CN114350849A - 检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒、方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，更具体地，涉及SARS‑CoV‑2的检测。本发明提供了一种用于检测SARS‑CoV‑2的组合物；同时，还提供了包括该组合物的试剂盒，所述组合物的用途，以及用于检测SARS‑CoV‑2的方法。本发明改善了SARS‑CoV‑2的核酸阳性检出率低的问题，对于疫情防控和确诊病患的治疗有积极的意义。

Description

检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒、方法及其用途
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域；具体地，涉及SARS-CoV-2的检测；更具体地，涉及SARS-CoV-2的三个基因靶标的检测。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV，SARS-CoV-2)，在2月11日国际病毒分类委员会将该病毒命名为SARS-CoV-2。冠状病毒是一个大型病毒家族，在此之前已知有6种可以感染到人类，如可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等。SARS-CoV-2是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，该病毒在分类学上属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)中的β类型冠状病毒，具有囊膜和刺突细胞学特征基因组为线性单股正链的RNA((+)ssRNA)病毒。
在目前《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中，SARS-CoV-2的核酸的检出仍是唯一确诊依据，在诊疗方案中了明确核酸检测的方式有两种：(1)实时荧光定量PCR(qPCR)检测核酸阳性；(2)病毒基因测序，测序结果与已知SARS-CoV-2高度同源。
病毒基因测序法虽然结果更为准确，但是其耗时长，成本高，很难大规模运用临床。
由于基因测序法存在上述限制，所以临床上，大部分的高疑待排患者都采取qPCR来进行检测。因为相对基因测序而言，qPCR方式具有速度快、可批量化、价格低等优势。
据报道，自从qPCR检测试剂大面积用于临床诊断以来，初次核酸阳性检出率只有30～50％；此外，更有医疗机构报道，个别病例在不同时间5次以上结果由阴性转为阳性；且在国内外网上爆出多个报道，WHO提供的引物探针存在特异性问题，美国CDC提供的检测试剂存在检测效果差的问题，还有康复出院后，再次发现SARS-CoV-2核酸检测转阳。除此之外，由于突变带来的基因组复杂性，使得检测结果更加难以准确得到。以上这些情况的发生为临床诊断和疾病控制带来极大困扰。
因此，本领域需求一种更为灵敏和准确检测SARS-CoV-2的qPCR相关产品。
发明内容
为解决以上问题，本发明人进行了大量分析和实验研究，发现针对SARS-CoV-2的基因组中N基因(Genbank登陆号：NC_045512.2)、ORF1ab基因(Genbank登陆号：NC_045512.2)上的两个特定区域以及E基因(Genbank登陆号：NC_045512.2)，来设计qPCR检测的扩增引物以及探针，能够有效地提高核酸阳性检出率，降低漏检率和弱阳性率，据此完成本发明。
上述所提及的特定区域分别为：
N基因：
ATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCG(SEQ ID NO:1)；以及
AACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGT(SEQ ID NO:2)。
ORF1ab基因：
ACAATTCACCTAATTTAGCATGGCCTCTTATTGTAACAGCTTTAAGGGCCAATTCTGCTGTCAAATTACAGAATAATGAGCTTAGTCCTGTTGCACTACGACAGATGTCTTGTGCTGCCGGTACTACACAAACTGCTTGCACTGATGACAATGCGTTAGCTTACTACAAC(SEQ ID NO:3)；以及
ACGGTGACATGGTACCACATATATCACGTCAACGTCTTACTAAATACACAATGGCAGACCTCGTCTATGCTTTAAGGCATTTTGATGAAGGTAATTGTGACACATTAAAAGAAATACTTGTCACATACAATTGTTGTGATGATGATTATTTCAATAAAAAGGACTGGTATGATTTTGTAGAAAACCCAGATATATTACGCGTATACGCCAACTTAG(SEQID NO:4)。
E基因：
ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAA(SEQ ID NO:5)。
因此，在第一方面，本发明提供了一种用于检测SARS-CoV-2的组合物，同时包括：
第一引物对，用于特异性地扩增SARS-CoV-2的N基因中如SEQ ID NO:1所示的区域；
第一探针，用于检测所述第一引物对的扩增产物；
第二引物对，用于特异性地扩增SARS-CoV-2的N基因中如SEQ ID NO:2所示的区域；
第二探针，用于检测所述第二引物对的扩增产物；
第三引物对，用于特异性地扩增ORF1ab基因中如SEQ ID NO:3所示的区域；
第三探针，用于检测所述第三引物对的扩增产物；
第四引物对，用于特异性地扩增ORF1ab基因中如SEQ ID NO:4所示的区域；
第四探针，用于检测所述第四引物对的扩增产物；
第五引物对，用于特异性地扩增E基因中如SEQ ID NO:5所示的区域；以及
第五探针，用于检测所述第五引物对的扩增产物。
在本发明中，所使用的引物和探针均用于qPCR。
通过对上述N基因、ORF1ab基因，以及E基因的特定区域同时进行检测，本发明的组合物提高了对SARS-CoV-2的核酸阳性检出率，降低了漏检率和弱阳性率，使得检测结果更为准确，对于疫情防控和确诊病患的治疗有积极的意义。
在本发明中，“特异性地扩增基因中如序列所示的区域”除了指序列所述的区域外，也包括序列所述的区域左右移动50～100bp范围内的区域。
例如特异性地扩增SARS-CoV-2的N基因中如SEQ ID NO:1所示的区域，也包括SEQID NO:1所示的区域左右移动50～100bp范围内的区域。
在一个具体的实施方案中，本发明的第一引物对和第一探针为：
N-1基因正向引物1：5’-GGTATTTCTACTACCTAGGAACT-3’(SEQ ID NO:6)；
N-1基因负向引物1：5’-CGATTGCAGCATTGTTAGCAGG-3’(SEQ ID NO:7)；和
N-1基因探针1：5’-GCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGC-3’(SEQ ID NO:8)。
在一个具体的实施方案中，本发明的第一引物对和第一探针为：
N-1基因正向引物2：ACCGAAGAGCTACCAGACGA(SEQ ID NO:9)；
N-1基因负向引物2：TGCAACCCATATGATGCCGT(SEQ ID NO:10)；和
N-1基因探针2：ACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAG(SEQ ID NO:11)。
在一个具体的实施方案中，本发明的第二引物对和第二探针为：
N-2基因正向引物1：5’-AACACAAGCTTTCGGCAGAC-3’(SEQ ID NO:12)；
N-2基因负向引物1：5’-ACCTGTGTAGGTCAACCACG-3’(SEQ ID NO:13)；和
N-2基因探针1：5’-CAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGC-3’(SEQ ID NO:14)。
在一个具体的实施方案中，本发明的第一引物对和第一探针为：
N-2基因正向引物2：CGTGGTCCAGAACAAACCCA(SEQ ID NO:15)；
N-2基因负向引物2：AATTGTGCAATTTGCGGCCA(SEQ ID NO:16)；和
N-2基因探针2：ATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAG(SEQ ID NO:17)。
在一个具体的实施方案中，本发明的第三引物对和第三探针为：
ORF1ab-1正向引物1：5’-ATTCACCTAATTTAGCATGGCCTC-3’(SEQ ID NO:18)；
ORF1ab-1负向引物1：5’-ACATCTGTCGTAGTGCAACAGGAC-3’(SEQ ID NO:19)；和
ORF1ab-1探针1：5’-TTGTAACAGCTTTAAGGGCCAATTCTGCTGT-3’(SEQ ID NO:20)。
在一个具体的实施方案中，本发明的第三引物对和第三探针为：
ORF1ab-1正向引物2：GGGCCAATTCTGCTGTCAAAT(SEQ ID NO:21)；
ORF1ab-1负向引物2：GTTTGTGTAGTACCGGCAGC(SEQ ID NO:22)；和
ORF1ab-1探针2：ATGAGCTTAGTCCTGTTGCACTACGAC(SEQ ID NO:23)。
在一个具体的实施方案中，本发明的第四引物对和第四探针为：
ORF1ab-2正向引物1：5’-ACGGTGACATGGTACCACAT-3’(SEQ ID NO:24)；
ORF1ab-2负向引物1：5’-CTAAGTTGGCGTATACGCGT-3’(SEQ ID NO:25)；和
ORF1ab-2探针1：5’-TACACAATGGCAGACCTCGTCTATGC-3’(SEQ ID NO:26)。
在一个具体的实施方案中，本发明的第四引物对和第四探针为：
ORF1ab-2正向引物2：ACACAATGGCAGACCTCGTC(SEQ ID NO:27)；
ORF1ab-2负向引物2：CAAAGCTTGGCGTACACGTT(SEQ ID NO:28)；和
ORF1ab-2探针2：CATTTTGATGAAGGTAATTGTGACACATTA(SEQ ID NO:29)。
在一个具体的实施方案中，本发明的第五引物对和第五探针为：
E基因正向引物1：5’-TAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCG-3’(SEQ ID NO:30)；
E基因负向引物1：5’-CACGAGAGTAAACGTAAAAAGAAGGT-3’(SEQ ID NO:31)；和
E基因探针1：5’-CTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGC-3’(SEQ ID NO:32)。
在一个具体的实施方案中，本发明的第五引物对和第五探针为：
E基因正向引物2：TTCGTTTCGGAAGAGACAGGT(SEQ ID NO:33)；
E基因负向引物2：GCGCAGTAAGGATGGCTAGT(SEQ ID NO:34)；和
E基因探针2：AGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTC(SEQ ID NO:35)。
上述的第一引物对和第一探针、第二引物对和第二探针、第三引物对和第三探针、第四引物对和第四探针，以及第五引物对和第五探针分别的具体引物对和探针序列可以相互组合，只要满足每种组合物包括第一引物对和第一探针、第二引物对和第二探针、第三引物对和第三探针、第四引物对和第四探针，以及第五引物对和第五探针即可。
在一个示例性的实施方案中，本发明提供了第一组合物，包括：
第一引物对和第一探针：SEQ ID NO:6～8；
第二引物对和第二探针：SEQ ID NO:12～14；
第三引物对和第三探针：SEQ ID NO:18～20；
第四引物对和第四探针：SEQ ID NO:24～26；
第五引物对和第五探针：SEQ ID NO:30～32。
在另一个示例性的实施方案中，本发明提供了第二组合物，包括：
第一引物对和第一探针：SEQ ID NO:9～11；
第二引物对和第二探针：SEQ ID NO:12～14；
第三引物对和第三探针：SEQ ID NO:18～20；
第四引物对和第四探针：SEQ ID NO:27～29；
第五引物对和第五探针：SEQ ID NO:30～32。
在又一个示例性的实施方案中，本发明提供了第三组合物，包括：
第一引物对和第一探针：SEQ ID NO:6～8；
第二引物对和第二探针：SEQ ID NO:15～17；
第三引物对和第三探针：SEQ ID NO:18～20；
第四引物对和第四探针：SEQ ID NO:24～26；
第五引物对和第五探针：SEQ ID NO:30～32。
在再一个示例性的实施方案中，本发明提供了第四组合物，包括：
第一引物对和第一探针：SEQ ID NO:6～8；
第二引物对和第二探针：SEQ ID NO:12～14；
第三引物对和第三探针：SEQ ID NO:21～23；
第四引物对和第四探针：SEQ ID NO:24～26；
第五引物对和第五探针：SEQ ID NO:30～32。
在一个示例性的实施方案中，本发明提供了第五组合物，包括：
第一引物对和第一探针：SEQ ID NO:6～8；
第二引物对和第二探针：SEQ ID NO:12～14；
第三引物对和第三探针：SEQ ID NO:18～20；
第四引物对和第四探针：SEQ ID NO:27～29；
第五引物对和第五探针：SEQ ID NO:30～32。
在一个示例性的实施方案中，本发明提供了第六组合物，包括：
第一引物对和第一探针：SEQ ID NO:6～8；
第二引物对和第二探针：SEQ ID NO:12～14；
第三引物对和第三探针：SEQ ID NO:18～20；
第四引物对和第四探针：SEQ ID NO:27～29；
第五引物对和第五探针：SEQ ID NO:33～35。
在一个示例性的实施方案中，本发明提供了第七组合物，包括：
第一引物对和第一探针：SEQ ID NO:9～11；
第二引物对和第二探针：SEQ ID NO:15～17；
第三引物对和第三探针：SEQ ID NO:18～20；
第四引物对和第四探针：SEQ ID NO:27～29；
第五引物对和第五探针：SEQ ID NO:33～35。
通过采用如上所示的组合物，本发明使得SARS-CoV-2的核酸检测的阳性率更高，漏检率和弱阳性率更低，同时能够以更高的灵敏度检测SARS-CoV-2，对于疫情防控和确诊病患的治疗有积极的意义。
在一个具体的实施方案中，本发明组合物还包括可以进一步实施巢式PCR的引物对。
进一步地，所述组合物中，第一、第二探针、第三、第四探针，和第五探针带有彼此不互相干扰的荧光报告基团。也就是说检测三个靶标基因之间的探针带有彼此不互相干扰的荧光报告基团。
在本文中，“彼此不互相干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光报告基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
在本发明中，荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，第一、第二探针的荧光报告基团为ROX；第三探针和第四探针的荧光报告基团为FAM；第五探针为HEX。
进一步地，探针的3’末端还具有猝灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
进一步地，探针中间还具有第二个猝灭基团。
通过添加第二个猝灭基团可以降低本底，进一步提高灵敏度。
进一步地，所述组合物包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。
其中，内标基因为RNaseP基因(Genbank登陆号：U77665.1)。优选地，内标上下游引物特异性扩增以下序列：
GAATTCGGCACGAGGTGGGACTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAGTTGTTGCTATCAATCATATCGTTGACTTTAAGGAAAAGAAACAGGAAATTGAAAAACCAGTAGCTGTTTCTGAACTCTTCACAACTTTGCCAATTGTACAGGGAAAATCAAGACCAATTAAAATTTTAACTAGATTAACAATTATTGTC(SEQ ID NO:36)或者
ATGTCTAGAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGGAACTCCAGCAGGACCATGAATGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTAAGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCC(SEQ ID NO:37)。
在一个具体的实施方案中，所述组合物包括：
内标引物对，用于特异性扩增如SEQ ID NO:36或37所示RNaseP基因的区域；
内标探针，用于检测所述内标引物对的扩增产物。
在一个具体的实施方案中，所述组合物包括：
内标引物对，用于特异性扩增如SEQ ID NO:36和37所示RNaseP基因的区域；
内标探针，用于检测所述内标引物对的扩增产物。
在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括：
内标上游引物1：5’-GAGGTGGGACTTCAGCATGGC-3’(SEQ ID NO:38)；
内标下游引物1：5’-TGTTTCTTTTCCTTAAAGTCAAC-3’(SEQ ID NO:39)；
内标探针1：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGA-3’(SEQ ID NO:40)。
在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括：
内标上游引物2：5’-GAACTCCAGCAGGACCATG-3’(SEQ ID NO:41)；
内标下游引物2：5’-GACCACTACCAGCAGAACAC-3’(SEQ ID NO:42)；
内标探针2：5’-TGCTCAGGGCGGACTGGGTGCT-3’(SEQ ID NO:43)。
在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括：
内标上游引物1：5’-GAGGTGGGACTTCAGCATGGC-3’(SEQ ID NO:38)；
内标下游引物1：5’-TGTTTCTTTTCCTTAAAGTCAAC-3’(SEQ ID NO:39)；
内标探针1：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGA-3’(SEQ ID NO:40)；以及
内标上游引物2：5’-GAACTCCAGCAGGACCATG-3’(SEQ ID NO:41)；
内标下游引物2：5’-GACCACTACCAGCAGAACAC-3’(SEQ ID NO:42)；
内标探针2：5’-TGCTCAGGGCGGACTGGGTGCT-3’(SEQ ID NO:43)
进一步地，所述第一、第二探针，第三、第四探针，第五探针，与内标探针带有彼此不互相干扰的荧光报告基团。
进一步地，所述内标探针的荧光报告基团为HEX。
进一步地，所述组合物中引物的用量为10～300μM；所述组合物中探针的用量为10～300μM。
在一些的实施方案中，本发明的组合物存在于同一包装中。
在另一些的实施方案中，本发明的第一引物对和第一探针、第二引物对和第二探针、第三引物对和第三探针、第四引物对和第四探针以及、第五引物对和第五探针，分别存在于单独的包装中。
在又一些实施方案中，本发明的第一引物对和第一探针及第二引物对和第二探针存在于一个包装中；而第三引物对和第三探针及第四引物对和第四探针存在于另一个包装中；而第五引物对和第五探针存在于又一个包装中。
在另一些的实施方案中，本发明的第一引物对和第一探针、第二引物对和第二探针、第三引物对和第三探针、第四引物对和第四探针以及、第五引物对和第五探针，和内标引物对和内标探针，分别存在于单独的包装中。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测SARS-CoV-2的试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供了一种检测SARS-CoV-2的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放体系和核酸扩增体系。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、核酸提取试剂、逆转录酶以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、逆转录酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/μL～15U/μL，例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶(MMLV)或者Tth酶；所述DNA聚合酶的浓度为3U/μL～15U/μL，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：反/逆转录酶、Taq酶、Mg2+、Mn2+、Rnasin、dNTP、引物、探针和PCR缓冲液。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20-200μl。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
第四方面，提供了一种用于检测SARS-CoV-2的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间3～15分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间5～30秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～15秒，退火，温度为60℃，时间为10～30秒，35～45次循环。
在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测SARS-CoV-2的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
逆转录，温度为50℃～60℃，时间3～15分钟，1次循环；cDNA预变性，温度为95℃，时间5～30秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～15秒，退火，温度为60℃，时间为10～30秒，35～45次循环。
在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染SARS-CoV-2并罹患肺炎的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中检测是否有SARS-CoV-2。
附图说明
图1为本发明组合物的第一组合物检测SARS-CoV-2的检测结果图；
图2为本发明组合物的第二组合物检测SARS-CoV-2的检测结果图；
图3为本发明组合物的第三组合物检测SARS-CoV-2的检测结果图；
图4为本发明组合物的第四组合物检测SARS-CoV-2的检测结果图；
图5为本发明组合物的第五组合物检测SARS-CoV-2的检测结果图；
图6为本发明组合物的第六组合物检测SARS-CoV-2的检测结果图；
图7为本发明组合物的第七组合物检测SARS-CoV-2的检测结果图；
图8为本发明组合物与ORF1ab单引物探针组合物的检测效果对比；
图9为本发明组合物与N基因单引物探针组合物的检测效果对比；
图10为本发明组合物与干扰物质的检测结果；
图11为本发明组合物的特异性检测结果；
图12～14为本发明组合物的灵敏度检测结果(200拷贝、100拷贝和50拷贝/mL).
具体实施方式
在本发明中，表述“第一”、“第二”、“第三”、“第四”和“第五”等仅用于描述目的，用以区分所限定的物质，而不以任何方式限定次序或主次。
针对本发明提供的目标区域(例如，SEQ ID NO:1所示的区域、SEQ ID NO:2所示的区域、SEQ ID NO:3所示的区域、SEQ ID NO:4所示的区域、SEQ ID NO:5所示的区域等)，可以设计特异性扩增引物和相应的检测探针。例如，可采用以下方式来进行。
对于荧光定量PCR引物，通常遵从以下原则：1、引物应在区域内设计并具有特异性；2、扩增产物长度在80～150bp，最长不要超过300bp；3、产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)；4、引物长度：一般在17～25碱基之间，上下游引物不宜相差太大；5、引物自身不能有连续4个碱基的互补，避免形成发卡结构；6、引物之间不能有连续4个碱基的互补，避免形成引物二聚体；7、引物G+C含量在40％～60％之间，45～55％最好；引物中碱基要随机分布，尽量均匀；8、引物Tm值在58～62度之间。
根据上述原则，针对本发明提供的目标区域，可以设计出例如包括但不限于如SEQID NO:6～7、9～10、12～13、15～16、18～19、21～22、24～25、27～28、30～31、和33～34所示的引物。
对于荧光定量PCR探针，通常遵从以下原则：1、先设计探针，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针；2、探针的Tm值应在68～70之间，如果是目测探针，则要仔细审查GC富含区；3、选择C多于G的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；4、探针应尽可能的短，一般不要超过30个bp；5、检测探针的DNA折叠和二级结构。
根据上述原则，针对本发明提供的目标区域，可以设计出例如包括但不限于如SEQID NO:8、11、14、17、20、23、26、29、32和35所示的探针。
可以使用常见的引物和探针设计软件，如Primer Express、Primer Premier、Oligo、Omiga等，来辅助进行设计。根据本发明所提供的特定扩增区域，本领域技术人员可以在上述原则的引导下并使用这些软件进行辅助完成探针和引物的设计。
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下所示：
第一组合物，包括：
第一引物对和第一探针：SEQ ID NO:6～8；
第二引物对和第二探针：SEQ ID NO:12～14；
第三引物对和第三探针：SEQ ID NO:18～20；
第四引物对和第四探针：SEQ ID NO:24～26；
第五引物对和第五探针：SEQ ID NO:30～32。
第二组合物，包括：
第一引物对和第一探针：SEQ ID NO:9～11；
第二引物对和第二探针：SEQ ID NO:12～14；
第三引物对和第三探针：SEQ ID NO:18～20；
第四引物对和第四探针：SEQ ID NO:27～29；
第五引物对和第五探针：SEQ ID NO:30～32。
第三组合物，包括：
第一引物对和第一探针：SEQ ID NO:6～8；
第二引物对和第二探针：SEQ ID NO:15～17；
第三引物对和第三探针：SEQ ID NO:18～20；
第四引物对和第四探针：SEQ ID NO:24～26；
第五引物对和第五探针：SEQ ID NO:30～32。
第四组合物，包括：
第一引物对和第一探针：SEQ ID NO:6～8；
第二引物对和第二探针：SEQ ID NO:12～14；
第三引物对和第三探针：SEQ ID NO:21～23；
第四引物对和第四探针：SEQ ID NO:24～26；
第五引物对和第五探针：SEQ ID NO:30～32。
第五组合物，包括：
第一引物对和第一探针：SEQ ID NO:6～8；
第二引物对和第二探针：SEQ ID NO:12～14；
第三引物对和第三探针：SEQ ID NO:18～20；
第四引物对和第四探针：SEQ ID NO:27～29；
第五引物对和第五探针：SEQ ID NO:30～32。
第六组合物，包括：
第一引物对和第一探针：SEQ ID NO:6～8；
第二引物对和第二探针：SEQ ID NO:12～14；
第三引物对和第三探针：SEQ ID NO:18～20；
第四引物对和第四探针：SEQ ID NO:27～29；
第五引物对和第五探针：SEQ ID NO:33～35。
第七组合物，包括：
第一引物对和第一探针：SEQ ID NO:9～11；
第二引物对和第二探针：SEQ ID NO:15～17；
第三引物对和第三探针：SEQ ID NO:18～20；
第四引物对和第四探针：SEQ ID NO:27～29；
第五引物对和第五探针：SEQ ID NO:33～35。
并且其中，第一探针的荧光报告基团为ROX；第二探针和第三探针的荧光报告基团为ROX和FAM，第四探针和第五探针为FAM和HEX，内标探针的荧光报告基团为CY5。探针的3’末端和中间均具有猝灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
实施例2、检测SARS-CoV-2的方法
本发明检测样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液。进行如下操作：
(1)使用圣湘生物核酸提取或纯化试剂S10016E，取300μL样本按照说明书操作。
(2)按每种反应液24μL和混合酶6μL的比例，取相应量的反应液和混合酶混匀，以每反应30μL的体积分装至各反应管。分别向各反应管中加入待检测的核酸样本20μL，然后盖上PCR管盖，瞬时离心后放置于实时荧光PCR仪器中。
(3)按以下循环条件进行反应和检测(荧光采集选取FAM通道、ROX通道、HEX通道以及CY5通道)：
Figure BDA0003424911260000161
Figure BDA0003424911260000171
反应结束后自动保存结果，对检测靶标以及内标的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线)，点击Analyze进行分析，使各项参数符合下述“质量控制”中的要求，然后到Plate窗口下记录定性结果。
(4)质量控制
阴性对照：FAM、HEX/VIC、ROX、CY5通道均无Ct值或Ct＞40；
阳性对照：FAM、HEX/VIC、ROX、CY5通道均Ct≤35；
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
(5)结果解释
先分析内标是否有扩增曲线，且Ct≤35，若有，表示本次检测有效，可继续进行后续分析:
Figure BDA0003424911260000172
Figure BDA0003424911260000181
根据上述3个通道的检测结果，判断结果如下：
Figure BDA0003424911260000182
若在内标通道没有检测到Ct或Ct＞40，表示本次检测样本细胞含量太低或者有干扰物质抑制反应，该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本重新采样，进行重复试验
实施例3、本发明组合物用于检测SARS-CoV-2
将本发明实施例1中的第一组合物至第七组合物按照实施例2所述的方法对新型冠状病毒的质控品进行检测，实验重复两次，结果如图1～7所示。
从图1～7可以看出，各扩增曲线挺拔，Ct值符合条件，表明本发明的各种组合物能够检测SARS-CoV-2。
实施例4、本发明组合物与ORF1ab单引物探针组合物的检测效果对比
将本发明实施例1中的组合物按照实施例2所述的方法对新型冠状病毒的质控品进行检测，同时使用ORF1ab单引物探针组合物作为对照，结果如图8所示。从图中可以看出，相比单引物探针组合物，本发明组合物的Ct值更为靠前，避免了弱阳性的出现，提高了检测的准确性。
实施例5、本发明组合物与N基因单引物探针组合物的检测效果对比
将本发明实施例1中的组合物按照实施例2所述的方法对新型冠状病毒的质控品进行检测，同时使用ORF1ab单引物探针组合物作为对照，结果如图9所示。从图中可以看出，相比单引物探针组合物，本发明组合物的Ct值更为靠前，避免了弱阳性的出现，提高了检测的准确性。
实施例6、本发明组合物的抗干扰测试
使用本发明实施例1中所述的第一组合物，按照实施例2所述的方法对具有干扰物质(100μg/mL盐酸羟甲唑啉、50μg/mL地塞米松、50μg/mL盐酸头孢甲肟、100μg/mL奥司他韦、100μg/mL扎那米韦、100μg/mL利巴韦林、100μg/mL阿奇霉素、300U/mLα-干扰素、320μg/mL布地奈德、125μg/mL苯福林、100μg/mL妥布霉素、50μg/mL倍氯美松、100μg/mL氟尼缩松、100μg/mL莫米松、200μg/mL氟替卡松、200μg/mL盐酸组胺、100μg/mL帕拉米韦、100μg/mL洛匹那韦、100μg/mL莫匹罗星、100μg/mL曲安奈德、100μg/mL利托那韦、100μg/mL阿比多尔、60μg/mL氯化钠、100μg/mL尿素、10μg/mL血红素、20μg/mL纯化粘蛋白、20％(v/v)无水乙醇、5％(v/v)人全血)的新型冠状病毒样本进行验证。
经过测试验证，干扰物质对试剂盒的检测结果无明显干扰。实验结果如图10所示，从图中可以看出均未出现干扰。
实施例7、本发明组合物的特异性验证
本发明的第一组合物与冠状病毒(NL63，HKU1，229E，OC43)、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒Yamagata型、Victoria型、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、呼吸道合胞病毒A、B型、鼻病毒A、B、C型、腺病毒1、2、3、4、5、7、55型、副流感病毒1、2、3型、肠病毒A、B型、肠病毒C型(EV-C95)、肠病毒D型(EV-D70)、偏肺病毒、人间质肺病毒、新生隐球菌、化脓性性链球菌、鲍曼不动杆菌、肺孢子虫、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎衣原体、EB病毒、人巨细胞病毒、烟曲霉、白色念球菌、光滑念珠菌、结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、诺如病毒、轮状病毒、水痘-带状疱疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人类基因组DNA等阳性样本检测，结果如图11所示，表明无交叉反应。
下表1中列出了一些具体的例子的检测结果。
表1
Figure BDA0003424911260000201
Figure BDA0003424911260000211
实施例8、本发明组合物的精密度验证
本实验将SARS-CoV-2阳性样本稀释至中浓度阳性、临界浓度阳性，加上SARS-CoV-2阴性样本作为待测样本进行批内不精密度的测定。
20个精密度样品用质检合格的新型冠状病毒检测试剂盒(其包含本发明的第一组合物)在同一台SLAN 96P仪器上检测，分析阳性检出率、阴性检出率，考察试剂盒的精密度性能，其结果如下表2所示，结果表明本发明的组合物的检测结果在每批间的结果是一致的，反映了良好的精密度。
表2、试剂批内不精密度检测结果Ct值统计
Figure BDA0003424911260000221
Figure BDA0003424911260000231
实施例9、本发明组合物的灵敏度验证
将含有新冠病毒全长的序列定值后稀释至200拷贝/ml、100拷贝/ml以及50拷贝/ml，用使用本发明实施例1中所述的第一组合物，按照实施例2所述的方法进行检测，结果如下图12～14所示。结果表明对低至50拷贝/mL的样本仍然能够准确检测出，表明本发明组合物的灵敏度为50拷贝/ml。
序列表
<110> 圣湘生物科技股份有限公司
<120> 检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒、方法及其用途
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 152
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga cttccctatg gtgctaacaa 60
agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat acaccaaaag atcacattgg 120
cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cg 152
<210> 2
<211> 196
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
aacacaagct ttcggcagac gtggtccaga acaaacccaa ggaaattttg gggaccagga 60
actaatcaga caaggaactg attacaaaca ttggccgcaa attgcacaat ttgcccccag 120
cgcttcagcg ttcttcggaa tgtcgcgcat tggcatggaa gtcacacctt cgggaacgtg 180
gttgacctac acaggt 196
<210> 3
<211> 170
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 3
acaattcacc taatttagca tggcctctta ttgtaacagc tttaagggcc aattctgctg 60
tcaaattaca gaataatgag cttagtcctg ttgcactacg acagatgtct tgtgctgccg 120
gtactacaca aactgcttgc actgatgaca atgcgttagc ttactacaac 170
<210> 4
<211> 216
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 4
acggtgacat ggtaccacat atatcacgtc aacgtcttac taaatacaca atggcagacc 60
tcgtctatgc tttaaggcat tttgatgaag gtaattgtga cacattaaaa gaaatacttg 120
tcacatacaa ttgttgtgat gatgattatt tcaataaaaa ggactggtat gattttgtag 180
aaaacccaga tatattacgc gtatacgcca acttag 216
<210> 5
<211> 228
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 5
atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt 60
cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt 120
gcgtactgct gcaatattgt taacgtgagt cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct 180
cgtgttaaaa atctgaattc ttctagagtt cctgatcttc tggtctaa 228
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtatttcta ctacctagga act 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgattgcagc attgttagca gg 22
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gccagaagct ggacttccct atggtgc 27
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
accgaagagc taccagacga 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tgcaacccat atgatgccgt 20
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acggtaaaat gaaagatctc agtccaag 28
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aacacaagct ttcggcagac 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acctgtgtag gtcaaccacg 20
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cagcgcttca gcgttcttcg gaatgtcgc 29
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cgtggtccag aacaaaccca 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aattgtgcaa tttgcggcca 20
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
attttgggga ccaggaacta atcag 25
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
attcacctaa tttagcatgg cctc 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
acatctgtcg tagtgcaaca ggac 24
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ttgtaacagc tttaagggcc aattctgctg t 31
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gggccaattc tgctgtcaaa t 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gtttgtgtag taccggcagc 20
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
atgagcttag tcctgttgca ctacgac 27
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
acggtgacat ggtaccacat 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ctaagttggc gtatacgcgt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ctaagttggc gtatacgcgt 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
acacaatggc agacctcgtc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
caaagcttgg cgtacacgtt 20
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cattttgatg aaggtaattg tgacacatta 30
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tagcgtactt ctttttcttg ctttcg 26
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
cacgagagta aacgtaaaaa gaaggt 26
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ctagttacac tagccatcct tactgcgc 28
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ttcgtttcgg aagagacagg t 21
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gcgcagtaag gatggctagt 20
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
agttaatagc gtacttcttt ttcttgcttt c 31
<210> 36
<211> 270
<212> DNA
<213> 智人
<400> 36
gaattcggca cgaggtggga cttcagcatg gcggtgtttg cagatttgga cctgcgagcg 60
ggttctgacc tgaaggctct gcgcggactt gtggagacag ccgctcacct tggctattca 120
gttgttgcta tcaatcatat cgttgacttt aaggaaaaga aacaggaaat tgaaaaacca 180
gtagctgttt ctgaactctt cacaactttg ccaattgtac agggaaaatc aagaccaatt 240
aaaattttaa ctagattaac aattattgtc 270
<210> 37
<211> 204
<212> DNA
<213> 智人
<400> 37
atgtctagag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 60
ctggacggcg gaactccagc aggaccatga atgctcaggg cggactgggt gctaagtgtt 120
ctgctggtag tggtcacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg 180
atgccaccta cggcaagctg accc 204
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gaggtgggac ttcagcatgg c 21
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tgtttctttt ccttaaagtc aac 23
<210> 40
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
agatttggac ctgcgagcgg gttctga 27
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gaactccagc aggaccatg 19
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
gaccactacc agcagaacac 20
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
tgctcagggc ggactgggtg ct 22

Claims (10)

1.一种用于检测SARS-CoV-2的组合物，同时包括：
第一引物对，用于特异性地扩增SARS-CoV-2的N基因中如SEQ ID NO:1所示的区域；
第一探针，用于检测所述第一引物对的扩增产物；
第二引物对，用于特异性地扩增SARS-CoV-2的N基因中如SEQ ID NO:2所示的区域；
第二探针，用于检测所述第二引物对的扩增产物；
第三引物对，用于特异性地扩增ORF1ab基因中如SEQ ID NO:3所示的区域；
第三探针，用于检测所述第三引物对的扩增产物；
第四引物对，用于特异性地扩增ORF1ab基因中如SEQ ID NO:4所示的区域；
第四探针，用于检测所述第四引物对的扩增产物；
第五引物对，用于特异性地扩增E基因中如SEQ ID NO:5所示的区域；以及
第五探针，用于检测所述第五引物对的扩增产物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第一引物对和第一探针为：SEQ ID NO:6～8或9～11。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第二引物对和第二探针为：SEQ ID NO:12～14或15～17。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第三引物对和第三探针为：SEQ ID NO:18～20或21～23。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第四引物对和第四探针为：SEQ ID NO:24～26或27～29。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述第五引物对和第五探针为：SEQ ID NO:30～32或33～35。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包括用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。
8.如权利要求1～7中任一项所述的组合物在制备检测SARS-CoV-2的试剂盒中的用途。
9.一种检测SARS-CoV-2的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～7中任一项所述的组合物。
10.一种用于检测SARS-CoV-2的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如权利要求1～7中任一项所述的组合物对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
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