WO1993023567A1

WO1993023567A1 - Method of judging pre-c mutation of hepatitis b virus

Info

Publication number: WO1993023567A1
Application number: PCT/JP1993/000602
Authority: WO
Inventors: Takuya Koshizaka; Hiroaki Okamoto
Original assignee: Sumitomo Metal Industries, Ltd.
Priority date: 1992-05-08
Filing date: 1993-05-07
Publication date: 1993-11-25
Also published as: JPH05308999A; EP0593789A4; EP0593789A1

Description

明細書

B型肝炎ウィルス p r e一 C変異の判定法技術分野

本発明は、 B型急性肝炎の予後を予測するのに有用な、 B型肝炎ウィルスの pr e-C 変異の判定方法およびそれに用いる試薬に関する。

背景技術

B型肝炎ウィルス感染初期には H B e抗原が血中に検出されるが、持続感染中に H B e抗原が消失し、 HB e抗体が検出されるようになる（seroconversion)_c この現象は、従来より感染していた B型肝炎ウィルス野生株が徐々に減少し、長期の持続感染においてプレコア（pre- C)領域に変異を生じ HB e抗原を分泌できなくなった B型肝炎ウィルス変異株が増加するものであることが明らかとなってきた。さらにこれらの HB e抗原を分泌できなくなった B型肝炎ウィルス変異株は野生型に比較して B型劇症肝炎を誘発し易いことがわかってきている。

これまで臨床的に B型急性肝炎の予後を予測するウィルス側のマーカーは存在しなかったが、ウィルスゲノムの pre- C 領域の'塩基配列の解析により急性肝炎の予後を予測することが可能となると考えられる。

B型肝炎ウィルス pre- C 変異株では pre- C 領域の開始コドンから 83番目の塩基が Gから Aに点変異を起こしている。この結果、 28番目のアミノ酸をコードすコドンは T G G (Trp) から T A G (stop)になり H B e抗原の前駆蛋白が産生されず、 H B e抗原を分泌できなくなつている。さらに 83番目と 86番目の 2つの塩基がともに Gから Aに変異を起こしているものも、ウィルス血症を伴う比較的重篤な慢性肝疾患には多く見いだされている。従来、この B型肝炎ウィルスの変異の判定は、ポリメラーゼチヱインリアクション法（P CR法）により、当該変異部位を含有する部分を DN A増幅し、この部分を他の適切なクローニング用プラスミドに連結後、この組み替え体を単離精製し、シークェ'ンス反応を行う方法で判定されてきた

(Y. Kosaka et al., Gastroenterology, Vol.100, 1087-1094, 1991、 H. Okamoto et al. , J. Viro logy, Vol. 64, 1298-1303, 1990、

岡本宏明、実験医学 Vol. 9, 1263-1268, 1991 、

赤羽賢浩、岡本宏明、臨床医 Vol. 16, 586-589, 1990)

しかしながら、この方法で用いられる判定方法は、クロ一ニングおよびシークエンス操作に時間と手間がかかり多数検体の処理には不向きである。さらに、野生株と変異株が同時に混在している場合、その変異率の程度を調べるためには、数十個のクローンについて同時に調べる必要があり、実用上の使用は困難である。従って、本発明の目的は、従来の B型肝炎ウィルス変異の判定法の上記問題点を解決し、簡易な操作により、迅速にしかも正確に B型肝炎ウィルス変異の判定を可能にする B型肝炎ゥィルス変異判定方法およびそれに用いる試薬を提供することである。

発明の開示

本発明者らは、 B型肝炎ウィルスの該変異部位を含む領域を P C R法により増幅する際に、使用するプライマ一を工夫することにより、 B型肝炎ウィルス pre- C変異株の検出を簡易にしかも精度よく行えることを見いだし、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下の（1) 〜（4) の工程からなる、 B型肝-炎ウィルスを含有するサンプルから B型肝炎ウィルスの pre- C変異を判定する方法を要旨とする。

(1) B型肝炎ウィルスゲノム D N Aの pre-C変異部位を含む一定領域を増幅することができるプライマーセットであって、増幅された D N Aにおいて変異の有無によって制限酵素による認識が異なるように、変異部分の近傍にミスマツチ塩基を導入して設計したプライマーを含むプライマ一セットを用いて、 P C R法により D N A増幅を行う。

(2) 増幅された D N Aを、増幅された D N Aにおいて pre- C変異に特異的な制限酵素で処理する。

(3) 制限酵素処理された D N Aまたはその断片を分別、検出する。

(4) 制限酵素による切断のパターンを調べて B型肝炎ウィルスの pre- C変異を検出、あるいはさらに変異したウィルスの比率を測定する。上記方法の（1) 工程で使用するプライマーセットは、第 1のプライマ一および第 2のプライマーからなり、第 1のプライマ一が、 B型肝炎ウィルスゲノム D N Aの pre-C 変異部位を含まずその近傍の塩基配列を有し、かつ該変異を増幅 D N Aの制限酵素処理により検出可能にするように人為的に 1または複数箇所のミ.スマッチ塩基が導入されたプライマーであり、第 2のプライマ一が変異部位を含む一定領域の増幅 D N Aを与えるプライマーであるのが好適である。

本発明方法によれば 1 力所あるいは複数箇所の B型肝炎ウィルスの p re- C 変異を検出することができ、特に 83番目および/または 86番目の変異の判定に好適である。

本発明はまた、上記方法において用いるプライマーセットに関し、さらにこのプライマ一セッ卜と制限酵素を含む B型肝炎ウィルスの変異判定用キッ卜に関す本発明方法によれば、短時間で、容易に且つ正確に B型肝炎ウィルス変異株の検出を行うことができ、さらに変異したウィルスの比率、すなわち変異率を測定することも可能である。

図面の簡単な説明

添付図面において、

第 1図は、本発明による B型肝炎の p re- C 8 3変異の検出方法を模式的に示す図である。

第 2図は、本発明による B型肝炎の pre- C 8 6変異の検出方法を模式的に示す図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明の判定は以下の手順により行う。

1 ) B型肝炎ウィルス遺伝子の変異部位を含む D N Aを、制限酵素による切断の有無で変異を検出できるように設計したプライマーセットを使用して、 P C R法により増幅する、 - -

2 ) 制限酵素で処理し、処理された D N Aまたはそめ断片を、電気泳動等適切な手段で分別、検出する、

3 ) 各制限酵素による切断のパターンを見る、 4 ) 切断のパターンから変異の判定を行う、あるいはさらに野生株と変異株の比率を求める。

この方法の第 1段階は、変異部位を含む D N Aの増幅である。変異の判定に使用するサンプルは、 B型肝炎患者の血液、'血清、血漿、リンパ球、組織等より調製した、 B型肝炎ウィルスを含有するサンプルである。

遺伝子の増幅は、常法である P C R法により行い、 P C R法としては 2段階 P C R法（ネステッド P C R法）を用いてもよい。 2段階 P C R法は、 P C Rを行う際に第 1段階として、目標とする領域より広い部分を増幅しうるプライマ一セットを用いて増幅し、次に第 2段階として、第 1段階で増幅した D N A断片内部の目標とする領域を増幅しうるプライマーセットを用いて増幅する方法である。本発明方法では、 P C R法に用いるプライマーとして、変異に特異的な制限酵素の切断部位を与えるように変異部位の近傍にミスマツチを導入した塩基配列のプライマーを使用することに特徵がある。 2段階 P C R法を用いる場合は、このプライマ一を 2段階目において使用する。

本来、 B型肝炎ウィルス pre- C の変異である pre- C領域の 83番目、 86番目の G → Aの両変異では、元の野生株と識別が可能になる制限酵素認識部位は生じないが、ミスマッチを含むプライマーを設計することによりこの部分に新たな制限酵素認識部位を導入することが可能となる。これは、プライマ一の一部に数塩基、例えば I ~ 5塩基のミスマッチがあっても P C Rによる増幅が可能であることを利用するものである。

例えば、図 1に示すように、 83番目の変異の検出には 80番目を T→Cにしたミスマッチプライマー（MP) (センス鎖として）を用いて増幅することにより、増幅 D N Aにおいてこの部分に新たな制限酵素認識部位を持たせることができる。この結果、野生株では Styl 認識部位（CCWWGG) ができるのに対し、 83変異株では Bsu36I 認識部位（CCTNAGG)が作られる。従って、 82番目から上流 22個の塩基からなり、 80番目にミスマッチを含むプライマ一を第 1のプライマーとして用いて増幅した D N A断片を、それぞれ Styl または Bsu36I で、あるいは Styl および Bsu36I で消化した後、電気泳動で分析することにより両者の識別が可能になる。実際にはこのようなプライマーを用いる場合、 Styl 認識部位が該プライマー内に存在しているので、この部分が切断されないように 70番目を C→ Aにしてプライマー設計を行った。

86番目の変異の検出には 92番目を A→T、 96番目を T→Cにしたミスマッチプライマー（アンチセンス鎖を用いる、但し塩基の表示はセンス鎖）を用いることによりこの部分に新たな制限酵素認識部位を持たせることができる。この結果、野生株では Bcgl認識部位 (10/12 (N)GCA(N)6TCG (N) 12/10) ができるのに対し、 86 変異株では Tthlll l 認識部位（GACNNNGTC)が作られる。従って、 88番目から下流 24個の塩基からなり、 92番目および 96番目にミスマッチを含むプライマ一を第 1 のプライマーとして用いて増幅した D N A断片を、それぞれ Bcg l または Tthl l I Iで、あるいは Bcgl および Tthlll lで消化した後、電気泳動で分析することにより両者の識別が可能になる。

上記においてミスマッチを含む第 1のプライマ一と共に用いる第 2のプライマ —は、電気泳動等適切な分離条件下で検出可能な D N Aを生じ、変異を検出するための制限酵素の切断部位が変異部分以外に全く無いか、あるいは存在しても変異の検出の妨げとならない増幅 D N Aを与えるプライマ一である。このようなプライマ一セットを用いて P C R法により本発明の目的に合う D N Aを増幅させることができる。具体的に説明すると、実施例 1では pre- C 83変異株検出用のミスマッチプライマーと、変異の下流側に存在する B型肝炎ウイルスのゲノム上の塩基配列のアンチセンス側をプライマーとして使用し、 99 塩基対（bp)の D N Aを、得て、制限酵素による処理を行い、 pre- C 83変異株の検出を行っている。

なお、 83番目の変異の検出において 80番目の塩基を T→ Cに変えたプライマ一では、 83番目の変異がある場合は Ddel 認識部位（CTNAG)も存在することになる。このように他の制限酵素でも変異の検出に適当であれば使用することができる。またプライマーの設定において、変異を検出するためにミスマッチを設定する D N A鎖は上記のようにセンス鎖、アンチセンス鎖いずれの鎖でも利用できる。さらに、プライマ一により変異部分に新たな制限酵素部位を作る際、上記例では野生株と変異株において異なる制限酵素の切断部位を同時に導入しているが、野生株か変異株のいずれかにのみ単一の制限酵素切断部位を生じるようなミスマッチ ― プライマ一を設定することによつても本発明の目的は達成される。例えば 75番目の塩基を G→C、 76番目を T→C、 77番目を G→Tに変えたミスマツチプライマ ― 5' -AAGCTGTGCCTTGGCCTGCTTT-3' (配列番号 6 ) を 83変異検出用に使用すると、 83変異株のみに EcoNI認識部位（GCTNNNNNAGG)が生じることになり、制限酵素 E coNIで処理したときに切断される D N Aは変異株であると判定される。

変異部位を含む D N Aの増幅のために使用するプライマーの長さは、増幅効率を考慮して決定できるが、 15〜40個程度のヌクレオチドからなるのが好ましい。また、増幅させる領域は、変異部位を含む 50〜300b. p. 程度の増幅 D N Aを得られるような範囲が好ましい。

本発明で使用するのに好適なプライマーセットとしては次のようなものがある。各プライマ一は D N A合成機により合成すればよい。

pre- C の 83番目の変異検出用プライマーセット

5' -AAGCTGTGCATTGGGTGGCCTT-3' (PC83F) (配列番号 1 )

5' -AAAGAATTCAGAAGGCAAAAAAGA-3' (PC2) (配列番号 2 )

r 5' -AAGCTGTGCATTGGGTGGCCTT-3' (PC83F) (配列番号 1 )

^ 5' -GGAGACTCTAAGGCCTCCCGA-3' (PC83 ) (配列番号 3 )

pre-C の 86番目の変異検出用プライマ一セッ卜

₅' -TTCTTTATACGGGTCGATGACCAT-3' (PC86R) (配列番号 4 ) 5' -GGAGGCTGTAGGCATAAATTGGT-3" (PC86F2) (配列番号 5 ) P C Rによる D N Aの增幅は常法に従い、 D N Aを熱変性し、これに上記ブライマ一をァニーノレさせ、次いで耐熱性ポリメラーゼ、 dNTP (dATP、 dGTP、 dNCP、 dTTP) を添加し、 D N A鎮を伸長させる。この熱変性、プライマ一のァ二一リング、 D N A鎖の伸長の工程を繰り返すことにより目的の領域のみを増幅できる。上記 P C Rによる D N A増幅処理の後、増幅した D N Aを 1種または 2種以上の制限酵素で処理する。使用する制限酵素は pre-C領域の変異の有無により切断パターンが異なるものである。例えば、実施例 1では野生株を切断するが、 83変異株は切断しない制限酵素として Styl を使用し、野生株を切断することなく 83 変異株を切断する制限酵素として Bsu36I を使用する。また、実施例 3では野生株を切断するが、 86変異株は切断しない制限酵素として Bcglを使用し、野生株を切断することなく 86変異株を切断する制限酵素として Tthl l llを使用する。このような制限酵素は市販のものを使用することができ、 D N Aの切断処理もその指示書に基づいて行えばよい。

次に、このように変異に応じて特定の制限酵素で処理した D N Aを電気泳動等適切な分離条件下で分離、検出する。この操作は常法に基づき行うことができ、例えば 10%ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動後、ェチジゥムブ口マイドによる染色を行い、 U V照射を行いバンドを検出する。

分離、検出した D N A断片について、用いた各制限酵素による切断の有無を調ベる。野生株のみ切断し、変異株を切断しない制限酵素を使用した場合、 B型肝炎ウィルスの野生株のみが検体中に存在していれば、増幅された D N Aは全て制限酵素により切断されたバンドを与える。変異株のみが存在している場合には制限酵素処理を行っても、制限酵素により切断されることなく、増幅された元のバンドが検出される。野生株および変異株が混在している場合には、切断されたバンドおよび切断されないバンドが検出され、それらの存在比により各バンドの濃淡が決定される。野生株を切断することなく、変異株のみを切断する制限酵素を使用した場合には、上記の切断パターンが完全に逆の結果を与えることとなる。従って、ある変異株の型判定と変異率の判定において、 1種類の制限酵素を使用しても十分に判定が可能であるが、上記のように性質の異なる 2種類の制限酵素を使用することによって、制限酵素の活性低下による誤判定を防ぎ、より正確な判定を行い得る。

B型肝炎ウィルス pre- C 領域に 83番目と 86番目の両方に変異を有する場合は、同一検体を 83変異検出用のプライマーと 86変異検出用プライマ一を用いてそれぞれ別個に D N A増幅を行い、それぞれについて制限酵素処理を行うことにより、両変異の有無の判定をすることができる。

本発明の方法に使用する B型肝炎ウィルスの p re- C 変異判定用キットは、上述のような pre- C の変異部位を含む領域を増幅するのに用いる各種のプライマ一セットおよび変異の有無により異なる切断パターンを与える制限酵素を含む。このキットにより、変異型を判定するには、変異に応じた切断パターンを記載した添付の判定表により、判定を行えばよい。また野生株と変異株の存在比率を推定するためには、目視により制限酵素処理後の電気泳動バンドの濃淡により行うことができ、より定量性を持たせるには、この電気泳動像を市販の C CDカメラ等を用いたデータ入力解析装置により、解析を行えばよい。

【実施例】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

B型肝炎ウィルスを含む血清検体 20 zl に、 0.2N NaOH 溶液 20 1 を加え混合後、 37°Cにて 1時間保温した。. 次いで 0.2 K HC1 溶液 20 1 を加え中和し、 10,0 OOX gで 5分間遠心し、その上清 ¾B型肝炎ウィルス DN A試料溶液とした。この試料溶液を用いて、以下のようにして実施例 1および 2では B型肝炎ウィルス pre- C の 83変異の、実施例 3では pre-C の 86変異の判定を行った。

【実施例 1】

B型肝炎ウィルス pre- C 83変異の判定（その 1)

上記 DN A試料溶液を用いて P C R法により pre- C 83変異株の検出を行った。すなわち、ウィルスゲノム上の塩基の変異を制限酵素の切断により検出可能にするよう設計されたプライマ一として 5'- AAGCTGTGCATTGGGTGGCCTT- 3' (PC83F) (配列番号 1 ) を、これに対し増幅後 99 bpの長さの DN Aを与えるプライマーとして 5' -AAAGAATTCAGAAGGCAAAAAAGA-3' (PC2) (配列番号 2 ) を用い、 -D N A試料溶液、耐熱性 DNAポリメラーゼを 2.5ュニット、 10 mM Tris-HCKpH 8.0)、 50 mM KC1 、 2.5 mM MgGI₂、 0.01%ゼラチン、 0.02% Nonidet P-40 、各々最終濃度 200 ¾{ の dNTP(dATP、 dCTP、 dGTP. dTTP) を加え、全量を 1Q0 1 とした後、ミネラルオイル 50 1 を重層し、反応を行った。 DNA増幅は、変性（94 °C) を 30秒、アニーリング（55°C) を 1分、 0^八伸長（72°0 を 1分の反応を 30サイクル繰り返した後、さらに DN A伸長（72°C) を 10分行うことにより行つた。

増幅した DNA約 200ng(10 1)を制限酵素 Styl および Bsu36I でそれぞれ処理をした。常法に従い 10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ェチジゥムブ口マイド染色して UV照射を行い、バンドを検出した。検出されるバンドのフラグメントサイズを記載した表 1の判定表に従って判定を行った。 Styl のみで切断された場合は血清中に存在している B型肝炎ウィルスの pre-C部分の変異がなく全て野生株であることを示し、 Bsu361のみで切断された場合は全て pre- C 83変異株であることを示している。両者が混在している場合には、その存在比率に応じてそれぞれの制限酵素で切断されない 99 bpのバンドの強度が異なってくる。その結果を表 2に示す。

(表 1 )

半 IJ 定表

(表 2)

【実施例 2】

B型肝炎ウィルス pre- C 83変異の判定（その 2)

上記 DNA試料溶液を用いて P C R法に"より pre- C 83変異株の検出を行った。すなわち、ウィルスゲノ厶上の塩基の変異を制限酵素の切断により検出可能にするよう設計されたプライマーとして 5'- AAGCTGTGCATTGGGTGGCCTT- 3' (PC83F) (配列番号 1 ) を、これに対し増幅後 161 b の長さの DNAを与えるプライマ一として 5' - GGAGACTCTAAGGCCTCCCGA-3' (PC83R) (配列番号 3 ) を用い、 DNA試料溶液 20^1 、耐熱性 DNAポリメラーゼを 2.5ュニット、 10 mM Tris-HCKpH 8. 0)、 50 mM KC1 、 2.5 mM MgCl₂、 0.01%ゼラチン、 0.02% Nonidet P-40 、各々最終濃度 200 zM の dNTP(dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP) を加え、全量を 100 1 とした後、ミネラルオイル 50 1 を重層し、反応を行った。 DNA増幅は、変性. (94°C) を 30秒、アニーリング（55°C) を 1分、 DNA伸長（72°C) を 1分の反応を 30サイクル繰り返した後、さらに DN A伸長（72°C) を 10分行うことにより行った。

増幅した DNA約 200ng(10 z 1)を制限酵素 Styl および Bsu36I でそれぞれ処理をした。常法に従い 10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ェチジゥムブ口マイド染色して UV照射を行い、バンドを検出した。制限酵素による切断の有無を調べ表 3の判定表に従って判定を行った。 Styl のみで切断された場合は血清中に存在している B型肝炎ウィルスの pre-C部分の変異がなく全て野生株であることを示し、 Bsu36Iのみで切断された場合は全て pre- C 83変異株であることを示している。両者が混在している場合にはその存在比率に応じてそれぞれの制限酵素で切断されない 161 のバンドの強度が異なってくる。その結果を表 4に示す。

(表 3)

判定表

① Styl ② Bsu36I

83 野生株 (G) 142, 19 161

83変異株 (A) 161 141,20 (表 4)

【実施例 3】

B型肝炎ウィルス pre- C 83変異の判定（その 3)

上記 DN A試料溶液を用いて Nested- P C R法により pre-C 83変異株の検出を行った。すなわち、第一段階目のプライマーとして、 5' - AATGTCAACGACCGACCTTG - 3' ($012) t 5' -GGAAAGAAGTCAGAAGGCAA-3' ($030) を用い、 DNA試料溶液 5 i 1 、耐熱性 DNAポリメラ一ゼを 1.25 ュニッ卜、 10 mM Tris-HCKpH 8.3)、 5Q mM KCK 1.5 mM MgCl₂、 0.001 %ゼラチン、各々最終濃度 200 M の dNTP(dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP) を加え、全量を 50 1 とした後、ミネラルオイル 25 1 を重層し、反応を行った。 DNA増幅は、変性（94°C) を 1分、アニーリング（55 °C) 、 1分、 DNA伸長（72°C) を 1分 30秒の反応を 35サイクル繰り返した後、さらに DN A伸長（72°C) を 7分行うことにより行った。

ウィルスゲノム上の塩基の変異を制限酵素の切断により検出可能にするよう設計されたプライマーとして 5' - AAGCTGTGCATTGGGTGGCCTT- 3' (PC83F)とこれに対し増幅後 99 bpの長さの DNAを与えるプライマ一として 5' - AAAGAATTCAGAAGGCAAA AAAGA-3' (PC2)を用い、上記第 1段階目の P C R溶液 1 1 、耐熱性 DN Aポリメラーゼを 1.25ュニット、 10 mM Tris-HCKpH 8.3)、 50 mM KC1 、 1.5 mM MgCl₂、 0.001 %ゼラチン、各々最終濃度 200 zMの d^TTP(dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP) を加え、全量を 50 1 とした後、ミネラルオイル 25^1 を重層し、第 2段階目の P CR反応を行った。 DNA増幅は、変性（94°C) を 1分、ァニ一リング（55°C) を 1分、 DNA伸長（72°C) を 1分 30秒の反応を 25サイクル繰り返した後、さらに DNA伸長（72°C) を 7分行うことにより行った。

増幅した DNA約 200ng(10ju 1)を制限酵素 Styl および Bsu36I でそれぞれ処理をした。常法に従い 10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ェチジゥムブ口マイド染色して UV照射を行い、バンドを検出した。表 1の型判定表に従って、制限酵素による切断の有無を調べ型判定を行った。 Styl のみ切断された場合は血清中に存在している B型肝炎ウィルスの pre- C部分の変異がなく全て野性株であることを示し、 Bsu36Iのみで切断された場合は全て pre- C 83変異株であることを示している。両者が混在している場合には、その存在比率に応じてそれぞれの制限酵素で切断されない 99 bpのバンドの強度が異なってくる。表 2と周様の結果が得られた _α

【実施例 4】

Β型肝炎ウィルス pre- C 86変異の判定

上記 DN A試料溶液を用いて P CR法により pre- C 86変異株の検出を行った。すなわち、ウィルスゲノム上の塩基の変異を制限酵素の切断により検出可能にするよう設計されたプライマーとして 5' -TTCTTTATACGGGTCGATGACCAT-3' (PC86R) (配列番号 4 ) を、これに対し増幢後 149 b の長さの DNAを与えるプライマ一として 5' -GGAGGCTGTAGGCATAAATTGGT-3' (PC86F2) (配列番号 5 ) を用い、 D A試料溶液 20^1 、耐熱性 DN Aボリメラーゼ 2.5ュニット、 10 Tris-HCKp H 8-0)、 50 mM KC1 、 2.5 raM MgCl₂、 0.01%ゼラチン、 0.02% Nonidet P-40 、各々最終濃度 200 の dNTP(dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP) を加え、全量を 100 1 とした後、ミネラルオイル 50ίί1 を重層し、反応を行った。 DNA増幅は、変性（94°C) を 30秒、アニーリング（55°C) を 1分、 DNA伸長（7TC) を 1分の反応を 30サイクル繰り返した後、さらに DN A伸長（72°C) を 10分行うことにより行った。

増幅した DNA約 200ng(10/£l)を制限酵素 Bcgl および Tthllliでそれぞれ処理をした。常法に従い 10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ェチジゥムブ口マイド染色して u v照射を行い、バンドを検出した。制限酵素による切断の有無を調べ表 5の判定表により判定を行った。 Bcg l のみで切断された場合は血清中に存在している B型肝炎ウィルスの pre- C 部分の変異がなく全て野生株であることを示し、 Tthlll l のみ切断された場合は全て pre- C 86変異株であることを示している。両者が混在している場合にはその存在比率に応じてそれぞれの制限酵素で切断されない 146 b のバンドの強度が異なってくる。その結果を表 6に示す ₍ (表 5 )

半 ϋ 定表

① Bcg l ② Tthlll l

86 野生株 (G) 113, 34, 2 149

86 変異株 (Α) 149 - 126, 23

(表 6 ) バンドの有無（強〜弱； + +〜十）

検体 No. Bcgl Tthlll l 半リ定

149 bp 113 bp 149 bp 126 bp

1 + + 86変異株

2 + + 86野性株

3 . + + + + 86野性株

4 + + + + + + 86野性株、変異株混合

5 + + + + 86野性株

6 + + 86野性株

7 + 86野性株【発明の効果】

本発明によれば、特定のプライマーで増幅した D N Aについて各制限酵素による切断のパターンを調べれば、 B型肝炎ウィルス pre- C変異の判定を行うことができるので、従来法よりも容易に短時間でしかも正確に判定し得る。また野生株と変異株の混在している場合にも対応でき、その存在比率まで測定することができる。本発明の簡便で正確な B型肝炎ウィルス pre- C変異の判定法によれば、 B 型急性肝炎の予後の予測が容易となり、非常に有用である。

【配列表】配列番号： 1

配列の長さ： 22

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 D N A

配列 -

AAGCTGTGCA TTGGGTGGCC TT 22

配列番号： 2

配列の長さ： 24

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 D N A

配列

AAAGAATTCA GAAGGCAAAA AAGA 24

配列番号： 3

配列の長さ： 21

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状 - 配列の種類：他の核酸合成 D N A

配列

GGAGACTCTA AGGCCTCCCG A 21 配列番号： 4

配列の長さ： 24

配列の型：核酸 ' 鎖の数：一本鎮

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列 -

TTCTTTATAC GGGTCGATGA CCAT 24

配列番号： 5

配列の長さ： 23

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GGAGGCTGTA GGCATAAATT GGT 23 配列番号： 6

配列の長さ： 22

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

AACCTGTGCC TTGGCCTGCT TT 22

Claims

請求の範囲

(1) 次の（1) ~(4) の工程からなる、 B型肝炎ウィルスを含有するサンプルから B型肝炎ウィルス pre-C 変異を判定する方法。

(a) B型肝炎ウィルスゲノム DNAの pre- C 変異部位を含む一定領域を増幅す ¾ことができるプライマ一セットであって、増幅された DN Aにおいて変異の有無によって制限酵素による認識が異なるように、変異部分の近傍にミスマッチ塩基を導入して設計したプライマーを含むプライマ一セットを用いて、ポリメラ一ゼチヱインリアクション法により D N A増幅を行う。

(b) ミスマッチ塩基が導入されて増幅された DNAを、該増幅 DNAにおいて pre-C 変異に特異的な制限酵素で処理する。

(c) 制限酵素処理された DNAまたはその断片を分別、検出する。

(d) 制限酵素による切断のパターンを調べて B型肝炎ウィルスの pre_C 変異を検出、あるいはさらに変異したウィルスの比率を測定する。

(2) 前記工程（a) で使用するプライマ一セッ卜が第 1のプライマーおよび第 2のプライマーからなり、第 1のプライマ一が、 B型肝炎ウィルスゲノム D N Aの pr e-C 変異部位を含まずその近傍の塩基配列を有し、かつ該変異を増幅 DN Aの制限酵素処理により検出可能にするように人為的に 1 または複数箇所のミスマッチ - 塩基が導入されたプライマ一であり、第 2のプライマ一が変異部位を含む一定領域の増幅 DNAを与えるプライマーである、請求の範囲第 1項記載の判定方法。

(3) 1箇所あるいは複数箇所の B型肝炎ウィルスの pre- C 変異を判定する請求の範囲第 2項記載の判定方法。

(4) 前記変異が B型肝炎ウィルスゲノム DNAの pre- C 領域における 83番目の変異および/または 86番目の変異である、請求の範囲第 3項記載の判定方法。

(5) pre- C 領域の 80番目にミスマッチ塩基を導入したプライマーを用いて、 pre - C 領域の 83番目の変異'を判定する請求の範囲第 4項記載の判定方法。

(6) pre-C 領域の 92番目および 96番目にミスマッチ塩基を導入したプライマーを用いて、 ore- C 領域の 86番目の変異を検出する請求の範囲第 4項記載の判定方法 c

(7) B型肝炎ウィルスゲノム D N Aの pre- C変異部位を含む一定領域を增幅することができるプライマ一セットであって、増幅された D N Aにおいて変異の有無によつて制限酵素による認識が異なるように、変異部分の近傍にミスマッチ塩基を導入して設計したプライマ一を含む、 B型肝炎ウィルスの pre- C 変異判定のために用いるプライマーセット。

(8) 第 1のプライマーおよび第 2のプライマーからなり、第 1のプライマーが、 B型肝炎ウィルスゲノム D N Aの pre，C変異部位を含まずその近傍の塩基配列を有し、かつ該変異を増幅 D N Aの制限酵素処理により検出可能にするように人為的に 1または複数箇所のミスマツチ塩基が導入されたプライマ一であり、第 2のプライマーが変異部位を含む一定領域の増幅 D N Aを与えるプライマーである、請求の範囲第 7項記載のプライマーセット。

(9) 前記変異が B型肝炎ウィルス D N Aの pre- C領域における 83番目の変異および Zまたは 86番目の変異である、請求の範囲第 8項記載のプライマーセット。

(10) pre- C領域の 83番目の変異を検出するためのプライマーセットであり、第 1のプライマーが配列表の配列番号 1に記載の塩基配列を有する、請求の範囲第

9項記載のプライマーセット。

(11) pre- C領域の 83番目の変異を検出するためのプライマーセットであり、第 1のブライマ一が配列表の配列番号 6に記載の塩基配列を有する、請求の範囲第 9項記載のプライマーセット。

(12) pre-C領の 86番目の変異を検出するためのプライマ一セットであり、第 1のプライマーが配列表の配列番号 4に記載の塩基配列を有する、請求の範囲第 9項記載のプライマーセット。

C13) 請求の範囲第 7項〜第 12項記載のいずれかのプライマーセットと、前記増幅された D N Aにおいて変異に特異的な制限酵素とを含む、 B型肝炎ウィルスの pre- C変異判定用キット。