WO2009044085A2 - Oligonucleotides, utilisation, methode de detection et kit permettant de diganostiquer la presence du gene e1 du virus de chikungunya - Google Patents

Oligonucleotides, utilisation, methode de detection et kit permettant de diganostiquer la presence du gene e1 du virus de chikungunya Download PDF

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WO2009044085A2
WO2009044085A2 PCT/FR2008/051625 FR2008051625W WO2009044085A2 WO 2009044085 A2 WO2009044085 A2 WO 2009044085A2 FR 2008051625 W FR2008051625 W FR 2008051625W WO 2009044085 A2 WO2009044085 A2 WO 2009044085A2
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Oligonucleotides use, detection method and kit for diagnosing the presence of the E1 gene of the human immunodeficiency virus
  • the present invention provides oligonucleotides for amplification and detection of a target sequence localized in the Chikungunya virus E1 gene.
  • the invention also relates to the use of these oligonucleotides, a detection method and a kit for diagnosing the presence of the El gene of Chikungunya virus.
  • the Chikungunya virus is an alphavirus arbovirus that is transmitted by Aedes mosquitoes. It was isolated for the first time in 1953. Since then, Chikungunya epidemics have occurred in tropical Africa and Asia. An unprecedented epidemic has occurred in Reunion Island, which has 775,000 inhabitants and for which more than 244,000 cases were reported as of April 20, 2006.
  • Serology is based on the detection of IgM and IgG antibodies that appear at different times during infection.
  • the IgM are detected in the serum on average 5 days after the onset of clinical signs and persist for several weeks at three month.
  • IgG are identified by two samples (acute phase and convalescence), and persist for years. The sensitivity and specificity of these tests are not well established, including the possibility of false positives by cross-reactions with IgM dengue or other arboviruses.
  • Parida et al describe the detection of Chikungunya virus by an alternative method to PCR called RT-LAMP for "reverse transcription loop-mediated isothermal amplification" (J. Clin Microbiol 2007 Feb; 45 (2): 351-7).
  • the primers were selected from the El protein gene. A sensitivity of 20 transcript copies per reaction was determined.
  • the disadvantage of this technique is that it requires 6 different primers to perform the amplification reaction.
  • the detection is not carried out with a specific probe but by turbimetry. Thus, in the case where the reaction is not specific and another virus is amplified, a false positive will be detected.
  • the present invention therefore relates to a pair of oligonucleotides for amplifying a target sequence located in the El gene of the Chikungunya virus genome, the oligonucleotide pair consisting of: a first oligonucleotide of a length between 10 and 50 nucleotides and comprising at least one fragment of 10 consecutive nucleotides derived from:
  • SEQ ID No. 1 5 '-CTCTTACCGGGTTTGTTGC-3', or its complementary sequence, and a second oligonucleotide of a length of between 10 and 50 nucleotides and comprising at least one fragment of 10 consecutive nucleotides derived from:
  • SEQ ID No. 2 5'-GCCTGGACACCTTTCGAC-3 ', or its complementary sequence.
  • the first oligonucleotide additionally comprises a promoter sequence that can be recognized by a DNA-dependent RNA polymerase enzyme.
  • the promoter sequence which can be recognized by a DNA dependent RNA polymerase enzyme is a T7 polymerase.
  • this oligonucleotide to which the promoter sequence is added, allows the amplification of the target sequence located in the E1 gene, it essentially consists of the following sequence: SEQ ID No. 3: 5'-
  • the part of the sequence in italic corresponds to the T7 promoter sequence.
  • the underlined sequence corresponds to a sequence creating a so-called linker between the promoter sequence and the oligonucleotide of sequence SEQ ID No. 1.
  • the invention also relates to an oligonucleotide to be used as a detection probe for a target sequence located in the E1 gene of the Chikungunya virus genome, the detection probe being between 10 and 50 nucleotides in length and comprising at least one fragment of 10 consecutive nucleotides derived from from:
  • SEQ ID No. 4 5'-CTCTCAGGCACCATCTGGC-S ', or its complementary sequence, said sequence comprising at least one labeling means.
  • the oligonucleotide used as a detection probe enables real-time detection and is flanked by two arms, one at the 5 'position and the other at the 3' position of said oligonucleotide, each arm having a length of between 5 and 15 nucleotides, preferably between 6 and 10 nucleotides and these arms being complementary to one another in order to present the oligonucleotide in the form of a loop in the absence of the sequence localized target in the El gene of the Chikungunya virus genome.
  • the detection probe has a fluorescent marker at the free end of one of the arms and a fluorescence absorber at the free end of the other arm.
  • the detection probe is constituted by a "molecular beacon", subsequently called molecular beacon.
  • Molecular beacons are detection probes in the form of single-stranded oligonucleotides, which have a rod-and-loop structure well known to those skilled in the art.
  • the loop contains a probe sequence complementary to the target sequence (amplicon in general), and the stem is formed by the hybridization of two sequences forming arms, which are each located at each end of the probe.
  • a fluorophore is covalently bound to the end of one of the two arms and an absorber of fluorescence (quencher) is covalently bound to the end of the other arm.
  • Molecular beacons do not fluoresce when free in solution, the structure now closes the fluorophore and absorber in close proximity to one another, resulting in the transfer of fluorescence from the fluorophore to the absorber.
  • the fluorescence absorber is a non-fluorescent chromophore that dissipates the energy received from the fluorophore in heat. However, in the presence of complementary amplicons, when they hybridize to these targets, they undergo a conformational change that allows them to fluoresce.
  • a probe-target hybrid is formed which is longer and more stable than the hybrid created by the two arms of the stem.
  • the rigidity and length of the hybrid-probe hybrid prevent the simultaneous existence of the stem hybrid.
  • the molecular beacon undergoes a spontaneous conformational reorganization that forces the stem hybrid to dissociate and the fluorophore and absorber to move away from each other, thereby restoring fluorescence.
  • the detection probe consists of a molecular beacon preferably consisting of: SEQ ID No. 5: 5 '- [6-FAM] -CGAGCGACTCTCAGGCACCATCTGGCrCGCrCG- [DabSyl] -3', or its complementary sequence.
  • the sequence in italic corresponds to the arms mentioned above, constituting the stem.
  • the two oligonucleotides for use as amplification primers, and the oligonucleotide for use as a detection probe each have a length of between 10 and 50 nucleotides and comprise at least one fragment of 10 nucleotides consecutive sequences SEQ ID No. 2 and 4 respectively.
  • each oligonucleotide is of a length of between 12 and 30 nucleotides and comprises at least one fragment of 10 or 12 consecutive nucleotides, and even more preferably, each oligonucleotide has a length of between 15 and 26 nucleotides and comprises at least one fragment of 10, 12 or 15 nucleotides.
  • the present invention also provides the use of the pair of oligonucleotides or probe as described above, in a nucleic acid amplification reaction of the Chikungunya virus genome that may be present in a biological sample.
  • the invention further relates to a method for detecting nucleic acids of Chikungunya virus that may be present in a sample, wherein the sample is subjected to a nucleic acid amplification reaction using an oligonucleotide pair, as described above, in the presence of the amplification reagents necessary for such amplification and where the presence of amplicons of interest is detected.
  • This detection method can be based on an RT-PCR amplification reaction.
  • this detection method may be based on a transcriptional amplification technique.
  • this technique is the NASBA technique.
  • the NASBA technique is a method of isothermal amplification of nucleic acids involving several enzymatic activities, which allows rapid detection of the Chikungunya virus.
  • the amplification of nucleic acids by this route is well suited to RNA genomes, thanks to the presence of a reverse transcription step directly in the amplification reaction.
  • the invention also relates to a method method of amplifying the Chikungunya virus El gene that may be present in a sample, comprising the steps of: incubating the sample in amplification buffer in the presence of two amplification primers, each having a length of between 10 and 50 nucleotides, one additionally comprising a promoter sequence, the other of opposite polarity to the primer associated with the promoter sequence, for hybridizing respectively upstream and downstream of an area of interest located in the gene El Chikungunya virus, add the following reagents in the sample:
  • An enzyme having an RNA activity dependent DNA polymerase an enzyme having a DNA-dependent DNA polymerase activity
  • An enzyme having an RNA polymerase-dependent DNA activity and maintaining the reaction mixture thus created under appropriate conditions and for a period of time sufficient for amplification to take place.
  • the enzymes listed above are four in number but it is quite possible to use an enzyme having two or three of the above mentioned activities, in this case the use of three or two enzymes remains possible and covered. by the invention.
  • other elements are necessary to establish an amplification such as nucleotides or buffer solutions. These buffer solutions can be optimized depending on the amplification technique used or the oligonucleotides present in the reaction. In a reaction transcriptional amplification, such as a NASBA reaction, these buffer solutions may contain, for example, DMSO which enhances the amplification reaction (as described in PCT / US90 / 04733).
  • an internal control in addition, it is also possible to add to the amplification reaction an internal control, to avoid the presence of false negative due to the failure of the amplification process.
  • an internal control in a transcriptional amplification reaction is described in PCT / EP93 / 02248. Such internal control is selected such that it does not compete with the target nucleic acid in the amplification reaction. All these elements are well known to those skilled in the art.
  • the invention provides a kit for detecting the El gene of the Chikungunya virus that may be present in a sample, containing at least one pair of oligonucleotides as described above to carry out the amplification of the El gene, - at least one labeled or labeled oligonucleotide, as described above, and having a nucleic acid sequence substantially complementary to at least a portion of the amplified nucleic acid sequence, - reagents necessary for carrying out an amplification reaction .
  • the reagents necessary for carrying out an amplification reaction are reagents allowing NASBA amplification.
  • substantially complementary it is meant that hybridization is performed between a labeled or labeled oligonucleotide, otherwise known as an amplification primer. or detection probe, and at least a portion of the amplicon target or amplified nucleic acid sequence, this hybridization being specific and selective to allow amplification or detection of the amplicon of interest.
  • detecttable marker is meant at least one marker capable of directly generating a detectable signal. For example, the presence of biotin is considered direct labeling because it is detectable, although it can be subsequently associated with labeled streptavidin. A nonlimiting list of these markers follows:
  • Enzymes that produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, chromophores such as fluorescent, luminescent compounds, colorants,
  • Electron density groups detectable by electron microscopy or by their electrical property such as conductivity, amperometry, voltammetry, impedance,
  • Detectable groups for example whose molecules are of sufficient size to induce detectable changes in their physical and / or chemical characteristics, this detection can be carried out by optical methods such as diffraction, surface plasmon resonance, surface, the variation of contact angle or physical methods such as atomic force spectroscopy, the tunnel effect,
  • radioactive molecules such as 32 P, 35 S or 125 I.
  • the marker is electrochemically detectable, and in particular the marker is a derivative of an iron complex, such as a ferrocene.
  • nucleic acid means a sequence of at least two deoxyribonucleotides or ribonucleotides optionally comprising at least one modified nucleotide, for example at least one nucleotide comprising a modified base, such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base for hybridization.
  • a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base for hybridization.
  • This polynucleotide can also be modified at the level of the internucleotide linkage, for example phosphorothioates, H-phosphonates or alkylphosphonates, at the level of the backbone such as, for example, alpha-oligonucleotides (FR 2 607 507) or PNAs (M Egholm et al., J. Am Chem Soc, 114, 1895-1897, 1992 or the 2 'O-alkyl ribose and LNA (BW, Sun et al., Biochemistry, 4160-4169, 43, 2004).
  • the nucleic acid may be natural or synthetic, an oligonucleotide, a polynucleotide, a nucleic acid fragment, a ribosomal RNA, a messenger RNA, a transfer RNA, a nucleic acid obtained by an enzymatic amplification technique such as :
  • purification step is meant in particular the separation between the nucleic acids of the microorganisms and the cellular constituents released in the lysis step which precedes the purification of the nucleic acids.
  • lysis methods such as thermal or osmotic shocks or treatments with chaotropic agents, such as guanidium salts (US-A-5, 234, 809).
  • This step generally makes it possible to concentrate the nucleic acids.
  • solid supports such as magnetic particles (see US-A-4, 672, 040 and US-A-5, 750, 338), can be used to purify nucleic acids, which are attached to these magnetic particles, by a washing step.
  • This nucleic acid purification step is particularly interesting if one wishes to subsequently amplify said nucleic acids.
  • a particularly interesting embodiment of these magnetic particles is described in patent applications WO-A-97/45202 and WO-A-99/35500.
  • the term "solid support” as used herein includes all materials to which a nucleic acid may be attached.
  • Synthetic materials or natural materials, possibly chemically modified, can be used as solid support, in particular polysaccharides, such as cellulose-based materials, for example paper, cellulose derivatives, such as cellulose acetate and nitrocellulose, or dextran; polymers, copolymers, especially based on styrene-type monomers, natural fibers such as cotton, and synthetic fibers, such as nylon; inorganic materials, such as silica, quartz, glasses, ceramics; latexes; magnetic particles; metal derivatives, gels, etc.
  • the solid support may be in the form of a microtiter plate, a membrane, a particle or a substantially planar plate of glass or silicon or derivatives.
  • the entire protocol (from the sample taken at the detection of amplicons) can be carried out in a single container or tube, processed manually or in a PLC.
  • Figures 1 to 8 Detection of Chikungunya virus at different concentrations in relative fluorescence unit (RFU ordinate) per unit of time (T on the abscissa).
  • the dotted curve corresponds to the signal emitted by the complementary probe according to the invention of a sequence of the Chikungunya and the solid line corresponds to the internal control, which is a synthetic transcript of about 1000 bases encompassing the amplified region of the NASBA primers; It will therefore be co-amplified with the wild-type sequence present in the sample.
  • the sequence indicated in bold and in italics corresponds to the T7 promoter sequence, recognized by the T7 RNA polymerase and is found in the oligonucleotides Pl for the implementation of the NASBA technique.
  • the underlined sequence corresponds to a sequence creating a gap, called a linker, between the promoter sequence and the oligonucleotide of sequence SEQ ID No. 1.
  • the doubly underlined sequences correspond to the sequences forming the rod of the molecular beacon.
  • Nucleic acids were extracted using the easyMAG System (bioMérieux BV, Boxtel, Holland) with NucliSENS Magnetic Extraction Reagents reagents (bioMérieux BV, Boxtel, Holland, NucliSENS EasyMAG Extraction Buffer 1 # 280130, NucliSENS EasyMAG Extraction Buffer 2 # 280131, NucliSENS EasyMAG Extraction Buffer 3 # 280132, NucliSENS EasyMAG Magnetic Silica # 280133, NucliSENS EasyMAG Buffer Lysis # 280134). The extractions were carried out on 200 ⁇ l of each of the plasma dilutions.
  • the dilutions correspond to concentrations of 41 copies / ml, 418 copies / ml, 4180 copies / ml, 41800 copies / ml, 418000 copies / ml, 4180000 copies / ml.
  • Results The results are visible in Figures 1 to 8 and show that the test works and detects a positive Chikungunya plasma up to the 4180 copies / ml concentration (equivalent to about 150 copies of Chikugunya RNA / NASBA reaction). It is observed that the higher the number of Chikungunya RNA copies, the greater the amplitude of the curve.
  • the results show that the internal control is correctly detected and plays its role of validating the test.
  • the internal control signal decreases in proportion to the number of Chikungunya RNA copies.
  • the signal from the internal control is at its peak in the negative plasma, and is minimal in the presence of a large number of Chikungunya RNA copies. Indeed, since it is a co-amplification, the amount of internal control has been calculated so that the internal control does not compete too much with the wild-type virus sequence.
  • the internal control is normally amplified when it is alone (negative sample), but as soon as a wild Chikungunya sequence is present, it is the amplification of this sequence which takes place until complete amplification inhibition.
  • internal control when the wild-type sequence is present in high concentration. So for the test to be validated, there must always be a signal: if the sample is negative we have positive internal control, if the sample is positive we have a positive signal with or without a signal for internal control (depending on whether the sample is strongly positive or not).
  • the primers and probe of the present invention and the reference technique were compared in NASBA and PCR, on a quantized qig of quantified chikunqunya RNA.
  • the primers / probes of the reference technique have been adapted in NASBA and those of the present invention to the reference technique.
  • a unique reaction mixture allowing the amplification and detection of Chikunqunya virus E1 E1 is prepared. Briefly, to 64 ⁇ l of diluent were added 11 ⁇ l of water, 13 ⁇ l of 1.2 M KCl, 4 ⁇ l of each of the 10 ⁇ M oliqonucletides, and 0.8 ⁇ l of the 20 ⁇ M molecular probe. A volume of 10 ⁇ l of the melanqe was then added to 5 ⁇ l of the solutions of the RNAs previously extracted. After incubation for 2 min at 65 ° C.
  • RT-PCR The one-step RT-PCR was carried out in a final volume of 20 ⁇ l containing 2.5 ⁇ l of extracted Ckikungunya RNA, and 10 ⁇ l of 2 ⁇ Thermoscript Reaction Mix Buffer (Invitrogen, Lot 1207045, Germany). , 2 pmol of Taqman probe, 9 pmol of each of the amplification primers, 25 mM MgSO4, 0.4 ⁇ l of the One Step RT-PCR enzyme mixture (Invitrogen, Lot 271375, Germany).
  • the amplifications were carried out in a LightCycler instrument (Roche, Molecular Biochemicals, Germany) using the following parameters: 50 ° C. for 20 min, 95 ° C. at 2 min and 45 cycles at 95 ° C. for 5 sec, and 60 ° C. C for 1 min.
  • R-CHIK SEQ ID NO.9: 5 '-CCAAATTGTCCYGGTCTTCCT-3'
  • F-CHIK SEQ ID NO.10: 5 '-AAGCTYCGCGTCCTTTACCAAG-3'
  • P-CHIK SEQ ID NO.11: 5 'Fam-CCAATGTCYTCMGCCTGGACACCT-Tamra
  • T and the letter M corresponds either to the base C or to the base
  • NASP1-PASTO-NAS SEQ ID NO.12:
  • F-CHIK SEQ ID NO.13: 5'-AAGCTYCGCGTCCTTTACCAAG-3 'BEAK-PASTO-NAS: SEQ ID NO.14: 5' Fam-CGAGCGACCCAATGTCYTCMGCCTGGACACCTCGCTCG-Dabsyl 3 '
  • the NASBA test is positive when the fluorescence signal obtained exceeds the negative control signal by 20%. ** The RT-PCR test is positive when a measurable Ct is obtained (the Ct is the number of cycles for which the signal becomes positive).
  • the primers and probe of the present invention can be used in RT-PCR and increase by two logarithm the sensitivity compared to the sequences of Pastorino and al. in the reference method.

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Abstract

La présente invention concerne des oligonucléotides destinés à permettre l'amplification et la détection d'une séquence cible localisée dans le gène El du virus du Chikungunya. Ces oligonucléotides ont une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprennent au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus des séquences suivantes : SEQ ID No. 1 : 5 ' -CTCTTACCGGGTTTGTTGC-3 '; SEQ ID No. 2 : 5 ' -GCCTGGACACCTTTCGAC-3 ' ou leur séquence complémentaire. L'invention concerne également l'oligonucléotide permettant la détection des amplicons, l'utilisation de ces oligonucléotides, une méthode de détection et un kit permettant de diagnostiquer la présence du gène El du virus du Chikungunya. L'invention trouve une application préférentielle dans le domaine du diagnostic.

Description

Oligonucléotides, utilisation, méthode de détection et kit permettant de diagnostiquer la présence du gène El du virus du
Chikungunya .
La présente invention concerne des oligonucléotides destinés à permettre l'amplification et la détection d'une séquence cible localisée dans le gène El du virus du Chikungunya. L'invention concerne également l'utilisation de ces oligonucléotides, une méthode de détection et un kit permettant de diagnostiquer la présence du gène El du virus du Chikungunya .
Le virus Chikungunya est un arbovirus du genre alphavirus qui se transmet par des moustiques Aedes. Il a été isolé pour la première fois en 1953. Depuis, des épidémies de Chikungunya ont eu lieu en Afrique tropicale et en Asie. Une épidémie sans précédent a eu cours sur l'Ile de La Réunion, qui compte 775 000 habitants et pour laquelle plus de 244 000 cas ont été rapportés au 20 avril 2006.
A l'heure actuelle, il n'existe pas de diagnostic de routine de l'infection par Chikungunya et très peu de laboratoires ont la capacité de diagnoster ce virus. Les techniques employées dans ces laboratoires de référence sont les suivantes : sérologie par des techniques courantes (inhibition de 1 ' hémagglutination, fixation du complément, immunofluorescence, Elisa) , - amplification et détection par RT-PCR en temps réel.
La sérologie repose sur la détection d'anticorps IgM et IgG qui apparaissent à différents moments de l'infection. Les IgM sont détectées dans le sérum en moyenne 5 jours après le début des signes cliniques et persistent plusieurs semaines à trois mois. Les IgG sont identifiés par deux prélèvements (phase aiguë et convalescence), et persistent pendant des années. La sensibilité et la spécificité, de ces tests ne sont pas bien établies, notamment la possibilité de faux positifs par réactions croisées avec les IgM de la dengue ou d'autres arbovirus .
En parallèle des tests d'amplification par RT-PCR en temps réel ont été mis au point. L'intérêt de la biologie moléculaire dans le diagnostic des maladies infectieuses est bien connues. Elle permet en effet une détection rapide du génome du virus et ceci dès la phase initiale virémique qui correspond au sept premier jours dans le cas d'une infection par le virus du Chikungunya. Ainsi, Pastorino et al décrivent un test RT-PCR pour la détection en temps réel du virus Chikungunya en utilisant la méthode TaqMan® (Journal of Virological Methods, 124 (2005) 65-71) . Les amorces d'amplification et la sonde de détection ont été sélectionnées dans la région du gène de la protéine structurale El. La sensibilité obtenue est de l,2.10~2 Dose Infectieuse par reaction. Dans une autre publication, Parida et al décrivent la détection du virus Chikungunya par une méthode alternative à la PCR nommée RT-LAMP pour «reverse transcription loop-mediated isothermal amplification » (J. Clin. Microbiol. 2007 Feb; 45 (2 ) : 351-7) . Les amorces ont été sélectionnées dans le gène de la protéine El. Une sensibilité de 20 copies de transcrits par réaction a été déterminée. L'inconvénient de cette technique est qu'elle nécessite 6 amorces différentes pour effectuer la réaction d'amplification. De plus, la détection n'est pas effectuée avec une sonde spécifique mais par turbimétrie. Ainsi, dans le cas où la réaction n'est pas spécifique et un autre virus est amplifié, un faux positif sera détecté.
Ainsi, un test d'identification du virus du Chikungunya, rapide, spécifique et très sensible est toujours attendu. La présente invention concerne donc une paire d 'oligonucléotides destinée à permettre l'amplification d'une séquence cible localisée dans le gène El du génome du virus du Chikungunya, la paire d'oligonucléotides consistant en : un premier oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de :
SEQ ID No. 1 : 5 ' -CTCTTACCGGGTTTGTTGC-3 ' , ou sa séquence complémentaire, et un second oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de :
SEQ ID No. 2 : 5 ' -GCCTGGACACCTTTCGAC-3 ' , ou sa séquence complémentaire.
Dans un mode particulier de l'invention, le premier oligonucléotide comprend additionnellement une séquence promotrice qui peut être reconnue par une enzyme ARN polymérase ADN dépendante. De préférence, la séquence promotrice qui peut être reconnue par une enzyme ARN polymérase ADN dépendante est une polymérase T7.
Ainsi, lorsque cet oligonucléotide, auquel est additionnée la séquence promotrice, permet l'amplification de la séquence cible localisée dans le gène El, il consiste essentiellement en la séquence suivante : SEQ ID No. 3 : 5'-
ΛΓΓCΓΛΛΓΛCGΛCΓCΛCΓΛΓΛGGGGCTCTTACCGGGTTTGTTGC-3 ' . La partie de la séquence en italique correspond à la séquence promotrice T7. La séquence soulignée correspond à une séquence créant un espace, dite linker, entre la séquence promotrice et 1 ' oligonucléotide de séquence SEQ ID No. 1.
L'invention concerne également un oligonucléotide destiné à être utilisé comme sonde de détection d'une séquence cible localisée dans le gène El du génome du virus du Chikungunya, la sonde de détection étant d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de :
SEQ ID No. 4 : 5'-CTCTCAGGCACCATCTGGC-S', OU sa séquence complémentaire, ladite séquence comportant au moins un moyen de marquage .
Dans un mode de réalisation intéressant de l'invention, 1 ' oligonucléotide utilisé comme sonde de détection permet une détection en temps réelle et est encadré de deux bras, l'un en position 5' et l'autre en position 3' dudit oligonucléotide, chaque bras ayant une longueur comprise entre 5 et 15 nucléotides, préférentiellement comprise entre 6 et 10 nucléotides et ces bras étant complémentaires l'un de l'autre afin de présenter l 'oligonucléotide sous forme d'une boucle en l'absence de la séquence cible localisée dans le gène El du génome du virus du Chikungunya.
Dans un mode encore plus avantageux, la sonde de détection comporte un marqueur fluorescent à l'extrémité libre d'un des bras et un absorbeur de fluorescence à l'extrémité libre de l'autre bras. De préférence, la sonde de détection est constituée par un « molecular beacon », appelle par la suite balise moléculaire. Les balises moléculaires sont des sondes de détection sous forme d'oligonucléotides simple brin, qui ont une structure en tige et boucle (stem loop structure) bien connue de l'homme du métier. La boucle contient une séquence sonde complémentaire de la séquence cible (amplicon en général), et la tige est formée par l'hybridation de deux séquences formant des bras, qui sont localisées chacune à chaque extrémité de la sonde. Un fluorophore est lié de façon covalente à l'extrémité d'un des deux bras et un absorbeur de fluorescence (quencher) est lié de façon covalente à l'extrémité de l'autre bras. Les balises moléculaires ne fluorescent pas lorsqu'elles sont libres en solution, la structure boucle maintenant le fluorophore et l'absorbeur à proximité l'un de l'autre, ce qui entraîne le transfert de la fluorescence du fluorophore vers l'absorbeur. Ledit absorbeur de fluorescence est un chromophore non fluorescent qui dissipe l'énergie reçue du fluorophore en chaleur. Cependant, en présence d'amplicons complémentaires, quand elles s'hybrident à ces cibles, elles subissent un changement conformationnel qui leur permet de fluorescer. Dans ce cas, il y a formation d'un hybride sonde-cible qui est plus long et plus stable que l'hybride créé par les deux bras de la tige. La rigidité et la longueur de l'hybride sonde-hybride empêchent l'existence simultanément de l'hybride tige. En conséquence, la balise moléculaire subit une réorganisation conformationnelle spontanée qui force l'hybride tige à se dissocier et le fluorophore et l'absorbeur à s'éloigner l'un de l'autre, ce qui restaure la fluorescence.
Plus précisément la sonde de détection est constituée par une balise moléculaire préférentiellement constituée par : SEQ ID No. 5 : 5'-[6-FAM]-CGAGCGACTCTCAGGCACCATCTGGCrCGCrCG- [DabSyl]-3', ou sa séquence complémentaire. La séquence en italique correspond aux bras mentionnés ci-dessus, constituant la tige.
Selon la présente invention, les deux oligonucléotides destinés à être utilisés comme amorces d'amplification, et 1 'oligonucléotide destiné à être utilisé comme sonde de détection, ont chacun une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenne au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus des séquences SEQ ID No. 2 et 4 respectivement. De préférence, chaque oligonucléotide est d'une longueur comprise entre 12 et 30 nucléotides et comprend au moins un fragment de 10 ou 12 nucléotides consécutifs, et encore plus préférentiellement , chaque oligonucléotide a une longueur comprise entre 15 et 26 nucléotides et comprend au moins un fragment de 10, 12 ou 15 nucléotides.
La présente invention propose aussi l'utilisation de la paire d'oligonucléotides ou de la sonde tels que décrits précédemment, dans une réaction d'amplification d'acides nucléiques du génome du virus du Chikungunya susceptible d'être présent dans un échantillon biologique.
L'invention concerne encore une méthode de détection d'acides nucléiques du virus du Chikungunya susceptible d'être présents dans un échantillon, dans laquelle l'échantillon est soumis à une réaction d'amplification d'acides nucléiques utilisant une paire d'oligonucléotides, telle que décrite précédemment, en présence des réactifs d'amplification nécessaires à une telle amplification et où la présence d'amplicons d'intérêt est détectée.
Cette méthode de détection peut être basée sur une réaction d'amplification RT-PCR.
Alternativement, cette méthode de détection peut être basée sur une technique d'amplification transcriptionnelle . Préférentiellement cette technique est la technique NASBA. La technique NASBA est une méthode d'amplification isotherme d'acides nucléiques faisant intervenir plusieurs activités enzymatiques, qui permet une détection rapide du virus Chikungunya. L'amplification d'acides nucléiques par cette voie convient bien aux génomes à ARN, grâce à la présence d'une étape de transcription inverse directement dans la réaction d'amplification.
Ainsi, l'invention concerne aussi une méthode d'amplification du gène El du virus du Chikungunya susceptible d'être présent dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : incuber l'échantillon dans un tampon d'amplification en présence de deux amorces d'amplification, chacune ayant une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides, l'une comprenant additionnellement une séquence promotrice, l'autre de polarité opposée à l'amorce associée à la séquence promotrice, pour s'hybrider respectivement en amont et en aval d'une zone d'intérêt localisée dans le gène El du virus du Chikungunya, ajouter les réactifs suivants dans l'échantillon:
• une enzyme ayant une activité RNA dépendant DNA polymérase, • une enzyme ayant une activité DNA dépendant DNA polymérase,
• une enzyme ayant une activité RNase H,
• une enzyme ayant une activité DNA dépendant RNA polymérase, et - maintenir le mélange réactionnel ainsi créé sous des conditions appropriées et pendant une durée de temps suffisante pour qu'une amplification ait lieu.
Les enzymes ci-dessus énumérées sont au nombre de quatre mais il est tout à fait possible de recourir à une enzyme ayant deux voir trois des activités ci-dessus mentionnées, dans ce cas l'utilisation de trois voir de deux enzymes reste possible et couverte par l'invention. De plus, d'autres éléments sont nécessaires à l'établissement d'une amplification tels que des nucléotides ou encore des solutions tampon. Ces solutions tampon peuvent être optimisées en fonction de la technique d'amplification utilisée ou des oligonucléotides présents dans la réaction. Dans une réaction d'amplification transcriptionnelle, telle qu'une réaction NASBA, ces solutions tampon peuvent contenir, par exemple du DMSO qui améliore la réaction d'amplification (tels que décrit dans le document PCT/US90/04733 ) . De plus, il est également possible d'ajouter à la réaction d'amplification un contrôle interne, afin d'éviter la présence de faux négatif due à l'échec du procédé d'amplification. L'utilisation d'un contôle interne dans une réaction d'amplification transcriptionnelle est décrite dans le document PCT/EP93/02248. Un tel contôle interne est sélectionné de telle manière qu'il ne rentre pas en compétition avec l'acide nucléique cible dans la réaction d'amplification. Tous ces éléments sont bien connus de l'homme du métier.
Enfin l'invention propose un kit de détection du gène El du virus du Chikungunya susceptible d'être présent dans un échantillon, contenant au moins une paire d'oligonucléotides telle que décrite précédemment pour réaliser l'amplification du gène El, - au moins un oligonucléotide marqué ou pouvant être marqué, tel que décrit précédemment, et ayant une séquence d'acide nucléique substantiellement complémentaire avec au moins une partie de la séquence d'acide nucléique amplifiée, - des réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d ' amplification .
De préférence, les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification sont des réactifs permettant une amplification NASBA.
Par « substantiellement complémentaire » on entend qu'une hybridation est réalisée entre un oligonucléotide marqué ou pouvant être marqué, autrement appelé amorce d'amplification ou sonde de détection, et au moins une partie de la séquence d'acide nucléique cible ou amplifiée dite amplicon, cette hybridation étant spécifique et sélective pour permettre l'amplification ou la détection de 1 'amplicon d'intérêt. Par « marqueur détectable », on entend au moins un marqueur capable de générer directement un signal détectable. Par exemple la présence de biotine est considéré comme un marquage direct, car elle est détectable, même s'il est possible de l'associer ultérieurement avec de la streptavidine marquée. Une liste non limitative de ces marqueurs suit :
• les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la péroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la β- galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, • les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants,
• les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par leur propriété électrique comme la conductivité, 1 'ampérométrie, la voltamétrie, l'impédance,
• les groupements détectables, par exemple dont les molécules sont de tailles suffisantes pour induire des modifications détectables de leurs caractéristiques physiques et/ou chimiques, cette détection peut être réalisée par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation de surface, la variation d'angle de contact ou des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel,
• les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 125I.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention le marqueur est détectable électrochimiquement , et en particulier le marqueur est un dérivé d'un complexe de fer, comme un ferrocène.
Le terme « acide nucléique » signifie un enchaînement d'au moins deux désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée, telle que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2, 6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les H-phosphonates, les alkyl-phosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha- oligonucléotides ( FR 2 607 507) ou les PNA (M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc, 114, 1895-1897, 1992 ou les 2' O-alkyl ribose et les LNA (BW, Sun et al., Biochemistry, 4160-4169, 43, 2004) . L'acide nucléique peut être naturel ou synthétique, un oligonucléotide, un polynucléotide, un fragment d'acide nucléique, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique telle que :
• PCR (Polymerase Chain Reaction) , décrite dans les brevets US- A-4,683,195, US-A-4, 683 , 202 et US-A-4, 800, 159, et sa dérivée RT-PCR (Reverse Transcription PCR) , notamment dans un format en une étape, tel que décrit dans le brevet EP-B-O .569.272,
• LCR (Ligase Chain Reaction) , exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-O .201.184,
• RCR (Repair Chain Reaction) , décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069,
• 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995, • NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO-A-91/02818,
• TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US- A-5,399,491, et • RCA (Rolling Circle Amplification (US-6, 576, 448 ) .
On parle alors d'amplicons pour désigner les acides nucléiques générés par une technique d'amplification enzymatique. Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison.
Les étapes d'amplification et de détection ci-dessus exposées peuvent être précédées par une étape de purification. Par « étape de purification », on entend notamment la séparation entre les acides nucléiques des micro-organismes et les constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse qui précède la purification des acides nucléiques. Ces étapes de lyse sont bien connues à titre d'exemple indicatif, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrites dans les demandes de brevet :
- WO-A-00/60049 sur la lyse par sonication, - WO-A-00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique,
- WO-A-99/53304 sur la lyse électrique, et
- WO-A-99/15621 sur la lyse mécanique.
L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les traitements par des agents chaotropiques, tels que les sels de guanidium (brevet US-A-5, 234, 809 ) .
Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques. A titre d'exemple, on peut utiliser des supports solides, tels que des particules magnétiques (voir à ce sujet les brevets US-A-4, 672, 040 et US-A-5, 750, 338 ) , et ainsi purifier les acides nucléiques, qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet WO-A-97/45202 et WO-A-99/35500. Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être fixé un acide nucléique. Des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides, tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose, tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose, ou le dextran ; des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques, telles que le nylon ; des matériaux minéraux, tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels, etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane, d'une particule ou d'une plaque sensiblement plane de verre ou silicium ou dérivés.
On peut réaliser l'ensemble du protocole (de l'échantillon prélevé à la détection des amplicons) dans un seul et même récipient ou tube, traité manuellement ou dans un automate.
Les figures et l'exemple ci-joints représentent un mode particulier de réalisation et ne peuvent pas être considérés comme limitant la portée de la présente invention. Figures 1 à 8 : Détection du virus de Chikungunya à différentes concentrations en unité de fluorescence relative (RFU en ordonnées) par unité de temps (T en abscisse) . La courbe en pointillé correspond au signal émis par la sonde complémentaire selon l'invention d'une séquence du virus du Chikungunya et la courbe en trait plein correspond au contrôle interne, celui-ci étant un transcript synthétique d'une taille d'environ 1000 bases qui englobe la région amplifiée par les primers NASBA ; II sera donc co-amplifié avec la séquence sauvage présente dans l'échantillon. Cependant ce contrôle interne a été modifié de façon à remplacer la région où se fixe normalement la sonde de détection par une séquence ne correspondant pas au Chikungunya. Cette région modifiée est reconnue par la sonde de détection du contrôle interne. Figure 1 plasma négatif . Figure 2 plasma positif, 4.18 copies/ml Figure 3 plasma positif, 41.8 copies/ml Figure 4 plasma positif, 418 copies/ml Figure 5 plasma positif, 4180 copies/ml Figure 6 plasma positif, 41800 copies/ml Figure 7 plasma positif, 418000 copies/ml Figure 8 plasma positif, 4180000 copies/ml
Exemple 1 : Expérience d'évaluation des amorces et de la sonde de détection du virus du chikungunya sur un ARN provenant d'échantillon clinique de la Réunion :
Les séquences de la paire d'oligonucléotide (Pl et P2) et la sonde de détection (MB) présente sous forme de balise moléculaire, sont indiqués ci-dessous :
Séquences des amorces et sonde utilisées : Pl, SEQ ID NO.3 :
5'- AAΓΓCΓAAΓACGACΓCACΓAΓAGGGGCTCTTACCGGGTTTGTTGC -3' P2, SEQ ID NO.2 : 5'- GCCTGGACACCTTTCGAC -3'
MB, SEQ ID NO.5 : 5 ' -CGAGCGACTCTCAGGCACCATCTGGCTCGCTCG-3 '
La séquence indiquée en gras et en italique correspond à la séquence promotrice T7, reconnue par l'ARN polymérase T7 et est retrouvée dans les oligonucléotides Pl pour la mise en œuvre de la technique NASBA. La séquence soulignée correspond à une séquence créant un espace, dite linker, entre la séquence promotrice et 1 'oligonucléotide de séquence SEQ ID No. 1. Les séquences soulignées doublement correspondent aux séquences formant la tige du molecular beacon.
Protocole opératoire :
- Source du virus Chikungunya :
Dilutions de plasmas de patients infectés et quantifiés, provenant du Centre Hospitalier Sud St Denis La Réunion.
- Extraction des acides nucléique : Les acides nucléiques ont été extraits en utilisant le Système easyMAG (bioMérieux B. V., Boxtel, Hollande) avec les réactifs NucliSENS Magnetic Extraction Reagents (bioMérieux B. V., Boxtel, Hollande, NucliSENS EasyMAG extraction Tampon 1 #280130, NucliSENS EasyMAG extraction Tampon 2 #280131, NucliSENS EasyMAG extraction Tampon 3 #280132, NucliSENS EasyMAG Silice Magnétique #280133, NucliSENS EasyMAG tampon lyse #280134) . Les extractions ont été faites sur 200 μl de chacune des dilutions de plasma. Les dilutions correspondent à des concentrations de 41 copies/ml, 418 copies/ml, 4180 copies/ml, 41800 copies/ml, 418000 copies/ml, 4180000 copies/ml .
- Amplification/Détection :
Selon les instructions du kit NucliSENS EasyQ Basic Kit V2 (bioMérieux B. V., Boxtel, Hollande), un mélange réactionnel unique permettant la détection simultanée du gène El du Chikungunya et du contrôle interne est préparé. Brièvement, à 64 μl de diluant ont été ajoutés 11 μl d'eau, 13 μl de KCl à 1,2 M, 4 μl de chacun des oligonucletides à 10 μM , et 0,8 μl de chacune des balises moléculaires à 20 μM (1 balise moléculaire spécifique de Chikungunya et une sonde spécifique du contrôle interne) . Un volume de 10 μl du mélange a ensuite été ajouté à 5 μl des solutions des ARNs précédemment extraits.
Résultats : Les résultats sont visibles sur les figures 1 à 8 et montrent que le test fonctionne et détecte un plasma Chikungunya positif jusqu'à la concentration 4180 copies/ml (équivalent à environ 150 copies d'ARN de Chikugunya/réaction NASBA) . On observe que plus le nombre de copies d'ARN de Chikungunya est élevé, plus l'amplitude de la courbe est grande.
Les résultats montrent aussi que le contrôle interne est correctement détecté et joue bien son rôle de validation de l'essai. Le signal du contrôle interne diminue proportionnellement au nombre de copies d'ARN de Chikungunya. Le signal du contrôle interne est à son maximal dans le plasma négatif, et est minimal en présence d'un fort nombre de copies d'ARN Chikungunya. En effet, étant donné qu'il s'agit d'une co-amplification, la quantité du contrôle interne a été calculée de façon à ce que le contrôle interne ne rentre pas trop en compétition avec la séquence sauvage du virus. Ainsi, le contrôle interne est normalement amplifié quand il est seul (échantillon négatif), mais dès qu'une séquence sauvage du Chikungunya est présente, c'est l'amplification de cette séquence qui a lieu jusqu'à complète inhibition de l'amplification du contrôle interne quand la séquence sauvage est présente à forte concentration. Ainsi pour que le test soit validé, il doit toujours y avoir un signal : si l'échantillon est négatif on a le contrôle interne positif, si l'échantillon est positif on a un signal positif avec ou non un signal pour le contrôle interne (selon si l'échantillon est fortement positif ou non) .
Exemple 2 : Comparaison de l'efficacité des amorces d'amplification et de la sonde de détection du virus du chikunqunya par rapport aux amorces et la sonde de la technique de référence en RT-PCR.
Les amorces et sonde de la présente invention et de la technique de référence ont été comparées en NASBA et en PCR, sur une qamme de dilutions d'ARNs chikunqunya quantifiés. Les amorces/sonde de la technique de référence ont été adaptées dans la NASBA et celles de la présente invention à la technique de référence.
Protocole opératoire :
- Source d'ARN Chikunqunya :
Les expériences ont été réalisées sur une qamme de dilutions d'ARNs purifiés d'une souche de Chikunqunya provenant de 1' IMTSSA (Institut de Médecine Tropicale du Service de Santé des Armées) .
- Amplification/Détection : • NASBA :
Selon les instructions du kit NucliSENS EasyQ Basic Kit V2 (bioMérieux B. V., Boxtel, Hollande, lot 010712.), un mélanqe réactionnel unique permettant l'amplification et la détection du qène El du virus du Chikunqunya est préparé. Brièvement, à 64 μl de diluant ont été ajoutés 11 μl d'eau, 13 μl de KCl à 1,2 M, 4 μl de chacun des oliqonucletides à 10 μM, et 0,8 μl de la sonde moléculaire à 20 μM. Un volume de 10 μl du mélanqe a ensuite été ajouté à 5 μl des solutions des ARNs précédemment extraits. Après une incubation de 2 min à 650C puis de 2 min à 410C, 5 μl du mélange d'enzymes est ajouté. L'amplification et la détection du signal en temps réel sont effectuées à l'aide du système NucliSENS EasyQ Analyzer (bioMérieux, Boxtel, Hollande, référence 285060) pendant 90 min à 410C. Les résultats sont analysés à l'aide du logiciel NucliSENS EasyQ Director 2.0 software.
• RT-PCR : La RT-PCR en une étape a été réalisée dans un volume final de 20 μl contenant 2,5 μl d'ARN de Ckikungunya extrait, 10 μl de 2X Thermoscript Reaction Mix Buffer (Invitrogen, Lot 1207045, Allemagne) , 2 pmol de sonde Taqman, 9 pmol de chacun des amorces d'amplification, 25 mM MgSO4, 0,4 μl du mélange d'enzymes One Step RT-PCR (Invitrogen, Lot 271375, Allemagne) . Les amplifications ont été réalisées dans un instrument LightCycler (Roche, Molecular Biochemicals, Allemagne) en utilisant les paramètres suivants: 5O0C pendant 20 min, 950C à 2 min et 45 cycles avec 950C pendant 5 sec, et 6O0C durant 1 min .
Amorces et sondes utilisées :
1) Amorces et sonde de la présente invention adaptées à la
NASBA :
Pl : SEQ ID NO .3 : 5'- AAΓΓCΓAAΓACGACΓCACΓAΓAGGGGCTCTTACCGGGTTTGTTGC -3' P2 : SEQ ID NO.2 : 5'- GCCTGGACACCTTTCGAC -3' MB : SEQ ID NO.5 :
5'Fam-CGAGCGACTCTCAGGCACCATCTGGCTCGCTCG-Dabsyl 3 ' .
2) Amorces et sonde de l'invention adaptées à une RT-PCR : Pl-CHIK-sansT7 : SEQ ID NO .6 : 5 ' -GCTCTTACCGGGTTTGTTGC-3 ' P2 : SEQ ID NO.7 : 5'- GCCTGGACACCTTTCGAC -3' BEAC-CHIK-SANS-TIGE : SEQ ID NO.8 : 5'Fam-ACTCTCAGGCACCATCTGGCT-Tamra3
3) Amorces et sonde issues de la publication de Pastorino et al. (revue Journal of Virological Methods, 124(2005) 65-71) pour une RT-PCR :
R-CHIK : SEQ ID NO.9 : 5 ' -CCAAATTGTCCYGGTCTTCCT-3 '
F-CHIK : SEQ ID NO.10 : 5 ' -AAGCTYCGCGTCCTTTACCAAG-3 '
P-CHIK : SEQ ID NO.11 : 5 'Fam-CCAATGTCYTCMGCCTGGACACCT-Tamra
3' (la lettre y correspondant soit à la base C soit à la base
T et la lettre M correspond soit à la base C soit à la base
A) .
4) Amorces et sonde issues de la publication de Pastorino et al. (revue Journal of Virological Methods, 124(2005) 65-71) adaptées à une NASBA:
NASP1-PASTO-NAS : SEQ ID NO.12 :
5 ' -ΛΛΓΓCΓΛΛΓΛCGΛCΓCΛCΎΛΓΛGGGGCCCAAATTGTCCYGGTCTTCCT-3 ' F-CHIK : SEQ ID NO.13 : 5 ' -AAGCTYCGCGTCCTTTACCAAG-3 ' BEAK-PASTO-NAS : SEQ ID NO.14 : 5' Fam-CGAGCGACCCAATGTCYTCMGCCTGGACACCTCGCTCG-Dabsyl 3'
Résultats :
Les résultats sont résumés dans le tableau ci dessous
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
*Le test NASBA est positif lorsque le signal de fluorescence obtenu dépasse de 20% le signal du contrôle négatif. **Le test RT-PCR est positif lorsque l'on obtient un Ct mesurable (le Ct correspond au nombre de cycle pour laquelle le signal devient positif) .
Les résultats montrent que sur la gamme de dilution d'ARNs chikungunya, les amorces et sonde de la présente invention utilisées en NASBA présentent une meilleure sensibilité que les amorces et sonde de la publication de Pastorino et al. utilisées dans le test de référence en RT-PCR. En effet, la NASBA détecte la dilution ICT7 , alors que la RT-PCR détecte seulement jusqu'à la dilution ICT5.
D'autre part, bien qu'en NASBA, les différentes amorces et sonde présentent une sensibilité identique, les amorces et sonde de la présente invention peuvent être utilisées en RT- PCR et augmenter de deux logarithm la sensibilité par rapport aux séquences de Pastorino et al. dans la méthode de référence .

Claims

REVENDICATIONS
1. Paire d'oligonucléotides destinée à permettre l'amplification d'une séquence cible localisée dans le gène El du génome du virus du Chikungunya, la paire d'oligonucléotides consistant en : un premier oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 1 : 5 ' -CTCTTACCGGGTTTGTTGC-3 ' , ou sa séquence complémentaire et, un second oligonucléotide d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de : SEQ ID No. 2 : 5 ' -GCCTGGACACCTTTCGAC-3 ' , ou sa séquence complémentaire .
2. Paire d'oligonucléotides, selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le premier oligonucléotide comprend additionnellement une séquence promotrice qui peut être reconnue par une enzyme ARN polymérase ADN dépendante.
3. Paire d'oligonucléotides, selon la revendication 2, caractérisée par le fait que la séquence promotrice qui peut être reconnue par une enzyme ARN polymérase ADN dépendante est une polymérase Tl.
4. Premier oligonucléotide, selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé par le fait qu'il consiste essentiellement en la séquence suivante : SEQ ID No. 3 :
5 ' -ΛΛΓΓCΓΛΛΓΛCGΛCΓCΛCΓΛΓΛGGGGCTCTTACCGGGTTTGTTGC-3 ' .
5. Oligonucléotide destiné à être utilisé comme sonde de détection d'une séquence cible localisée dans le gène El du génome du virus du Chikungunya, la sonde de détection étant d'une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 nucléotides consécutifs issus de :
SEQ ID No. 4 : 5'-CTCTCAGGCACCATCTGGC-S', OU sa séquence complémentaire, ladite séquence comportant au moins un moyen de marquage .
6. Oligonucléotide, selon la revendication 5, destiné à permettre une détection en temps réelle, caractérisé par le fait que l 'oligonucléotide est encadré de deux bras, l'un en position 5' et l'autre en position 3' dudit oligonucléotide, chaque bras ayant une longueur comprise entre 5 et 15 nucléotides, préférentiellement comprise entre 6 et 10 nucléotides et ces bras étant complémentaires l'un de l'autre afin de présenter l 'oligonucléotide sous forme d'une boucle en l'absence de la séquence cible localisée dans le gène El du génome du virus du Chikungunya.
7. Oligonucléotide, selon la revendication 6, dont l'extrémité libre d'un des bras comporte un marqueur fluorescent et l'extrémité libre de l'autre bras comporte un absorbeur de fluorescence.
8. Oligonucléotide, selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, caractérisée par le fait qu'il consiste essentiellement en la séquence suivante : SEQ ID No. 5 : 5 ' - [6-FAMl -CGAGCGACTCTCAGGCACCATCTGGCTCGCTCG- [DabSyl]-3', ou sa séquence complémentaire.
9. Oligonucléotide, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 5, caractérisé par le fait que chaque oligonucléotide est d'une longueur comprise entre 12 et 30 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10 ou 12 nucléotides consécutifs, et préférentiellement d'une longueur comprise entre 15 et 26 nucléotides et comprenant au moins un fragment de 10, 12 ou 15 nucléotides.
10. Utilisation d'une paire d'oligonucléotides, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou 9, dans une réaction d'amplification d'acides nucléiques ou comme sonde de détection, selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, du génome du virus du Chikungunya susceptible d'être présent dans un échantillon biologique.
11. Méthode de détection d'acides nucléiques du virus du Chikungunya susceptible d'être présent dans un échantillon, dans laquelle l'échantillon est soumis à une réaction d'amplification d'acides nucléiques utilisant une paire d'oligonucléotides, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou 9, en présence des réactifs d'amplification nécessaires à une telle amplification et la présence d'amplicons d'intérêt est détectée.
12. Méthode, selon la revendication 11, caractérisée en ce que la réaction d'amplification utilisée est une RT-PCR.
13. Méthode, selon la revendication 11, caractérisée en ce que la réaction d'amplification utilisée est une technique d ' amplification transcriptionnelle .
14. Méthode, selon la revendication 13, caractérisée en ce que la réaction d'amplification utilisée est la technique NASBA.
15. Méthode d'amplification du gène El du virus du Chikungunya susceptible d'être présent dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes :
- incuber l'échantillon dans un tampon d'amplification en présence de deux amorces d'amplification, chacune ayant une longueur comprise entre 10 et 50 nucléotides, l'une comprenant additionnellement une séquence promotrice, l'autre de polarité opposée à l'amorce associée à la séquence promotrice, pour s'hybrider respectivement en amont et en aval d'une zone d'intérêt localisée dans le gène El du virus du Chikungunya,
- ajouter les réactifs suivants dans l'échantillon:
• une enzyme ayant une activité RNA dépendant DNA polymérase,
• une enzyme ayant une activité DNA dépendant DNA polymérase,
• une enzyme ayant une activité RNase H,
• une enzyme ayant une activité DNA dépendant RNA polymérase, et
- maintenir le mélange réactionnel ainsi créé sous des conditions appropriées et pendant une durée de temps suffisante pour qu'une amplification ait lieu.
16. Kit de détection du gène El du virus du Chikungunya susceptible d'être présent dans un échantillon, contenant : - au moins une paire d'oligonucléotides selon les revendications 1 à 4 ou 9, au moins un oligonucléotide marqué ou pouvant être marqué, selon l'une quelconque des revendications 5 à 9, et ayant une séquence d'acide nucléique substantiellement complémentaire avec au moins une partie de la séquence d'acide nucléique amplifiée, des réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification .
17. Kit selon la revendication 16, dans lequel les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification sont des réactifs permettant une amplification NASBA.
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