CN117587164A - 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a系统的鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于RPA‑CRISPR‑Cas12a系统的鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测方法及应用，属于生化与分子生物学技术领域。通过提取待测样品的RNA，反转录为cDNA，以获得的cDNA为模板，与特异性RPA引物对结合进行扩增反应，得到扩增产物，将扩增产物与含有Cas12a蛋白、gRNA的系统混合，并加入ssDNA检测探针进行反应；最后使用可视化检测仪器对反应产物进行观察。本发明提供了一种能快速、灵敏、高特异性且能满足现场快速检测技术需求的靶标鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测方法，可有效脱离实验室昂贵的热循环仪器，对于鹅源番鸭呼肠孤病毒的快速防控具有重要的指导意义。
Description
技术领域
本发明属于生化与分子生物学技术领域，涉及一种基于RPA-CRISPR-Cas12a系统的鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测方法及应用。
背景技术
自2020年7月以来，一种以肝脾白灶性坏死为特征的传染病在中国许多地区的鹅场广泛传播，给我国养鹅业造成了严重的经济损失。经分离、培养、生物学鉴定、基因组序列分析，确定该病原为鹅源番鸭呼肠孤病毒(G-MDRV)。开发快速、准确且便捷的核酸检测方法是成功预防和控制感染的关键。传统核酸检测技术如RT-PCR、巢氏RT-PCR以及灵敏度更高的实时荧光定量RT-PCR等，不仅需要昂贵仪器设备，而且需要专业人士操作，限制了它们在采样现场或设备不足的实验室中的应用。因此，如何更加快速、简便、准确、灵敏地检测，是MDRV核酸检测未来的发展方向。
规律成簇间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated proteins，Cas)构成CRISPR-Cas系统。研究表明，CRISPR-Cas系统不仅具有基因编辑能力，还可用于病原的核酸检测。随着对CRISPR-Cas系统的深入研究，已有多种CRISPR-Cas系统被开发为快速、灵敏的核酸检测技术。其中Ⅱ类Cas12a蛋白可在gRNA引导下具有优异的靶基因序列特异性识别能力和高效的反式切割活性，已被开发成识别不同类型靶标的核酸检测方法，在快速检测领域具有重大潜力。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种等温扩增技术，因其具有反应迅速、特异性强、低温运行、灵敏度高、适用性广、试剂形态灵活等优势广泛用于病原核酸检测。为提高CRISPR-Cas12a系统的灵敏度，将RPA与Cas12a介导的反式切割活性相结合，可在极低拷贝水平检测到靶标核酸分子。
现有技术中，已有结合RPA与CRISPR-Cas系统检测病毒核酸的相关专利申请，如：CN 114292963A公开了一种鸭坦布苏病毒核酸CRISPR-Cas13a检测系统及RPA引物对和crRNA，可对鸭坦布苏病毒进行特异性检测。CN 115786582 A则公开了一种结合RPA与CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒方法、试剂盒及其制备方法，该检测系统可在30-40min内检测猴痘病毒的基因组DNA，检测限为1copy/μL，可以实现快速、灵敏地猴痘病毒检测。但是，对于鹅源番鸭呼肠孤病毒，目前尚无结合RPA与CRISPR-Cas系统进行检测的相关报道，所以本领域的技术人员致力于开发一套基于RPA-CRISPR-Cas12a系统，用于G-MDRVσC基因的简便快速检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于RPA-CRISPR-Cas12a系统的G-MDRV可视化检测方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明采用RPA、CRISPR-Cas12a系统、荧光实时监测、测流层析技术相结合的方法，推动了G-MDRV诊断技术的发展，为防控G-MDRV病提供技术支持。
为实现上述目的，本发明主要包括以下内容：
本发明第一方面，提供了一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的引物-探针组合，所述引物-探针组合包括：特异性RPA引物对，gRNA，ssDNA检测探针；
所述特异性RPA引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；
所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述ssDNA检测探针为用于荧光检测的ssDNA 1-荧光淬灭探针或用于试纸条检测的ssDNA 2-荧光生物素探针。
所述ssDNA 1-荧光淬灭探针为一端标记有荧光基团FAM和另一端标记有荧光淬灭基团BHQ1的单链DNA，所述ssDNA 2-荧光生物素探针为一端标记有荧光基团FITC和另一端标记有生物素基团Biotin的单链DNA。
所述单链DNA的核苷酸序列为：TTATT。
本发明第二方面，提供上述的引物-探针组合在制备检测鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测产品中的应用。
本发明第三方面，提供了一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的试剂盒，所述试剂盒含有上述检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的引物-探针组合；
所述试剂盒还包括：Cas蛋白，鹅源番鸭呼肠孤病毒质粒标准品，反应缓冲液；
所述Cas蛋白为Cas12a蛋白；
所述反应缓冲液为10×reaction buffer。
所述鹅源番鸭呼肠孤病毒质粒标准品由如下方法制备而成：
采用SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示的特异性RPA引物对扩增鹅源番鸭呼肠孤病毒的基因组，得到扩增产物，将扩增产物连接到pMD18-T载体上，筛选阳性克隆并提取质粒DNA，即制备得到鹅源番鸭呼肠孤病毒质粒标准品；
本发明第四方面，提供了鹅源番鸭呼肠孤病毒检测试剂盒在进行鹅源番鸭呼肠孤病毒流行病学调查中的应用。
本发明第五方面，提供了一种对鹅源番鸭呼肠孤病毒进行可视化检测的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的RNA，反转录为cDNA；
(2)以(1)中获得的cDNA为模板，与特异性RPA引物对结合进行扩增反应，得到扩增产物；
(3)将扩增产物与含有Cas12a蛋白、gRNA的系统混合，并加入ssDNA检测探针进行反应；
(4)用可视化检测仪器或检测试纸条对反应产物进行检测观察，并对观察结果进行判读，若用可视化检测仪器检测反应产物时发出荧光信号或用检测试纸条检测反应产物时检测线位置出现红色条带或检测线和质控线位置均出现红色条带，则表明待测样品中存在鹅源番鸭呼肠孤病毒。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种快速、灵敏、高特异性且能满足现场快速检测技术需求的靶标鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测方法，可有效脱离实验室昂贵的热循环仪器，对于鹅源番鸭呼肠孤病毒的快速防控具有重要的指导意义。
附图说明
图1为基于RPA-CRISPR-Cas12a高灵敏度酶分子检测系统的示意图。
图2为G-MDRV序列比对(A)及gRNA设计(B)。
图3为RPA引物扩增筛选的DNA凝胶电泳图(A)及5条gRNA对G-MDRVσC基因序列的阳性质粒CRISPR-Cas12a检测40min荧光值测定结果(B)。
图4为基于RPA-CRISPR-Cas12a检测试纸条横向流动检测的原理图；其中A:基于RPA-CRISPR-Cas12a检测试纸条工作原理；B：基于RPA-CRISPR-Cas12a检测试纸条检测结果判定示意图。
图5为基于RPA-CRISPR-Cas12a检测方法的特异性测试结果；其中A、B为荧光特异性检测示意图；C为在紫外光下进行荧光特异性检测示意图；D为使用检测试纸条进行特异性检测结果示意图。
图6为基于RPA-CRISPR-Cas12a检测方法的敏感性测试结果；其中A、B为荧光敏感性检测示意图；C为在紫外光下进行荧光敏感性检测示意图；D为使用检测试纸条进行敏感性检测结果示意图。
具体实施方式
为更好的理解本发明，下面结合具体实例对本发明做进一步说明。除非特别说明，本发明所用的试剂、耗材等均为市购。实施例中的实验技术方法均为常规方法和试剂说明书所建议的方法。
以下实施例所涉及材料及仪器如下：
1.实验材料：
RPA引物由睿博兴科生物技术有限公司合成，所设计的gRNA序列由金斯瑞生物科技公司合成，ssDNA检测探针由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成。
RNA提取试剂盒为TransGen,cat.no.EC301-11，RNA反转录试剂盒为HiFiScriptcDNA Synthesis Kit(KANGWEI,cat.no.CW2569M)，DNA凝胶提取试剂盒为Omega Bio-tek,cat.no.D2500-02，质粒提取试剂盒为TIANprep Mini Plasmid Kit(TIANGEN,cat.no.DP105)，RPA试剂盒为TwistAmp Basic Kit(TwistAmp,cat.no.TABAS03KIT)，检测试纸条为HybriDetect(Milenia Biotec)。
2.实验仪器：
DS-11分光光度计，罗氏LightCycler96实时荧光定量PCR仪，科创锐新凝胶成像系统(Gel K8160)等。
实施例1：鹅源番鸭呼肠孤病毒检测RPA引物及gRNA设计与筛选
(1)RPA引物设计与筛选
鉴于在持续的免疫选择压力下，σC是基因组中最容易发生突变以适应更大进化压力的基因，σC基因组虽高度变异，但常用于分离鉴定不同ARV毒株，是分析序列差异、毒株致病力、免疫原性关系的重要因子，选择二代测序技术获得的G-MDRV病毒分离株HNPY(GenBank No.OP244611)的全基因组序列中σC基因的保守核苷酸区(图2)作为RPA引物的附着位点。
RPA引物设计原则：
引物长度控制在30-50个碱基以内，过长或者过短均影响扩增效率；引物中避免出现回文序列等特殊序列；GC含量控制在30-70％之间，避免形成二级结构或者发卡结构；扩增目的片段大小最适为100-200bp左右。
按照RPA扩增引物设计原则设计5对特异性RPA引物，同时利用NCBIPrimer BLAST对所设计出的引物进行特异性筛选，各引物对基因序列如下所示：
RPA-F1：CATTGCAGTCCTCGTATGATGCTCTCTTCGA (SEQ ID NO.1)
RPA-R1：GAGAGGATAGAAACAATGTTGTCCGTTGTCC(SEQ ID NO.2)
RPA-F2：ATGTCCGAAACTCCCGCTCCTCCAGGATACA(SEQ ID NO.4)
RPA-R2：AGGAAAGACGACGTGACAAATCCTCGACATC(SEQ ID NO.5)
RPA-F3：TAGATCTGATGTCTTAGCGCTAATTCTTTCGT(SEQ ID NO.6)
RPA-R3：CGAGTTGTATATCATATCCATACGTACGCGTA(SEQ ID NO.7)
RPA-F4：TCGTGTTGCTAAGTTAGAATGTGCGACGTCTC(SEQ ID NO.8)
RPA-R4：ATCGTCAAACACCATGTCGACCATGAACATGT(SEQ ID NO.9)
RPA-F5：CTCATTGCAGTCCTCGTATGATGCTCTCTTC(SEQ ID NO.10)
RPA-R5：AACACCATGTCGACCATGAACATGTTAGC(SEQ ID NO.11)
分别用5对RPA引物扩增含有G-MDRVσC基因序列的阳性质粒，通过DNA凝胶电泳分析各对引物核酸扩增情况，如图3A所示，最终选择扩增效果最好的引物对RPA-F1/RPA-R1作为RPA扩增引物。
(2)gRNA设计与筛选
在CRISPR-Cas系统中，特异性的gRNA可通过引导相关Cas蛋白对PAM序列的识别，从而使Cas蛋白与dsDNA结合并激活其切割活性。CRISPR-Cas12a检测方法的核心在于gRNA，故gRNA质量与检测方法的灵敏度、精准度直接相关。
gRNA序列由两部分构成：5’端的保守基因序列(scaffold/repeat部分)，以及3’端的靶基因序列的互补序列构成。鉴于Cas12a蛋白的PAM序列为(TTTN，N为任意核苷酸)，因此根据PAM后的Protospacer序列设计gRNA序列3’端的靶基因序列的互补序列。gRNA序列设计如图2所示，即根据RPA引物扩增的G-MDRV高度保守的σC靶标区域内找出TTTN序列，往后选取20nt，设计其对应的互补序列，并通过NCBIPrimer BLAST对比分析序列特异性，再在靶基因序列的互补序列前加上保守基因序列scaffold/repeat(下划线标注)。为了筛选效率最高的gRNA，针对靶标G-MDRVσC高度保守的区域，设计合成了5条gRNA，各gRNA序列信息如下所示：
gRNA1：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCUAAGUCUCUAUCCGAUUUA(SEQ ID NO.3)
gRNA2：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGCUCUCUUCGAAGAGGUGC(SEQ ID NO.12)
gRNA3：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAUAUGAUAUACAACUCAUU(SEQ ID NO.13)
gRNA4：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAUGUGCGACGUCUCACAUU(SEQ ID NO.14)
gRNA5：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAUCACUUUGGACAACGGAC(SEQ ID NO.15)
注：根据WIPOST.26标准的规定，上述gRNA序列中的尿嘧啶“U”在序列表中用“T”表示。
通过在罗氏LightCycler96实时荧光定量PCR仪上反应40min，进行CRISPR-Cas12a荧光检测，如图3B所示，在5条gRNA中，gRNA1荧光值最高，说明扩增效果最好，灵敏度最高。
实施例2：ssDNA检测探针的制备
(1)用于荧光检测的ssDNA 1-荧光淬灭探针
在ssDNA序列两端分别标记FAM荧光基团和BHQ1荧光淬灭基团，即可构成荧光检测的ssDNA报告探针。其序列为：FAM-TTATT-BHQ1。
(2)用于试纸条检测的ssDNA 2-荧光生物素探针
在ssDNA序列两端分别标记FITC荧光基团和Biotin生物素基团，即可构成试纸条检测的ssDNA检测探针。其序列为：FITC-TTATT-Biotin。
实施例3：基于RPA-CRISPR-Cas12a系统的鹅源番鸭呼肠孤病毒试剂盒检测
所述试剂盒包括：特异性RPA引物对，gRNA，ssDNA 1-荧光淬灭探针，Cas12a蛋白，鹅源番鸭呼肠孤病毒质粒标准品，10×reaction buffer反应缓冲液；
所述特异性RPA引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；
所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述ssDNA 1-荧光淬灭探针为一端标记有荧光基团FAM和另一端标记有荧光淬灭基团BHQ1的单链DNA，其序列为：FAM-TTATT-BHQ1。
(1)RPA反应
使用RPA试剂盒对靶点基因进行扩增，按照表1的方案在冰盒上配制恒温扩增体系。将各反应物加到装有冻干酶粉颗粒的反应管中，充分混匀，置于37℃反应20min，产物于4℃保存备用。
表1：RPA反应体系
(2)基于荧光的CRISPR-Cas12a检测
参照表2在冰盒上配制CRISPR-Cas12a检测反应体系(ssDNA reporter选择实施例2中用于荧光检测的ssDNA 1-荧光淬灭探针)，按照反应条件：37℃孵育90分钟，每5分钟记录一次荧光信号，在罗氏LightCycler96实时荧光定量PCR仪上进行CRISPR-Cas12a荧光检测。
或37℃孵育40min后于凝胶成像系统下使用紫外灯观察荧光。
实施例4：基于RPA-CRISPR-Cas12a系统的鹅源番鸭呼肠孤病毒试纸条检测
(1)基于RPA-CRISPR-Cas12a系统检测试纸条的组成
检测试纸条包括：依次搭接的样品结合垫、硝酸纤维素膜(NC)和吸水纸，硝酸纤维素膜(NC)位于样品结合垫和吸水纸之间，硝酸纤维素膜(NC)上沿样品流动方向依次设有质控线(C)和检测线(T)，质控线上含有生物素-配体，检测线上包被有山羊抗兔IgG抗体，样品结合垫上负载有金纳米颗粒标记的兔抗异硫氰酸荧光素(FITC)的单克隆抗体。
试纸条的山羊抗兔IgG抗体以条带状固定在硝酸纤维素膜上(检测线)，当在样品结合垫滴加样品后，若样品中存在鹅源番鸭呼肠孤病毒时，gRNA与RPA扩增产物互补结合，激活Cas12a蛋白切割活性，对ssDNA 2-荧光生物素探针进行切割，在试纸层析作用下，向吸水纸方向迁移，当金纳米颗粒标记的兔抗异硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体与切割的荧光生物素探针FITC末端形成结合物，移动至固定的山羊抗兔IgG抗体区域时，结合物又与之发生特异性结合而被聚集在检测线上，最终形成一条红色沉淀线，可通过肉眼观察到显色结果。若样品中存在较少鹅源番鸭呼肠孤病毒时，金纳米颗粒标记的兔抗FITC的单克隆抗体、荧光生物素探针与生物素-配体结合，三者形成结合物，形成一条红色沉淀线；金纳米颗粒标记的兔抗FITC单克隆抗体与切割的荧光生物素探针FITC末端形成的结合物继续移动至山羊抗兔IgG抗体区域时，又与之发生特异性结合而被聚集在检测线上，最终在质控线和检测线处形成两条红色沉淀线，可通过肉眼观察到显色结果。
(2)基于RPA-CRISPR-Cas12a系统的试纸条检测
参照表2在冰盒上配制CRISPR-Cas12a检测反应体系(ssDNA reporter选择实施例2中用于试纸条检测的ssDNA 2-荧光生物素探针)，将配制好的CRISPR-Cas12a反应液置于37℃反应40min后，将得到的反应产物加至试纸条样品结合垫上，与试纸条孵育5min后对带有结果的试纸条进行结果判读。
表2：CRISPR-Cas12a检测反应体系
(3)试纸条检测结果判读标准:
如图4所示：若待测样品检测线位置出现红色条带或检测线和质控线位置均出现红色条带时，则表示待测样品感染G-MDRV；且当检测线出现红色条带而质控线位置未出现红色条带时，表明样品中G-MDRV含量高；
若待测样品检测线位置不出现红色条带，在质控线上出现红色条带，则表示待测样品未感染G-MDRV；
若待测样品检测线位置和质控线位置均未出现红色条带，则表示所用的试纸条或反应液可能已经损坏、失效或检测过程中操作有误。
实施例5：RPA-CRISPR-Cas12a系统的特异性测试
(1)毒株cDNA的提取
Ⅰ型鹅星状病毒(GAstV-1)、Ⅱ型鹅星状病毒(GAstV-2)、小鹅瘟病毒(GPV)、坦布苏病毒(TMUV)、H9N2亚型禽流感病毒(H9N2-AIV)均保存于本实验室。
使用RNA提取试剂盒提取上述病毒和G-MDRV的RNA，利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。
(2)毒株样品的特异性检测
将反转录的cDNA作为模板，参照实施例3和实施例4进行RPA-CRISPR-Cas12a系统核酸检测的特异性测试。
结果如图5A和5B所示，G-MDRV样品的荧光值随时间快速升高，且当反应40min时，G-MDRV与GAstV-1、GAstV-2、GPV、TMUV、H9N2-AIV有极显著差异(P＜0.001)；
结果如图5C所示，G-MDRV样品可在紫外光下激发较强荧光；
结果如图5D所示，只有检测G-MDRV样品的试纸条呈现阳性检测结果，其他试纸条均为阴性结果。
以上结果表明，本发明建立的检测G-MDRV方法具有很强的特异性，与其他病毒没有交叉反应。
实施例6：RPA-CRISPR-Cas12a系统的敏感性测试
1.制备靶标阳性质粒标准品
(1)合成靶点cDNA
采用RNA提取试剂盒提取HNPY毒株总RNA；利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。
(2)阳性G-MDRVσC质粒标准品的构建
设计G-MDRVσC基因的正向和反向引物，通过PCR扩增σC基因组，扩增产物经DNA凝胶提取试剂盒纯化后，按照经典的分子克隆操作方法，将其连接到pMD18-T载体上，随后将重组质粒pMD18-T-σC转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，测序筛选阳性克隆并使用质粒提取试剂盒提取质粒，利用DS-11分光光度计测量质粒浓度，根据公式copies/μL＝浓度(ng/μL)×(6.02×1023)/(DNA长度×660)计算pMD18-T-σC质粒标准品的拷贝数。
2.基于RPA-CRISPR-Cas12a系统进行敏感性检测的结果判读
以10倍梯度稀释的pMD18-T-ORF2标准品质粒(copies/μL)为模板，参照实施例3和实施例4进行RPA-CRISPR-Cas12a系统核酸检测的敏感性测试。
结果如图6A和6B所示，当反应40min时，101～106copies/μL组产生的荧光值与阴性对照相比有极显著差异(P＜0.001)。
结果如图6C所示，101～106copies/μL组可在紫外光下激发较强荧光；
结果如图6D所示，101～106copies/μL组的试纸条呈现阳性检测结果，其他试纸条均为阴性结果。
以上结果表明，本发明建立的检测G-MDRV方法最低检测限为100copies/μL。
实施例7：临床样品的RPA-CRISPR-Cas12a检测应用
分别使用本发明建立的RPA-CRISPR-Cas12a方法以及参照本实验室发表的ZhangShuai,Wang Xiaomeng,Diao Youxiang et al.Recombinant characteristics,pathogenicity,and transmissibility of a variant goose orthoreovirus derivedfrominter-lineage recombination.[J].Vet Microbiol,2023,277:109620.中记录的荧光定量PCR检测方法对35份疑似G-MDRV感染的鹅的泄殖腔拭子进行检测，检测结果如表3所示:
表3：四种方法检测检测G-MDRV临床样本的结果统计
其中，Fluorescence detection和UV light transilluminator采用本发明建立的基于RPA-CRISPR-Cas12a荧光试剂盒检测，Lateral flow strip采用本发明建立的基于RPA-CRISPR-Cas12a的试纸条检测，结果显示，使用RPA-CRISPR-Cas12a系统对鹅源番鸭呼肠孤病毒进行可视化检测与使用传统荧光定量PCR检测的结果相一致，因此基于RPA-CRISPR-Cas12a系统进行快速、灵敏、高特异性的鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测是可行的。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的引物-探针组合，其特征在于，所述引物-探针组合包括：特异性RPA引物对，gRNA，ssDNA检测探针；
所述特异性RPA引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；
所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述ssDNA检测探针为用于荧光检测的ssDNA 1-荧光淬灭探针或用于试纸条检测的ssDNA 2-荧光生物素探针。
2.根据权利要求1所述的一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的引物-探针组合，其特征在于，所述ssDNA 1-荧光淬灭探针为一端标记有荧光基团FAM和另一端标记有荧光淬灭基团BHQ1的单链DNA，所述ssDNA 2-荧光生物素探针为一端标记有荧光基团FITC和另一端标记有生物素基团Biotin的单链DNA。
3.根据权利要求2所述的引物-探针组合，其特征在于，所述单链DNA的核苷酸序列为：TTATT。
4.权利要求1-3任一项所述的引物-探针组合在制备检测鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测产品中的应用。
5.一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-3任一项所述的引物-探针组合。
6.根据权利要求5所述的一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：Cas蛋白，鹅源番鸭呼肠孤病毒质粒标准品，反应缓冲液。
7.根据权利要求6所述的一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的试剂盒，其特征在于，所述Cas蛋白为Cas12a蛋白；所述反应缓冲液为10×reaction buffer。
8.根据权利要求5所述的一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的试剂盒，其特征在于，所述鹅源番鸭呼肠孤病毒质粒标准品由如下方法制备而成：
采用SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示的特异性RPA引物对扩增鹅源番鸭呼肠孤病毒的基因组，得到扩增产物，将扩增产物连接到pMD18-T载体上，筛选阳性克隆并提取质粒DNA，即制备得到鹅源番鸭呼肠孤病毒质粒标准品。
9.权利要求5-8任一项所述的试剂盒在进行鹅源番鸭呼肠孤病毒流行病学调查中的应用。
10.一种对鹅源番鸭呼肠孤病毒进行可视化检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的RNA，反转录为cDNA；
(2)以(1)中获得的cDNA为模板，与特异性RPA引物对结合进行扩增反应，得到扩增产物；
(3)将扩增产物与含有Cas12a蛋白、gRNA的系统混合，并加入ssDNA检测探针进行反应；
(4)用可视化检测仪器或检测试纸条对反应产物进行检测观察，并对观察结果进行判读，若用可视化检测仪器检测反应产物时发出荧光信号或用检测试纸条检测反应产物时检测线位置出现红色条带或检测线和质控线位置均出现红色条带，则表明待测样品中存在鹅源番鸭呼肠孤病毒。
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