KR20230087965A - CRISPR-Cas 기반의 아프리카돼지열병 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 아프리카돼지열병 바이러스 검출방법 - Google Patents
CRISPR-Cas 기반의 아프리카돼지열병 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 아프리카돼지열병 바이러스 검출방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 CRISPR-Cas 기반의 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 아프리카돼지열병 바이러스 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 등온증폭에 의해 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 가이드 RNA 및 CRISPR-Cas 단백질을 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 프라이머쌍, 또는 상기 프라이머쌍 및 가이드 RNA를 이용하면 검체 내 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스를 매우 높은 민감도와 특이도로 신속하게 검출할 수 있다.
본 발명이 제공하는 프라이머쌍, 또는 상기 프라이머쌍 및 가이드 RNA를 이용하면 검체 내 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스를 매우 높은 민감도와 특이도로 신속하게 검출할 수 있다.
Description
본 발명은 CRISPR-Cas 기반의 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 아프리카돼지열병바이러스 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 등온증폭에 의해 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 가이드 RNA 및 CRISPR-Cas 단백질을 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
아프리카돼지열병 바이러스(African swine fever virus, ASFV)는 아스파바이러스과(Asfarviridae)에 속하는 유일한 바이러스로서 170~193kbp의 매우 큰 dsDNA를 genome으로 가지며, 150~167개의 ORF (open reading frame)를 포함하고 있다. 아프리카돼지열병 바이러스 특이 단백질 중에는 캡시드 단백질(capsid protein)인 p72를 암호화한 B646L 구조 단백질 유전자의 C-말단(C-terminal) 지역의 염기 서열 변이에 기초해서, 24개의 유전자형(genotype)으로 분류된다. 24개의 유전자형 모두 사람에게는 감염되지 않으며, 아프리카를 벗어나 전 세계적으로 확산하고 있는 바이러스는 대부분 유전형 II의 고병원성 바이러스이다.
한편, 아프리카돼지열병 바이러스의 임상 증상은 돼지열병(classical swine fever)과 아주 유사하고, 두 질병은 일반적으로 실험실 진단에서 변별되어야 하기 때문에 이에 따라 상기 아프리카돼지열병 바이러스에 대한 감염여부를 확인하기 위한 많은 연구들이 행해져 왔다.
종래의 바이러스 진단법으로는 전자현미경 또는 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 그러나, 전자현미경을 이용한 진단방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태학적 특징으로 종을 진단하는 것은 거의 불가능하다. 현재의 일반화된 방법은 혈청학적 방법을 이용한 검사로, 혈액, 소변, 뇌척수액 또는 양수에서 아프리카돼지열병 바이러스의 유전 물질(DNA)을 검출하거나 아프리카돼지열병 바이러스 감염에 반응하여 생성된 혈중 항체를 검출하는 방법이다. 혈청학적 방법 중 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법은 가장 일반적으로 사용되는 진단방법이나 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 정확한 진단이 실패하는 경우가 자주 발생하는 문제가 있다. 또한, 바이러스를 대량생산 및 정제하여 동 바이러스를 불활화한 다음, 이를 항원으로 사용하여 아프리카돼지열병 바이러스에 대한 항체를 검출해야 하기 때문에 상기 항원을 제조하기 위하여는 몇 주 또는 몇 개월이라는 긴 시간과 많은 비용이 소요되는 문제가 있다.
또한, 혈청학적 방법을 이용한 검사는 돼지에게서 시료를 수득하기 위해 전문가가 전문 장비를 가지고 채취해야 하므로 별도의 시간과 비용이 소요되기 때문에, 돼지 농가에서 쉽게 채취할 수 있는 방법을 개발할 필요가 있었다.
이에, 본 발명자는 전술한 문제를 해결하고 생물학적 시료에서 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스를 매우 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍과 선택적으로 가이드 RNA 및 CRISPR-Cas 단백질을 이용한 유전자 가위 반응을 통해 매우 높은 민감도와 특이도로 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스를 검출할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머; 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 프라이머쌍을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머쌍, 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제를 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출방법을 제공하는 것이다:
(a) 검체로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 DNA를 상기 프라이머쌍을 이용하여 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계.
본 발명의 다른 목적은 아프리카돼지열병 바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머; 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 프라이머쌍을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 프라이머쌍, 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제를 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출방법을 제공한다:
(a) 검체로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 DNA를 상기 따른 프라이머쌍을 이용하여 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아프리카돼지열병 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술의 하나를 제공한다; Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY (2th ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walkered., 1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머; 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 프라이머쌍을 제공한다.
본 발명에서 상기 "프라이머(primer)"란 짧은 서열의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로서 목적하는 DNA 또는 RNA의 반대편 가닥의 상보적 위치에 특이적으로 부착되어 유전자의 증폭(amplification)을 개시하는 역할을 하는 올리고뉴클레오티드로서, 바람직하게는 아프리카돼지열병 바이러스 유전자의 P30 gene 영역에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열과 각각 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 유사한 서열의 프라이머도 포함될 수 있다.
상기 프라이머쌍는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 프라이머는 아프리카돼지열병 바이러스 유전자의 P30 gene를 증폭할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
상기 프라이머쌍은 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스의 CP204L 유전자를 특이적으로 증폭하여 74bp의 증폭산물을 나타내며, 상기 증폭산물의 분석을 통해 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스가 검출될 수 있다.
상기 증폭은 당업계에서 증폭 대상(유전자 등)을 증폭하기 위하여 이용되는 어떠한 방법에 의해서도 수행될 수 있고, 예를 들어, 재조합-중합효소 증폭법(Recombinase polymerase amplification; RPA)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 증폭산물은 예를 들어, 앰플리콘(amplicon)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "재조합효소-중합효소 증폭법(Recombinase Polymerase Amplification; RPA)"은 DNA 및 RNA 증폭을 확인할 수 있는 기술을 의미하며, 기존 PCR 과는 다르게 DNA 결합 단백질과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 서열(target sequence)을 증폭시킬 수 있는 기술이다. RPA는 기존의 PCR 방법과 유사하나, 일정한 온도에서 온도변화 없이 특정 유전자의 증폭이 가능하기 때문에 반응 시간을 단축할 수 있고, 특수한 장비가 필요치 않아서 검사 단가가 저렴하고, 운반성이 뛰어나 현장검사가 가능할 수 있다는 장점을 가진다. 재조합효소-중합효소 증폭법(Recombinase Polymerase Amplification; RPA)은 박테리오파지 T4 재조합효소를 이용하여 DNA 이중가닥의 해리를 일으키고 동시에 DNA 중합효소와 특정 primer들을 사용하여 특정DNA를 증폭해내는 방법이다. 이는 PCR의 경우와 같이 표적 기질(target template)과 한 쌍의 프라이머(oligonucleotide)를 사용하여 특정 염기서열의 DNA를 증폭시킬 수 있으나, PCR의 경우와 달리 일정 온도(37℃ - 70℃)의 범위에서 등온조건으로 증폭반응을 일으킬 수 있는 장점이 있다. 현재 RPA는 매우 빠르게 증폭산물을 만들 수 있도록 발전되었으며, 이는 등온조건의 장점과 함께 널리 인식되어 특이 유전자 증폭을 통한 특정병원체의 검출법에 다양하게 RPA가 응용되고 있다.
본 발명은 또한 상기 프라이머쌍, 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제를 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 가이드 RNA는 crRNA 또는 gRNA 일 수 있다. crRNA는 CRISPR RNA라 불리운다. 또한, gRNA는 가이드 RNA를 지칭한다. crRNA 및 gRNA는 단일 가닥 RNA(single strand RNA) 일 수 있다. 또한, crRNA는 tracrRNA와 결합하여 크리스퍼 연관 단백질을 작동하게 할 수 있으며, crRNA는 tracrRNA와 결합된 형태로 이용될 수 있다. 이때, crRNA는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스에 특이적으로 존재하는 유전자 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있다. 또한, gRNA도 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스에 특이적으로 존재하는 유전자 서열과 결합하여 크리스퍼 연관 단백질이 활성을 나타내게 할 수 있다. 상기 crRNA 또는 gRNA는 15 내지 50개의 핵산으로 구성된 RNA 일 수 있다. 일 구체예로 crRNA 또는 gRNA는 41개의 핵산으로 구성될 수 있다. 또한, crRNA 또는 gRNA는 Cas9, Cas12 또는 Cas13과 같은 크리스퍼 연관 단백질이 활성을 갖게 하기 위해 3'에 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 일 실시예로 상기 gRNA는 서열번호 3 또는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 엔도뉴클레아제는 CRISPR 연관 단백질일 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어, CRISPR 연관 단백질은 DNA 또는 RNA와 같은 핵산이 이중 가닥 혹은 단일 가닥을 가질 경우(dsDNA/RNA 및 ssDNA/RNA) 이를 인식하여 절단할 수 있는 효소이다. 구체적으로, 이들은 crRNA 또는 gRNA와 결합된 이중가닥 혹은 단일가닥 핵산을 인식하여 이를 절단할 수 있다.
본 발명에서 상기 엔도뉴클레아제의 일 구체예는, gRNA가 표적 부위와 결합된 것을 인식하여 엔도뉴클레아제 기능이 활성화되는 것일 수 있다. 또한, 엔도뉴클레아제 기능이 활성화됨에 따라, 이중가닥 및/또는 단일가닥 DNA 및/또는 RNA를 비특이적 절단할 수 있는 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 것일 수 있다. 또한, Cas12a와 같은 크리스퍼 연관 단백질은 일단 활성화되면, 비특이적 엑소뉴클레아제 활성이 나타날 수 있다. 이러한 경우 DNA 및 RNA를 비특이적으로 절단할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 구체예의 조성물은 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스의 특정 표적 부위, 보다 구체적으로는 CP204L 유전자에 crRNA 또는 gRNA가 결합되고, 이에 의해 활성화되는 비특이적 뉴클레아제에 의해 리포터(Reporter)가 절단됨으로써 리포터에 결합된 형광물질의 발광에 의해 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스가 검출될 수 있다.
구체적으로, 상기 CRISPR 연관 단백질의 일 구체예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Cas14, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, CsMT2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3 및 Csf4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 Cas9, Cas10, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas13a, Cas13b, Cas13c 및 Cas13d로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 보다 더 바람직하게는 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h 및 Cas12i로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 가장 바람직하게는 Cas12a(Cpf1)일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 조성물은 리포터 유전자 (Reporter gene)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 상기 리포터 유전자는 형광물질과 결합되어 있는 것이 바람직하며, 상기 형광물질은 FAM, TET, JOE, YAKYE, HEX, CY3, ATTO550, TAM, ROX, TxRed, CY35, LC610, LC640, ATTO647N, CY5, VIC, evergreen dye 및 ATTO680 로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서 상기 조성물은 등온 증폭 반응 및 이와 연속되는 크리스퍼 유전자 가위 반응에 의해 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스를 검출하는 방법에 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 상기 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍을 통해 증폭된 증폭산물 내에 표적 부위가 존재한다면 가이드 RNA가 표적부위와 상보적으로 결합하고 엔도뉴클레아제, 바람직하게는 CRISPR 연관 단백질이 활성화되어 리포터 유전자의 서열을 자른다. 그 결과 리포터 유전자에 결합된 형광물질이 발광을 하게 되고 이를 통해 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있고, 상기 조성물 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPCwater) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출방법을 제공한다:
(a) 검체로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 DNA를 상기 프라이머쌍을 이용하여 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계.
본 발명에서 상기 “검체”는 시험, 검사, 분석 등에 쓰는 물질이나 생물을 말하는 것으로서 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스의 존재 유무가 의심되는 생물학적 시료일 수 있다.
본 발명에서 상기 생물학적 시료는 아프리카돼지열병 바이러스 감염이 의심되는 개체, 즉, 사람 등 포유동물로부터 분리된 시료일 수 있다. 이의 비제한적인 예시로서 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 모피, 소변 등이 포함될 수 있다.
검체로부터 DNA를 수득하는 것은 통상의 알려진 DNA 수득 방법을 이용할 수 있다. 출발물질이 gDNA인 경우 gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 출발물질이 mRNA인 경우에는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성될 수도 있다. 예를 들어, 상기 DNA 분리는 통상적으로 시료에서 제노믹 DNA(Genomic DNA, gDNA)를 분리하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 퀴아젠(Qiagen)사의 DNeasy mini kit 등의 상업적으로 판매되는 DNA 분리 키트 등을 이용할 수 있다.
본 발명에서 상기 “증폭”은 PCR, RT-PCR, 등온증폭법으로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있으며, 바람직하게는 등온증폭법일 수 있다.
상기 “등온증폭법(Isothermal amplification)”은 일정한 반응온도 조건하에서 목적으로 삼는 핵산배열(주형)을 증폭시키는 방법을 말하는 것으로서, 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification, RPA), 루프 매개 증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP), 헬리카제-종속 증폭(helicasedependent amplification, HDA), 회전환 증폭(rolling circle amplification, RCA), 다중치환증폭(multiple displacement amplification, MDA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA), 핵산 서열-기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA) 중 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification, RPA)일 수 있다.
상기 증폭산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 예를 들어, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다. 또한, RPA 증폭산물을 수득하여 아가로오스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis) 등의 방법으로 분리할 수 있으며, 사용된 프라이머 세트에 의해 중합된 DNA에 해당하는 길이, 구체적으로는 74 bp의 길이를 갖는 DNA의 존재를 확인하여 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 (b) 단계 이후에 상기 증폭산물을 가이드 RNA, 엔도뉴클레아제 및 리포터 유전자를 포함하는 조성물과 혼합하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이 경우, 상기 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스는 상기 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제에 의한 유전자 가위 반응에 따라 상기 리포터 유전자의 형광 반응을 검출함으로써 그 존재 여부가 확인될 수 있다.
본 발명은 또한 아프리카돼지열병 바이러스 감염증 진단용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 “진단”은 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 또는 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것을 포함한다.
본 발명이 제공하는 프라이머쌍 및 가이드 RNA를 포함하는 조성물은 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 이를 이용하면 진단하고자 하는 생물학적 시료(예컨대, 타액, 분변, 혈액, 소변 등) 내 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있어, 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환들을 매우 빠르고 정확하게 진단할 수 있다.
본 발명이 제공하는 프라이머쌍, 또는 상기 프라이머쌍 및 가이드 RNA를 이용하면 검체 내 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스를 매우 높은 민감도와 특이도로 신속하게 검출할 수 있다.
도 1은 아프리카돼지열병바이러스 Target p30 유전자DNA sequence에서 conserved region을 조사한 것이다.
도 2는 아프리카돼지열병바이러스 CP204L(P30)유전자의 gRNA가 결합할 위치를 찾은 것이다.
도 3은 야생혈아프리카돼지열병 바이러스의 CP204L(P30)유전자에 대하여 RPA 등온 PCR용 두 가지 primer set를 이용한 증폭한 예이다(lane 1: primer set 1, lane 2: primer set 2).
도 4는 야생혈아프리카돼지열병 바이러스의 CP204L(P30)유전자에 대하여 RPA 등온 PCR용 프라이머 세트로 증폭한 후, Cas12a를 이용해 바이러스를 검출한 결과이다.
도 2는 아프리카돼지열병바이러스 CP204L(P30)유전자의 gRNA가 결합할 위치를 찾은 것이다.
도 3은 야생혈아프리카돼지열병 바이러스의 CP204L(P30)유전자에 대하여 RPA 등온 PCR용 두 가지 primer set를 이용한 증폭한 예이다(lane 1: primer set 1, lane 2: primer set 2).
도 4는 야생혈아프리카돼지열병 바이러스의 CP204L(P30)유전자에 대하여 RPA 등온 PCR용 프라이머 세트로 증폭한 후, Cas12a를 이용해 바이러스를 검출한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 아프리카돼지열병 바이러스 검출을 위한 gRNA 선발
아프리카돼지열병 바이러스 특이적인 검출용 gRNA를 제작하기 위하여, 일차적으로 바이러스의 유전 정보를 이용하여 다중 정렬(multiplealignment)을 수행하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다. 아프리카돼지열병 바이러스의 유전자 중 p30 (CP204L)를 선택하였다.
Primer3 프로그램을 이용하여 gRNA를 디자인한 결과 두 부위에서 프라이머가 선별되었다(도 2). gRNA는 target 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 컨스와 5'TTTV protospacer adjacmemt motfi (PAM)을 포함하도록 제작하였다. 아프리카돼지열병 바이러스의 P30 gene에 특이적인 프라이머쌍 및 프로브의 서열은 하기 표 1과 같다.
실시예 2: 프라이머를 이용한 아프리카돼지열병 바이러스 target 유전자의 증폭
상기 실시예 1에서 제조한 RPA용 프라이머와 프로브의 성능 테스트를 위해서 야생형 아프리카돼지열병 바이러스 DNA를 이용하여 target유전자를 증폭하였다. 아프리카돼지열병 바이러스에 대한 primer set 1과 set 2 모두 target유전자를 잘 증폭하는 것을 확인하였다(도 3).
반응 조건: 39°C, 20min
반응용액 조성:
Primer Fw - 1,75 μl
Primer Rw - 1,75 μl
2x Recation Buffer - 12,5 μl
25mM dNTP - 1,8 μl
H2O - 1,2μl
10x Basic Emix - 2,5 μl
Core Reaction Mix -1,25 μl
MgOAc - 1,25 μl
DNA template - 1 μl
Total volume - 25 μl
실시예 3: RPA 프라이머, gRNA 및 CRISPR-Cas12a를 이용한 아프리카돼지열병 바이러스의 검출
상기 실시예 3에서 증폭된 아프리카돼지열병 유전자를 CRISPR-Cas12a와 RPA 등온 PCR를 이용하여 RPA 프라이머와 gRNA의 이용하여 증폭하였다(도 5).
반응 조건: 37°C, 20min
반응용액 조성:
NEBuffer 2.1- 3μl
gRNA (300nM) - 3μl
Cas12a - 1μl
Probe (10pM) - 1,5μl
ddH2O - 1,5μl
Total volume - 10 μl
본 발명이 제공하는 프라이머쌍, 또는 상기 프라이머쌍 및 가이드 RNA를 이용하면 검체 내 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스를 매우 높은 민감도와 특이도로 신속하게 검출할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
<110> UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION, YONSEI UNIVERSITY WONJU CAMPUS
<120> Composition for detecting African swine fever virus based on
CRISPR-Cas, and African swine fever virus detection method using
the same
<130> NP21-0085
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPA forward primer 1
<400> 1
aatgaaacca atgaatgcac atcctccttt gaaa 34
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPA reverse primer 1
<400> 2
tttgtgcaag catatacagc ttggagtctt taggt 35
<210> 3
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Guide RNA 1
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga ugagcaagag cccucaucgg a 41
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPA forward primer 2
<400> 4
agatactctt cacaagttgt gtttcatgcg ggtag 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPA reverse primer 2
<400> 5
cgagcagatt tcacaatatc atacttaaca gtact 35
<210> 6
<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Guide RNA 2
<400> 6
uaauuucuac uaaguguaga uuguugagau uaucaauagc g 41
Claims (17)
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머; 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 프라이머쌍.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 재조합효소-중합효소 증폭(Recombinase polymerase amplification; RPA) 반응용인 것을 특징으로 하는 프라이머쌍.
- 제1항에 따른 프라이머쌍, 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 3 또는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 CRISPR 연관 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 CRISPR 연관 단백질은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Cas14, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, CsMT2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3 및 Csf4로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 조성물은 리포터 유전자 (Reporter gene)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 형광물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 형광물질은 FAM, TET, JOE, YAKYE, HEX, CY3, ATTO550, TAM, ROX, TxRed, CY35, LC610, LC640, ATTO647N, CY5, VIC, evergreen dye 및 ATTO680 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 조성물은 등온 증폭 반응 및 이와 연속되는 크리스퍼 유전자 가위 반응에 의해 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스를 검출하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제3항의 조성물을 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출용 키트.
- 하기 단계를 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 검출방법:
(a) 검체로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 DNA를 제1항에 따른 프라이머쌍을 이용하여 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계.
- 제12항에 있어서, 상기 증폭은 등온증폭인 것을 특징으로 하는 검출방법.
- 제13항에 있어서, 상기 등온증폭은 RPA(Recombinase polymerase amplification) 인 것을 특징으로 하는 검출방법.
- 제12항에 있어서, 상기 (b) 단계 이후에 상기 증폭산물을 가이드 RNA, 엔도뉴클레아제 및 리포터 유전자를 포함하는 조성물과 혼합하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
- 제12항에 있어서, 상기 검체는 생물학적 시료인 것을 특징으로 하는 검출방법.
- 제3항의 조성물을 포함하는 아프리카돼지열병(African swine fever) 바이러스 감염증 진단용 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210176688A KR20230087965A (ko) | 2021-12-10 | 2021-12-10 | CRISPR-Cas 기반의 아프리카돼지열병 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 아프리카돼지열병 바이러스 검출방법 |
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2021
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