CN112831600A - 一种检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测SARS‑CoV‑2病毒的引物探针组合及其应用，所述检测SARS‑CoV‑2病毒的引物探针组合特异性扩增并检测SARS‑CoV‑2病毒的ORF1ab基因、N基因或E基因中的任意一种或至少两种的组合。本发明还提供了一种基于微流控数字PCR的SARS‑CoV‑2病毒联合检测试剂盒及其使用方法。本发明所述检测SARS‑CoV‑2病毒的引物探针组合特异性好，灵敏度高，检测结果准确；所述基于微流控数字PCR的SARS‑CoV‑2病毒联合检测试剂盒检测耗时短，成本较低；操作简便，可用于定性检测和定量检测，应用价值极高。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及一种检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合及其应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)传染性强，潜伏期长，危害人们的身体健康，阻止社会的发展，造成了巨大的损失。目前，SARS-CoV-2病毒检测的方法主要有四种：测序法、qPCR法、胶体金法和磁微粒化学发光法。
测序可以检测微量物质，适用的体液类型较多。但测序检测需要配合使用测序的仪器，给临床的检测带来了困难，此外，对于测序结果进行分析也需要工作人员具备一定的生信基础，对操作人员的水平要求较高。qPCR法是目前应用最广的检测方法，但受采样部位、采样量、运输、储存及实验室检测条件和人员操作因素的影响，可能存在一定的误差，准确度有待进一步提高。胶体金法和磁微粒化学发光法都属于抗体检测，对病人IgM/IgG特异性抗体进行血清学检测，具有较高特异性。但由于检测的目标是患者血清中的抗体，而患者从感染病毒到体内生成抗体需要较长的时间，所以该方法通常只能检测出感染病毒时间较长的患者。SARS-CoV-2病毒携带者存在一定时间的潜伏期，对于潜伏期的患者，抗体法检测的效果不佳，而潜伏期患者同样具有传染性，不利于疫情的控制。
目前市面上也存在一些用于检测SARS-CoV-2病毒的相关试剂盒。CN211235890U公开了一种SARS-CoV-2检测试纸条、检测卡和检测试剂盒，包括依次相连的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，结合垫上包被有胶体金标记的SARS-CoV-2抗原，反应垫包括检测区和质控区，检测区设置有包被抗人IgA抗体的第一检测线、包被抗人IgG抗体的第二检测线以及包被抗人IgM抗体的第三检测线。该产品操作简单，使用方便，准确率高，特异性强，但由于该试剂盒对抗体进行检测，同样存在只能检测出感染时间较长的患者的弊端。
关于SARS-CoV-2病毒的检测，目前普遍存在对感染初期的患者的检测灵敏度较低、准确性较差的问题。如何提供一种SARS-CoV-2病毒的检测方法，可以增加检测的灵敏度，能够对感染初期的病人进行及时的诊断与治疗，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合及其应用，所述检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合特异性强，灵敏度高，检出所需的模板量较少，几种引物探针组合配合使用，可以提高检测的准确率；所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒使用简单，操作方便，应用价值极高。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合，所述检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合特异性扩增并检测SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因、N基因或E基因中的任意一种或至少两种的组合；
扩增所述ORF1ab基因的特异性引物对包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列，检测所述ORF1ab基因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
扩增所述N基因的特异性引物对包括SEQ ID No.4～5所示的核苷酸序列，检测所述N基因的探针包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
扩增所述E基因的特异性引物对包括SEQ ID No.7～8所示的核苷酸序列，检测所述E基因的探针包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。
本发明中，所述ORF1ab基因为编码SARS-CoV-2病毒的开放阅读框1ab(Openreading frame 1ab)的基因，N基因为核衣壳蛋白(Nucleoprotein)的编码基因，E基因为囊膜蛋白(Envelope protein)的编码基因，这三个基因的编码区为SARS-CoV-2病毒的高度保守序列，选取保守区域作为靶标区域进行检测，配合特异性扩增的引物及对应的探针，可以提高检测的准确性。
优选地，所述检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合中包括特异性扩增并检测SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因、N基因和E基因的特异性引物对和探针。
本发明中，将上述三种目标基因的扩增序列和探针混合进行联合检测时，检测效果最佳，不同基因的引物与探针之间不会互相影响，联合检测可以降低漏检的发生概率，提高了早期患者检测的准确率。
优选地，所述检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合包括SEQ ID No.1～9所述的核苷酸序列。
其中，SEQ ID No.1～9的核苷酸序列如下：
SEQ ID No.1：CATGTTGACACTGACTTAACAA；
SEQ ID No.2：CAATTTGGGTGGTATGTCTGAT；
SEQ ID No.3：AGAGTTTTAACCTCTCTTCCGTGAAG；
SEQ ID No.4：AGGGAGCCTTGAATACACC；
SEQ ID No.5：CTTGAGGAAGTTGTAGCACG；
SEQ ID No.6：CGCAATCCTGCTAACAATGCTG；
SEQ ID No.7：TCTTGCTTTCGTGGTATTCTT；
SEQ ID No.8：GCAGCAGTACGCACACA；
SEQ ID No.9：ACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG。
优选地，所述探针包括双标记探针、分子信标探针或能量传递荧光探针中的任意一种或至少两种的组合，优选为双标记探针。
优选地，所述探针包括荧光标记基团和荧光淬灭基团。
优选地，所述荧光标记基团包括FAM、Alexa Fluor 488、ATTO488、TET、JOE、VIC、Alexa Fluor 532、ATTO532、HEX、ROX、Alexa Fluor 594、ATTO594、TAMRA、CY3、CY3.5、CY5、Alexa Fluor 647、ATTO647、CY5.5、OregonGreenTM、CALRedTM、Red640、TexasRed、AlexaFluor 700或ATTO700中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是FAM、Alexa Fluor 488或CY3和Alexa Fluor 700的组合。
优选地，检测所述ORF1ab基因的探针包括荧光标记基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1。
优选地，检测所述N基因的探针包括荧光标记基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1。
优选地，检测所述E基因的探针包括荧光标记基团ROX和荧光淬灭基团BHQ2。
第二方面，本发明提供了一种基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒，所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒包括如第一方面所述的检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合。
本发明中，所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒包括了检测反应所需的全部试剂，使用方便，操作简单，对检测人员的技术水平要求较低；将核酸检测与微流控数字PCR技术相结合，为大量样本的大规模检测提供了条件，且试剂的使用量较少，节约了检测成本；通过添加阳性质控品和阴性质控品，可以全程监控提取和扩增的质量，检测结果更为准确，应用价值更高。
优选地，所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒还包括RT-dPCR反应液、RT-dPCR反应酶、阴性质控品、阳性质控品、密封油和数字PCR芯片。
优选地，所述RT-dPCR反应液包含三羟甲基氨基甲烷、镁离子、钾离子和dNTPs。
优选地，所述RT-dPCR反应酶包含反转录酶、DNA聚合酶和RNA酶抑制剂。
优选地，所述RT-dPCR反应酶还包含UNG酶。
优选地，所述阴性质控品包括生理盐水。
优选地，所述阳性质控品包括人工合成的含有SARS-CoV-2病毒目标片段基因的重组质粒和/或RNA假病毒。
优选地，所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒还包括内源性管家基因GAPDH的特异性引物对SEQ ID No.10～11及其探针SEQ ID No.12。
其中，SEQ ID No.10～12的核苷酸序列如下：
SEQ ID No.10：CGCAGGCCGGATGTG；
SEQ ID No.11：ATACGACCAAATCCGTTGACT；
SEQ ID No.12：TGCGGGCCGAGCCACATCG。
优选地，所述GAPDH基因的探针包括荧光标记基团Cy5和荧光淬灭基团BHQ3。
第三方面，本发明提供了一种如第二方面所述的基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：
对待测样本进行核酸提取，并以提取的核酸作为模板进行扩增；其中，所述扩增使用的引物探针组合为第一方面所述的检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合，而后检测，根据荧光信号判断待测样本的检测结果。
本发明中，所述SARS-CoV-2病毒的引物探针组合灵敏度高，特异性好，检测准确度高；所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒使用方便，操作简单，配合相应的使用方法，可用于大批量样本的快速检测，既可用于定性检测，又可进行定量检测，应用前景十分广阔。
优选地，所述扩增的程序包括：
反转录：
36～38℃孵育8～12min，孵育的温度例如可以是36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃，孵育的时间例如可以是8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min或12min；
UNG酶水解：
54～57℃孵育8～12min，孵育的温度例如可以是54℃、54.5℃、55℃、55.5℃、56℃、56.5℃或57℃，孵育的时间例如可以是8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min或12min；
预变性：
93～97℃孵育8～12min，孵育的温度例如可以是93℃、93.5℃、94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃、96.5℃或97℃，孵育的时间例如可以是8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min或12min；
变性：
93～97℃孵育15～30s，孵育的温度例如可以是93℃、93.5℃、94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃、96.5℃或97℃，孵育的时间例如可以是15s、16s、17s、18s、19s、20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s或30s；
退火和延伸：
58～62℃孵育20～60s，循环35～45次，孵育的温度例如可以是58℃、58.5℃、59℃、59.5℃、60℃、60.5℃、61℃、61.5℃或62℃，孵育的时间例如可以是20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、55s或60s，循环的次数例如可以是35次、36次、37次、38次、39次、40次、41次、42次、43次、44次或45次。
优选地，所述退火和延伸后还包括23～28℃保温的步骤，保温的温度例如可以是23℃、23.5℃、24℃、24.5℃、25℃、25.5℃、26℃、26.5℃、27℃、27.5℃或28℃。
优选地，所述判断的依据为：
FAM、HEX或ROX中的任意一通道或至少两通道的结果为阳性，且Cy5通道结果为阳性，则判定该样本含有SARS-CoV-2病毒；
FAM、HEX和ROX三通道的结果均为阴性，且Cy5通道结果为阳性，则判定该样本不含SARS-CoV-2病毒。
其中，根据扩增后有无阳性点判断通道结果为阳性或阴性；
所述扩增后阳性点数大于或等于1，则通道结果为阳性；
所述扩增后无阳性点，则通道结果为阴性。
优选地，若Cy5为阴性，则无论FAM、HEX或ROX通道的结果为何，均需要进行复检，若复检结果一致，则根据FAM、HEX和ROX三通道的结果进行判定。
作为优选技术方案，本发明所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：
(1)对待测样本和阴性质控品进行核酸提取；
(2)以提取的核酸作为模板进行PCR扩增，其中所述扩增使用的引物包括SEQ IDNo.1～2、SEQ ID No.4～5、SEQ ID No.7～8和SEQ ID No.10～11所示的核苷酸序列；
所述PCR扩增的程序包括：
反转录：36～38℃孵育8～12min；
UNG酶水解：54～57℃孵育8～12min；
预变性：93～97℃孵育8～12min；
变性：93～97℃孵育15～30s；
退火和延伸：58～62℃孵育20～60s，循环35～45次；
23～28℃保温；
(3)根据荧光信号进行判断：
所述判断的依据为：
FAM、HEX或ROX中的任意一通道或至少两通道的结果为阳性，且Cy5通道结果为阳性，则判定该样本含有SARS-CoV-2病毒；
FAM、HEX和ROX三通道的结果均为阴性，且Cy5通道结果为阳性，则判定该样本不含SARS-CoV-2病毒；
若Cy5为阴性，则无论FAM、HEX或ROX通道的结果为何，均需要进行复检，若复检结果一致，则根据FAM、HEX和ROX三通道的结果进行判定。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合选取SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因、N基因或E基因的保守区域作为靶标区域，配合相应的引物与探针，检测的准确性高，特异性好，灵敏度也很高，可检测出样本中较低量的病毒核酸；应用价值较高；
(2)本发明所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒试剂使用量较少，成本较低，既可用于定性检测，又可以实现定量检测，配合微流控数字PCR技术，可实现大批量样本的快速检测，并能够对样本中的病毒拷贝数进行计算，通过对样本中ORF1ab基因、N基因和E基因进行联合检测，提高了检测的准确性，且操作简单，对检测人员的水平要求较低，具有应用于临床检测中的潜能。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实验材料：
RT-dPCR反应液购自上海小海龟科技有限公司；
RT-dPCR反应酶购自上海小海龟科技有限公司；
阳性质控品为含有靶片段和内标片段的重组质粒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
密封油购自上海小海龟科技有限公司；
数字PCR芯片购自上海小海龟科技有限公司；
待测样本可以是患者的血清、唾液、漱口水、鼻/咽拭子核酸保存液，以下实施例中采用的是患者的咽拭子核酸保存液。
实施例1
本实施例提供一种检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合，所述检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合特异性扩增并检测SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因、N基因和E基因。
扩增所述ORF1ab基因的特异性引物对包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列，检测所述ORF1ab基因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
扩增所述N基因的特异性引物对包括SEQ ID No.4～5所示的核苷酸序列，检测所述N基因的探针包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
扩增所述E基因的特异性引物对包括SEQ ID No.7～8所示的核苷酸序列，检测所述E基因的探针包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.1：CATGTTGACACTGACTTAACAA；
SEQ ID No.2：CAATTTGGGTGGTATGTCTGAT；
SEQ ID No.3：AGAGTTTTAACCTCTCTTCCGTGAAG；
SEQ ID No.4：AGGGAGCCTTGAATACACC；
SEQ ID No.5：CTTGAGGAAGTTGTAGCACG；
SEQ ID No.6：CGCAATCCTGCTAACAATGCTG；
SEQ ID No.7：TCTTGCTTTCGTGGTATTCTT；
SEQ ID No.8：GCAGCAGTACGCACACA；
SEQ ID No.9：ACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG。
本发明选择SARS-CoV-2病毒的开放阅读框ORF1ab、核衣壳蛋白的编码基因和囊膜蛋白的编码基因中的保守区域作为检测区域，合成了相应的引物与探针，特异性好，灵敏度高；通过3组引物探针组合的配合使用，提高了检测的准确性，应用价值更高。
实施例2
本实施例提供一种基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒，所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒包括检测体系、RT-dPCR反应液、RT-dPCR反应酶、阴性质控品、阳性质控品、密封油和数字PCR芯片。
其中，所述检测体系包括ORF1ab基因的特异性引物对SEQ ID No.1～2及探针SEQID No.3、N基因的特异性引物对SEQ ID No.4～5及探针SEQ ID No.6、E基因的特异性引物对SEQ ID No.7～8及探针SEQ ID No.9、内源性管家基因GAPDH的特异性引物对SEQ IDNo.10～11及探针SEQ ID No.12；
SEQ ID No.10：CGCAGGCCGGATGTG；
SEQ ID No.11：ATACGACCAAATCCGTTGACT；
SEQ ID No.12：TGCGGGCCGAGCCACATCG。
所述引物的浓度均为0.5μmol/L，所述探针的浓度均为0.25μmol/L；
所述RT-dPCR反应液为三羟甲基氨基甲烷(浓度为50mmol/L，pH为8.0)、硫酸镁(浓度为2.5mmol/L)、氯化钾(75mmol/L)和dNTPs(dATPs、dUTPs、dGTPs和dCTPs的组合物，浓度为0.15mmol/L)的混合液；
所述RT-dPCR反应酶为反转录酶(浓度为5U/μL)、DNA聚合酶(浓度为10U/μL)、RNA酶抑制剂(浓度为5U/μL)和UNG酶(浓度为5U/μL)的混合液；
阴性质控品为生理盐水；
阳性质控品为人工合成的含有ORF1ab、N、E基因目的基因和内标片段的重组质粒。
本实施例所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒包括了SARS-CoV-2病毒检测所需的试剂，既可用于定性检测，又可用于定量检测，结合微流控数字PCR技术，可以实现大批量样本的同时检测，耗时较短，准确率较高，应用前景广阔。
实施例3
本实施例使用实施例2制备的基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒进行检测，具体包括以下步骤：
(1)对待测样本和阴性质控品进行核酸提取：
将200μL的液态样本与阴性质控品同时进行核酸提取，阳性质控品无需进行核酸提取，以提取的核酸作为模板进行后需的扩增及检测实验；
(2)以提取的核酸作为模板进行PCR扩增：
从试剂盒中取出5μL的检测体系、7μL RT-dPCR反应液和3μL RT-dPCR反应酶混合，随后分别加入步骤(1)提取的待测样本和阴性质控品的核酸和阳性质控品各20μL，混合；
(3)芯片进样：
将数字PCR芯片置于进样仪的芯片仓内，用吸头先吸取25μL密封油，再缓慢吸取30μL步骤(2)所得的混合液，将吸头插入进样仓的芯片塞中，开启芯片进样程序，完成芯片进样；
(4)PCR扩增：
将芯片置于核酸扩增仪的芯片槽内，进行PCR扩增，所述PCR扩增的方法为：
反转录：37℃孵育10min；
UNG酶水解：55℃孵育10min；
预变性：95℃孵育10min；
变性：95℃孵育20s；
退火和延伸：60℃孵育40s，循环45次；
25℃保温；
(5)根据荧光信号进行判断：
将反应后的芯片转移至生物芯片阅读仪上，生成检测报告，根据检测报告进行判断：
所述判断的依据为：
FAM、HEX或ROX中的任意一通道或至少两通道的结果为阳性，且Cy5通道结果为阳性，则判定该样本含有SARS-CoV-2病毒；
FAM、HEX和ROX三通道的结果均为阴性，且Cy5通道结果为阳性，则判定该样本不含SARS-CoV-2病毒；
其中，根据扩增后有无阳性点判断通道结果为阳性或阴性；
所述扩增后阳性点数大于等于1，则通道结果为阳性；
所述扩增后无阳性点，则通道结果为阴性。
若Cy5为阴性，则无论FAM、HEX或ROX通道的结果为何，均需要进行复检，若复检结果一致，则根据FAM、HEX和ROX三通道的结果进行判定。
本实施例对6个样本进行了检测，且各结果中GAPDH的检测通道Cy5均检测到荧光，即检测结果可靠，具体结果如表1所示。
表1
其中，“No”表示未检测到通道信号，“+”表示含有SARS-CoV-2病毒，“-”表示不含SARS-CoV-2病毒。
由表1可知，使用所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒使对样本进行检测，不仅可以进行定性检测，还可以通过qPCR扩增的Ct值计算出样本中病毒的浓度，实现定量检测，方便后续的数据统计及分析，操作简便，耗时较短，应用价值极高。
综上所述，本发明提供了一种检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合，通过对SARS-CoV-2病毒的多个保守基因进行联合检测，提高了检测的准确性；所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒包括了检测反应所需的全部试剂，试剂使用量少，检测成本较低；所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒的使用方法十分简便，容易操作，与微流控数字PCR技术配合使用，可实现大规模样本的快速检测，检测迅速，耗时较短，且即可定性检测，又可进行定量检测，应用价值极高。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 连云港市妇幼保健院（连云港市第三人民医院）
<120> 一种检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合及其应用
<130> 2020
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
catgttgaca ctgacttaac aa 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
caatttgggt ggtatgtctg at 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
agagttttaa cctctcttcc gtgaag 26
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
agggagcctt gaatacacc 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
cttgaggaag ttgtagcacg 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cgcaatcctg ctaacaatgc tg 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tcttgctttc gtggtattct t 21
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gcagcagtac gcacaca 17
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
actagccatc cttactgcgc ttcg 24
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
cgcaggccgg atgtg 15
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
atacgaccaa atccgttgac t 21
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
tgcgggccga gccacatcg 19
Claims (10)
1.一种检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合，其特征在于，所述检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合特异性扩增并检测SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因、N基因或E基因中的任意一种或至少两种的组合；
扩增所述ORF1ab基因的特异性引物对包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列，检测所述ORF1ab基因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
扩增所述N基因的特异性引物对包括SEQ ID No.4～5所示的核苷酸序列，检测所述N基因的探针包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
扩增所述E基因的特异性引物对包括SEQ ID No.7～8所示的核苷酸序列，检测所述E基因的探针包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合，其特征在于，所述检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合中包括特异性扩增并检测SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因、N基因和E基因的特异性引物对和探针；
优选地，所述检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合包括SEQ ID No.1～9所述的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合，其特征在于，所述探针包括双标记探针、分子信标探针或能量传递荧光探针中的任意一种或至少两种的组合，优选为双标记探针；
优选地，所述探针包括荧光标记基团和荧光淬灭基团；
优选地，所述荧光标记基团包括FAM、Alexa Fluor 488、ATTO488、TET、JOE、VIC、AlexaFluor 532、ATTO532、HEX、ROX、Alexa Fluor 594、ATTO594、TAMRA、CY3、CY3.5、CY5、AlexaFluor 647、ATTO647、CY5.5、OregonGreenTM、CALRedTM、Red640、TexasRed、Alexa Fluor700或ATTO700中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，检测所述ORF1ab基因的探针包括荧光标记基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；
优选地，检测所述N基因的探针包括荧光标记基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1；
优选地，检测所述E基因的探针包括荧光标记基团ROX和荧光淬灭基团BHQ2。
4.一种基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒包括如权利要求1～3任一项所述的检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合。
5.根据权利要求4所述的基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒还包括RT-dPCR反应液、RT-dPCR反应酶、阴性质控品、阳性质控品、密封油和数字PCR芯片；
优选地，所述RT-dPCR反应液包含三羟甲基氨基甲烷、镁离子、钾离子和dNTPs；
优选地，所述RT-dPCR反应酶包含反转录酶、DNA聚合酶和RNA酶抑制剂；
优选地，所述RT-dPCR反应酶还包含UNG酶；
优选地，所述阴性质控品包括生理盐水；
优选地，所述阳性质控品包括人工合成的含有SARS-CoV-2病毒目标片段基因的重组质粒和/或RNA假病毒。
6.根据权利要求4或5所述的基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒还包括内源性管家基因GAPDH的特异性引物对SEQ ID No.10～11及其探针SEQ ID No.12。
7.根据权利要求6所述的基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述GAPDH基因的探针包括荧光标记基团Cy5和荧光淬灭基团BHQ3。
8.一种如权利要求4～7任一项所述的基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括如下步骤：
对待测样本进行核酸提取，并以提取的核酸作为模板进行扩增；其中，所述扩增使用的引物探针组合为权利要求1～3任一项所述的检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合，而后检测，根据荧光信号判断待测样本的检测结果。
9.根据权利要求8所述的基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述扩增的程序包括：
反转录：36～38℃孵育8～12min；
UNG酶水解：54～57℃孵育8～12min；
预变性：93～97℃孵育8～12min；
变性：93～97℃孵育15～30s；
退火和延伸：58～62℃孵育20～60s，循环35～45次；
优选地，所述退火和延伸后还包括23～28℃保温的步骤；
优选地，所述判断的依据为：
FAM、HEX或ROX中的任意一通道或至少两通道的结果为阳性，且Cy5通道结果为阳性，则判定该样本含有SARS-CoV-2病毒；
FAM、HEX和ROX三通道的结果均为阴性，且Cy5通道结果为阳性，则判定该样本不含SARS-CoV-2病毒；
其中，根据扩增后有无阳性点判断通道结果为阳性或阴性；
所述扩增后阳性点数大于或等于1，则通道结果为阳性；
所述扩增后无阳性点，则通道结果为阴性。
10.根据权利要求8或9所述的基于微流控数字PCR的SARS-CoV-2病毒联合检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对待测样本和阴性质控品进行核酸提取；
(2)以提取的核酸作为模板进行PCR扩增，其中所述扩增使用的引物包括SEQ ID No.1～2、SEQ ID No.4～5、SEQ ID No.7～8和SEQ ID No.10～11所示的核苷酸序列；
所述PCR扩增的程序包括：
反转录：36～38℃孵育8～12min；
UNG酶水解：54～57℃孵育8～12min；
预变性：93～97℃孵育8～12min；
变性：93～97℃孵育15～30s；
退火和延伸：58～62℃孵育20～60s，循环35～45次；
23～28℃保温；
(3)根据荧光信号进行判断：
所述判断的依据为：
FAM、HEX或ROX中的任意一通道或至少两通道的结果为阳性，且Cy5通道结果为阳性，则判定该样本含有SARS-CoV-2病毒；
FAM、HEX和ROX三通道的结果均为阴性，且Cy5通道结果为阳性，则判定该样本不含SARS-CoV-2病毒。
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