FR2921064A1

FR2921064A1 - Oligonucleotides, utilisation, methode de detection et kit permettant de diagnostiquer la presence du gene e1 du virus du chikungunya

Info

Publication number: FR2921064A1
Application number: FR0757598A
Authority: FR
Inventors: Jean Noel Telles
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2007-09-14
Filing date: 2007-09-14
Publication date: 2009-03-20
Also published as: WO2009044085A3; US20100216117A1; WO2009044085A2; EP2185731A2

Abstract

La présente invention concerne des oligonucléotides destinés à permettre l'amplification et la détection d'une séquence cible localisée dans le gène E1 du virus du Chikungunya.Ces oligonucléotides ont une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprennent au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus des séquencessuivantes :SEQ ID No. 1 : 5'-CTCTTACCGGGTTTGTTGC-3'SEQ ID No. 2 : 5'-GCCTGGACACCTTTCGAC-3'ou leur sequence complémentaire.L'invention concerne également l'oligonucléotide permettant la détection des amplicons, l'utilisation de ces oligonucléotides, une méthode de détection et un kit permettant de diagnostiquer la présence du gène E1 du virus du Chikungunya.L'invention trouve une application préférentielle dans le domaine du diagnostic.

Description

Oligonucléotides, utilisation, méthode de détection et kit permettant de diagnostiquer la présence du gène El du virus du Chikungunya.

La présente invention concerne des oligonucléotides destinés à permettre l'amplification et la détection d'une séquence cible localisée dans le gène E1 du virus du Chikungunya. L'invention concerne également l'utilisation de ces oligonucléotides, une méthode de détection et un kit permettant de diagnostiquer la présence du gène E1 du virus du Chikungunya.

Le virus Chikungunya est un arbovirus du genre alphavirus qui se transmet par des moustiques Aedes. Il a été isolé pour la première fois en 1953. Depuis, des épidémies de Chikungunya ont eu lieu en Afrique tropicale et en Asie. Une épidémie sans précédent a eu cours sur l'Ile de La Réunion, qui compte 775 000 habitants et pour laquelle plus de 244 000 cas ont été rapportés au 20 avril 2006.

A l'heure actuelle, il n'existe pas de diagnostic de routine de l'infection par Chikungunya et très peu de laboratoires ont la capacité de diagnoster ce virus. Les techniques employées dans ces laboratoires de référence sont les suivantes . sérologie par des techniques courantes (inhibition de l'hémagglutination, fixation du complément, immunofluorescence, Elisa), - amplification et détection par RT-PCR en temps réel. La sérologie repose sur la détection d'anticorps IgM et IgG qui apparaissent à différents moments de l'infection. Les

IgM sont détectées dans le sérum en moyenne 5 jours après le début des signes cliniques et persistent plusieurs semaines à trois mois. Les IgG sont identifiés par deux prélèvements (phase aiguë et convalescence), et persistent pendant des années. La sensibilité et la spécificité, de ces tests ne sont pas bien établies, notamment la possibilité de faux positifs par réactions croisées avec les IgM de la dengue ou d'autres arbovirus.

En parallèle des tests d'amplification par RT-PCR en temps réel ont été mis au point. L'intérêt de la biologie moléculaire dans le diagnostic des maladies infectieuses est bien connues. Elle permet en effet une détection rapide du génome du virus et ceci dès la phase initiale virémique qui correspond au sept premier jours dans le cas d'une infection par le virus du Chikungunya. Ainsi, Pastorino et al décrivent un test RT-PCR pour la détection en temps réel du virus Chikungunya en utilisant la méthode TagMan (Journal of Virological Methods, 124 (2005) 65-71). Les amorces d'amplification et la sonde de détection ont été sélectionnées dans la région du gène de la protéine structurale El. La sensibilité obtenue est de 1,2.10-2 Dose Infectieuse par reaction. Dans une autre publication, Parida et al décrivent la détection du virus Chikungunya par une méthode alternative à la PCR nommée RT-LAMP pour reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (J. Clin. Microbiol. 2007 Feb; 45(2):351-7). Les amorces ont été sélectionnées dans le gène de la protéine El. Une sensibilité de 20 copies de transcrits par réaction a été déterminée. L'inconvénient de cette technique est qu'elle nécessite 6 amorces differents pour effectuer la réaction 3

d'amplification. De plus, la détection n'est pas effectuée avec une sonde spécifique mais par turbimétrie. Ainsi, dans le cas où la réaction n'est pas spécifique et un autre virus est amplifié, un faux positif sera détecté.

Ainsi, un test d'identification du virus du Chikungunya, rapide, spécifique et très sensible est toujours attendu.

La présente invention concerne donc une paire d'oligonucléotides destinée à permettre l'amplification d'une séquence cible localisée dans le gène E1 du génome du virus du Chikungunya, la paire d'oligonucléotides consistant en . - un premier oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 1 5'-CTCTTACCGGGTTTGTTGC-3', ou sa séquence complémentaire, et - un second oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 2 : 5'-GCCTGGACACCTTTCGAC-3', ou sa séquence complémentaire.

Dans un mode particulier de l'invention, le premier oligonucléotide comprend additionnellement une séquence promotrice qui peut être reconnue par une enzyme ARN polymérase ADN dépendante. De préférence, la séquence promotrice qui peut être reconnue par une enzyme ARN polymérase ADN dépendante est une polymérase T7. Ainsi, lorsque cet oligonucléotide, auquel est additionnée la séquence promotrice, permet l'amplification

de la séquence cible localisée dans le gène E1, il consiste essentiellement en la séquence suivante : SEQ ID No. 3 5 '-ATTCTAATACGACTCACTATAGGGGCTCTTACCGGGTTTGTTGC-3'. La partie de la séquence en italique correspond à la séquence promotrice T7. La séquence soulignée correspond à une séquence créant un espace, dite linker, entre la séquence promotrice et l'oligonucléotide de sequence SEQ ID No. 1.

L'invention concerne également un oligonucléotide destiné à être utilisé comme sonde de détection d'une séquence cible localisée dans le gène E1 du génome du virus du Chikungunya, la sonde de détection étant d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 4 5'-CTCTCAGGCACCATCTGGC-3', ou sa séquence complémentaire, ladite séquence comportant au moins un moyen de marquage.

Dans un mode de réalisation intéressant de l'invention, l'oligonucléotide utilisé comme sonde de détection permet une détection en temps réelle et est encadré de deux bras, l'un en position 5' et l'autre en position 3' dudit oligonucléotide, chaque bras ayant une longueur comprise entre 5 et 15 nucléotides, préférentiellement comprise entre 6 et 10 nucléotides et ces bras étant complémentaires l'un de l'autre afin de présenter l'oligonucléotide sous forme d'une boucle en l'absence de la séquence cible localisée dans le gène E1 du génome du virus du Chikungunya.

Dans un mode encore plus avantageux, la sonde de détection comporte un marqueur fluorescent à l'extrémité libre d'un des bras et un absorbeur de fluorescence à l'extrémité libre de l'autre bras. De préférence, la sonde de détection est constituée par un molecular beacon , appellé par la suite balise moléculaire. Les balises 5 moléculaires sont des sondes de détection sous forme d'oligonucléotides simple brin, qui ont une structure en tige et boucle (stem loop structure) bien connue de l'homme du métier. La boucle contient une séquence sonde complémentaire de la séquence cible (amplicon en général), et la tige est formée par l'hybridation de deux séquences formant des bras, qui sont localisées chacune à chaque extrémité de la sonde. Un fluorophore est lié de façon covalente à l'extrémité d'un des deux bras et un absorbeur de fluorescence (quencher) est lié de façon covalente à l'extrémité de l'autre bras. Les balises moléculaires ne fluorescent pas lorsqu'elles sont libres en solution, la structure boucle maintenant le fluorophore et l'absorbeur à proximité l'un de l'autre, ce qui entraîne le transfert de la fluorescence du fluorophore vers l'absorbeur. Ledit absorbeur de fluorescence est un chromophore non fluorescent qui dissipe l'énergie reçue du fluorophore en chaleur. Cependant, en présence d'amplicons complémentaires, quand elles s'hybrident à ces cibles, elles subissent un changement conformationnel qui leur permet de fluorescer.

Dans ce cas, il y a formation d'un hybride sonde-cible qui est plus long et plus stable que l'hybride créé par les deux bras de la tige. La rigidité et la longueur de l'hybride sonde-hybride empêchent l'existence simultanément de l'hybride tige. En conséquence, la balise moléculaire subit une réorganisation conformationnelle spontanée qui force l'hybride tige à se dissocier et le fluorophore et l'absorbeur à s'éloigner l'un de l'autre, ce qui restaure la fluorescence.

Plus précisément la sonde de détection est constituée par une balise moléculaire préférentiellement constituée 5 par . SEQ ID No. 5 : 5'-[6-FAM]-CGAGCGACTCTCAGGCACCATCTGGCTCGCTCG-[DabSyl]-3', ou sa séquence complémentaire. La séquence en italique correspond aux bras mentionnés ci-dessus, constituant la tige. 10 Selon la présente invention, les deux oligonucléotides destinés à être utilisés comme amorces d'amplification, et l'oligonucléotide destiné à être utilisé comme sonde de détection, ont chacun une longueur comprise entre 10 et 50 15 nucléotides et comprenne au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus des séquences SEQ ID No. 2 et 4 respectivement. De préférence, chaque oligonucléotide est d'une longueur comprise entre 12 et 30 nucléotides et comprend au moins un fragment de 10 ou 12 nucléotides 20 consécutifs, et encore plus préférentiellement, chaque oligonucléotide a une longueur comprise entre 15 et 26 nucléotides et comprend au moins un fragment de 10, 12 ou 15 nucléotides.

25 La présente invention propose aussi l'utilisation de la paire d'oligonucléotides ou de la sonde tels que décrits précédemment, dans une réaction d'amplification d'acides nucléiques du génome du virus du Chikungunya susceptible d'être présent dans un échantillon biologique. 30 L'invention concerne encore une méthode de détection d'acides nucléiques du virus du Chikungunya susceptible 6

d'être presents dans un échantillon, dans laquelle l'échantillon est soumis à une réaction d'amplification d'acides nucléiques utilisant une paire d'oligonucléotides, telle que décrite précédemment, en présence des réactifs d'amplification nécessaires à une telle amplification et où la présence d'amplicons d'intérêt est détectée. Cette méthode de détection peut être basée sur une réaction d'amplification RT-PCR. Alternativement, cette méthode de détection peut être basée sur une technique d'amplification transcriptionnelle. Préférentiellement cette technique est la technique NASBA. La technique NASBA est une méthode d'amplification isotherme d'acides nucléiques faisant intervenir plusieurs activités enzymatiques, qui permet une détection rapide du virus Chikungunya. L'amplification d'acides nucléiques par cette voie convient bien aux génomes à ARN, grâce à la présence d'une étape de transcription inverse directement dans la réaction d'amplification.

Ainsi, l'invention concerne aussi une méthode d'amplification du gène E1 du virus du Chikungunya susceptible d'être présent dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : incuber l'échantillon dans un tampon d'amplification en présence de deux amorces d'amplification, chacune ayant une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides, l'une comprenant additionnellement une séquence promotrice, l'autre de polarité opposée à l'amorce associée à la séquence promotrice, pour s'hybrider respectivement en amont et en aval d'une zone d'intérêt localisée dans le gène E1 du virus du Chikungunya, - ajouter les réactifs suivants dans l'échantillon: 8

• une enzyme ayant une activité RNA dépendant DNA polymérase, • une enzyme ayant une activité DNA dépendant DNA polymérase, • une enzyme ayant une activité RNase H, • une enzyme ayant une activité DNA dependant RNA polymérase, et maintenir le mélange réactionnel ainsi créé sous des conditions appropriées et pendant une durée de temps 10 suffisante pour qu'une amplification ait lieu.

Les enzymes ci-dessus énumérées sont au nombre de quatre mais il est tout à fait possible de recourir à une enzyme ayant deux voir trois des activités ci-dessus mentionnées, 15 dans ce cas l'utilisation de trois voir de deux enzymes reste possible et couverte par l'invention. De plus, d'autres éléments sont nécessaires à l'établissement d'une amplification tels que des nucléotides ou encore des solutions tampon. Ces solutions tampon peuvent être 20 optimisées en fonction de la technique d'amplification utilisée ou des oligonucléotides présents dans la réaction. Dans une réaction d'amplification transcriptionnelle, telle qu'une réaction NASBA, ces solutions tampon peuvent contenir, par exemple du DMSO qui améliore la réaction 25 d'amplification (tels que décrit dans le document PCT/US90/04733). De plus, il est également possible d'ajouter à la réaction d'amplification un contrôle interne, afin d'éviter la présence de faux négatif due à l'échec du procédé d'amplification. L'utilisation d'un contôle interne 30 dans une réaction d'amplification transcriptionnelle est décrite dans le document PCT/EP93/02248. Un tel contôle interne est sélectionné de telle manière qu'il ne rentre pas 9

en compétition avec l'acide nucléique cible dans la réaction d'amplification. Tous ces éléments sont bien connus de l'homme du métier.

Enfin l'invention propose un kit de détection du gène El du virus du Chikungunya susceptible d'être présent dans un échantillon, contenant au moins une paire d'oligonucléotides telle que décrite précédemment pour réaliser l'amplification du gène El, au moins un oligonucléotide marqué ou pouvant être marqué, tel que décrit précédemment, et ayant une séquence d'acide nucléique substantiellement complémentaire avec au moins une partie de la séquence d'acide nucléique amplifiée, - des réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification.

De préférence, les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification sont des réactifs 20 permettant une amplification NASBA.

Par substantiellement complémentaire on entend qu'une hybridation est réalisée entre un oligonucléotide marqué ou pouvant être marqué, autrement appelé amorce 25 d'amplification ou sonde de détection, et au moins une partie de la séquence d'acide nucléique cible ou amplifiée dite amplicon, cette hybridation étant spécifique et sélective pour permettre l'amplification ou la détection de l'amplicon d'intérêt. 30 Par marqueur détectable , on entend au moins un marqueur capable de générer directement un signal détectable. Par exemple la présence de biotine est considéré i0

comme un marquage direct, car elle est détectable, même s'il est possible de l'associer ultérieurement avec de la streptavidine marquée. Une liste non limitative de ces marqueurs suit . • les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la péroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la (3-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, • les chromophores comme les composés fluorescents, lo luminescents, colorants, • les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par leur propriété électrique comme la conductivité, l'ampérométrie, la voltamétrie, l'impédance, 15 • les groupements détectables, par exemple dont les molécules sont de tailles suffisantes pour induire des modifications détectables de leurs caractéristiques physiques et/ou chimiques, cette détection peut être réalisée par des méthodes optiques comme la diffraction, 20 la résonance plasmon de surface, la variation de surface, la variation d'angle de contact ou des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, • les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 1251.

25 Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention le marqueur est détectable électrochimiquement, et en particulier le marqueur est un dérivé d'un complexe de fer, comme un ferrocène.

30 Le terme acide nucléique signifie un enchaînement d'au moins deux désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié,

par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée, telle que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les H-phosphonates, les alkyl-phosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonucléotides ( FR 2 607 507) ou les PNA (M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., 114, 1895-1897, 1992 ou les 2' 0-alkyl ribose et les LNA (BW, Sun et al., Biochemistry, 4160-4169, 43, 2004). L'acide nucléique peut être naturel ou synthétique, un oligonucléotide, un polynucléotide, un fragment d'acide nucléique, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique telle que : • PCR (Polymerase Chain Reaction), décrite dans les brevets US-A-4,683,195, US-A-4,683,202 et US-A-4,800,159, et sa dérivée RT-PCR (Reverse Transcription PCR), notamment dans un format en une étape, tel que décrit dans le brevet EPB-0.569.272, • LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-0.201.184, • RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069, • 3SR (Self Sustained Sequence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995, • NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la 30 demande de brevet WO-A-91/02818, • TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491, et

• RCA (Rolling Circle Amplification (US-6,576,448). On parle alors d'amplicons pour désigner les acides nucléiques générés par une technique d'amplification enzymatique.

Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison.

Les étapes d'amplification et de détection ci-dessus exposées peuvent être précédées par une étape de purification. Par étape de purification , on entend notamment la séparation entre les acides nucléiques des micro-organismes et les constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse qui précède la purification des acides nucléiques. Ces étapes de lyse sont bien connues à titre d'exemple indicatif, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrites dans les demandes de brevet : -WO-A-00/60049 sur la lyse par sonication, - WO-A-00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, - WO-A-99/53304 sur la lyse électrique, et - WO-A-99/15621 sur la lyse mécanique.

L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les traitements par des agents chaotropiques, tels que les sels de guanidium (brevet US-A-5,234,809). Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques. A titre d'exemple, on peut utiliser des supports solides, tels que des particules magnétiques (voir à ce sujet les brevets US-A-4,672, 040 et US-A-5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques, qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de 13

réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet WO-A-97/45202 et WO-A-99/35500. Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être fixé un acide nucléique. Des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides, tels que les matériaux à base de cellulose, Io par exemple du papier, des dérivés de cellulose, tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose, ou le dextran ; des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques, telles que le nylon ; 15 des matériaux minéraux, tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels, etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane, d'une particule ou d'une 20 plaque sensiblement plane de verre ou silicium ou dérivés. On peut réaliser l'ensemble du protocole (de l'échantillon prélevé à la détection des amplicons) dans un seul et même récipient ou tube, traité manuellement ou dans un automate. 25 Les figures et l'exemple ci-joints représentent un mode particulier de réalisation et ne peuvent pas être considérés comme limitant la portée de la présente invention. Figures 1 à 8 : Détection du virus de Chikungunya à 30 différentes concentrations en unité de fluorescence relative (RFU en ordonnées) par unité de temps (T en abscisse). La courbe en pointillé correspond au signal émis par la sonde

complémentaire selon l'invention d'une séquence du virus du Chikungunya et la courbe en trait plein correspond au contrôle interne, celui-ci étant un transcript synthetique d'une taille d'environ 1000 bases qui englobe la région amplifiée par les primers NASBA ; Il sera donc co-amplifié avec la séquence sauvage présente dans l'échantillon. Cependant ce contrôle interne a été modifié de façon à remplacer la région où se fixe normalement la sonde de détection par une séquence ne correspondant pas au Chikungunya. Cette région modifiée est reconnue par la sonde de détection du contrôle interne. Figure 1 : plasma négatif. Figure 2 : plasma positif, 4.18 copies/ml Figure 3 : plasma positif, 41.8 copies/ml Figure 4 : plasma positif, 418 copies/ml Figure 5 : plasma positif, 4180 copies/ml Figure 6 : plasma positif, 41800 copies/ml Figure 7 : plasma positif, 418000 copies/ml Figure 8 : plasma positif, 4180000 copies/ml Exemple 1 : Expérience d'évaluation des amorces et de la sonde de détection du virus du chikungunya sur un ARN provenant d'échantillon clinique de la Réunion : Les séquences de la paire d'oligonucléotide (P1 et P2) et la sonde de détection (MB) présente sous forme de balise moléculaire, sont indiqués ci-dessous :

Séquences des amorces et sonde utilisées : P1, SEQ ID NO.3 : 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGCTCTTACCGGGTTTGTTGC -3' P2, SEQ ID NO.2 : 5'-GCCTGGACACCTTTCGAC -3' MB, SEQ ID NO.5 : 5'-CGAGCGACTCTCAGGCACCATCTGGCTCGCTCG-3' 15 La séquence indiquée en gras et en italique correspond à la séquence promotrice T7, reconnue par l'ARN polymérase T7 et est retrouvée dans les oligonucléotides P1 pour la mise en oeuvre de la technique NASBA. La séquence soulignée correspond à une séquence créant un espace, dite linker, entre la séquence promotrice et l'oligonucléotide de sequence SEQ ID No. 1.

Protocole opératoire : - Source du virus Chikungunya : Dilutions de plasmas de patients infectés et quantifiés, provenant du Centre Hospitalier Sud St Denis La Réunion. 15 - Extraction des acides nucléique : Les acides nucléiques ont été extraits en utilisant le Système easyMAG (bioMérieux B.V., Boxtel, Hollande) avec les réactifs NucliSENS Magnetic Extraction Reagents (bioMérieux 20 B.V., Boxtel, Hollande, NucliSENS EasyMAG extraction Tampon 1 #280130, NucliSENS EasyMAG extraction Tampon 2 #280131, NucliSENS EasyMAG extraction Tampon 3 #280132, NucliSENS EasyMAG Silice Magnétique #280133, NucliSENS EasyMAG tampon lyse #280134). Les extractions ont été faite sur 200 pal de 25 chacune des dilutions de plasma. Les dilutions correspondent à des concentrations de 41 copies/ml, 418 copies/ml, 4180 copies/ml, 41800 copies/ml, 418000 copies/ml, 4180000 copies/ml.

30 - Amplification/Détection : Selon les instructions du kit NucliSENS EasyQ Basic Kit V2 (bioMérieux B.V., Boxtel, Hollande), un mélange réactionnel 16

unique permettant la détection simultanée du gène E1 du Chikungunya et du contrôle interne est préparé. Brièvement, à 64 pal de diluant ont été ajoutés 11 pal d'eau, 13 pal de KC1 à 1,2 M, 4 pal de chacun des oligonucletides à 10 pM , et 0,8 pal de chacune des balises moléculaires à 20 pM (1 balise moléculaire spécifique de Chikungunya et une sonde spécifique du contrôle interne). Un volume de 10 pal du mélange a ensuite été ajouté à 5 pal des solutions des ARNs précédemment extraits.

Résultats : Les résultats sont visibles sur les figures 1 à 8 et montrent que le test fonctionne et détecte un plasma Chikungunya positif jusqu'à la concentration 4180 copies/ml (équivalent à environ 150 copies d'ARN de Chikugunya/réaction NASBA). On observe que plus le nombre de copies d'ARN de Chikungunya est élevé, plus l'amplitude de la courbe est grande. Les résultats montrent aussi que le contrôle interne est correctement détecté et joue bien son rôle de validation de l'essai. Le signal du contrôle interne diminue proportionnellement au nombre de copies d'ARN de Chikungunya. Le signal du contrôle interne est à son maximal dans le plasma négatif, et est minimal en présence d'un fort nombre de copies d'ARN Chikungunya. En effet, étant donné qu'il s'agit d'une co-amplification, la quantité du contrôle interne a été calculée de facon à ce que le contrôle interne ne rentre pas trop en compétition avec la séquence sauvage du virus. Ainsi, le contrôle interne est normalement amplifié quand il est seul (échantillon négatif), mais dès qu'une séquence sauvage du Chikungunya est présente, c'est l'amplification de cette séquence qui a lieu jusqu'à complète inhibition de l'amplification du contrôle interne quand la séquence sauvage est présente à forte concentration. Ainsi pour que le test soit validé, il doit toujours y avoir un signal : si l'échantillon est négatif on a le contrôle interne positif, si l'échantillon est positif on a un signal positif avec ou non un signal pour le contrôle interne (selon si l'échantillon est fortement positif ou non).

Claims

REVENDICATIONS

1. Paire d'oligonucléotides destinée à permettre l'amplification d'une séquence cible localisée dans le gène E1 du génome du virus du Chikungunya, la paire d'oligonucléotides consistant en : - un premier oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 1 5'-CTCTTACCGGGTTTGTTGC-3', ou sa séquence complémentaire et -un second oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 2 : 5'-GCCTGGACACCTTTCGAC-3', ou sa séquence complémentaire.

2. Paire d'oligonucléotides, selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le premier oligonucléotide comprend additionnellement une séquence promotrice qui peut être reconnue par une enzyme ARN polymérase ADN dépendante.

3. Paire d'oligonucléotides, selon la revendication 2, caractérisée par le fait que la séquence promotrice qui peut être reconnue par une enzyme ARN polymérase ADN dépendante est une polymérase T7.

4. Premier oligonucléotide, selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé par le fait qu'il consiste essentiellement en la séquence suivante : SEQ ID No. 3 : 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGCTCTTACCGGGTTTGTTGC-3'. 19

5. Oligonucléotide destiné à être utilisé comme sonde de détection d'une séquence cible localisée dans le gène E1 du génome du virus du Chikungunya, la sonde de détection étant d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 4 5'-CTCTCAGGCACCATCTGGC-3', ou sa séquence complémentaire, ladite séquence comportant au moins un moyen 10 de marquage.

6. Oligonucléotide, selon la revendication 5, destiné à permettre une détection en temps réelle, caractérisé par le fait que l'oligonucléotide est encadré de deux bras, l'un 15 en position 5' et l'autre en position 3' dudit oligonucléotide, chaque bras ayant une longueur comprise entre 5 et 15 nucléotides, préférentiellement comprise entre 6 et 10 nucléotides et ces bras étant complémentaires l'un de l'autre afin de présenter l'oligonucléotide sous forme 20 d'une boucle en l'absence de la séquence cible localisée dans le gène E1 du génome du virus du Chikungunya.

7. Oligonucléotide, selon la revendication 6, dont l'extrémité libre d'un des bras comporte un marqueur 25 fluorescent et l'extrémité libre de l'autre bras comporte un absorbeur de fluorescence.

8. Oligonucléotide, selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisée par le fait qu'il 30 consiste essentiellement en la séquence suivante : SEQ ID No. 5 : 5'-[6-FAM]-CGAGCGACTCTCAGGCACCATCTGGCTCGCTCG-[DabSyl]-3', ou sa séquence complémentaire. 20

9. Oligonucléotide, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 5, caractérisé par le fait que chaque oligonucléotide est d'une longueur comprise entre 12 et 30 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 ou 12 nucléotides consécutifs, et préférentiellement d'une longueur comprise entre 15 et 26 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10, 12 ou 15 nucléotides.

10. Utilisation d'une paire d'oligonucléotides, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou 9, dans une réaction d'amplification d'acides nucléiques ou comme sonde de détection, selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, du génome du virus du Chikungunya susceptible d'être présent dans un échantillon biologique.

11. Méthode de détection d'acides nucléiques du virus du Chikungunya susceptible d'être présent dans un échantillon, dans laquelle l'échantillon est soumis à une réaction d'amplification d'acides nucléiques utilisant une paire d'oligonucléotides, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou 9, en présence des réactifs d'amplification nécessaires à une telle amplification et la présence d'amplicons d'intérêt est détectée.

12. Méthode, selon la revendication 11, caractérisée en ce que la réaction d'amplification utilisée est une RTPCR.

13. Méthode, selon la revendication 11, caractérisée en ce que la réaction d'amplification utilisée est une technique d'amplification transcriptionnelle.

14. Méthode, selon la revendication 13, caractérisée en ce que la réaction d'amplification utilisée est la technique NASBA.

15. Méthode d'amplification du gène E1 du virus du Chikungunya susceptible d'être présent dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : -incuber l'échantillon dans un tampon d'amplification en 10 présence de deux amorces d'amplification, chacune ayant une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides, l'une comprenant additionnellement une séquence promotrice, l'autre de polarité opposée à l'amorce associée à la séquence promotrice, pour s'hybrider respectivement en 15 amont et en aval d'une zone d'intérêt localisée dans le gène E1 du virus du Chikungunya, -ajouter les réactifs suivants dans l'échantillon: • une enzyme ayant une activité RNA dépendant DNA polymérase, 20 • une enzyme ayant une activité DNA dépendant DNA polymérase, • une enzyme ayant une activité RNase H, • une enzyme ayant une activité DNA dependant RNA polymérase, et 25 - maintenir le mélange réactionnel ainsi créé sous des conditions appropriées et pendant une durée de temps suffisante pour qu'une amplification ait lieu.

16. Kit de détection du gène E1 du virus du 30 Chikungunya susceptible d'être présent dans un échantillon, contenant . - au moins une paire d'oligonucléotides selon les revendications 1 à 4 ou 9, - au moins un oligonucléotide marqué ou pouvant être marqué, selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, et ayant une séquence d'acide nucléique substantiellement complémentaire avec au moins une partie de la séquence d'acide nucléique amplifiée, - des réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification.

17. Kit selon la revendication 16, dans lequel les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification sont des réactifs permettant une amplification NASBA.15