長期の持続感染においてプ
レコア (pre-C)領域に変異を生じＨＢｅ抗原を分泌でき
なくなったＢ型肝炎ウイルス変異株が増加するものであ
ることが明らかとなってきた。さらにこれらのＨＢｅ抗
原を分泌できなくなったＢ型肝炎ウイルス変異株は野生
型に比較してＢ型劇症肝炎を誘発し易いことがわかって
きている。
【０００３】これまで臨床的にＢ型急性肝炎の予後を予
測するウイルス側のマーカーは存在しなかったが、ウイ
ルスゲノムのpre-C 領域の塩基配列の解析により急性肝
炎の予後を予測することが可能となると考えられる。
【０００４】Ｂ型肝炎ウイルスpre-C 変異株ではpre-C
領域の開始コドンから83番目の塩基がＧからＡに点変異
を起こしている。この結果、28番目のアミノ酸をコード
すコドンはＴＧＧ(Trp) からＴＡＧ(stop)になりＨＢｅ
抗原の前駆蛋白が産生されず、ＨＢｅ抗原を分泌できな
くなっている。さらに83番目と86番目の２つの塩基がと
もにＧからＡに変異を起こしているものも、ウイルス血
症を伴う比較的重篤な慢性肝疾患には多く見いだされて
いる。従来、このＢ型肝炎ウイルスの変異の判定は、ポ
リメラーゼチェインリアクション法 (ＰＣＲ法) によ
り、当該変異部位を含有する部分をＤＮＡ増幅し、この
部分を他の適切なクローニング用プラスミドに連結後、
この組み替え体を単離精製し、シークエンス反応を行う
方法で判定されてきた (Y.Kosaka et al., Gastroenterology, Vol.100, 1087-
1094, 1991、H.Okamoto et al., J.Virology, Vol.64,
1298-1303, 1990、岡本宏明、実験医学 Vol.9, 1263-12
68, 1991 、赤羽賢浩、岡本宏明、臨床医 Vol.16, 586-
589, 1990) しかしながら、この方法で用いられる判定方法は、クロ
ーニングおよびシークエンス操作に時間と手間がかかり
多数検体の処理には不向きである。さらに、野生株と変
異株が同時に混在している場合、その変異率の程度を調
べるためには、数十個のクローンについて同時に調べる
必要があり、実用上の使用は困難である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、従来のＢ型肝炎ウイルス変異の判定法の判定上の問
題点を解決し、簡易な操作により、迅速にしかも正確に
Ｂ型肝炎ウイルス変異の判定を可能にするＢ型肝炎ウイ
ルス変異判定方法およびそれに用いる試薬を提供するこ
とである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｂ型肝炎
ウイルスの該変異部位を含む領域をＰＣＲ法により増幅
する際に、使用するプライマーを工夫することにより、
Ｂ型肝炎ウイルスpre-C 変異株の検出を簡易にしかも精
度よく行えることを見いだし、本発明を完成させるに至
った。
【０００７】すなわち、本発明は、以下の(1) 〜(4) の
工程からなる、Ｂ型肝炎ウイルスを含有するサンプルか
らＢ型肝炎ウイルスのpre-C 変異を判定する方法を要旨
とする。
【０００８】(1) Ｂ型肝炎ウイルスのpre-C 変異部位を
含む一定領域を増幅することができるプライマーセット
であって、増幅されたＤＮＡにおいて変異の有無によっ
て制限酵素による認識が異なるように、変異部分の近傍
にミスマッチ塩基を導入して設計したプライマーを含む
プライマーセットを用いて、ＰＣＲ法によりＤＮＡ増幅
を行う。
【０００９】(2) 増幅されたＤＮＡを、増幅されたＤＮ
Ａにおいてpre-C 変異に特異的な制限酵素で処理する。
【００１０】(3) 制限酵素処理されたＤＮＡまたはその
断片を分別、検出する。
【００１１】(4) 制限酵素による切断のパターンを調べ
てＢ型肝炎ウイルスのpre-C 変異株を検出、あるいは変
異したウイルスの比率を評価する。
【００１２】上記方法の(1) 工程で使用するプライマー
セットは、第１のプライマーが、Ｂ型肝炎ウイルスのpr
e-C 変異部位を含まずその近傍の塩基配列を有し、かつ
pre-C 変異を制限酵素処理により検出可能にするよう
に、人為的に１または複数箇所のミスマッチ塩基が導入
されたプライマーであり、第２のプライマーが、変異検
出用の制限酵素切断部位が変異部分以外にないか、ある
いは存在しても変異の検出の妨げとならない増幅ＤＮＡ
を与えるプライマーであるのが好適である。
【００１３】本発明方法によれば１ヵ所あるいは複数箇
所のＢ型肝炎ウイルスのpre-C 変異を検出することがで
きる。
【００１４】本発明はまた、上記方法において用いるプ
ライマーおよび制限酵素を含むＢ型肝炎ウイルスの変異
判定用キットに関する。
【００１５】本発明方法によれば、短時間で、容易に且
つ正確にＢ型肝炎ウイルス変異株の検出および変異した
ウイルスの比率、すなわち変異率を判定できる。
【００１６】
【作用】本発明の判定は以下の手順により行う。
【００１７】１) Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の変異部位を
含むＤＮＡを、制限酵素による切断の有無で変異を検出
できるように設計したプライマーを使用して、ＰＣＲ法
により増幅する、 ２) 制限酵素で処理し、処理されたＤＮＡまたはその断
片を、電気泳動等適切な手段で分別、検出する、 ３) 各制限酵素による切断のパターンを見る、 ４) 切断のパターンから変異の判定を行う、あるいはさ
らに野生株と変異株の比率を求める。
【００１８】この方法の第１段階は、変異部位を含むＤ
ＮＡの増幅である。遺伝子の増幅は、常法であるＰＣＲ
法により行い、ＰＣＲ法としては２段階ＰＣＲ法 (ネス
テッドＰＣＲ法) を用いてもよい。本発明方法では、Ｐ
ＣＲ法に用いるプライマーとして、変異に特異的な制限
酵素の切断部位を与えるように変異部位の近傍にミスマ
ッチを導入した塩基配列のプライマーを使用することに
特徴がある。２段階ＰＣＲ法を用いる場合は、このプラ
イマーをを２段階目において使用する。
【００１９】本来、Ｂ型肝炎ウイルスpre-C の変異であ
るpre-C 領域の83番目、86番目のＧ→Ａの両変異では、
元の野生株と識別が可能になる制限酵素認識部位は生じ
ないが、ミスマッチを含むプライマーを設計することに
よりこの部分に新たな制限酵素部位を導入することが可
能となる。これは、プライマーの一部に数塩基、例えば
１〜５塩基のミスマッチがあってもＰＣＲによる増幅が
可能であることを利用するものである。
【００２０】例えば、図１に示すように、83番目の変異
の検出には80番目をＴ→Ｃにしたミスマッチプライマー
(MP）（センス鎖として) を用いて増幅することによ
り、増幅ＤＮＡにおいてこの部分に新たな制限酵素認識
部位を持たせることができる。この結果、野生株では S
tyI 認識部位 (CCWWGG) ができるのに対し、83変異株で
は Bsu36I 認識部位 (CCTNAGG)が作られる。従って、82
番目から上流22個の塩基からなり、80番目にミスマッチ
を含むプライマーを第１のプライマーとして用いて増幅
したＤＮＡ断片を、それぞれ StyI または Bsu36I で、
あるいは StyI および Bsu36I で消化した後、電気泳動
で分析することにより両者の識別が可能になる。実際に
は StyI 認識部位がプライマー内に存在しているので、
この部分が切断されないように70番目をＣ→Ａにしてプ
ライマー設計を行った。
【００２１】86番目の変異の検出には92番目をＡ→Ｔ、
96番目をＴ→Ｃにしたミスマッチプライマー (アンチセ
ンス鎖を用いる、但し塩基の表示はセンス鎖) を用いる
ことによりこの部分に新たな制限酵素認識部位を持たせ
ることができる。この結果、野生株ではBcgI認識部位
(10/12(N)GCA(N)6TCG(N)12/10) ができるのに対し、86
変異株ではTth111I 認識部位 (GACNNNGTC)が作られる。
従って、88番目から下流24個の塩基からなり、92番目お
よび96番目にミスマッチを含むプライマーを第１のプラ
イマーとして用いて増幅したＤＮＡ断片を、それぞれ B
cgI または Tth111Iで、あるいは BcgI および Tth111I
で消化した後、電気泳動で分析することにより両者の識
別が可能になる。
【００２２】上記においてミスマッチを含む第１のプラ
イマーと共に用いる第２のプライマーは、電気泳動等適
切な分離条件下で検出可能なＤＮＡを生じ、変異を検出
するための制限酵素の切断部位が変異部分以外に全く無
いか、あるいは存在しても変異の検出の妨げとならない
増幅ＤＮＡを与えるプライマーである。このようなプラ
イマーセットを用いてＰＣＲ法により本発明の目的に合
うＤＮＡを増幅させることができる。具体的に説明する
と、実施例１ではpre-C 83変異株検出用のミスマッチプ
ライマーと、変異の下流側に存在するＢ型肝炎ウイルス
のゲノム上の塩化配列のアンチセンス側をプライマーと
して使用し、 99 塩基対(bp)のＤＮＡを得て、制限酵素
による処理を行い、pre-C 83変異株の検出を行ってい
る。
【００２３】なお、83番目の変異の検出において80番目
の塩基をＴ→Ｃに変えたプライマーでは、83番目の変異
がある場合は DdeI 認識部位 (CTNAG)も存在することに
なる。このように他の制限酵素でも変異に検出に適当で
あれば使用することができる。またプライマーの設定に
おいて、変異を検出するためにミスマッチを設定するＤ
ＮＡ鎖は上記のようにセンス鎖、アンチセンス鎖いずれ
の鎖でも利用できる。さらに、プライマーにより変異部
分に新たな制限酵素部位を作る際、上記例では野生株と
変異株において異なる制限酵素の切断部位を同時に導入
しているが、野生株か変異株のいずれかにのみ単一の制
限酵素切断部位を生じるようなミスマッチプライマーを
設定することによっても本発明の目的は達成される。例
えば75番目の塩基をＧ→Ｃ、76番目をＴ→Ｃ、77番目を
Ｇ→Ｔに変えたミスマッチプライマー 5'-AAGCTGTGCCTT
GGCCTGCTTT-3' を83変異検出用に使用すると、83変異株
のみに EcoNI認識部位 (CCTNNNNNAGG)が生じることにな
り、制限酵素 EcoNIで処理したときに切断されるＤＮＡ
は変異株であると判定される。
【００２４】上記ＰＣＲによるＤＮＡ増幅処理の後、増
幅したＤＮＡを１種または２種以上の制限酵素で処理す
る。使用する制限酵素はpre-C 領域の変異の有無により
切断パターンが異なるものである。例えば、実施例１で
は野生株を切断するが、83変異株は切断しない制限酵素
として StyI を使用し、野生株を切断することなく83変
異株を切断する制限酵素として Bsu36I を使用する。ま
た、実施例３では野生株を切断するが、86変異株は切断
しない制限酵素としてBcgIを使用し、野生株を切断する
ことなく86変異株を切断する制限酵素として TthlllIを
使用する。このような制限酵素は市販のものを使用する
ことができ、ＤＮＡの切断処理もその指示書に基づいて
行えばよい。
【００２５】次に、このように変異に応じて特定の制限
酵素で処理したＤＮＡを電気泳動等適切な分離条件下で
分離、検出する。この操作は常法に基づき行うことがで
き、例えば10％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動
後、エチジウムブロマイドによる染色を行い、ＵＶ照射
を行いバンドを検出する。
【００２６】分離、検出したＤＮＡ断片について、用い
た各制限酵素による切断の有無を調べる。野生株のみ切
断し、変異株を切断しない制限酵素を使用した場合、Ｂ
型肝炎ウイルスの野生株のみが検体中に存在していれ
ば、増幅されたＤＮＡは全て制限酵素により切断された
バンドを与える。変異株のみが存在している場合には制
限酵素処理を行っても、制限酵素により切断されること
なく、増幅された元のバンドが検出される。野生株およ
び変異株が混在している場合には、切断されたバンドお
よび切断されないバンドが検出され、それらの存在比に
より各バンドの濃淡が決定される。野生株を切断するこ
となく、変異株のみを切断する制限酵素を使用した場合
には、上記の切断パターンが完全に逆の結果を与えるこ
ととなる。従って、ある変異株の型判定と変異率の判定
において、１種類の制限酵素を使用しても十分に判定が
可能であるが、上記のように性質の異なる２種類の制限
酵素を使用することによって、制限酵素の活性低下によ
る誤判定を防ぎ、より正確な判定を行い得る。
【００２７】Ｂ型肝炎ウイルスpre-C 領域に83番目と86
番目の両方に変異を有する場合は、同一検体を83変異検
出用のプライマーと86変異検出用プライマーを用いてそ
れぞれ別個にＤＮＡ増幅を行い、それぞれについて制限
酵素処理を行うことにより、両変異の有無の判定をする
ことができる。
【００２８】本発明の方法に使用するＢ型肝炎ウイルス
のpre-C 変異判定用キットは、上述のようなpre-C の変
異部位を含む領域を増幅するのに用いる各種のプライマ
ーセットおよび変異の有無により異なる切断パターンを
与える制限酵素を含む。
【００２９】このキットにより、変異型を判定するに
は、変異に応じた切断パターンを記載した添付の判定表
により、判定を行えばよい。また野生株と変異株の存在
比率を推定するためには、目視により制限酵素処理後の
電気泳動バンドの濃淡により行うことができ、より定量
性を持たせるには、この電気泳動像を市販のＣＣＤカメ
ラ等を用いたデータ入力解析装置により、解析を行えば
よい。
【００３０】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３１】Ｂ型肝炎ウイルスを含む血清検体20μl
に、0.2N NaOH 溶液20μl を加え混合後、37℃にて１時
間保温した。次いで0.2 N HCl 溶液20μl を加え中和
し、10,000×ｇで５分間遠心し、その上清をＢ型肝炎ウ
イルスＤＮＡ試料溶液とした。この試料溶液を用いて、
以下のようにして実施例１および２ではＢ型肝炎ウイル
スpre-C の83変異の、実施例３ではpre-C の86変異の判
定を行った。
【００３２】
【実施例１】 Ｂ型肝炎ウイルスpre-C 83変異の判定 (その１) 上記ＤＮＡ試料溶液を用いてＰＣＲ法によりpre-C 83変
異株の検出を行った。すなわち、ウイルスゲノム上の塩
基の変異を制限酵素の切断により検出可能にするよう設
計されたプライマーとして5'-AAGCTGTGCATTGGGTGGCCTT-
3' (PC83F)を、これに対し増幅後 99 bpの長さのＤＮＡ
を与えるプライマーとして5'-AAAGAATTCAGAAGGCAAAAAAG
A-3' (PC2)を用い、ＤＮＡ試料溶液20μl 、耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを 2.5ユニット、10 mM Tris-HCl(pH 8.
0)、50 mM KCl 、2.5 mM MgCl2、0.01％ゼラチン、0.02
％ Nonidet-40 、各々最終濃度 200μM の dNTP(dATP、
dCTP、dGTP、dTTP) を加え、全量を100 μl とした後、
ミネラルオイル50μl を重層し、反応を行った。ＤＮＡ
増幅は、変性 (94℃) を30秒、アニーリング (55℃) を
１分、ＤＮＡ伸長 (72℃) を１分の反応を30サイクル繰
り返した後、さらにＤＮＡ伸長 (72℃) を10分行うこと
により行った。
【００３３】増幅したＤＮＡ約200ng(10μl)を制限酵素
StyI および Bsu36I でそれぞれ処理をした。常法に従
い10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、エチジウム
ブロマイド染色してＵＶ照射を行い、バンドを検出し
た。検出されるバンドのフラグメントサイズを記載した
表１の判定表に従って判定を行った。 StyI のみで切断
された場合は血清中に存在しているＢ型肝炎ウイルスの
pre-C 部分の変異がなく全て野生株であることを示し、
Bsu36Iのみで切断された場合は全てpre-C 83変異株であ
ることを示している。両者が混在している場合には、そ
の存在比率に応じてそれぞれの制限酵素で切断されない
99 bpのバンドの強度が異なってくる。その結果を表２
に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
【実施例２】 Ｂ型肝炎ウイルスpre-C 83変異の判定（その２） 上記ＤＮＡ試料溶液を用いてＰＣＲ法によりpre-C 83変
異株の検出を行った。すなわち、ウイルスゲノム上の塩
基の変異を制限酵素の切断により検出可能にするよう設
計されたプライマーとして5'-AAGCTGTGCATTGGGTGGCCTT-
3' (PC83F)を、これに対し増幅後 161 bp の長さのＤＮ
Ａを与えるプライマーとして5'-GGAGACTCTAAGGCCTCCCGA
-3' (PC83R) を用い、ＤＮＡ試料溶液20μl 、耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼを 2.5ユニット、10 mM Tris-HCl(pH
8.0)、50 mM KCl 、2.5 mM MgCl2、0.01％ゼラチン、0.
02％ Nonidet-40 、各々最終濃度 200μM の dNTP(dAT
P、dCTP、dGTP、dTTP) を加え、全量を100 μl とした
後、ミネラルオイル50μl を重層し、反応を行った。Ｄ
ＮＡ増幅は、変性 (94℃) を30秒、アニーリング (55
℃) を１分、ＤＮＡ伸長 (72℃) を１分の反応を30サイ
クル繰り返した後、さらにＤＮＡ伸長 (72℃) を10分行
うことにより行った。
【００３７】増幅したＤＮＡ約200ng(10μl)を制限酵素
StyI および Bsu36I でそれぞれ処理をした。常法に従
い10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、エチジウム
ブロマイド染色してＵＶ照射を行い、バンドを検出し
た。制限酵素による切断の有無を調べ表３の判定表に従
って判定を行った。 StyI のみで切断された場合は血清
中に存在しているＢ型肝炎ウイルスのpre-C 部分の変異
がなく全て野生株であることを示し、Bsu36Iのみで切断
された場合は全てpre-C 83変異株であることを示してい
る。両者が混在している場合にはその存在比率に応じて
それぞれの制限酵素で切断されない 161 bp のバンドの
強度が異なってくる。その結果を表４に示す。
【００３８】
【表３】
【００３９】
【表４】
【００４０】
【実施例３】 Ｂ型肝炎ウイルスpre-C 86変異の判定 上記ＤＮＡ試料溶液を用いてＰＣＲ法によりpre-C 86変
異株の検出を行った。すなわち、ウイルスゲノム上の塩
基の変異を制限酵素の切断により検出可能にするよう設
計されたプライマーとして5'-TTCTTTATACGGGTCGATGACCA
T-3' (PC86R)を、これに対し増幅後 149 bp の長さのＤ
ＮＡを与えるプライマーとして5'-GGAGGCTGTAGGCATAAAT
TGGT-3'(PC86F2) を用い、ＤＮＡ試料溶液20μl 、耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼ 2.5ユニット、10 mM Tris-HCl(p
H 8.0)、50 mM KCl 、2.5 mM MgCl2、0.01％ゼラチン、
0.02％ Nonidet-40 、各々最終濃度 200μM の dNTP(dA
TP、dCTP、dGTP、dTTP) を加え、全量を100 μl とした
後、ミネラルオイル50μlを重層し、反応を行った。Ｄ
ＮＡ増幅は、変性 (94℃) を30秒、アニーリング (55
℃) を１分、ＤＮＡ伸長 (72℃) を１分の反応を30サイ
クル繰り返した後、さらにＤＮＡ伸長 (72℃) を10分行
うことにより行った。
【００４１】増幅したＤＮＡ約200ng(10μl)を制限酵素
BcgI および Tth111Iでそれぞれ処理をした。常法に従
い10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、エチジウム
ブロマイド染色してＵＶ照射を行い、バンドを検出し
た。制限酵素による切断の有無を調べ表５の判定表によ
り判定を行った。 BcgI のみで切断された場合は血清中
に存在しているＢ型肝炎ウイルスのpre-C 部分の変異が
なく全て野生株であることを示し、Tth111I のみ切断さ
れた場合は全てpre-C 86変異株であることを示してい
る。両者が混在している場合にはその存在比率に応じて
それぞれの制限酵素で切断されない 146 bp のバンドの
強度が異なってくる。その結果を表６に示す。
【００４２】
【表５】
【００４３】
【表６】
【００４４】
【発明の効果】本発明によれば、特定のプライマーで増
幅したＤＮＡについて各制限酵素による切断のパターン
を調べれば、Ｂ型肝炎ウイルスpre-C 変異の判定を行う
ことができるので、従来法よりも容易に短時間でしかも
正確に判定し得る。また野生株と変異株の混在している
場合にも対応でき、その存在比率まで測定することがで
きる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｂ型肝炎のpre-C ８３変異の検出方法を示す図
である。
【図２】Ｂ型肝炎のpre-C ８６変異の検出方法を示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/51 Ｃ１２Ｑ 1/70 8114−4Ｂ // Ａ６１Ｂ 10/00 Ｍ

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の(1) 〜(4) の工程からなる、Ｂ型肝
    炎ウイルスを含有するサンプルからＢ型肝炎ウイルスpr
    e-C 変異を判定する方法。 (1) Ｂ型肝炎ウイルスのpre-C 変異部位を含む一定領域
    を増幅することができるプライマーセットであって、増
    幅されたＤＮＡにおいて変異の有無によって制限酵素に
    よる認識が異なるように、変異部分の近傍にミスマッチ
    塩基を導入して設計したプライマーを含むプライマーセ
    ットを用いて、ポリメラーゼチェインリアクション法に
    よりＤＮＡ増幅を行う。 (2) 増幅されたＤＮＡを、増幅されたＤＮＡにおいてpr
    e-C 変異に特異的な制限酵素で処理する。 (3) 制限酵素処理されたＤＮＡまたはその断片を分別、
    検出する。 (4) 制限酵素による切断のパターンを調べてＢ型肝炎ウ
    イルスのpre-C 変異株を検出、あるいは変異したウイル
    スの比率を評価する。
  2. 【請求項２】 第１のプライマーが、Ｂ型肝炎ウイルス
    のpre-C 変異部位を含まずその近傍の塩基配列を有し、
    かつpre-C 変異を制限酵素処理により検出可能にするよ
    うに、人為的に１または複数箇所のミスマッチ塩基が導
    入されたプライマーであり、第２のプライマーが、変異
    検出用の制限酵素切断部位が変異部分以外にないか、あ
    るいは存在しても変異の検出の妨げとならない増幅ＤＮ
    Ａを与えるプライマーであるプライマーセットを用い
    て、工程(1) のＤＮＡ増幅を行う、請求項１記載の判定
    方法。
  3. 【請求項３】 １箇所あるいは複数箇所のＢ型肝炎ウイ
    ルスのpre-C 変異を検出する、請求項１または２項記載
    の判定方法。
  4. 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれかの項記載の
    方法において用いるプライマーおよび制限酵素を含む、
    Ｂ型肝炎ウイルスの変異判定用キット。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006320326A (ja) * 1994-12-09 2006-11-30 Gene Pool Inc 特異的配列構成を有する核酸の検出法
US8114962B2 (en) 1994-12-09 2012-02-14 The Gene Pool, Inc. Method of detection of nucleic acids with a specific sequence composition
WO2018074458A1 (ja) * 2016-10-18 2018-04-26 国立大学法人東京大学 方法及び診断薬

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
US6428955B1 (en) 1995-03-17 2002-08-06 Sequenom, Inc. DNA diagnostics based on mass spectrometry
US5667974A (en) * 1995-06-07 1997-09-16 Abbott Laboratories Method for detecting nucleic acid sequences using competitive amplification
JP2000501615A (ja) * 1995-12-15 2000-02-15 アマーシャム・ライフ・サイエンス・インコーポレーテッド 酵素増幅中に生じる変異配列の検出および除去のためのミスマッチ修復系を用いる方法
US6051378A (en) 1996-03-04 2000-04-18 Genetrace Systems Inc. Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry
US5965363A (en) 1996-09-19 1999-10-12 Genetrace Systems Inc. Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis
CA2270132A1 (en) * 1996-11-06 1998-05-14 Sequenom, Inc. Dna diagnostics based on mass spectrometry
JP2001524808A (ja) 1996-12-10 2001-12-04 ジーントレイス・システムズ・インコーポレイテッド 放出可能な不揮発性の質量標識分子
CA2308762A1 (en) * 1997-11-04 1999-05-14 Roche Diagnostics Gmbh Specific and sensitive nucleic acid detection method
EP0955378A1 (en) * 1998-04-06 1999-11-10 Bente Lomholt Langdahl Method and kit for detecting a sequence variation in the human TGF-beta 1 gene
ATE423221T1 (de) 2000-06-13 2009-03-15 Univ Boston Verwendung von mass-matched nukleotide in der analyse von oligonukleotidmischungen sowie in der hoch-multiplexen nukleinsäuresequenzierung
AU2002233540A1 (en) * 2001-02-23 2002-09-12 Pyrosequencing Ab Allele-specific primer extension assay
WO2003031934A2 (en) * 2001-10-09 2003-04-17 Chiron Corporation Identification of oligonucleotides for the capture, detection and quantitation of hepatitis b viral dna
KR100647277B1 (ko) 2003-08-14 2006-11-17 삼성전자주식회사 Ｂ형 간염 검사용 ｐｃｒ 프라이머 세트 및 이를 포함하는 ｂ형 간염 검사 키트
WO2009016652A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Bigtec Private Limited A buffer system and a method for direct pcr amplification

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
ATE108491T1 (de) * 1988-03-18 1994-07-15 Baylor College Medicine Mutationsnachweis durch kompetitiven oligonukleotid-priming.
GB9006924D0 (en) * 1990-03-28 1990-05-23 Imperial College Prognosis of hepatitis infection

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006320326A (ja) * 1994-12-09 2006-11-30 Gene Pool Inc 特異的配列構成を有する核酸の検出法
JP4598722B2 (ja) * 1994-12-09 2010-12-15 ザ ジェン プール インク． 特異的配列構成を有する核酸の検出法
US8114962B2 (en) 1994-12-09 2012-02-14 The Gene Pool, Inc. Method of detection of nucleic acids with a specific sequence composition
WO2018074458A1 (ja) * 2016-10-18 2018-04-26 国立大学法人東京大学 方法及び診断薬
JPWO2018074458A1 (ja) * 2016-10-18 2019-08-08 国立大学法人 東京大学 方法及び診断薬

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