CN111647685A - 一种检测covid-19病毒的引物组、探针组和试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测covid-19病毒的引物组、探针组和试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测COVID‑19病毒的引物组，包括上游引物和下游引物，引物组对样本要求较低，扩增特异性强，大大提高了临床检测结果的灵敏度。本发明还公开了一种检测COVID‑19病毒的探针组，包括一号探针和二号探针，可分别与目标单链DNA通过碱基互补配对结合，并被磁珠捕获，可实现放大光学信号、定量检测的目的；本发明还公开了一种检测COVID‑19病毒的试剂盒，采用上述引物组和探针组，结合磁珠捕获和光学信号放大技术，具有高灵敏度、高特异性的特点，操作简单，成本低，可以广泛应用于基层医疗机构；上述试剂盒可用于检测COVID‑19病毒，检测结果稳定可靠，适用场景广泛，具有很大的市场前景。

Description

一种检测COVID-19病毒的引物组、探针组和试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种检测COVID-19病毒的引物组、探针组和试剂盒及其应用。
背景技术
新型冠状病毒于2020年1月12日由世界卫生组织命名为2019-nCoV，2020 年2月11日由世界卫生组织正式命名为COVID-19。复旦大学张永振教授领导科研团队破译其基因序列，并于网站上公开发表。石正丽团队发现2019-nCoV 全基因组与SARS-CoV的序列同源性达76％，通过对其保守的7个非结构蛋白进行对比，确认2019-nCoV和SARS-CoV同属于冠状病毒β属，病毒spike糖蛋白(S)通过与宿主细胞受体血管紧张素转化酶II(ACE-2)结合而侵入机体。冠状病毒作为一个大的病毒家族，是具外膜的单股正链RNA病毒；冠状病毒有包膜，包膜上存在棘突(spike)，不同冠状病毒的棘突有明显的差异。该病毒已知可引起感冒、中东呼吸综合征(MERS)及严重急性呼吸综合征(SARS)等，传染性大，危害严重。
目前常用的检测新冠病毒COVID-19的方法是实时荧光RT-PCR法和测序法，实时荧光RT-PCR方法检测新冠病毒COVID-19已经用在了临床，但是其对样本要求较高，存在假阴性的情况，也需要专业的PCR实验室才可以开展，对操作人员的技能要求较高，不利于大范围内推广。而基因测序的方法，需要专门的测序仪器，测序的时间周期较长，测序数据量大，也需要专业的生物信息分析人员对序列信息进行分析，成本较高，不利于临床应用。因此，新冠病毒 COVID-19的临床检测，迫切需要一种特异性高，灵敏度强、操作相对简单的低成本的试剂盒。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种检测COVID-19 病毒的引物组，对样本要求较低，扩增特异性强，大大提高了临床检测结果的灵敏度；
本发明的目的之二在于提供一种检测COVID-19病毒的探针组，探针的序列可与目标单链DNA形成互补配对结合，并被磁珠捕获，可实现放大光学信号、定量检测的目的；
本发明的目的之三在于提供一种检测COVID-19病毒的试剂盒，采用上述引物组和探针组，结合磁珠捕获和光学信号放大技术，具有高灵敏度、高特异性的特点，可以实现病毒的定量检测；成本低廉，也可以广泛应用于基层医疗机构；
本发明的目的之四在于提供一种上述试剂盒在检测COVID-19病毒上的应用，操作简单，成本低，检测结果稳定可靠，适用场景广泛，具有很大的市场前景。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种检测COVID-19病毒的引物组，包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述下游引物的5’端结合有Phos磷酸基团。
上述引物组是根据COVID-19病毒的特异性序列片段设计的，该序列片段的特异性可达99.9％以上，可大大提高临床检测结果的灵敏度。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种检测COVID-19病毒的探针组，包括一号探针和二号探针，所述一号探针和二号探针分别与目标单链DNA通过碱基互补配对结合；所述一号探针和二号探针的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述一号探针的3’端结合有生物素；所述二号探针的5’端结合有氨基。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
一种检测COVID-19病毒的试剂盒，包括：上述检测COVID-19病毒的引物组、上述检测COVID-19病毒的探针组、发光标记物、磁珠、清洗液、激发液。
优选地，所述引物组中的上游引物、下游引物的体积比为1:(10-30)。
进一步地，所述发光标记物用于标记探针组中的一号探针；所述发光标记物为吖啶酯。
所述清洗液包括：0.8-1.2vol.％的1M Tris溶液、0.8-1.2vol.％的5％土温-20，余量为超纯水；
所述激发液包括0.2M的NaOH、0.06％的过氧化氢；
所述磁珠上包被有羟基；所述磁珠的粒径为50nm-100um、密度为 1.05-3.38g/m3。磁珠上包被的羟基可以与二号探针上的氨基连接。
本发明的第四个目的可以通过采取如下技术方案达到：
检测COVID-19病毒的试剂盒在检测COVID-19病毒上的应用，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的RNA，经逆转录后，通过不对称PCR扩增制备目标单链DNA；
(2)将发光标记物与一号探针混合进行反应，制备发光标记物-一号探针复合物；将所述目标单链DNA与所述发光标记物-一号探针复合物混合，加入 Binding Buffer，50-60℃反应25-35min后，置于冰上冷却，得到一次杂交产物；
(3)将磁珠和结合有氨基的二号探针混合进行反应，得到磁珠-二号探针复合物；将所述一次杂交产物与所述磁珠-二号探针复合物混合，加入核酸连接酶， 50-60℃反应8-12min后，置于冰上冷却，得到二次杂交产物；
(4)清洗所述二次杂交产物，然后加入激发液，利用采集光信号的仪器捕获光信号强度。
进一步地，步骤(2)中，所述目标单链DNA与发光标记物-一号探针复合物的质量比为1：(2.8-10)；
步骤(3)中，所述一次杂交产物与磁珠-二号探针复合物的体积比为1： (2.1-11)。
进一步地，所述发光标记物-一号探针复合物是通过以下方法制备的：
1)取结合有生物素的一号探针溶于NaHCO3中，制成一号探针溶液；
2)取所述一号探针溶液与发光标记物溶液混合，室温下反应4-6h，然后用乙醇法纯化，即得发光标记物-一号探针复合物。
优选地，所述一号探针与所述发光标记物的质量比为1:(4-16)。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明的引物组是根据COVID-19病毒的特异性序列片段设计的，经过序列比对软件DNAman等比对后发现，引物片段所在的碱基序列的特异性可以达到99.9％以上，这大大提高了临床检测结果的灵敏度。
2、本发明设计了特异的探针组，能有效的与扩增后体系中的目标单链DNA 互补配对结合，结合光学信号放大技术和磁珠捕获技术，能够检测到体系中微量的目标片段，实现COVID-19病毒的定量检测，特异性高、灵敏度好。
3、本发明的检测COVID-19病毒的试剂盒，采用特异设计的引物组和探针组，具有高灵敏度、高特异性的特点。将引物组用于不对称RT-PCR扩增，可以获得大量的特异性目标单链DNA；然后利用探针组，结合磁珠捕获和光学信号放大技术，可以特异性的捕获目标单链DNA，再检测光信号强度，即可实现定量检测的目的。本发明试剂盒对技术人员的专业性要求低，操作简单，成本低廉，准确度高，检测结果稳定可靠，适用场景广泛，可以广泛应用于基层医疗机构，具有很大的市场前景。
附图说明
图1为实施例3中的不对称PCR产物琼脂糖电泳图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
一种检测COVID-19病毒的引物组，包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.1：5’-at ctcgttgact ttcaggttac-3’
SEQ ID NO.2：5’-tagaggtaac caacgagaag ta-3’
其中，下游引物的5’端结合有Phos磷酸基团。
本发明通过基因序列比对软件选择出能特异性地检测COVID-19病毒的靶序列，根据该段靶序列利用Primer 5软件设计PCR引物组，如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示。和常规引物相比，本发明引物片段所在的碱基序列(150bp左右)，是COVID-19病毒的特异性序列片段，经过序列比对软件DNAman等比对后发现，引物片段所在的碱基序列的特异性可以达到99.9％以上，这大大提高了临床检测结果的灵敏度。
本发明的引物组可用于制备COVID-19病毒的检测试剂或试剂盒。
一种检测COVID-19病毒的探针组，包括一号探针和二号探针，一号探针和二号探针分别与上述引物组扩增后的目标单链DNA通过碱基互补配对结合；一号探针和二号探针的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示：
SEQ ID NO.3：5’-ctcgttgact ttcaggttac tatagcagag at-3’
SEQ ID NO.4：5’-ctaactgaga ataaatattc tcaattagat ga-3’
其中，一号探针的3’端结合有生物素，二号探针的5’端结合有氨基。
一号探针通过3’端的生物素可以与发光标记物连接，二号探针的氨基可以与磁珠连接，实现捕获、信号放大的目的。
本发明的探针组可用于制备COVID-19病毒的检测试剂或试剂盒。
一种检测COVID-19病毒的试剂盒，包括：上述检测COVID-19病毒的引物组、上述检测COVID-19病毒的探针组、发光标记物、磁珠、清洗液、激发液。
其中，引物组的上游引物和下游引物的体积比为1:(10-30)。
发光标记物可以与一号探针中的生物素结合，用于标记探针组中的一号探针。作为进一步的优选方案，发光标记物为吖啶酯。吖啶酯是一类可用作化学发光标记物的化学物质，其发光原理是：在碱性过氧化氢溶液中，吖啶酯的分子受到过氧化氢离子进攻时，吖啶环上的取代基能与吖啶环上的C-9和过氧化氢形成不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷可分解为二氧化碳和电子激发态的N-甲基吖啶酮。
清洗液包括：1vol.％的1M Tris溶液、1vol.％的5％土温-20，余量为超纯水；
激发液包括0.2M的NaOH、0.06％的过氧化氢；
磁珠上包被有羟基，可以与二号探针上的氨基链接。磁珠的粒径为 50nm-100um、密度为1.05-3.38g/m3。
上述试剂盒在检测COVID-19病毒上的应用，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的RNA，经逆转录后，通过不对称PCR扩增制备目标单链DNA；
(2)将发光标记物与一号探针混合进行反应，制备发光标记物-一号探针复合物；将上述目标单链DNA与发光标记物-一号探针复合物混合，加入Binding Buffer，50-60℃反应25-35min后，置于冰上冷却，得到一次杂交产物；
(3)将磁珠和结合有氨基的二号探针混合进行反应，得到磁珠-二号探针复合物；将上述一次杂交产物与磁珠-二号探针复合物混合，加入核酸连接酶， 50-60℃反应8-12min后，置于冰上冷却，得到二次杂交产物；
(4)清洗得到的二次杂交产物，然后加入激发液，利用采集光信号的仪器捕获光信号强度。
其中，步骤(2)中，目标单链DNA与发光标记物-一号探针复合物的质量比为1：(2.8-10)；
步骤(3)中，一次杂交产物与磁珠-二号探针复合物的体积比为1：(2.1-11)。进一步地，发光标记物-一号探针复合物是通过以下方法制备的：
1)取结合有生物素的一号探针溶于NaHCO3中，制成一号探针溶液；
2)取一号探针溶液与发光标记物溶液混合，室温下反应4-6h，然后用乙醇法纯化，即得发光标记物标记的一号探针。
其中，一号探针与发光标记物的质量比为1:(4-16)。
实施例1
(1)发光标记物-一号探针复合物的制备：
1)选择吖啶酯作为发光标记物，吖啶酯溶液通过以下方法制备：
用1.58mL的DMSO溶解5mg吖啶酯，即得浓度是3.164mg/mL的吖啶酯母液，备用。将吖啶酯母液用DMSO稀释10倍，即得浓度为0.3164mg/mL的吖啶酯溶液。
2)一号探针溶液的制备：
取结合有生物素的一号探针，溶于0.1M的NaHCO3中，定容至90μl，即得一号探针溶液。
3)将步骤1)的吖啶酯溶液与步骤2)的一号探针溶液混合，控制吖啶酯与一号探针的质量比为(4-16):1，然后将混合液在室温下反应5小时，用乙醇法纯化后，即得吖啶酯标记的一号探针。
(2)磁珠-二号探针复合物的制备：将粒径为1-5μm、密度为1.5-2.5g/m3的羟基微型磁球与二号探针溶液混合，室温下温育一段时间，即得磁珠-二号探针复合物。
(3)激发液的配制：将终浓度为0.2M的NaOH、0.06％的过氧化氢混合均匀，即得激发液。
(4)清洗液的配制：取100μl的1M Tris溶液、100μl的5％土温-20，与9800μl 的超纯水混合均匀，即得清洗液。
实施例2
一种试剂盒，包括：PCR扩增反应体系、一号探针、二号探针、吖啶酯溶液、磁珠、清洗液、激发液。
一号探针为：5’-ctcgttgact ttcaggttac tatagcagag at-Biotin-3’
二号探针为：5’-NH2-ctaactgaga ataaatattc tcaattagat ga-3’；
其中，一号探针与吖啶酯溶液可通过实施例1记载的方法，制备成发光标记物-一号探针复合物；二号探针与磁珠可通过实施例1记载的方法，形成磁珠- 二号探针复合物。
PCR扩增反应体系包括：1.0μL 10×Buffer、0.2μLdNTPs、1.0μL 2U/μL的Taq 酶、0.1μL 1.25μmol/L的上游引物、1.0μL 1.25μmol/L的下游引物、模板等，ddH2O 补足至10μL；
上游引物为：5’-at ctcgttgact ttcaggttac-3’
下游引物为：Phos磷酸基团-5’-tagaggtaac caacgagaag ta-3’；
清洗液和激发液可通过实施例1记载的方法进行配制。
实施例3
采用实施例2的试剂盒检测COVID-19病毒，包括以下步骤：
(1)不对称PCR扩增
以经过测序确诊的COVID-19病毒感染患者的血清为样本，提取RNA，逆转录后进行不对称PCR扩增，得到目标单链DNA。
其中，PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火30s、 72℃延伸60s，进行40个循环，纯化得到PCR扩增产物。
采用15％的琼脂糖电泳检测PCR产物，结果如图1所示，在150bp左右处出现明显的条带。
(2)一次杂交反应
按照实施例1记载的方法，制备发光标记物-一号探针复合物，其中，发光标记物吖啶酯与一号探针的质量比为8:1；按照质量比1:6将步骤(1)得到的目标单链DNA与发光标记物-一号探针复合物混合，溶于0.1M的NaHCO3中，定容至90μL；加入Binding Buffer，55℃下反应30min后，置于冰上冷却5min，得到一次杂交产物。
(3)二次杂交反应
按照实施例1记载的方法，制备磁珠-二号探针复合物；取10μl步骤(2) 得到的一次杂交产物、30μl磁珠-二号探针复合物，加入核酸连接酶，补充ddH2O 至300μl，混合后于55℃反应10分钟，反应后置于冰上冷却5min，即得二次杂交产物。
(4)用100μl清洗液清洗二次杂交产物2次，清洗后，每个反应孔加入激发液100μl，在市面可购的普通化学发光检测机器上持续10s，检测光的总信号值。
实施例4
采用实施例3的检测方法，分别检测目标单链DNA含量为0-330ng时对应的光信号值，目标单链DNA含量和对应的检测光信号值如表1所示。
表1目标单链DNA含量及对应的光信号值
目标单链DNA(ng) 光信号值
0 47695
0.4 475585
0.8 709021
3.2 1351671
41.2 1638094
82.4 2995482
164.8 5875285
329.6 9423524
将表1中的光信号值和检测的目标单链DNA的量拟合一个标准曲线，得 Y＝27557X+670644，R2＝0.9816。该标准曲线为PCR后的目标单链DNA的量X 与光信号值Y的拟合，根据测得的光信号值可以算出PCR后的目标单链DNA 的量，进而可以进一步定量样本中目标RNA含量，实现COVID-19病毒的定量检测。
上述实施方式仅为本发明专利的优选实施方式，不能以此来限定本发明专利保护的范围，本领域的技术人员在本发明专利的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明专利所要求保护的范围。
序列表
<110> 广州中科抗体生物技术有限公司
<120> 一种检测COVID-19病毒的引物组、探针组和试剂盒及其应用
<130> 1
<141> 2020-05-19
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
atctcgttga ctttcaggtt ac 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
tagaggtaac caacgagaag ta 22
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
ctcgttgact ttcaggttac tatagcagag at 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
ctaactgaga ataaatattc tcaattagat ga 32

Claims (10)

1.一种检测COVID-19病毒的引物组，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的检测COVID-19病毒的引物组，其特征在于，所述下游引物的5’端结合有Phos磷酸基团。
3.一种检测COVID-19病毒的探针组，其特征在于，包括一号探针和二号探针，所述一号探针和二号探针分别与目标单链DNA通过碱基互补配对结合；所述一号探针和二号探针的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求3所述检测COVID-19病毒的探针组，其特征在于，所述一号探针的3’端结合有生物素；所述二号探针的5’端结合有氨基。
5.一种检测COVID-19病毒的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的检测COVID-19病毒的引物组、权利要求3或4所述的检测COVID-19病毒的探针组、发光标记物、磁珠、清洗液、激发液。
6.根据权利要求5所述的检测COVID-19病毒的试剂盒，其特征在于，所述引物组中的上游引物、下游引物的体积比为1:(10-30)。
7.根据权利要求5所述的检测COVID-19病毒的试剂盒，其特征在于，所述发光标记物用于标记探针组中的一号探针；所述发光标记物为吖啶酯。
8.根据权利要求5所述的检测COVID-19病毒的试剂盒，其特征在于，所述清洗液包括：0.8-1.2vol.％的1M Tris溶液、0.8-1.2vol.％的5％土温-20，余量为超纯水；所述激发液包括0.2M的NaOH、0.06％的过氧化氢；所述磁珠上包被有羟基；所述磁珠的粒径为50nm-100um、密度为1.05-3.38g/m3。
9.权利要求5所述的检测COVID-19病毒的试剂盒在检测COVID-19病毒上的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的RNA，经逆转录后，通过不对称PCR扩增制备目标单链DNA；
(2)将发光标记物与一号探针混合进行反应，制备发光标记物-一号探针复合物；将所述目标单链DNA与所述发光标记物-一号探针复合物混合，加入Binding Buffer，50-60℃反应25-35min后，置于冰上冷却，得到一次杂交产物；
(3)将磁珠与结合有氨基的二号探针混合进行反应，得到磁珠-二号探针复合物；将所述一次杂交产物与所述磁珠-二号探针复合物混合，加入核酸连接酶，50-60℃反应8-12min后，置于冰上冷却，得到二次杂交产物；
(4)清洗所述二次杂交产物，然后加入激发液，利用采集光信号的仪器捕获光信号强度。
10.根据权利要求9所述的检测COVID-19病毒的试剂盒在检测COVID-19病毒上的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述目标单链DNA与发光标记物-一号探针复合物的质量比为1:(2.8-10)；
步骤(3)中，所述一次杂交产物与磁珠-二号探针复合物的体积比为1：(2.1-11)。
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