JP2001238687A

JP2001238687A - Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型の判定方法

Info

Publication number: JP2001238687A
Application number: JP2000388595A
Authority: JP
Inventors: Moritoshi Kinoshita; 盛敏木下; Yusuke Ishida; 祐介石田; Makoto Kuboki; 真久保木
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2001-09-04

Abstract

(57)【要約】【課題】簡便な操作および短時間で高確度で効率よくC
型肝炎ウイルス（HCV）遺伝子のタイプ1並びにサブタイ
プ2a、2bおよび3aを判定し、C型肝炎の診断、治療など
のための薬物療法に関する適性な指針を与える方法を提
供。【解決手段】HCV遺伝子の5'非翻訳領域の-167位、-163
位および-161位の塩基を決定し、これらの塩基情報に基
づいて遺伝子型のタイプ1並びにサブタイプ2a、2bおよ
び3aを判定するC型肝炎ウイルスの遺伝子型の判定方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、C型肝炎ウイルス
(Hepatitis C virus、以下「HCV」と略記する)の遺伝子
型の判定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】HCVには遺伝子変異が高頻度に認められ
（顕著な塩基多様性を示し）、このことから遺伝子配列
の違いに基づく型分類が行われている。現在、その遺伝
子型は、HCVを大きくタイプ1からタイプ6までの6つに分
類し、この1〜6に更にサブタイプとしてa，b，cなどを
附記して表記されている（P. Simmonds, et al., Journ
al of General Virology, 74, 661-668 (1993)）。世界
に広く分布する代表的なHCVの遺伝子型としては、サブ
タイプ1a、1b、2a、2bおよび3aの5つが知られている。

【０００３】近年、肝炎患者の血清中HCV-RNAゲノムの
検出が、HCV感染の直接証明となるとされ、該HCV-RNAゲ
ノムがウイルス増殖のマーカーとして臨床上有用である
として注目されつつある。最近の研究では、インターフ
ェロンによるHCV関連疾患の治療効果の予測のために、
患者血清中のHCV-RNA量と共にこの遺伝子型の情報が、
その指標として重要視されている。即ち、血清中HCV-RN
A量の少ない症例では著効例が多く、またサブタイプ1b
は、2aおよび2bに比して無効例が多いという事例が報告
されており（「インターフェロン療法の実際」、C型肝
炎の最新ガイド、株式会社南江堂、1994年）、患者にお
けるHCV-RNA量およびHCV遺伝子型に関する情報が得られ
れば、事前に該患者におけるインターフェロン投与によ
る治療効果が予測できることが知られている。

【０００４】また、HCVの遺伝子型を判定すれば、各型
毎の肝炎の進行程度、肝硬変、肝癌などへの移行率、症
状の特徴などに関する解析が可能になり、この解析結果
を予後の予測、治療の指針などとすることができる。更
にこの解析結果は感染経路の解明なども役立つ。従っ
て、HCVの遺伝子型の判定は、HCVが関与する疾患の診
断、治療、予後の予測などの面で、極めて重要である。

【０００５】従来、既にいくつかのHCVの遺伝子型判定
方法が報告されている。例えば岡本らは、HCVのコア領
域を標的として7種のプライマーを作成し、これらのプ
ライマーを組合せ、逆転写酵素を用いたRT-PCR(Reverse
Transcription-PCR, Genome Res., 6(10), 986 (199
6))を実施し、得られた遺伝子産物のサイズから遺伝子
型を判定する方法を報告している（H. Okamoto, et a
l., Journal of General Virology, 73, 673-679 (199
2)）。また、茶山らは、HCVのNS5領域を選び、同様にし
て遺伝子型を判定する方法を報告している（茶山一彰
ら、「肝臓」、33巻、805-806頁、1992年）。更に、HCV
の5'-非翻訳領域（以下「5'-NCR」と略記する）の遺伝
子増幅産物を制限酵素により切断して遺伝子型の判定を
行う試み（F. McOmish, et al., Transfusion, 33, 7-1
3 (1993)；特開平9-75100号公報など）、同増幅産物を
直接塩基配列決定して得られる塩基情報に基づいて遺伝
子型を判定する方法（Germer J. J., et al., J. Clin.
Microbiol., 37(8), 2625-2630 (1999); Holland J.,
et al., Pathology, 30(2), 192-195 (1998); Doglio
A., et al., Res. Virol., 149(4), 219-227 (1998)）
なども報告されている。

【０００６】しかしながら、上記報告された各種のHCV
遺伝子型の判定方法は、その判定精度、判定効率、操作
の煩雑さ、判定に要する時間、コストなどにおいて、尚
充分に満足できるものではなく、これらの改善された、
新しいHCV遺伝子型の判定方法の確立および臨床上HCVを
簡易・迅速に定量および遺伝子型判定できる系の開発が
望まれている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
要望に合致する改良されたHCV遺伝子型の判定方法を提
供することにある。

【０００８】本発明者らは、上記目的より、多数のC型
肝炎患者血清について、その5'-NCR（HCV-RNAの定性的
または定量的測定法において、従来よりPCR増幅されて
いる領域のひとつである）の塩基配列を決定して、遺伝
子型判定のアルゴリズム作成のデーターベースとした。

【０００９】その結果、該5'-NCRの塩基配列中の特定位
置の数個の塩基が、HCV遺伝子型に特異的であり、特定
位置の少なくとも3つの塩基情報によって、HCV遺伝子の
タイプ1並びにサブタイプ2a、2bおよび3aが確実に判定
できるという事実を見出した。またこの知見を基礎とし
て、臨床検体中のHCV-RNAの定量と遺伝子型判定とを、
簡便な操作で、短時間で、同時に行い得る新しい方法
（系）の開発に成功した。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、HCV遺伝子の
5'-NCRの-167位、-163位および-161位の塩基を決定し、
これらの塩基情報に基づいて遺伝子型のタイプ1並びに
サブタイプ2a、2bおよび3aを判定する、HCVの遺伝子型
の判定方法を提供する。

【００１１】本発明は、また、HCV遺伝子の5'-NCRの-16
7位、-163位、-161位および-99位の塩基を決定し、これ
らの塩基情報に基づいて遺伝子型のサブタイプ1a、1b、
2a、2bおよび3aを判定する、HCVの遺伝子型の判定方法
を提供する。

【００１２】本発明は、更に、以下のHCV遺伝子の型判
定方法を提供する。 (i) HCV遺伝子の5'-NCRの-159位、-155位、-132位、-12
8位、-124位、-122位および-119位からなる群から選ば
れる少なくとも1つの塩基を決定し、該塩基情報を更に
参照する上記判定方法； (ii) HCV遺伝子の5'-NCRのPCR増幅産物を被検サンプル
とする上記判定方法； (iii) PCR増幅産物がHCV-RNAの定量測定法に従い得られ
るPCR増幅産物である上記判定方法；および (iv) 塩基の決定が、配列番号1の塩基配列からなるプラ
イマーを用いた直接塩基配列決定法に従い行われる上記
判定方法。

【００１３】また、本発明は、配列番号1の塩基配列か
らなるプライマーを提供する。

【００１４】更に、本発明は、検体中のHCV-RNA量の定
量とその遺伝子型の判定を行う方法であって、(a) HCV
遺伝子の5'-NCRをRT-PCRによって増幅してHCV-RNA量を
定量する工程、(b) 工程(a)で調製されたPCR増幅産物を
精製する工程、および(c) 工程(b)で精製されたPCR増幅
産物の塩基配列を決定してHCV-RNAの遺伝子型を判定す
る工程を含むことを特徴とする方法を提供する。

【００１５】上記検体中のHCV-RNA量の定量とその遺伝
子型の判定を行う方法は、更に、以下の態様を包含す
る。 (i) 工程(a)で調製されたPCR増幅産物が、HCV遺伝子の
5'-NCRの-274番から-31番の塩基配列からなるDNA断片で
ある態様； (ii) 工程(a)で調製されたPCR増幅産物を、鋳型として
その領域内に設定したプライマーを用いて更にPCRによ
って増幅し、得られるPCR増幅産物を引続き工程(b)およ
び(c)に供する態様； (iii) 工程(b)の精製が、ガラス担体を用いたカラムク
ロマトグラフィーにより行われる態様； (iv) 工程(c)の塩基配列の決定が直接塩基配列決定法に
従い行われる態様。

【００１６】本発明の遺伝子型判定方法は、容易且つ簡
便な操作で、短時間に、所望のHCVの遺伝子型判定を、
高精度に効率よく行うことができる。

【００１７】また、本発明に係わるHCV-RNA量の定量と
その遺伝子型の判定を行う方法は、容易且つ簡便な操作
および短時間で、高精度で効率よく実施できるものであ
り、C型肝炎の診断、治療、予後の予測などに有効であ
る。特に、本発明方法によって、患者のHCVの遺伝子型
が判定できれば、該患者に対するインターフェロン投与
による治療効果を事前に予測することができ、かくし
て、個々の患者に合った適切な薬物療法を実施すること
ができる利点がある。

【００１８】

【発明の実施の形態】本明細書において、アミノ酸、ペ
プチド、塩基配列、核酸、制限酵素、その他に関する略
号による表示は、IUPACおよびIUPAC-IUBによる命名法ま
たはその規定、および「塩基配列又はアミノ酸配列を含
む明細書等の作成のためのガイドライン」（平成9年3
月、特許庁調整課審査基準室）に従うものとする。

【００１９】また、本発明におけるHCV遺伝子の5'-NCR
の塩基配列は、HCV遺伝子のサブタイプ1bの代表例とし
て、国立遺伝学研究所核酸データーベース（DDBJ）に登
録されているK-14（DDBJ D31602）を基準とし、その翻
訳領域の開始コドン(ATG)におけるAを0番目として、こ
のAの直前の5'-NCRにおける塩基を-1番目とし、5'上流
側に向かって連続する負の番号を付して示すものであ
る。

【００２０】本発明によれば、上記の通り、HCV遺伝子
の5'-NCRにおける特定位置（即ち、-167位、-163位およ
び-161位）のわずか3つの塩基（および所望により更に-
99位を加えた4つの塩基）を同定するのみで、HCV遺伝子
型を正確に判定することができる。また、上記3ヶ所ま
たは4ヶ所に加えて、更に5'-NCR中の他の塩基情報、好
ましくは、-159位、-155位、-132位、-128位、-124位、
-122位および-119位からなる群から選ばれる少なくとも
1つの塩基を決定し、この塩基情報を参照することによ
って、より的確にHCV遺伝子型を判定することができ
る。

【００２１】本発明者が確認した上記HCV遺伝子の5'-NC
Rにおける特定位置と、HCV遺伝子型との関連は、下記表
1に示されるとおりである。

【００２２】

【表１】

【００２３】上記表1に示されるとおり、HCV遺伝子の5'
-NCRの-167番目がT、-163番目がAおよび-161番目がGで
ある場合は、HCV遺伝子型はタイプ1と同定できる。この
タイプ1の同定に当たっては、更に-159番目がCまたは
T、-155番目がC、-132番目がG、-128番目がAまたはT、-
124番目がCまたはG、-122番目がC，GまたはTおよび-119
番目がAまたはGである塩基情報の少なくとも1つを参照
することができる。

【００２４】当該タイプ1の同定は、患者由来の被検サ
ンプルを他の遺伝子型であるタイプ2、3などと明確に区
別できるものであり、これによって、例えば該患者に対
するインターフェロン投与による治療効果は充分に予測
可能である。

【００２５】所望により、上記タイプ1は、更にそのサ
ブタイプ1aおよび1bを同定することもできる。このサブ
タイプ1aおよび1bの同定には、HCV遺伝子の5'-NCRの-99
番目の塩基情報が役立つ。即ち、当該-99番目の塩基がG
である場合は、サブタイプ1bと同定でき、またAである
場合は、実質的にサブタイプ1aと同定できる。

【００２６】HCV遺伝子の5'-NCRの-167番目がT、-163番
目がGおよび-161番目がGである場合は、HCVの遺伝子型
はサブタイプ2aと同定できる。この同定には更に-159番
目がA、-155番目がT、-132番目がA、-128番目がT、-124
番目がC、-122番目がCおよび-119番目がCまたはTである
塩基情報の少なくとも1つを参照することができる。

【００２７】HCV遺伝子の5'-NCRの-167番目がT、-163番
目がGおよび-161番目がAである場合は、HCVの遺伝子型
はサブタイプ2bと同定できる。この同定には更に-159番
目がA、-155番目がT、-132２番目がA、-128番目がT、-1
24番目がT、-122番目がCおよび-119番目がTである塩基
情報の少なくとも1つを参照することができる。

【００２８】HCV遺伝子の5'-NCRの-167番目がC、-163番
目がGおよび-161番目がGである場合は、HCVの遺伝子型
はサブタイプ3aと同定できる。この同定には更に-159番
目がT、-155番目がC、-132番目がG、-128番目がA、-124
番目がC、-122番目CＣおよび119番目がGである塩基情報
の少なくとも1つを参照することができる。

【００２９】本発明のHCVの遺伝子型判定方法は、上記
の通りHCV遺伝子の5'-NCRの特定位置の塩基情報を指標
とするものであり、かかる塩基情報を得るための被検サ
ンプルの調製、その塩基配列の決定のための手法などに
は何ら限定はなく、公知もしくは将来得られ得る各種の
方法を広く採用することができる。

【００３０】以下、本発明に係るHCV遺伝子型の判定方
法につき詳述すれば、本発明に係るHCV遺伝子型の判定
は、例えば前述した工程(a)〜(c)の実施により行うこと
ができる。この工程(a)〜(c)は、より詳しくは以下のご
とくして実施できる。工程(a)：PCR増幅産物の調製本発明に従う遺伝子型判定に供される被検サンプルの好
ましい例としては、検体(HCV遺伝子)中の5'-NCRをRT-PC
Rに従い増幅させたPCR増幅産物を挙げることができる。
ここで、被検サンプルとしての上記PCR増幅産物は、HCV
遺伝子の5'-NCRの全領域に対応する塩基長を与えるもの
であってもよいが、特にその必要はなく、本発明のHCV
の遺伝子型判定に利用できる塩基情報を含むもの、即
ち、少なくとも5'-NCRの塩基番号-167〜-161位を含むDN
A断片、好ましくは-167〜-99位を含むDNA断片（部分DN
A）であればよい。

【００３１】尚、RT-PCRは、HCV遺伝子の5'-NCRの特定
位置を含む適当な標的領域を特異的に増幅するように適
宜設定したプライマーを利用して、常法に従って実施す
ることができる。その実施には、例えば前記した既知判
定方法に係る文献などの記載が参照される。

【００３２】このようなPCR増幅産物の調製には、既知
のHCV-RNA定量測定法に用いられる方法がそのまま利用
できる。かかる方法の利用によれば、本発明に係わるHC
V遺伝子の型判定のための所望のPCR増幅産物が調製でき
ると共に、該PCR増幅産物を利用して検体中のHCV-RNA量
も定量できる利点がある。

【００３３】本発明方法の好ましい態様は、この工程
(a)においてHCV-RNA量を定量する態様を包含する。

【００３４】HCV-RNAの定量は、HCV遺伝子の5'-NCRをRT
-PCRによって増幅してPCR増幅産物を得ることを前提と
して、その手法などにはなんらの限定もなく、従来より
知られているまたは将来得られ得る各種の方法を広く採
用して実施することができる。

【００３５】本発明に係るHCVの遺伝子型判定方法に使
用できるHCV-RNAの定量測定法の具体例としては、例え
ば以下の市販の測定用キットを利用する方法を挙げるこ
とができる。

【００３６】「アンプリコア^TMHCVモニター（HCV-RNA測
定用）」（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）「アンプリコア^TMHCVモニターｖ2.0（HCV-RNA測定
用）」（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）。

【００３７】後者のキットを用いる定量測定法の実施に
際しては、HCV遺伝子の5'-NCRの-274番から-31番の塩基
配列からなる所望のPCR増幅産物が調製される。

【００３８】上記測定キットを利用して調製されるPCR
増幅産物は、本発明のHCV遺伝子型の判定に極めて有効
に利用することができる。即ち、該PCR増幅産物は、調
製の簡便さはもとより、HCV-RNA量の定量と同時にその
遺伝子型判定を行うことができる点で極めて有利であ
る。

【００３９】尚、上記HCV-RNA定量測定法に際して調製
されるPCR増幅産物は、所望により、これを鋳型とし
て、その一部領域を増幅するようにその領域内に適宜設
定したプライマーを利用して更に常法に従いPCR増幅し
てもよく、かくして得られる増幅産物を本発明に従う遺
伝子型判定のための被検サンプルとすることもできる。工程(b)：PCR増幅産物の精製工程(a)で得られるPCR増幅産物を、常法、例えばガラス
担体を用いる通常のカラムクロマトグラフィーなどの精
製工程に付して精製する。

【００４０】当該精製工程において用いられるカラム
は、市販の精製用カラムのいずれでもよい。好適なカラ
ムの例としては、例えばGFXカラム（アマシャムファル
マシア社）、セントリセップスピンカラム（PEバイオシ
ステムズ社）、セントリスピン20カラム（プリンストン
セパレーション社）などを例示できる。精製操作、精製
条件などは、これらのカラムを用いる通常の方法と特に
異なるものではなく、慣用される操作、条件を採用する
ことができる。工程(c)：塩基配列の決定と遺伝子型の判定工程(b)で精製されたPCR増幅産物について、その塩基配
列、特にその特定位置の塩基配列を決定して、HCV-RNA
の遺伝子型を判定する。

【００４１】当該塩基配列決定のための手法は、本発明
判定方法にかかる特定の塩基情報が得られる限りにおい
て何ら限定はない。該手法としては、公知もしくは将来
得られ得る各種の方法を広く採用することができる。

【００４２】好ましくは、当該塩基配列の決定は、それ
に利用されるシークエンサ−が一般に広く採用されてい
ることより、任意のシ−クエンシング用プライマーを用
いる直接塩基配列決定法（例えばサイクルシークエンシ
ング法：服部正平、「PCRを用いた直接塩基配列決定
法」、実験医学（増刊）新PCRとその応用、29-35頁（19
97）、羊土社など）に従い実施することができる。

【００４３】ここで、シ−クエンシング用プライマー
は、本発明にかかる特定の塩基情報が得られるように設
定したものである限り特に限定はなく、PCR増幅産物の
領域から任意に設定することができる。当該プライマー
の特に好ましいものとしては、HCV遺伝子の5'-NCRの-21
0番〜-189番に対応する配列番号1の塩基配列からなるプ
ライマー（「geno7」と命名）を例示することができ
る。

【００４４】このプライマーgeno7は、HCV遺伝子型の判
定を行い得る塩基多様性を含む5'-NCRにおいて、どの遺
伝子型のHCV-RNAとも反応することができものであり、
その利用によれば、配列決定が極めて良好に実施でき
る。例えば後述する実施例では、配列決定に供した全て
の被検サンプルを例外なく配列決定できている。

【００４５】本発明はかかる配列番号1の塩基配列から
なるプライマーをも提供するものである。

【００４６】本発明に係るHCVの遺伝子型の判定方法に
おいて用いられる検体サンプルは、HCV遺伝子を含む限
り特に限定されるものではなく、例えば被検者から採取
されたHCV遺伝子を含むサンプルなどの各種生体試料の
いずれでもよい。臨床上の指標としては、特に血清など
の血液サンプルが好ましい。

【００４７】また、本発明において採用され得る各種の
操作、例えば、RNAの抽出、DNAまたはDNA断片の合成、
切断、削除、付加または結合を目的とする酵素処理、RN
AまたはDNAの単離、精製、複製、選択、増幅などはいず
れも常法に従うことができる（分子遺伝学実験法、共立
出版（株）1983年発行；PCRテクノロジー、宝酒造
（株）1990年発行など参照）。またこれらのDNAなどは
必要に応じて適宜常法に従い修飾して用いることもでき
る。

【００４８】本発明のHCVの遺伝子型判定方法によれ
ば、簡単な操作および短時間で、検体中のHCVの遺伝子
型を判定することができ、また同時にHCV-RNA量を測定
することができる。かかるHCV-RNA量とHCV遺伝子型とを
同時に一連の操作で知ることができる本発明方法に従え
ば、例えばC型肝炎患者におけるインターフェロンによ
る治療効果が予測でき、かくして個々の患者に合った適
切な治療を実施することも可能となる。この点より、本
発明方法は、C型肝炎患者などのHCVが関与する患者に対
するインターフェロン治療効果の有効性の判断に有用で
あり、本発明方法によって、非常に簡便にかつ正確に当
該効果の予測が可能である。

【００４９】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。但し、本発明はこれらに何ら限定されるもの
ではない。実施例1 HCV-RNAの5'-NCRの塩基配列ライブ
ラリー (1)プライマーの調製本例において用いたプライマー（geno7, geno5およびge
no6）の塩基配列をそれぞれ配列番号1、2および3に示
す。これらは、自動シンセサイザーを用いて合成した。

【００５０】プライマーgeno7は、シークエンシング用
であり、HCV-RNAのコア蛋白のイニシエーションコドンA
TGのAを0番とした時の-210番から-189番の配列に相当す
る。

【００５１】プライマーgeno5およびgeno6は、PCR用で
あり、それぞれ同-271番から-252番および同-64番から-
43番の配列に相当する。 (2)サンプルの調製岡本法（「スマイテストHCVジェノタイプ」（株）特殊
免疫研究所）でHCV-RNAの遺伝子型を決定しておいた57
例の患者血清におけるHCV-RNA量を、HCV-RNA定量測定キ
ット「アンプリコア^TMHCVモニターv2.0（HCV-RNA測定
用）」（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用い
て、同キット操作法に従い定量した。

【００５２】上記測定キットは、HCV遺伝子の5'-NCRの-
274番から-31番の配列からなる244bpのPCR産物を与える
ものであり、この定量済みPCR産物溶液を利用して、以
下の通り遺伝子型判定のための被検サンプルを調製し
た。

【００５３】PCR産物は、GFXカラム（GFX^TMPCR DNA and
Gel Band Purification: アマシャム・ファルマシア
社）を用いて精製した。

【００５４】即ち、GFXカラムに同キット添付のコレク
ションチューブをセットし、同キット添付のキャプチャ
ー緩衝液500μlをカラムに加えた後、「アンプリコア^TM
HCVモニターv2.0」で定量済みのPCR産物溶液60μlを加
えて、4〜6回ピペッティングにより攪拌した。このGFX
カラムをコレクションチューブをセットしたまま15000
回転／分で30秒間遠心し、コレクションチューブに溶出
される溶液を取り除いた。再度コレクションチューブを
セットし、同キット添付のウォッシュ緩衝液500μlをGF
Xカラムに加え、15000回転／分で30秒間遠心し、コレク
ションチューブに溶出される溶液ごとコレクションチュ
ーブを廃棄した。次にGFXカラムに1.5mlサンプルチュー
ブをセットし、1 mM EDTAを含む10mMトリス緩衝液（pH
8.0）の20μlをGFXカラムに加え、室温に1分間放置した
後、15000回転／分で1分間遠心して、1.5mlサンプルチ
ューブに溶出してくるPCR産物を回収した。

【００５５】回収したPCR産物の1μlを取り、3%アガロ
ースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロミド染色にて
244bpのPCR産物のバンドを確認した。

【００５６】ここでバンドが確認された場合には、回収
したPCR産物を被検サンプルとして後述のシークエンシ
ング反応に供した。

【００５７】一方、244bpのバンドが確認されない場合
には、シークエンシング反応に供するPCR産物が不足し
ていると考えられるため、geno5プライマーとgeno6プラ
イマーによるPCR増幅を行った。即ち、「アンプリコア
^TMHCVモニターv2.0」のPCR産物溶液2μlに、10×PCR緩
衝液（アドバンスドバイオテクノロジー社）2μl、10mM
dNTPs溶液（パーキン・エルマー社）1.6μl、25mM MgC
l₂（アドバンスドバイオテクノロジー社）1.2μl、10pm
ol/μlのgeno5プライマー溶液0.8μl、10pmol/μlのgen
o6プライマー溶液0.8μlおよび「Thermostable DNAポリ
メラーゼ」（アドバンスドバイオテクノロジー社）0.5U
を加え、総容量20μlとして94℃、3分間の後、94℃、30
秒間、56℃、30秒間および72℃、90秒間のサイクルを35
サイクル行い、次いで72℃、10分間反応させた。

【００５８】かくして得たPCR産物の全量をGFXカラムに
て同様に精製し、被検サンプルとしてシークエンシング
反応に供した。 (3)シークエンシング（塩基配列の決定）シークエンシング反応は、gene7プライマーによる直接
塩基配列決定法（サイクルシークエンシング法）に従い
以下の通り行った。

【００５９】即ち、前記被検サンプル（PCR産物）2μl
に、「BigDye Terminator Rmix」（パーキン・エルマー
社）4μl、3.2pmol/μlのgeno7プライマー溶液0.5μlお
よび滅菌蒸留水を加えて総容量10μlとして、96℃、30
秒間、50℃、30秒間および60℃、4分間のサイクルを35
サイクル行った。シークエンシング反応後、反応液に脱
イオン化ホルムアミド色素液を加えて、ABI377自動シー
クエンサー（パーキン・エルマー社）にて塩基配列を決
定した。 (4)HCV遺伝子の5'-NCRの塩基配列データベースと遺伝子
型判定 (4-1) 上記57例の患者血清サンプルのHCV遺伝子型は、
岡本法でサブタイプ1b、2aおよび2bの3種と同定され
た。

【００６０】これらのサンプルのHCV遺伝子の5'-NCRの
塩基配列情報を、遺伝子型決定のための遺伝子型判定ア
ルゴリズム作成にデータベースとして供した。

【００６１】尚、遺伝子型サブタイプ3aの同定には、既
存のHCV株の配列情報（GeneBank No. HCV6311, HCV6318
およびHCV6323）を利用した。

【００６２】当該データベースを注意深く観察すること
により、HCV遺伝子の5'-NCRの-167番目、-163番目およ
び-161番目の塩基は、HCV遺伝子型のサブタイプ1b、2
a、2bおよび3aの各遺伝子型で共通しており、この3ヵ所
の塩基情報に基づけば、これら遺伝子型間の区別乃至同
定が可能であることがわかった。

【００６３】即ち、HCV遺伝子型のサブタイプ1bでは、H
CV遺伝子の5'-NCRの-167番目が「T」、-163番目が「A」
および-161番目が「G」であった。

【００６４】HCV遺伝子型のサブタイプ2aでは、HCV遺伝
子の5'-NCRの-167番目が「T」、-163番目が「G」および
-161番目が「G」であった。

【００６５】HCV遺伝子型のサブタイプ2bでは、HCV遺伝
子の5'-NCRの-167番目が「T」、-163番目が「G」および
-161番目が「A」であった。

【００６６】HCV遺伝子型のサブタイプ3aでは、HCV遺伝
子の5'-NCRの-167番目が「C」、-163番目が「G」および
-161番目が「G」であった。 (4-2) 上記57例の患者サンプル中にはHCV遺伝子型のサ
ブタイプ1aは存在しておらず、このサブタイプ1aの遺伝
子型判定に関する情報が得られないため、岡本法でHCV
遺伝子型がサブタイプ1aおよび1bと判定された両者を含
むサンプルとして、血友病患者の血清を用いて、実施例
１に記載の本発明方法を繰り返し、各サンプルのHCV遺
伝子の5'-NCRの塩基配列情報を得た。

【００６７】その結果、岡本法で判定されたサブタイプ
1aおよび1bの両者とも、共通してHCV遺伝子の5'-NCRの-
167番目は「T」、-163番目は「A」および-161番目は
「G」であった。このことから、本発明方法によってHCV
遺伝子型のタイプ1の同定が可能であることが判った。

【００６８】更に、本発明方法に従えば、岡本法でサブ
タイプ1aと判定されたサンプルにおけるHCV遺伝子の5'-
NCRの-99番目の塩基は、11例全例においていずれも
「A」であった。一方、HCV遺伝子の5'-NCRの-99番目の
塩基が「G」と決定されたサンプルは、HCV遺伝子型のサ
ブタイプ1bと同定できた。

【００６９】これらのことから、本発明方法によって、
HCV遺伝子の5'-NCRの-167、-163、-161および-99位の遺
伝子情報に基づいて、HCV遺伝子型のタイプ乃至サブタ
イプの区別乃至同定が可能であることが判った。実施例２ HCV遺伝子型の判定 C型肝炎患者の血清を用いて、実施例1に従いHCV遺伝子
型の判定を行った。

【００７０】即ち、「アンプリコア^TMHCVモニターv2.
0」でウイルス量を定量した患者血清サンプルにつき、
そのHCV遺伝子の5'-NCRの塩基配列を決定し、実施例1で
示した塩基情報に基づく遺伝子型判定を行った。

【００７１】実施例1の57例を含む全290サンプルについ
てのHCV-RNA量の定量結果と遺伝子型判定結果は次のと
おりであった。即ち、全290例中284例についてHCV-RNA
量の定量が可能であり、被検者におけるウイルス量が把
握できた。当該定量法に従うPCR産物を利用することに
より、290例全てにおいて、そのHCV遺伝子の5'-NCRの塩
基配列の決定が可能であった。

【００７２】このことから、本発明によれば、被検者に
おけるHCV-RNA 量の定量とその遺伝子型の判定との両者
を非常に簡単に実施でき、得られた情報から、当該被検
者におけるインターフェロン治療効果が予測でき、かく
して本発明方法は臨床上極めて有用であることが判っ
た。

【００７３】上記で決定されたHCV遺伝子の5'-NCRの特
定位置における塩基情報に基づく遺伝子型判定結果は、
以下の通りである。（タイプ1）：タイプ1と判定された例数は220例であ
り、これらは岡本法での遺伝子型判定結果（全例が1bで
あった）に一致していた。これら全例において、-167番
目の塩基は「T」、-163番目の塩基は「A」および-161番
目の塩基は「G」であった。

【００７４】-159番目の塩基は「C」として特徴付けら
れた（但し、8例で「T」が、3例で「C」および「T」の
両者が検出された）。

【００７５】-155番目の塩基は「C」として特徴付けら
れた。

【００７６】-132番目の塩基は「G」として特徴付けら
れた。

【００７７】-128番目の塩基は「A」として特徴付けら
れた（但し、1例で「T」が同時に検出された）。

【００７８】-124番目の塩基は「C」として特徴付けら
れた（但し、1例で「G」が同時に検出された）。

【００７９】-122番目の塩基は「T」として特徴付けら
れた（但し、「C」または「G」が各1例で同時に検出さ
れた）。

【００８０】-119番目の塩基は「A」として特徴付けら
れた（但し、2例で「G」が同時に検出された）。（サブタイプ1aおよび1b）：上記タイプ1と判定された2
20例は、いずれも岡本法での遺伝子型判定では1bと判定
され、その中に1aと判定されたサンプルはなかった。

【００８１】この220例および前記(4-2)に示した血友病
患者サンプル111例における-99番目の塩基は次の通りで
あった。

【００８２】サブタイプ1a全11例において、-99番目の
塩基は「A」として特徴付けられた。

【００８３】サブタイプ1b全320例において、-99番目の
塩基は「G」として特徴付けられた（但し、5％弱の16例
において「A」が検出された）。（サブタイプ2a）：サブタイプ2aと判定された例数は42
例であり、これら全例において、-167番目の塩基は
「T」、-163番目の塩基は「G」および-161番目の塩基は
「G」であった。

【００８４】これら42例中41例は、岡本法での型判定結
果と一致していた。不一致例は、岡本法で（サブタイプ
1b＋2a）混合型とされた1例であり、本発明の判定方法
ではその主要なタイプ（サブタイプ2a）を判定している
と考えられる。また、これら42例における下記特定位置
の塩基はそれぞれ次の通りである。

【００８５】-159番目の塩基は「A」として特徴付けら
れた。

【００８６】-155番目の塩基は「T」として特徴付けら
れた。

【００８７】-132番目の塩基は「A」として特徴付けら
れた。

【００８８】-128番目の塩基は「T」として特徴付けら
れた。

【００８９】-124番目の塩基は「C」として特徴付けら
れた。

【００９０】-122番目の塩基は「C」として特徴付けら
れた。

【００９１】-119番目の塩基は「C」として特徴付けら
れた（但し、1例で「T」が、2例で「C」および「T」の
両者が検出された）。（サブタイプ2b）：サブタイプ2bと判定された全26例に
おいて、-167番目の塩基は「T」、-163番目の塩基は
「G」および-161番目の塩基は「A」であった。

【００９２】これら26例全例は、岡本法での型判定結果
と一致していた。以下の特定位置における塩基はそれぞ
れ次の通りである。

【００９３】-159番目の塩基は「A」として特徴付けら
れた。

【００９４】-155番目の塩基は「T」として特徴付けら
れた。

【００９５】-132番目の塩基は「A」として特徴付けら
れた。

【００９６】-128番目の塩基は「T」として特徴付けら
れた。

【００９７】-124番目の塩基は「T」として特徴付けら
れた。

【００９８】-122番目の塩基は「C」として特徴付けら
れた。

【００９９】-119番目の塩基は「T」として特徴付けら
れた。（サブタイプ3a）：試験した290例中に、サブタイプ3a
と判定されたサンプルはなかった。（タイプ1＋サブタイプ2b）混合型：2例において、-167
番目の塩基として「T」、-163番目の塩基として「A」お
よび「G」、-161番目の塩基として「A」および「G」、-
159番目の塩基として「A」および「C」、-155番目の塩
基として「C」および「T」、-132番目の塩基として
「A」および「G」、-128番目の塩基として「A」および
「T」、-124番目の塩基として「C」および「T」、-122
番目の塩基として「C」および「T」、-119番目の塩基と
して「A」および「T」をそれぞれ検出した。

【０１００】このことから上記2例は、（タイプ1＋サブ
タイプ2b）の混在型と判定され、これは岡本法での型判
定結果に一致していた（表2参照）。

【０１０１】以上のことから、HCV遺伝子の5'-NCRの-16
7番目、-163番目および-161番目の塩基情報に基づけ
ば、HCV遺伝子型のタイプ1並びにサブタイプ2a、2bおよ
び3aの区別乃至同定が極めて簡便に行い得ることがわか
った。

【０１０２】また、HCV遺伝子の5'-NCRの-99番目の塩基
情報に基づいて、サブタイプ1aおよび1bの区別乃至同定
が行い得ることがわかった。

【０１０３】更に、HCV遺伝子の5'-NCRの-159番目、-15
5番目、-132番目、-128番目、-124番目、-122番目およ
び-119番目の塩基は、同様にそれぞれの遺伝子型に特徴
的であり、必要に応じてこれらの少なくともひとつの塩
基情報を更に参照することにより、より的確な遺伝子型
判定が可能であることがわかった。

【０１０４】本発明方法に従い求められる特定位置にお
ける塩基情報と遺伝子型との関連は、前述した表1に示
すとおりである。

【０１０５】以上の結果（本発明方法と岡本法による型
判定結果との対比）をまとめて表2に示す。

【０１０６】

【表２】

【０１０７】また、本発明方法に従い得られた結果を、
群別測定（セログルーピング）と対比して表3に示す。

【０１０８】

【表３】

【０１０９】尚、表3において、群別測定は、市販のキ
ット（イムチェック・F-HCV「コクサイ」；国際試薬
（株））を用いて該キットの仕様書に従い実施した。表
中、群別測定における「untyped」は、同法による判定
不能例（グループ1の抗体もグループ2の抗体も検出でき
なかった例）および判定保留例（グループ1の抗体とグ
ループ2の抗体の両者が検出され判定できなかった例）
を示す。

【０１１０】表3に示す結果より、群別測定では、290例
中、41例で判定不能または判定保留となり、治療指針と
なる群別判定情報を得ることはできなかったのに比し
て、本発明方法によれば、より多くのサンプルで当該情
報を得ることが可能であることが判る。

【０１１１】更に、本発明方法に従う遺伝子型判定結果
とウイルス量定量結果を対比して表4に示す。

【０１１２】

【表４】

【０１１３】表4に示す結果より、290例中、6例のみウ
イルス量が0.5KIU/ml未満となったが、これらのサンプ
ルにおいても本発明の遺伝子型判定は可能であった。ま
た、上記6例を除く284 例では、ウイルス量の定量と遺
伝子型判定とが同時に行い得た。これらのことから本発
明方法はウイルスの検出面においても充分に高感度であ
り有用と考えられることが明らかとなった。

【０１１４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Pharmaceutical Co., ltd. <120> A method for determination of hepatitis C virus genotype <130> C100JP <150> JP H11-363869 and JP H11-363871 <151> 1999-12-22 and 1999-12-22 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> geno 7 primer <400> 1 ggagagccat agtggtctgc gg 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> geno 5 primer <400> 2 gaaagcgtct agccatggcg 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> geno 6 primer <400> 3 ctatcaggca gtaccacaag gc 22

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】C型肝炎ウイルス遺伝子の5'非翻訳領域の-
167位、-163位および-161位の塩基を決定し、これらの
塩基情報に基づいて遺伝子型のタイプ1並びにサブタイ
プ2a、2bおよび3aを判定する、C型肝炎ウイルスの遺伝
子型の判定方法。
【請求項２】C型肝炎ウイルス遺伝子の5'非翻訳領域の-
167位、-163位、-161位および-99位の塩基を決定し、こ
れらの塩基情報に基づいて遺伝子型のサブタイプ1a、1
b、2a、2bおよび3aを判定する、C型肝炎ウイルスの遺伝
子型の判定方法。
【請求項３】C型肝炎ウイルス遺伝子の5'非翻訳領域の-
159位、-155位、-132位、-128位、-124位、-122位およ
び-119位からなる群から選ばれる少なくとも1つの塩基
を決定し、該塩基情報を更に参照する請求項1に記載の
判定方法。
【請求項４】C型肝炎ウイルス遺伝子の5'非翻訳領域のP
CR増幅産物を被検サンプルとする請求項1に記載の判定
方法。
【請求項５】PCR増幅産物がC型肝炎ウイルス-RNA定量的
測定法に従い得られるPCR増幅産物である請求項4に記載
の判定方法。
【請求項６】塩基の決定が、配列番号1の塩基配列から
なるプライマーを用いた直接塩基配列決定法に従い行わ
れる請求項1に記載の判定方法。
【請求項７】配列番号1の塩基配列からなるプライマ
ー。
【請求項８】検体中のC型肝炎ウイルス-RNA量を定量す
ると共に、その遺伝子型を判定する方法であって、以下
の工程(a)〜(c): (a) C型肝炎ウイルス遺伝子の5'非翻訳領域をRT-PCRに
よって増幅してC型肝炎ウイルス-RNA量を定量する工
程、 (b) 工程(a)で調製されたPCR増幅産物を精製する工程、
および (c) 工程(b)で精製されたPCR増幅産物の塩基配列を決定
してC型肝炎ウイルス-RNAの遺伝子型を判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】工程(a)で調製されたPCR増幅産物が、C型
肝炎ウイルス遺伝子の5'非翻訳領域の-274番から-31番
の塩基配列からなるDNA断片である請求項8に記載の方
法。
【請求項１０】工程(a)で調製されたPCR増幅産物を、鋳
型としてその領域内に設定したプライマーを用いて更に
PCRによって増幅し、得られるPCR増幅産物を引続き工程
(b)および工程(c)に供する請求項8に記載の方法。
【請求項１１】工程(b)の精製が、ガラス担体を用いた
カラムクロマトグラフィーにより行われる請求項8に記
載の方法。
【請求項１２】工程(c)の塩基配列の決定が直接塩基配
列決定法に従い行われる請求項8に記載の方法。