CN117867166A - 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大别山病毒的引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于RPA‑CRISPR/Cas12a检测大别山病毒的引物组及其应用。本发明设计检测大别山病毒的引物组，利用SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物，不依赖大型仪器，恒温条件进行DNA扩增，利用SEQ ID NO.3所示的Cas12a结合引物结合Cas12a酶，对扩增后的产物进行识别和切割，同时还会激活其切割非特性单链DNA(ssDNA)切割活性，并对非特异性单链DNA(即探针)进行切割，利用试纸条对切割后产物进行检测即可判断是否存在大别山病毒。本发明提供的引物组能同时保证检测的灵敏度与特异性，快速检测大别山病毒。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大别山病毒的引物组及其应用。
背景技术
大别山病毒(大别山汉坦病毒Dabieshan orthohantavirus，DBSV)是新型蜱传病毒，属于布尼亚病毒科、汉坦病毒属，因其与汉坦病毒(Hantan virus,HTNV)亲缘关系较近，最初被认为是汉坦病毒的一个亚型，于2015年被国际病毒分类委员会(ICTV)正式命名。近年来，新型蜱传病毒因其能诱发严重的人类疾病而受到了社会上的广泛关注。虽然DBSV对人类和动物的致病性尚不清楚，但DBSV可以进行跨物种传播，且DBSV与HTNV亲缘性较近，所以人们怀疑DBSV参与了人类的发热性疾病。因此，迫切需要建立分子生物学和血清学检测方法对蜱虫及人畜群体中DBSV的流行情况进行调查研究。目前针对大别山病毒检测技术主要有以下三种：
(1)聚合酶链式反应(PCR)技术：目前检测DBSV所使用的PCR方法包括普通PCR，巢式PCR，实时荧光定量PCR。但PCR技术在应用上仍有一定的局限。PCR作为目前的确诊手段，必须在具有复杂设备和专业操作的中心实验室中进行，然而这类诊断实验室通常远离病例所在地，在周转的过程中可能导致诊断结果延迟，这对于病毒的有效监测尤为不利。此外，由于许多样品中含有PCR反应抑制物，使得PCR检测中通常对样品前处理的要求比较严苛。
(2)环介导等温扩增(LAMP)技术：通过降低设备要求和加快检测过程，效率更高，操作更简单。未处理的样本并不会影响LAMP检测的灵敏性和特异性。虽然LAMP使用的酶较少，不需要预扩增连接过程，但容易导致非特异性扩增。
(3)链置换扩增(SDA)：SDA和LAMP一样，也容易污染引起非特异性扩增，而且SDA不适合扩增长度超过100bp的序列。
以上检测方法在对DBSV的检测进行检查时，无法满足现场对DBSV快速准确地检测。因此，如何快速灵敏且特异性的检测DBSV显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大别山病毒的引物组及其应用，快速灵敏且特异性的检测DBSV的引物组。
为了实现上述目的，本发明提供了一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大别山病毒的引物组，所述引物组包括上游引物、下游引物、Cas12a结合引物以及探针；
所述上游引物包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
所述下游引物包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述Cas12a结合引物包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
所述探针的5’端利用荧光标记修饰，3’端利用生物素修饰。
优选的，所述探针的核苷酸序列包括5’-TTATTATT-3’；所述荧光标记包括FAM或FITC。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物组在制备检测大别山病毒的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种检测大别山病毒的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组，还包括Cas12a酶、RNase抑制剂、逆转录酶、醋酸镁溶液和缓冲液中的一种或多种。
优选的，所述的上游引物的独立浓度为10μM；所述下游引物的独立浓度为10μM；所述Cas12a结合引物的独立浓度为1μM；所述探针的独立浓度为1.5μM。
本发明还提供了一种非诊断目的的检测大别山病毒的方法，包括如下步骤：
提取待测样品的基因组；
利用上述技术方案所述引物组中的上游引物和下游引物对所述基因组进行扩增反应，得到扩增产物；
将Cas12a酶、所述扩增产物和上述技术方案所述引物组中的Cas12a结合引物和探针混合，进行切割反应，得到RPA-CRISPR/Cas12a反应产物；
利用核酸检测试纸条检测所述RPA-CRISPR/Cas12a反应产物；
当核酸检测试纸条清晰显示测试线时即为阳性反应；仅显示质控线时为阴性反应。
优选的，所述扩增反应的条件为：37℃30min。
优选的，进行所述扩增反应时，以50μL的总体系计，在冻干酶管中加入PrimerFree Rehydration buffer 29.5μL、10μM上游引物2.4μL、10μM下游引物2.4μL、基因组1μL、280mM醋酸镁2.5μL和无酶ddH2O 11.2μL；
所述冻干酶管中包括结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶和逆转录酶。
优选的，所述切割反应的条件包括：37℃反应30min；
优选的，进行所述切割反应时，以50μL的总体系计，将1μM Cas12a酶1μL、1μMCas12a结合引物5μL、1.5μM探针5μL、扩增产物5μL、1×NE Buffer 5μL和余量的无菌无酶水混合。
有益效果：
本发明基于RPA-CRISPR/Cas12a设计检测大别山病毒的引物组，所述引物组包括上游引物、下游引物、Cas12a结合引物以及探针；所述上游引物包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述下游引物包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述Cas12a结合引物包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述探针的5’端利用荧光标记修饰，3’端利用生物素修饰。利用本发明提供的上游引物和下游引物可以不依赖大型仪器，在恒温条件进行DNA扩增，Cas12a结合引物结合Cas12a酶和对扩增后的产物进行识别和切割，同时还会激活其切割非特性单链DNA(ssDNA)切割活性，并对非特异性单链DNA(即探针)进行切割，利用蓝光照射或试纸条对切割后产物进行检测即可判断是否存在大别山病毒。本发明提供的引物组能同时保证检测的灵敏度与特异性，快速检测大别山病毒。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例2电泳检测结果；
图2为利用LF试纸条检测时阳性和阴性判断标准；
图3为以ddH2O为阴性样品(－)，对RPA-CRISPR/Cas12a反应产物(+)检测结果；
图4为实施例3灵敏性检测结果；
图5为实施例4特异性检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大别山病毒的引物组，所述引物组包括上游引物、下游引物、Cas12a结合引物以及探针；
所述上游引物包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
所述下游引物包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述Cas12a结合引物包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
所述探针的5’端利用荧光标记修饰，3’端利用生物素修饰。
在本发明中，所述探针的核苷酸序列优选包括5’-TTATTATT-3’；所述荧光标记优选包括FAM或FITC，进一步优选为FAM。
本发明SEQ ID NO.1～4所述的核苷酸序列具体如下：
SEQ ID NO.1：5’-CTGAAGGAGAGATCAATGCTTAGTTATGGA-3’；
SEQ ID NO.2：5’-GATAGGAACCACAAATGATGTCAGGTAAAC-3’；
SEQ ID NO.3：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUACUGUCCGCAAGCUUCAAGC-3’。
本发明基于大别山病毒核酸的基因序列(登录号：NC_038384.1)，选择设计上游引物和下游引物，无需依赖大型仪器，在恒温条件下进行DBSV核酸的扩增，能够特异性扩增含有Cas12a切割靶点的大别山病毒的核苷酸序列，之后利用Cas12a结合引物结合Cas12a酶，对扩增产物和探针进行切割后利用蓝光照射或试纸条进行检测，即可检测是否含有大别山病毒，实现大别山病毒的可视化检测，并且特异性好、灵敏性高、操作简单、耗时短。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物组在制备检测大别山病毒的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种检测大别山病毒的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组，还包括Cas12a酶、RNase抑制剂、逆转录酶、醋酸镁溶液和缓冲液冻干酶中的一种或多种。
在本发明中，所述的上游引物的独立浓度优选为10μM；所述下游引物的独立浓度优选为10μM；所述Cas12a结合引物的独立浓度优选为1μM；所述探针的独立浓度优选为1.5μM；所述醋酸镁溶液的独立浓度优选为280mM。
本发明还提供了一种非诊断目的的检测大别山病毒的方法，包括如下步骤：
提取待测样品的基因组；
利用上述技术方案所述引物组中的上游引物和下游引物对所述基因组进行扩增反应，得到扩增产物；
将Cas12a酶、所述扩增产物和上述技术方案所述引物组中的Cas12a结合引物和探针混合，进行切割反应，得到RPA-CRISPR/Cas12a反应产物；
利用核酸检测试纸条检测所述RPA-CRISPR/Cas12a反应产物；
当核酸检测试纸条清晰显示测试线时即为阳性反应；仅显示质控线时为阴性反应。
本发明提取待测样品的基因组。本发明对所述提取的方式没有严格要求，采用本领域常规方式即可。
得到所述基因组后，本发明以所述基因组为模板，利用上述技术方案所述引物组中的上游引物和下游引物对所述基因组进行扩增反应，得到扩增产物。
在本发明中，所述扩增反应的条件优选包括：37℃30min。本发明进行所述扩增反应时，优选以50μL的总体系计，在冻干酶管中加入Primer Free Rehydration buffer 29.5μL、10μM上游引物2.4μL、10μM下游引物2.4μL、基因组1μL、280mM醋酸镁2.5μL和余量的无酶ddH2O。本发明所述冻干酶管中优选包括结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶和逆转录酶。本发明所述扩增反应使用的试剂优选取自默瑞(上海)生物科技有限公司购入的TwistAmp DNA扩增试剂盒，产品货号TABASRT01KIT。
得到所述扩增产物后，本发明将Cas12a酶、所述扩增产物和上述技术方案所述引物组中的Cas12a结合引物和探针混合，进行切割反应，得到RPA-CRISPR/Cas12a反应产物。
在本发明中，所述切割反应的条件优选包括：37℃反应30min。本发明进行所述切割反应时，优选以50μL的总体系计，将1μM Cas12a酶1μL、1μM Cas12a结合引物5μL、1.5μM探针5μL、扩增产物5μL、1×NE Buffer 5μL和余量的无菌无酶水混合。本发明通过限定Cas12a酶、Cas12a结合引物、探针和扩增产物的体积比能够提高切割效果。本发明所述切割反应使用的试剂均优选取自深圳易致生物科技有限公司的CRISPR Cas12a DNA检测试剂盒，货号为D-F-CAS12-1S。
得到所述RPA-CRISPR/Cas12a反应产物后，本发明优选利用核酸检测试纸条检测所述RPA-CRISPR/Cas12a反应产物。
在本发明中，当核酸检测试纸条的测试线和质控线均产生带有颜色的条带，或只有测试线产生带有颜色的条带，则为阳性反应，即待测样品含有大别山病毒；当只有质控线产生带有颜色的条带，测试线处无颜色变化，则为阴性反应，即待测样品不含大别山病毒。
本发明用上游引物和下游引物扩增大别山病毒的核酸后再进行CRISPR/Cas12a的检测，检测结果可以通过蓝光照射或试纸条来判读，实现了大别山病毒的可视化、快速检测且不受特定实验仪器以及专业人员等方面的条件限制，并且不需要PCR扩增所需的温度循环过程，不受样品中非目标DNA的影响特异性好、灵敏性高，准确性和现场检测适用性高，对样品中抑制剂的抗性也较强，扩增时间短，非常适用于病原微生物的现场快速检测。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大别山病毒的引物组及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
基于大别山病毒核酸序列(登录号：NC_038384.1)选择Cas12a酶切割靶点，设计RPA引物、Cas12a结合引物(以下记为CrRNA)和探针(即单链报告分子)，具体序列信息如下表1。
表1用于大别山病毒检测的序列信息
以上序列送交生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中RPA引物扩增的目标产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为5’-CTGAAGGAGAGATCAATGCTTAGTTATGGAAACATTCTTGACCTAAACCACCTGGACATTGATGAACCAACAGGGCAGACTGCTGACTGGCTGAGCATCATTGTTTACCTGACATCATTTGTGGTTCCTATC-3’，全长132bp。
实施例2
1.提取大别山病毒的基因组，稀释至浓度为2.16×107copies/μL。
2.Rt-RPA反应
利用默瑞(上海)生物科技有限公司购入的TwistAmp DNA扩增试剂盒进行Rt-RPA反应，具体步骤如下：
(1)按表2配置RPA扩增反应体系(预混液)
表2 RPA扩增反应体系
(2)将步骤(1)预混液混匀后加入冻干酶管(含有能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)、链置换DNA聚合酶和逆转录酶)中，加入基因组，在管盖上加入醋酸镁，盖管后离心混匀，反应条件为：37℃、30min，得到扩增产物。
3.电泳检测
利用PCR产物回收纯化试剂盒，将步骤2得到的扩增产物分离纯化后，加入5μLLoading Buffer，进行琼脂糖凝胶电泳分离观测产物，结果如图1所示。根据图1可以看出，步骤2扩增产物存在特异性条带，并且位于100～200bp，与目标产物的大小一致。
4.切割反应
将4μL步骤2得到的扩增产物进行切割。具体步骤为：将1μL 1μM Cas12酶、5μL 1μMcrRNA、5μL 1×NE Buffer、5μL步骤2得到的任意一个扩增产物和5μL 1.5μM单链报告分子混合，加无菌无酶水补足至50μL，37℃进行反应30min，得到RPA-CRISPR/Cas12a反应产物。
5.LF试纸条检测
在利用LF试纸条检测RPA-CRISPR/Cas12a反应产物时，无论是否存在病毒，或者是否存在Cas12a酶切割靶点，扩增时，探针上的生物素均被胶体金包被链霉素亲和素截留在C线(即质控线)，呈现对照线颜色(图2中Negative)；病毒存在Cas12a酶切割靶点时，探针会被切割，被切割的探针含生物素标记的部分会先被截留在C线，带荧光标记的部分会继续往上流动，被对应的胶体金包被的抗体所截留在T线(即测试线)，因此，阳性出现T线和C线俩条线(图2中Positive)
基于上述原理，以ddH2O为阴性样品，按LF试纸条(Milenia HybriDetect 1kit,TwistDx)操作说明，对阴性样品和步骤6得到的RPA-CRISPR/Cas12a反应产物进行检测，结果如图3所示。
根据图3可以看出，步骤6得到的RPA-CRISPR/Cas12a反应产物在核酸检测试纸条测试线具有清晰的条带，为阳性反应；阴性样品仅在质控线有条带，为阴性样品。
实施例3
灵敏性实验
稀释实施例2大别山病毒的基因组，获得浓度为2.16×105、2.16×103和2.16×101copies/μL的检测物，以不同浓度的基因组为模板利用实施例2的方法进行检测，每个待检测物重复检测3次，检测结果如图4所示，其中1～3号为浓度为2.16×105copies/μL的检测物，4～6号为浓度为2.16×103copies/μL的检测物，7～9号为浓度为2.16×101copies/μL的检测物。
根据图4可以看出，LF试纸条在检测阳性检测物拷贝数为2.16×101copies/μL时为阳性。
实施例4
特异性实验
以新布尼亚病毒(SFTSV)、汉坦病毒(HV)、汉滩病毒(HTNV)、肾综合征出血热(HFRS)、蜱传脑炎病毒(TBEV)和普马拉病毒(PUUV)等病毒核酸为检测样品(依次编号为1～6)，ddH2O为阴性对照(编号为7)，大别山病毒(DBSV)为阳性对照(编号为8)。按照实施例2中的方法对不同的样品进行检测，结果如图5所示。
根据图5可以看出，仅DBSV的试纸条在测试线附近出现颜色条带，显示为阳性，其他未被检出。说明本方法特异性强，可准确检测，且与其他病原核酸无交叉反应。
根据上述内容可以看出，本发明提供的引物组可以特异性检测大别山病毒，并且灵敏度高，与常规的PCR等方案相比，无需借助实验室内大型仪器，耗时短，结果直观可见，整个检测过程在37℃～42℃，半小时内即可完成。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大别山病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物、下游引物、Cas12a结合引物以及探针；
所述上游引物包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
所述下游引物包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述Cas12a结合引物包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
所述探针的5’端利用荧光标记修饰，3’端利用生物素修饰。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述探针的核苷酸序列包括5’-TTATTATT-3’；所述荧光标记包括FAM或FITC。
3.权利要求1或2所述的引物组在制备检测大别山病毒的试剂盒中的应用。
4.一种检测大别山病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组，还包括Cas12a酶、逆转录酶、醋酸镁溶液和缓冲液中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的上游引物的独立浓度为10μM；所述下游引物的独立浓度为10μM；所述Cas12a结合引物的独立浓度为1μM；所述探针的独立浓度为1.5μM。
6.一种非诊断目的的检测大别山病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取待测样品的基因组；
利用权利要求1或2所述引物组中的上游引物和下游引物对所述基因组进行扩增反应，得到扩增产物；
将Cas12a酶、所述扩增产物和上述技术方案所述引物组中的Cas12a结合引物和探针混合，进行切割反应，得到RPA-CRISPR/Cas12a反应产物；
利用核酸检测试纸条检测所述RPA-CRISPR/Cas12a反应产物；
当核酸检测试纸条清晰显示测试线时即为阳性反应；仅显示质控线时为阴性反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增反应的条件为：37℃30min。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进行所述扩增反应时，以50μL的总体系计，在冻干酶管中加入Primer Free Rehydrationbuffer 29.5μL、10μM上游引物2.4μL、10μM下游引物2.4μL、基因组1μL、280mM醋酸镁2.5μL和无酶ddH2O 11.2μL；
所述冻干酶管中包括结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶和逆转录酶。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述切割反应的条件包括：37℃反应30min。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进行所述切割反应时，以50μL的总体系计，将1μM Cas12a酶1μL、1μM Cas12a结合引物5μL、1.5μM探针5μL、扩增产物5μL、1×NEBuffer 5μL和余量的无菌无酶水混合。
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