JPH08500732A - 核酸検出における偽陰性の除外 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、試料中の増幅された被分析核酸を検出するアッセイにおける偽陰性試験結果を除外する方法に係わる。増幅前に、被分析核酸と同じ増幅試薬を用いて増幅され得る、被分析核酸から区別可能な核酸を含む内部対照を試料に加える。内部対照は、被分析核酸から区別し得るべく突然変異された被分析核酸に対応する核酸配列を含むことが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸検出における偽陰性の除外 本発明は、増幅された被分析核酸を検出するアッセイにおいて偽陰性試験結果 を除外する方法に係わる。 通常、試料中の増幅された核酸を検出する場合、検査対象試料中に被分析核酸 がもともと存在しなかったことを示す陰性試験結果は、別の確認アッセイを実施 することによってのみ確証され得る。別の確認試験の実施はかなり時間を要する ものであるが故に、増幅された被分析核酸を検出するアッセイにおいて陰性試験 結果について対照を与える方法が必要である。アッセイ過程及び増幅方法におい て各試料に直接内部チェックを与え得るならば、別の確認試験を実施する必要は ない。 被分析核酸と同時に増幅され得る他の配列を、被分析核酸を含む試料に加える ことがBecker及びHahlbrock (Nucleic Acids Research, Vol.17, Number 22, 19 89 )に記載されている。Becker及びHahlbrockによって記載されている方法は、被 分析核酸と１ヌクレオチドだけ異なる核酸配列（点突然変異）を含む種々の既知 量の内部標準を、未知量の被分析核酸を含む試料に加え、被分析核酸と共にＰＣ Ｒ によって同時増幅するという核酸の定量方法である。内部標準配列中に１塩基の 変更を導入することによって特異的制限部位を生成し、適当な制限酵素を用いて 突然変異配列を切断してから、増幅された核酸を含む試料を電気泳動ゲルにかけ る。突然変異配列（の一部）及び被分析核酸を表わすゲル中のバンドを比較する ことにより、核酸を定量する。Becker及びHahlbrookは彼らの定量方法において 内部標準をマーカーとして使用し、そこで被分析物質及びマーカーの両方を非競 合的に増幅している。 本発明は、試料中の増幅された被分析核酸を検出するアッセイにおける偽陰性 試験結果を除外する方法であって、増幅前に、被分析核酸と同じ増幅試薬を用い て増幅され得る、被分析核酸から区別可能な核酸を含む内部対照を試料に加える ことを特徴とする方法に係わる。増幅に使用される試薬は増幅プライマーを含む 。本発明の方法に使用される内部対照は、いずれも同じ増幅プライマーを用いて アニーリングし得る点で被分析核酸に類似であるべきである。 試料に内部対照を与えなければ、陰性試験結果からは、増幅された核酸がある ことは示されない。この場合、被増幅核酸を表わすシグナルの不在は、増幅また はアッセイ方 法の誤りに起因するものかもしれず、別の確認試験を実施してこの可能性を排除 する必要がある。本発明の全ての試料中に内部対照を用いる方法を使用する１つ の利点は、「陰性」試料（即ち被分析物質が存在しない試料）の場合、増幅され た内部対照の存在を示すシグナルが得られることである。内部対照を表わすシグ ナルの出現により陰性試験結果は確認され、後続作業（増幅及び検出作業）にお ける対照として作用する。従って偽陰性試験結果は除外される。 本発明の方法に使用される内部対照は、増幅された内部対照の存在が検出時に 、被分析物質を表わすシグナルとは異なるシグナルによって示される点で被分析 物質とは異なる必要がある。例えばゲル電気泳動分離の場合は、被分析物質と内 部対照はゲル上端から異なる移動距離にバンドが出現することにより示される。 固相ハイブリダイゼーションアッセイの場合は、増幅された被分析物質及び内部 対照核酸の存在は、固相上の異なるスポットによって示され得る。 本発明の方法は、それによって適当な増幅プライマーを構築し得る試料中に任 意に存在する全ての種類の核酸、即 ちＲＮＡ及びＤＮＡの検出に使用し得る。例えば臨床（血液）試料を、ＨＩＶ、 ＨＣＶまたはＣＭＶのごときウイルス由来のＲＮＡの存在について試験し得る。 本発明の方法は、任意の種類の増幅方法、例えば米国特許第４，６８３，１９ ５号明細書及び同第４，６８３，２０２号明細書に記載のごとき所謂ポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用し得る。好ましい核酸増幅方法は、欧州特許出願第 ０，３２９，８２２号明細書に記載のごとき「核酸配列基準増幅（ＮＡＳＢＡ） 」である。 例えばＰＣＲを使用するよりもＮＡＳＢＡを使用することの利点は、ＮＡＳＢ Ａは当初存在する核酸から（大量の）一本鎖ＲＮＡを生成するが故に、増幅完了 後に一本鎖核酸を得るための変性ステップが必要でないことであり、当初存在す る核酸はＲＮＡでもＤＮＡでもよい。一本鎖ＲＮＡではなくで二本鎖ＤＮＡを生 成するＰＣＲの別の欠点は、鋳型と相補的な変性プライマーと第２鎖とが再アニ ーリングのときに競合し、増幅感度を低下させることである。 本発明の方法によれば、増幅前の試料調製の際に内部対照を所定量で加える。 加える内部対照の量は、被分析核酸増幅をほとんど妨害しないものである。 ＮＡＳＢＡのごとき増幅方法を使用する場合、核酸が好ましく増幅されるかど うかは、試料中に存在する被分析核酸の量に対する内部対照の相対添加量に従う 。被分析核酸が試料中に内部対照以上の量で存在する場合（例えば百分子の対照 を千分子以上の被分析物質を含む試料に添加する場合）、被分析核酸は好ましく 増幅される。増幅が完了した後も内部対照の量は依然として極めて低い。一方、 検査対象試料が被分析核酸について陰性の場合（被分析核酸、例えばウイルスＲ ＮＡが試料中にもともと存在しなかったことを意味する）、増幅プライマーを大 量の被分析核酸と競合することがないので内部対照が増幅され、増幅作業完了後 に対照は大量の検出可能な量で存在する。 内部対照は、被分析核酸から区別されるよう突然変異された、被分析核酸に対 応する核酸配列を含むのが好ましい。 内部対照は、後続の検出作業に従って種々の方法で被分析物質から区別し得る 。どんな場合でも、内部対照として使用される核酸は、被分析核酸と同じ増幅試 薬を用いて増幅され得るべきである点で被分析核酸と類似であらねばならない。 内部対照は、被分析核酸から区別されるべく種々 の方法で突然変異し得る。例えば挿入物を導入し、被分析物質より長い内部対照 を作製したり、欠失によってより短い内部対照を作製し得る。いずれも場合も、 内部対照が突然変異（例えば欠失）のために被分析核酸より効率的に増幅され得 ることは回避すべきである。試料中に存在し得る被分析核酸の増幅を内部対照が 妨害しないよう、被分析核酸よりも非効率的に増幅される内部対照を使用するこ とが好ましい。 本発明の１つの実施態様においては、内部対照及び被分析物質は、１つの同じ 相補的オリゴヌクレオチドと検出可能な複合体を形成し得る点で相互に類似であ る。このオリゴヌクレオチドは、内部対照中にも存在する被分析物質の配列の一 部にハイブリダイズする。 増幅された核酸（被分析物質または内部対照）をゲル電気泳動によって検出す る場合、被分析核酸と長さが異なる内部対照を使用することが好ましい。被分析 物質と内部対照の長さの相違により、電気泳動ゲルにおいて異なる移動度がもた らされる。内部対照は被分析核酸と長さが異なる故に、内部対照は、被分析核酸 の特性を表わすスポットとは異なるゲル上端からの移動距離を有するバンドとし て出 現する。 即ちゲルの上端からの移動距離により被分析物質が増幅されたか内部対照が増 幅されたかが判り、内部対照が増幅された場合は、試料中に検出可能量の被分析 核酸が不在であることが確認される。 増幅された核酸を電気泳動にかける場合、ゲル中の核酸の存在は当分野におけ る任意の公知の方法によって示し得る。「サザンブロット」として公知の１つの 良く知られた方法は、電気泳動後に核酸をニトロセルロースに移し、放射性標識 相補的プローブを用いてハイブリダイズすることを含む。次いで核酸をオートラ ジオグラフィーによって可視化することができる。 上述の方法はかなり時間を要するが故に、電気泳動にかける前に増幅された核 酸に相補的オリゴヌクレオチドを加えることが好ましい。得られた複合体をゲル 電気泳動によって残りの遊離標識プローブから分離することができる。試料をゲ ル電気泳動にかける前に検出プローブを試料中に存在する核酸とハイブリダイズ する場合、検出プローブは、増幅後に存在する核酸（被分析物質または対照）に 加える。被分析物質及び内部対照にハイブリダイズし得る検出プロ ーブは、存在する被増幅核酸と複合体を形成する。加えたオリゴヌクレオチドの 量の一部は、増幅された核酸に特異的に結合し、加えたオリゴヌクレオチドの残 りは、遊離標識オリゴヌクレオチドとして残存し、ゲル電気泳動のときに複合体 から分離される。この残存遊離標識プローブは通常はゲルの底部に別個のバンド として出現する。 試験結果が陰性である（被分析核酸は存在しない）場合でも、１つのバンドが 、ゲル中の、内部対照と標識プローブとの間で形成される複合体の寸法に特徴的 な高さのところに出現し、増幅及び標識プローブとのハイブリダイゼーションが 実際に起こったことが示される。こうしてアッセイの陰性結果（検出すべき核酸 は存在しない）が確認される。 ゲルを横断し得る標識を使用する限りは、検出プローブを種々の方法で標識し 得る。酵素標識プローブを使用し、それがハイブリダイズし得る核酸を含む試料 に加えて検出可能な複合体を形成し、複合体をゲル電気泳動によって遊離酵素標 識プローブから分離することが、本出願人名義の同時係属米国特許出願第０７／ ９１０，８６０号明細書に記載されており、該特許出願明細書の開示は参照によ り本 明細書の一部を構成するものとする。 上述の米国特許出願に記載のごとき酵素標識、例えば西洋ワサビペルオキシダ ーゼは、電気泳動されゲル系中に固定された後も活性を維持し、尚適当な基質と 反応し、ゲル中の標識核酸（即ち酵素標識複合体核酸及び／または遊離酵素標識 オリゴヌクレオチド）の存在を示す呈色反応を与え得る。このように得られる系 は使用が単純である。ゲル中の酵素標識を検出するために特別の装置を必要とせ ず、従って、例えば所定のウイルス由来の所定の核酸の存在について臨床試料を 試験するなどの診断目的には極めて有効である。 残存遊離酵素標識オリゴヌクレオチドを酵素標識複合体核酸からゲル電気泳動 によって分離した後、適当な酵素基質を用いて染色することによりゲル中の標識 複合体を検出する。 染色作業は単純且つ迅速である。ゲルを単に適当な酵素基質を含む溶液中に浸 漬すると、ゲル中に存在する酵素標識と基質溶液との間で呈色反応が起こる。使 用した基質は、ゲル中に存在する酵素標識核酸を含むバンドと反応する。酵素標 識と基質との呈色反応はゲル上またはゲル中で起こ り、酵素活性の存在を示すゲル上またはゲル中の発色を目視により検出し得る。 オリゴヌクレオチドを西洋ワサビペルオキシダーゼまたはその誘導体で標識し、 ゲル中の標識核酸を３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン／Ｈ₂Ｏ₂を用 いて染色することにより検出を行うと、優れた結果が得られる。西洋ワサビペル オキシダーゼ（ＨＲＰ）は過酸化水素の水への変換を触媒する。ＨＲＰの非沈殿 性基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）は、過酸化水を水に変換するた めの電子供与体として作用する色原体基質であり、ＨＲＰによって着色複合体に 変換され、それによって酵素活性の存在が示される。呈色は目視により検出し得 る。 染色処理は、酵素が依然として活性を示す条件下に実施する必要がある。染色 液は、使用した酵素標識に適したｐＨ値を有するべきである。 電気泳動緩衝液は通常、酵素の活性最適値とは異なるｐＨ値を有する。従って 、ゲルを電気泳動にかけたあと緩衝液を用いて洗浄することにより、ゲルを酵素 反応を起こすのに適したｐＨ値にすべきである。 ＨＲＰを酵素標識として使用する場合は、電気泳動にか けた後に酵素基質（例えばＴＭＢ／Ｈ₂Ｏ₂）及びイミダールを含む緩衝液中でゲ ルを直接染色することができる。イミダールは、ＨＲＰの活性最適値をより高い ｐＨ値にシフトさせる。従ってイミダールを用いると、ゲルを電気泳動緩衝液中 で直接染色することができ、時間を要する洗浄処理を省略し得る。 本発明方法の上記実施態様によれば、核酸増幅が酵素シグナル増幅と組合せら れるので（各酵素分子は、ゲル中／上に滞留する多数の基質分子を変換し得る） 、高感度が得られる。 勿論本発明の方法は、検出方法が被増幅核酸のゲル電気泳動を含む上述の適用 に制限されない。例えば被増幅核酸（被分析物質または内部対照）の検出は、固 相上に固定された被分析物質及び内部対照の両方と反応し得る相補的オリゴヌク レオチドを使用して同様に実施し得る。被分析物質または内部対照が固相に結合 されたかどうかを検出するためには、２種の異なる標識検出プローブを使用し得 る。一方は（被分析核酸の一部と相補的なオリゴヌクレオチドを含むが故に）固 相に結合した被分析物質と特異的に反応し、第１検出プローブ上の標識とは区別 され得る標識を含 む第２標識検出プローブは内部対照と特異的に反応する。この場合に使用される 内部対照は、固相上に固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る点 で被分析物質と類似である必要があるが、被分析物質とは異なる標識検出プロー ブと反応する点で被分析物質とは異なる必要がある。これは、第１標識検出プロ ーブと相補的な配列を、被分析物質中に存在しない、第２標識検出プローブと相 補的な異なるヌクレオチド配列で置き換えることにより内部対照を構築すること で行い得る。固相に結合したこの種の標識により、被分析物質または内部対照が 存在するかどうかが示され、それによって試験結果が陽性か陰性かが示される。 本発明の別の実施態様は、一方は被分析物質に特異的に結合し、他方は内部対 照に特異的に結合する２種のオリゴヌクレオチドを固相上の２つの別個のスポッ トに固定することを含む。固相上のスポットのいずれかに結合した被増幅核酸を 、被分析核酸及び内部対照の両方に存在する配列と相補的な標識オリゴヌクレオ チドにハイブリダイズさせることにより検出し得る。この場合、試験結果が陽性 か陰性かを示すのは、標識が結合した固相上のスポットである。 例えば被増幅核酸の存在を散乱内面全反射によって検出する場合には標識は金ゾ ル粒子とし得るが、放射性標識（オートラジオグラフィーによって検出）または 適当な酵素基質と呈色反応を与える酵素標識プローブを使用することもできる。 以下、実施例により本発明を更に説明する。 実施例１： ＡＩＤＳ患者由来の検体から核酸を抽出した。全血、血漿、単球及び血小板を 出発材料として使用した。ＨＩＶ１に感染させたＳＣＩＤ−ｈｕマウスの全血試 料から核酸を抽出した。試料を、Boomら(J.Clin.Microbiol.28:495-503.1990)に よって記載されている試料処理方法に従って処理した。抽出した核酸をＮＡＳＢ Ａの入力として使用してＲＮＡを増幅した。夾雑物のチェックとして鋳型は含め ず、一連の種々の量のＷＴ ＨＩＶ−１ ＲＮＡ（１０¹、１０²、１０³、１０⁴ 分子）を使用して検出感度を判定した。ＨＩＶ遺伝子ｇａｇに対するプライマー 対を増幅に使用した（プライマー１（ＯＴ２７０）：AATTCTAATACGACTCACTATAGG GGTGCTATGTCACTTCCCCCTTGGTTCTCTCA；プライマー２（ＯＴ２７１）：AGTGGGGGGA CATCAAGCAGCCATGCAAA)。 各増幅反応に、１０²のＲＮＡ分子を処理の対照として加えた。このＲＮＡ分子 （Ｅ２）は、野生型ＨＩＶ−１ＲＮＡと同じターゲット配列を含むと共に、２２ ｂｐ Ｓｐｈ ＩｘＰｓｔ Ｉフラグメントを置き換える１４０ｂｐの挿入物を 含んだ。水浴中４５℃で１０分間、ハイブリダイゼーションを実施した。ハイブ リダイズした及びハイブリダイズしなかったＨＲＰ標識オリゴヌクレオチドを分 離するため、Biometra Multigel G44形状の７％ネイティブアクリルアミドゲル を使用した。１＊ＴＢＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ５０ｍＭボレート，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．５）を移動及びゲル緩衝液として使用した。 ２．５μｌのハイブリダイズした試料をゲルに添加した。キシレンシアノール がゲル長の７０％に達したときに電気泳動を停止した。ゲル電気泳動完了後、ゲ ルを洗浄し、クエン酸緩衝液ｐＨ５．０中で５分間揺動した。次いでゲルを洗浄 し、１％デキストランスルフェートを含むクエン酸緩衝液ｐＨ５．０中で１５分 間揺動してから、クエン酸緩衝液ｐＨ５．０中で２分間、再度洗浄した。ＴＭＢ （０．１mg／ml）及びＨ₂Ｏ₂（１μｌ ３０％Ｈ₂Ｏ₂／１０ml）を用いて１０分 間染色することによりＨＲＰを含むバンドを可 視化した。ゲルを水で濯ぎ、５０％メタノール中で少なくとも２時間インキュベ ート（脱水）した。次いでゲルをゲルドライヤー（Bio-radモデル５８３）内で 真空下５０℃で乾燥した。表１に目視評価結果をまとめて示す。 実施例２： 実施例１において判定不可と評価されたものを、実施例１に記載の実験と同様 に実施した別の実験において再試験した。実施例１で判定不可であった試料は、 再試験すると全てが陽性と評価された。入力分子が最低の対照（１０²）も陽性 と評価された。これらの結果から、かかる実験は実施例１よりも幾分高い感度を 与えると結論し得る。結果を表２に与える。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料中の増幅された被分析核酸を検出するアッセイにおける偽陰性結果を除 外する方法であって、増幅前に、前記被分析核酸と同じ増幅試薬を用いて増幅さ れ得る、被分析核酸から区別可能な核酸を含む内部対照を加えることを特徴とす る方法。 ２．前記内部対照が、前記被分析核酸から区別し得るよう突然変異された、被分 析核酸に対応する核酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．前記内部対照が、前記被分析核酸よりも非効率的に増幅されることを特徴と する請求項１または２に記載の方法。 ４．前記内部対照及び被分析核酸の両方が、１つの同じ相補的オリゴヌクレオチ ドと検出可能な複合体を形成し得ることを特徴とする請求項１から３のいずれか 一項に記載の方法。 ５．前記被分析核酸及び内部対照が、長さは異なるが、両方が同じ相補的オリゴ ヌクレオチドと検出可能な複合体を形成し得ることを特徴とする請求項４に記載 の方法。 ６．前記相補的オリゴヌクレオチドを固相上に固定し、前記検出可能な複合体が 、別様に標識された反応物質とそれ ぞれ反応し得ることを特徴とする請求項４に記載の方法。 ７．前記被分析核酸及び内部対照核酸がそれぞれ、異なる相補的オリゴヌクレオ チドと検出可能な複合体を形成し得ることを特徴とする請求項１から３のいずれ か一項に記載の方法。 ８．前記オリゴヌクレオチドを固相上の異なるスポットにそれぞれ固定する請求 項７に記載の方法。