KR101939336B1 - 호흡기 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 호흡기 바이러스 검출용 키트 - Google Patents

호흡기 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 호흡기 바이러스 검출용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 호흡기 바이러스의 감염여부를 확인할 수 있게 하는 프라이머 및/또는 프로브를 포함하는 호흡기 바이러스 진단용 프라이머 및/또는 프로브 세트, 상기 프라이머 및/또는 프로브 세트를 포함하는 호흡기 바이러스 진단용 조성물, 상기 프라이머 및/또는 프로브 세트 또는 조성물을 포함하는 호흡기 바이러스 진단용 키트 및 상기 조성물을 이용하는 단계를 포함하는 호흡기 바이러스 진단을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 실시간 다중 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하는 경우 5개 튜브(1회)의 반응을 통해서 호흡기 바이러스 14종을 동시에 신속하게 검출하여 임상 진단을 할 수 있다.

Description

호흡기 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 호흡기 바이러스 검출용 키트{Composition for Detecting Virus Relating Respiratory Disease and Kit for Detecting Virus Relating Respiratory Disease Comprising the Same}
본 발명은 호흡기 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 호흡기 바이러스 검출용 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 호흡기 바이러스의 감염여부를 확인할 수 있게 하는 프라이머 및/또는 프로브를 포함하는 호흡기 바이러스 진단용 프라이머 및/또는 프로브 세트, 상기 프라이머 및/또는 프로브 세트를 포함하는 호흡기 바이러스 진단용 조성물, 상기 프라이머 및/또는 프로브 세트 또는 조성물을 포함하는 호흡기 바이러스 진단용 키트 및 상기 조성물을 이용하는 단계를 포함하는 호흡기 바이러스 진단을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다.
호흡기 바이러스는 급성 호흡기 감염의 주요 원인이며, 나이나 성별에 관계없이 가장 흔한 질병이라 할 수 있다. 특히 영아나 노인, 심폐기능과 면역기능이 저하된 사람들의 경우 후유증을 유발하여 사망에 이를 수 있는 것으로 알려져 있다. 호흡기 바이러스와 관련된 질환은 가장 흔하게는 감기 증상으로 시작하여, 인두염, 만성 천식의 악화, 폐렴에 이르기까지 다양하다. 이런 호흡기 바이러스를 조기에 진단하게 되면 불필요한 항생제의 남용을 예방할 수 있고, 바이러스의 유형을 조기에 발견하여 적절한 환자 치료를 수행할 수 있는 장점이 있다.
이러한 호흡기 바이러스의 진단방법은 전통세포배양법, 신속세포배양법, 신속 항원 비면역형광검사법, 신속 항원면역형광검사법, 전기영동방식을 이용한 분자진단법 등이 있다. 현재 표준 검사법인 세포 배양법의 경우는 검사결과를 확인하는데 5~9일 이상이 소요되어 호흡기 바이러스 감염의 조기 진단과 치료에 어려움이 있으며, 이런 단점을 보안하기 위해 24~72시간 내에 결과를 확인하면서 민감도는 전통 배양법과 비슷한 R-mix 바이러스 배양법 등이 시행되고 있지만 역시 조기 진단과 치료에는 한계를 보이고 있다. 신속 항원 비면역형광검사법은 빠른 시간에 결과를 확인할 수 있지만 민감도가 전통 배양법 보다 낮아 위음성이 많은 단점이 있고, 전기영동 방식을 이용한 분자진단법의 경우는 민감도 문제는 해결했으나, 2 step으로 진행되어 오염의 문제가 발생할 수 있고, 시간이 오래 걸리는 단점이 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 민감도, 오염 및 장시간이 소요되는 호흡기 바이러스 진단법의 문제점을 극복할 수 있는 방법을 찾기 위하여 예의 노력한 결과, 14종의 바이러스에 특이적인 유전자를 증폭할 수 있는 각 프라이머 세트 및 프로브를 개발하여 One-Step 실시간 RT-PCR 방법에 의해 높은 민감도와 특이도로 14종의 호흡기 바이러스를 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 하나의 목적은 호흡기 바이러스의 감염여부를 확인할 수 있게 하는 프라이머를 포함하는, 호흡기 바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 프라이머 세트 및 호흡기 바이러스의 특이적인 유전자를 검출할 수 있는 프로브, DNA 중합효소, 역전사 효소등을 포함하는 호흡기 바이러스 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트 또는 조성물을 포함하는 호흡기 바이러스 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용하는 단계를 포함하는 호흡기 바이러스 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 호흡기 바이러스의 감염여부를 확인할 수 있도록, 서열번호 1-2, 3-4, 5-6, 7-8, 9-10, 11-12, 13-14, 17-18, 19-20, 21-22, 23-24, 25-26, 32-33 및 서열번호 27-29의 정방향서열과 서열번호 30-31의 역방향 서열의 조합을 포함하는 프라이머 세트로 구성된 그룹으로 선택되는 호흡기 바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서의 용어, "진단"은 병리 상태를 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 기존의 다양한 호흡기 바이러스에 특이적인 유전자의 발현 유무를 확인하여 호흡기 바이러스에 의해 야기되는 질병의 발병 여부 및 발병 후 항바이러스 약제 치료과정에서의 예후를 확인하는 것이다.
본 발명에서의 용어 "프라이머"란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3'hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA합성을 개시할 수 있다. 본 발명에 의하면, 상기 프라이머는 10 내지 30개의 염기서열을 가지는 각각의 정방향 및 역방향의 핵산으로 구성됨이 바람직하다.
상기 프라이머는 호흡기 바이러스의 감염여부를 확인할 수 있도록 호흡기 바이러스에 특이적인 유전자를 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭시킬 수 있는데, 상기 호흡기 바이러스는 특별히 이에 제한되지 않으나, 코로나 바이러스 229E(Corona Virus 229E), 코로나 바이러스 OC43(Corona Virus OC43), 코로나 바이러스 NL63(Corona Virus NL63), 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A Virus), 인플루엔자 B 바이러스(Influenza B Virus), 파라인플루엔자 바이러스 1(Parainfluenza Virus 1), 파라인플루엔자 바이러스 2(Parainfluenza Virus 2), 파라인플루엔자 바이러스 3( Parainfluenza Virus 3), Rs 바이러스 A(Respiratory Syncytial Virus A), Rs 바이러스 B(Respiratory Syncytial Virus B), 아데노 바이러스(Adeno Virus), 라이노 바이러스 A, B, C(Rhino Virus A, B, C), 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 보카바이러스(Boca Virus) 등을 들 수 있고, 상기 각 호흡기 바이러스를 다른 바이러스와 구별시킬 수 있는 유전자는 특별히 이에 제한되지 않으나, 코로나 바이러스 229E의 핵단백질(N) 유전자(nucleoprotein (N) gene), 코로나 바이러스 OC43의 핵단백질(N) 유전자(nucleoprotein (N) gene), 코로나 바이러스 NL63의 폴리단백질 (1a) 유전자(polyprotein (1a) gene), 인플루엔자 A 바이러스의 기질 단백질(M) 유전자(matrix protein (M) gene), 인플루엔자 B 바이러스의 헴어글루티닌(HA) 유전자(hemagglutinin (HA) gene), 파라인플루엔자 바이러스 1의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자(hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene), 파라인플루엔자 바이러스 2의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자(hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene), 파라인플루엔자 바이러스 3의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자 (hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene), Rs 바이러스 A의 융합 단백질 유전자(fusion protein gene), Rs 바이러스 B의 융합 단백질 유전자(fusion protein gene), 아데노 바이러스의 헥손 단백질 유전자(hexon protein gene), 또는 라이노 바이러스 A, B, C의 5’UTR, 메타뉴모바이러스의 핵단백질(N) 유전자(nucleoprotein (N) gene), 보카 바이러스의 nucleocapsid protein (NP) gene, Viral protein (VP) gene 등을 들 수 있다.
상기 본 발명을 다른 관점에서 살펴보면, 본 발명의 호흡기 바이러스의 감염여부를 확인할 수 있게 하는 프라이머는 특별히 이에 제한되지 않으나, 코로나 바이러스 229E의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는 프라이머, 코로나 바이러스 OC43의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 3 및 4의 염기서열을 가지는 프라이머, 코로나 바이러스 NL63의 폴리단백질 (1a) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 5 및 6의 염기서열을 가지는 프라이머, 파라인플루엔자 바이러스 1의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 7 및 8의 염기서열을 가지는 프라이머, 파라인플루엔자 바이러스 2의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 9 및 10의 염기서열을 가지는 프라이머, 파라인플루엔자 바이러스 3의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 11 및 12의 염기서열을 가지는 프라이머, 인플루엔자 A 바이러스의 기질 단백질(M) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 13 및 14의 염기서열을 가지는 프라이머, 인플루엔자 B 바이러스의 헴어글루티닌(HA) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 17 및 18의 염기서열을 가지는 프라이머, Rs 바이러스 A의 융합 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 19 및 20의 염기서열을 가지는 프라이머, Rs 바이러스 B의 융합 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 21 및 22의 염기서열을 가지는 프라이머, 아데노 바이러스의 헥손 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 25 및 26의 염기서열을 가지는 프라이머, 라이노 바이러스 A, B, C의 5’UTR을 증폭시킬 수 있는 서열번호 27 및 31의 염기서열을 가지는 프라이머, 메타뉴모바이러스의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 23 및 24의 염기서열을 가지는 프라이머, 보카 바이러스의 nucleocapsid protein (NP) gene, Viral protein (VP) gene을 증폭시킬 수 있는 서열번호 32 및 33의 염기서열을 가지는 프라이머 등을 사용함이 바람직하다.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 호흡기 바이러스 진단용 조성물에 관한 것이다. 이때, 상기 조성물은 호흡기 바이러스의 특이적인 유전자를 검출할 수 있도록 서열번호 34 내지 40 및 제 42 내지 52의 염기서열을 가지는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 "프로브"란 상보적인 염기서열과 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 염기서열의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 또한, 실시간 PCR을 수행하기 위해서는 형광표식 프로브를 이용할 수 있다. 보다 구체적으로 TaqMan 프로브를 이용하는 경우 5' 말단은 형광물질로 3' 말단은 quencher 물질로 수식한 올리고뉴클레오타이드를 PCR 반응액에 첨가한다. 또한, Cycling 프로브를 이용한 실시간 PCR은 RNA와 DNA로 이루어지는 키메라 프로브와 RNAse H로 구성된 고감도의 검출방법이다. 이 역시 프로브의 5' 말단은 형광물질로 3' 말단은 quencher 물질로 표식한다.
상기 본 발명을 다른 관점에서 살펴보면, 본 발명자들은 실시간 PCR을 수행하여 그 증폭 산물을 검출하는 경우에는 그 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링할 수 있으므로 DNA 및 RNA의 정확한 정량이 가능하고, 전기영동이 필요없어 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며 오염의 위험이 적음에 착안하여, 실시간 PCR을 수행하고자 형광표식 프로브를 제작하였다. 상기 프로브는 특별히 이에 제한되지 않으나, 코로나 바이러스 229E의 핵단백질(N) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 34의 염기서열을 가지는 프로브, 코로나 바이러스 OC43의 핵단백질(N) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 35의 염기서열을 가지는 프로브, 코로나 바이러스 NL63의 폴리단백질 (1a) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 36의 염기서열을 가지는 프로브, 파라인플루엔자 바이러스 1의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 37의 염기서열을 가지는 프로브, 파라인플루엔자 바이러스 2의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 38의 염기서열을 가지는 프로브, 파라인플루엔자 바이러스 3의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 39의 염기서열을 가지는 프로브, 인플루엔자 A 바이러스의 기질 단백질(M) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 40의 염기서열을 가지는 프로브, 인플루엔자 B 바이러스의 헴어글루티닌(HA) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 42의 염기서열을 가지는 프로브, Rs 바이러스 A의 융합 단백질 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 43의 염기서열을 가지는 프로브, Rs 바이러스 B의 융합 단백질 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 44의 염기서열을 가지는 프로브, 메타뉴모바이러스의 핵단백질(N) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 45의 염기서열을 가지는 프로브, 아데노 바이러스의 헥손 단백질 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 46-49의 염기서열을 가지는 프로브, 라이노 바이러스 A, B, C의 5’UTR을 검출할 수 있는 서열번호 50-51의 염기서열을 가지는 프로브, 보카 바이러스의 nucleocapsid protein (NP) gene, Viral protein (VP) gene을 검출할 수 있는 서열번호 52의 염기서열을 가지는 프로브 등을 사용함이 바람직하다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
상기 본 발명을 다른 관점에서 살펴보면, 본 발명의 호흡기 바이러스 진단용 조성물은 상기 프로브 뿐만 아니라, 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 DNA 중합효소를 추가로 포함할 수도 있는데, 상기 DNA 중합효소는 특별히 이에 제한되지 않으나, Hot start Taq DNA 중합효소를 사용함이 바람직하다.
상기 본 발명을 또 다른 관점에서 살펴보면, 본 발명의 호흡기 바이러스 진단용 조성물은 시료에서 추출된 RNA를 역전사 중합효소 연쇄반응에 적용하여 수득한 호흡기 바이러스의 특이적인 유전자를 표적으로 하는데, 이를 위하여 본 발명의 호흡기 바이러스 진단용 조성물은 상기 프로브와 DNA 중합효소 이외에도 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 역전사 효소를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 호흡기 바이러스 진단용 조성물을 포함하는 호흡기 바이러스 진단용 키트에 관한 것이다. 상기 키트를 이용하면, 환자가 호흡기 바이러스로 인한 질환이 발병되었는지의 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 진단용 키트는, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 진단용 키트 및 진단용 조성물은 역전사 반응 및 실시간 다중PCR(real-time multiplex PCR)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 호흡기 바이러스 동시 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 진단용 키트는, 검출 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 호흡기 바이러스의 유전자인 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, 상보적인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Hot start Taq-폴리머라아제 및 역전사 표소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
뿐만 아니라, 상기 키트를 이용하면, 호흡기 바이러스의 진단을 위한 정보를 제공할 수도 있다.
상기 본 발명을 다른 관점에서 살펴보면, 본 발명의 호흡기 바이러스 진단을 위한 정보의 제공방법은 a) 상기 호흡기 바이러스 진단용 조성물에 Hot start Taq DNA 중합 효소 및 역전사 효소를 포함하는 효소 조성물을 혼합하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 제조된 혼합물에 검체 DNA, RNA 또는 DNA 및 RNA를 첨가하는 단계; 및, c) 상기 b) 단계에서 제조된 검체 DNA, RNA 또는 DNA 및 RNA를 포함하는 반응액을 역전사 반응 및 실시간 PCR 반응을 수행하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 호흡기 바이러스는 특별히 이에 제한되지 않으나, 코로나 바이러스 229E, 코로나 바이러스 OC43, 코로나 바이러스 NL63, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 1, 파라인플루엔자 바이러스 2, 파라인플루엔자 바이러스 3, Rs 바이러스 A, Rs 바이러스 B, 아데노 바이러스, 라이노 바이러스 A, B, C, 메타뉴모바이러스, 보카 바이러스 등을 사용함이 바람직하고, 상기 검체로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 침 또는 가래(Nasopharyngeal swabs(NPS), Nasla swabs(NS), Throat swabs(TS), Nasal aspirates(NA)) 등을 사용함이 바람직하다. 이때, 상기 c) 단계에서 DNA 또는 DNA 및 RNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 PCR , 실시간 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 포함될 수 있으며 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여 호흡기 바이러스 감염 의심 환자에서의 Virus genome을 검출하여 호흡기 바이러스의 감염 여부를 예측할 수 있다.
본 발명에서 "검체"란 다양한 호흡기 바이러스 감염에 의해 상기 각 바이러스에 특이적인 유전자의 발현 수준이 차이 나는 침 또는 가래와 같은 시료를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 본 발명을 다른 관점에서 살펴보면, 본 발명의 본 발명의 호흡기 바이러스 진단을 위한 정보의 제공방법은 상기 a) 단계에 있어서 RNA 추출과정의 유효성에 대한 판단기준을 제공하도록 Human RNase P를 표적으로 하는 인터널 콘트롤 프라이머로서 서열번호 15 및 16의 염기서열을 가지는 프라이머를 추가로 포함하거나 또는 서열번호 41의 염기서열을 가지는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 호흡기 바이러스 진단용 프라이머 세트를 이용하면, 실시간 다중 역전사 중합효소 연쇄반응을 통하여 5개 tube (1회)의 반응을 통해서 호흡기 바이러스 14종을 동시에 신속하게 검출 하여 임상 진단을 할 수 있으므로, 보다 신속한 호흡기 질환의 진단 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하에서는 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상술하지만, 본 발명의 범주가 그것에 의해 한정되는 것은 아니다.
하기 실험은 비인두의 흡인물 혹은 swab한 검체(Nasopharyngeal swabs(NPS), Nasal swabs(NS), Throat swabs(TS), Nasal aspirates(NA)) 를 대상으로 한 것으로 호흡기 바이러스 14종의 검출 및 구분을 수행하였다.
실시예 1 : 호흡기 바이러스 특이적인 프라이머 및 프로브의 제작
실시예 1-1 : 호흡기 바이러스 특이적인 프라이머의 제작
본 발명자들은 코로나 바이러스 229E의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는 프라이머, 코로나 바이러스 OC43의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 3 및 4의 염기서열을 가지는 프라이머, 코로나 바이러스 NL63의 폴리단백질 (1a) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 5 및 6의 염기서열을 가지는 프라이머, 파라인플루엔자 바이러스 1의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 7 및 8의 염기서열을 가지는 프라이머, 파라인플루엔자 바이러스 2의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 9 및 10의 염기서열을 가지는 프라이머, 파라인플루엔자 바이러스 3의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 11 및 12의 염기서열을 가지는 프라이머, 인플루엔자 A 바이러스의 기질 단백질(M) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 13 및 14의 염기서열을 가지는 프라이머, RNase P를 표적으로 하는 내부 대조군으로서 RNA 추출과정의 유효성에 대한 판단기준을 제공하는 서열번호 15 및 16의 염기서열을 가지는 프라이머, 인플루엔자 B 바이러스의 헴어글루티닌(HA) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 17 및 18의 염기서열을 가지는 프라이머, Rs 바이러스 A의 융합 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 19 및 20의 염기서열을 가지는 프라이머, Rs 바이러스 B의 융합 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 21 및 22의 염기서열을 가지는 프라이머, 아데노 바이러스의 헥손 단백질 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 25 및 26의 염기서열을 가지는 프라이머, 라이노 바이러스 A, B, C의 5’UTR을 증폭시킬 수 있는 서열번호 27 및 31의 염기서열을 가지는 프라이머, 메타뉴모바이러스의 핵단백질(N) 유전자를 증폭시킬 수 있는 서열번호 23 및 24의 염기서열을 가지는 프라이머, 보카 바이러스의 nucleocapsid protein (NP) gene, Viral protein (VP) gene을 증폭시킬 수 있는 서열번호 32 및 33의 염기서열을 가지는 프라이머를 통상의 방법을 이용하여 각각 작제하였다(참조: 표 1).
프라이머의 염기서열
이름 염기서열 길이 서열번호
229E-F CAGTCAAATGGGCTGATGCA 20 1
229E-R AAAGGGCTATAAAGAGAATAAGGTATTCT 29 2
OC43-F AYGAGGCTATTCCGACTAGGT 21 3
OC43-R CTTCCTGAGCCTTCAATATAGTAACC 26 4
NL63-F ACGTACTTCTATTATGAAGCATGATATTAA 30 5
NL63-R AGCAGATTTAATGTTATACTTAAAACTACG 30 6
PIV1-F GTTGTCAATGTCTTAATYCGTATCAATAATT 31 7
PIV1-R TAGCCTMCCYTCGGCACCTAA 21 8
PIV2-F TTTCCAATYTTCAGGACTATGAA 25 9
PIV2-R TCCTGGTATRGCAGTGACTGAA 26 10
PIV3-2-F CAGGATATAGGAAAATCATATCAAGT 26 11
PIV3-2-R ACATGACTTYCTATTGTCATTTATGTT 27 12
IfA-F AGACCAATYYTGTCACCTCT 20 13
IfA-R TGGACAAAKCGTCTACGCT 19 14
RNaseP-F AGATTTGGACCTGCGAGCG 19 15
RNaseP-R GAGCGGCTGTCTCCACAAGT 20 16
IfB-F AARTACGGTGGATTAAAYAAAAGCAA 26 17
IfB-R AATAGTTTTGCAGGMGGTCTATATTTGG 28 18
RSV A-1-F ATTGTTATCATTAATTGCTGTTGGA 25 19
RSV A-1-R CTAAATGCAATATTATTTATACCACTCAG 29 20
RSV B-1-F TGCAGTRACAGAATTACAGCTACTT 25 21
RSV B-1-R TTAGTGGTATTGATTGTRTAGTTCA 25 22
MPV-2-F TCATCAGGYAAYATYCCACA 20 23
MPV-2-R ACTTCTATDGTTGATGCTAGYTT 23 24
AdV-F CACNGTGGGGTTTCTRAACTT 21 25
AdV-R CARTGGKCWTACATGCAYATC 21 26
RV-1-F TGTGAAGAGCCSCRTGTG 18 27
RV-2-F TGTGAAGACTCGCATGTGCT 20 28
RV-3-F GTGYGAAGAGYCTANTGTGCT 21 29
RV-R GGACRCCCAAAGTAGTYGGTYC 22 30
RV-2-R GGACAYCCAAAGTAGTYGGTYC 22 31
BoV-1-F GAAATGCTTTCTGCTGYTGAAAG 23 32
BoV-1-R GGTTCACCGTTWTCAAGWGGATT 23 33
실시예 1-2 : 호흡기 바이러스 특이적인 프로브의 제작
본 발명자들은 코로나 바이러스 229E의 핵단백질(N) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 34의 염기서열을 가지는 프로브, 코로나 바이러스 OC43의 핵단백질(N) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 35의 염기서열을 가지는 프로브, 코로나 바이러스 NL63의 폴리단백질 (1a) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 36의 염기서열을 가지는 프로브, 파라인플루엔자 바이러스 1의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 37의 염기서열을 가지는 프로브, 파라인플루엔자 바이러스 2의 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 38의 염기서열을 가지는 프로브, 모든 헴어글루티닌-뉴라미니다제(HN) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 39의 염기서열을 가지는 프로브, 인플루엔자 A 바이러스의 기질 단백질(M) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 40의 염기서열을 가지는 프로브, 내부 대조군으로서 RNase P를 검출할 수 있는 서열번호 41의 염기서열을 가지는 프로브, 인플루엔자 B 바이러스의 헴어글루티닌(HA) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 42의 염기서열을 가지는 프로브, Rs 바이러스 A의 융합 단백질 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 43의 염기서열을 가지는 프로브, Rs 바이러스 B의 융합 단백질 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 44의 염기서열을 가지는 프로브, 메타뉴모바이러스의 핵단백질(N) 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 45의 염기서열을 가지는 프로브, 아데노 바이러스의 헥손 단백질 유전자를 검출할 수 있는 서열번호 46-49의 염기서열을 가지는 프로브, 라이노 바이러스 A, B, C의 5’UTR을 검출할 수 있는 서열번호 50-51의 염기서열을 가지는 프로브, 보카바이러스의 nucleocapsid protein (NP) gene, Viral protein (VP) gene을 검출할 수 있는 서열번호 52의 염기서열을 가지는 프로브를, 통상의 방법을 이용하여 각각 제작하였다(참조: 표 2).
프로브의 염기서열
이름 5 염기서열 3 길이 서열번호
229E-P-rev FAM CCCTGACGACCACGTTGTGGTTCA TAMRA 24 34
OC43-P HEX CGCCTGGCACGGTACTCCCTC TAMRA 21 35
NL63-P Cy5 ATTGCCAAGGCTCCTAAACGTACAGGTGTT BHQ3 30 36
PIV1-P FAM AGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACWATTCCAAT TAMRA 32 37
PIV2-P HEX CYATTTACCTAAGTGATGGAATCAATCGCAAA TAMRA 31 38
PIV3-2-P Cy5 CAGACTTGGTACCTGACTTAAATCCYAGGA BHQ3 30 39
IfA-P FAM ACGCTCACCGTGCCCAGT TAMRA 18 40
RNaseP-P HEX TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG TAMRA 23 41
IfB-P Cy5 TGCAAARGCMATAGGRAATTGCCCA BHQ3 25 42
RSV A-1-P FAM CTGTAAGGCCAGAAGCACACCARTCACAC TAMRA 29 43
RSV B-1-P Cy5 CGGGCCAGAAGAGAAGCACCACAGTA BHQ3 26 44
MPV-2-P HEX CAGAGRCCYTCAGCACCAGACACAC TAMRA 25 45
AdV-1-P FAM TGCACCAGCCCGGGGCTCAGGTACT TAMRA 25 46
AdV-2-P FAM TGCACCAGACCSGGACTCAGGTACT TAMRA 25 47
AdV-3-P FAM TGCACCAGGCCCGGGCTCAGRTACT TAMRA 25 48
AdV-4-P FAM TGCACCAGCCCGGKACTCAGGTAYT TAMRA 25 49
RV-P HEX CCGGCCCCTGAATGYGGCTAAYC TAMRA 23 50
RV-2-P HEX CCGGCYCCYGAATGTGGCTAACC TAMRA 23 51
BoV-1-P Cy5 CCTRGAGGGTGGGTGCTKCCT BHQ3 21 52
실시예 2 : 호흡기 바이러스 진단
실시예 2-1 : 필요 용액의 준비
하기 표 3의 시약을 준비하였다. 이들은 사용 전에 상온에 방치하여 해동시켰으며, 상온에서 30분 이상 방치하지 않는 것이 바람직하다.
구성물 및 구성성분
번호 구성 구성성분 서열번호
1 RT-PCR Premix One-step RT-PCR premix
2 프라이머/프로브 혼합액1
(primer/probe
Mixture1)		 Corona Virus primer/probe mix
1. 229E primer probe mix (FAM)
2. OC43 primer probe mix (HEX)
3. NL63 primer probe mix (Cy5)
1-2, 34
3-4, 35
5-6, 36
3 프라이머/프로브 혼합액2
(primer/probe
Mixture2)		 Parainfluenza Virus (PIV)primer/probe mix
1. PIV1 primer/probe mix (FAM)
2. PIV2 primer/probe mix (HEX)
3. PIV3 primer/probe mix (Cy5)
7-8, 37
9-10, 38
11-12, 39
4 프라이머/프로브 혼합액3
(primer/probe
Mixture3)		 Influenza Virus/ RNase P primer/probe mix
1. Influenza A pirmer/probe mix (FAM)
2. RNase P primer/probe mix (HEX)
3. Influenza B primer/probe mix (Cy5)
13-14, 40
15-16, 41
17-18, 42
5 프라이머/프로브 혼합액4
(primer/probe
Mixture4)		 Respiratory syncytial Virus (RSV) primer/probe mix
1. RSV A primer/probe mix (FAM)
2. RSV B primer/probe mix (Cy5)
3.Metapneumovirus primer/probe mix (HEX)

19-20, 43
21-22, 44
23-24, 45
6 프라이머/프로브 혼합액5
(primer/probe
Mixture5)		 Adeno Virus / Rhino Virus primer probe mix
1. Adeno Virus primer/probe mix (FAM)
2. Rhino Virus A,B,C primer/probe mix (HEX)
3. Boca Virus primer/probe mix (Cy5)
25-26, 46-49
27-31, 50-51
32-33, 52
7 양성대조액
(Positive Control)		 Positive control containing 12 types of Respiratory Virus, RNase P primer/probe binding sequences
8 음성대조액
(Negative Control)		 Negative control containing RNase P primer/probe binding sequences
실시예 2-2 : 검체의 준비
비인두의 흡인물 혹은 swab한 검체(Nasopharyngeal swabs(NPS), Nasal swabs(NS), Throat swabs(TS), Nasal aspirates(NA))를 사용하였다.
실시예 2-3 : 호흡기 바이러스 진단방법
상기 실시예 2-2에서 준비된 검체에서 RNA 추출 키트를 이용하여 RNA를 추출하였다. RT-PCR Premix가 10㎕씩 분주되어 있는 200㎕ PCR 튜브를 시료와 양성대조액, 음성대조액을 더한 수 만큼 준비하였다. 미리 분주되어 제공된 각 RT-PCR Premix 튜브에 RVP 프라이머/프로브 혼합액 5㎕와 추출한 시료 혹은 양성, 음성대조액을 5㎕씩 첨가하였다(참조: 표 4).
검체 및 구성물
검체 및 구성물명 1 테스트당 사용량(㎕)
RT-PCR Premix 10
RV 프라이머/프로브 혼합액 5
투입검체양 추출한 시료, 양성대조액 또는 음성대조액 5
합 계 20
뚜껑을 닫고 원심분리 한 후 잘 섞어 주었다. 원심분리한 후 실시간 PCR 싸이클러(real-time PCR cycler)에 넣어 반응을 진행하였다. 구체적인 실시간 PCR 반응 조건은 하기와 같다(참조: 표 5).
실시간 PCR 반응 조건
진행 온도 시간 반복 회수(회)
Reverse-transcription Step 1 45℃ 10분 1회
Step 2 94℃ 5분
PCR 반응 Step 3 94℃ 5초 40회(* Signal detection 반응 구간)
Step 4 53℃ 30초
Step 5* 72℃ 30초
PCR반응 결과는 real-time PCR detection system에 의해 실시간으로 측정하고, 반응이 완료된 후에 한계값(Cut-off value)(기기명: SLAN, FAM: 0.06, HEX: 0.06, CY5: 0.04)을 입력하였다.
실시예 2-4 : 결과 판정
(1) 각 대조군 별 Ct값
대조군을 대상으로 반응하였을 때의 Ct값(threshold cycle : 한계값을 통과하는 사이클 수)은 다음과 같고(참조: 표 6 및 표 7), 시료의 Ct값이 각 항목(FAM, HEX 및 CY5) 모두 37 이하인 경우에 양성으로 판정하였다(참조: 표 6 및 표 7).
양성대조액의 판정기준
양성대조액 FAM HEX CY5
프라이머/프로브 혼합액1 30 ± 3 30 ± 3 30 ± 3
프라이머/프로브 혼합액2 30 ± 3 30 ± 3 30 ± 3
프라이머/프로브 혼합액3 30 ± 3 30 ± 3 30 ± 3
프라이머/프로브 혼합액4 30 ± 3 30 ± 3 30 ± 3
프라이머/프로브 혼합액5 30 ± 3 30 ± 3 30 ± 3
음성대조액의 판정기준
음성대조액 FAM HEX CY5
프라이머/프로브 혼합액1 No Ct No Ct No Ct
프라이머/프로브 혼합액2 No Ct No Ct No Ct
프라이머/프로브 혼합액3 No Ct 30 ± 3 No Ct
프라이머/프로브 혼합액4 No Ct No Ct No Ct
프라이머/프로브 혼합액5 No Ct No Ct No Ct
상기 표 6 및 7에서 보듯이, 양성대조액의 경우 Ct값이 각 파장별로 30 ± 3의 범위내에 들어와야 하고, 음성대조액의 경우는 인터널 컨드롤인 RNase P만 Ct값이 나타나고 나머지 호흡기 바이러스들은 Ct값이 나오지 않아야(No Ct) 결과가 유효함을 알 수 있었다.
(2) 결과 분석
각 반응별로 FAM, HEX, CY5 파장의 시그널 형성을 확인하여 다음 표와 같이 반응 유효성과 양성, 음성을 분석하였다(참조: 표 8).
반응 유효성 및 양성과 음성의 분석기준
항목 FAM HEX CY5 결과 해석
프라이머 프로브 혼합액 1 + - - 229E
- + - OC43
- - + NL63
- - - Corona Virus 음성
프라이머 프로브 혼합액 2 + - - PIV1
- + - PIV2
- - + PIV3
- - - Parainfluenza Virus 음성
프라이머 프로브 혼합액 3 + + - Influenza A
- + + Influenza B
- + - Influenza A/B 음성
- - - 재시험
프라이머 프로브 혼합액 4 + - - RSV A
- - + RSV B
- - + Metapneumovirus
- - - RSV A/B/Metapneumovirus 음성
프라이머 프로브 혼합액 5 + - - Adeno Virus
- + - Rhino Virus A,B,C
- - + Boca Virus
- - - Adeno/Rhino/Boca Virus 음성
상기 표 8은 호흡기바이러스의 음양성 판단을 나타내는 각 유형별 결과 분석표이다. 예를 들어 프라이머프로브 혼합액 1을 사용하여 FAM 항목에서만 Ct값이 37보다 작은 숫자로 나올 경우(양성), 코로나바이러스 229E에 감염되었음을 의미한다. 아울럿, 상기 표에서 재시험으로 표시된 것은 인터널 컨트롤이 검출되지 않아, 다시 실험해야 한다는 것을 의미한다.
<110> LG Life Sciences Ltd. <120> Composition for Detecting Virus Relating Respiratory Disease and Kit for Detecting Virus Relating Respiratory Disease Comprising the Same <130> PA100856/KR <160> 52 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 229E-F <400> 1 cagtcaaatg ggctgatgca 20 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 229E-R <400> 2 aaagggctat aaagagaata aggtattct 29 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer OC43-F <400> 3 aygaggctat tccgactagg t 21 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer OC43-R <400> 4 cttcctgagc cttcaatata gtaacc 26 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer NL63-F <400> 5 acgtacttct attatgaagc atgatattaa 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer NL63-R <400> 6 agcagattta atgttatact taaaactacg 30 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PIV1-F <400> 7 gttgtcaatg tcttaatycg tatcaataat t 31 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PIV1-R <400> 8 tagcctmccy tcggcaccta a 21 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PIV2-F <400> 9 tttccaatyt tcaggactat gaa 23 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PIV2-R <400> 10 tcctggtatr gcagtgactg aa 22 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PIV3-2-F <400> 11 caggatatag gaaaatcata tcaagt 26 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PIV3-2-R <400> 12 acatgactty ctattgtcat ttatgtt 27 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer IfA-F <400> 13 agaccaatyy tgtcacctct 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer IfA-R <400> 14 tggacaaakc gtctacgct 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RNaseP-F <400> 15 agatttggac ctgcgagcg 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RNaseP-R <400> 16 gagcggctgt ctccacaagt 20 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer IfB-F <400> 17 aartacggtg gattaaayaa aagcaa 26 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer IfB-R <400> 18 aatagttttg caggmggtct atatttgg 28 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RSV A-1-F <400> 19 attgttatca ttaattgctg ttgga 25 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RSV A-1-R <400> 20 ctaaatgcaa tattatttat accactcag 29 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RSV B-1-F <400> 21 tgcagtraca gaattacagc tactt 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RSV B-1-R <400> 22 ttagtggtat tgattgtrta gttca 25 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MPV-2-F <400> 23 tcatcaggya ayatyccaca 20 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MPV-2-R <400> 24 acttctatdg ttgatgctag ytt 23 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AdV-F <400> 25 cacngtgggg tttctraact t 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AdV-R <400> 26 cartggkcwt acatgcayat c 21 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RV-1-F <400> 27 tgtgaagagc cscrtgtg 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RV-2-F <400> 28 tgtgaagact cgcatgtgct 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RV-3-F <400> 29 gtgygaagag yctantgtgc t 21 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RV-R <400> 30 ggacrcccaa agtagtyggt yc 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer RV-2-R <400> 31 ggacayccaa agtagtyggt yc 22 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer BoV-1-F <400> 32 gaaatgcttt ctgctgytga aag 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer BoV-1-R <400> 33 ggttcaccgt twtcaagwgg att 23 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 229E-P-rev <400> 34 ccctgacgac cacgttgtgg ttca 24 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe OC43-P <400> 35 cgcctggcac ggtactccct c 21 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe NL63-P <400> 36 attgccaagg ctcctaaacg tacaggtgtt 30 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe PIV1-P <400> 37 aggccaaaga ttgttgtcga gacwattcca at 32 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe PIV2-P <400> 38 cyatttacct aagtgatgga atcaatcgca aa 32 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe PIV3-2-P <400> 39 cagacttggt acctgactta aatccyagga 30 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe IfA-P <400> 40 acgctcaccg tgcccagt 18 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe RNaseP-P <400> 41 ttctgacctg aaggctctgc gcg 23 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe IfB-P <400> 42 tgcaaargcm ataggraatt gccca 25 <210> 43 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe RSV A-1-P <400> 43 ctgtaaggcc agaagcacac cartcacac 29 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe RSV B-1-P <400> 44 cgggccagaa gagaagcacc acagta 26 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe MPV-2-P <400> 45 cagagrccyt cagcaccaga cacac 25 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe AdV-1-P <400> 46 tgcaccagcc cggggctcag gtact 25 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe AdV-2-P <400> 47 tgcaccagac csggactcag gtact 25 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe AdV-3-P <400> 48 tgcaccaggc ccgggctcag rtact 25 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe AdV-4-P <400> 49 tgcaccagcc cggkactcag gtayt 25 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe RV-P <400> 50 ccggcccctg aatgyggcta ayc 23 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe RV-2-P <400> 51 ccggcyccyg aatgtggcta acc 23 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe BoV-1-P <400> 52 cctrgagggt gggtgctkcc t 21

Claims (15)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. (i) 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍; 및 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는, 프라이머 세트 및
    (ii) 서열번호 37의 염기서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 38의 염기서열로 이루어지는 프로브, 및 서열번호 39의 염기서열로 이루어지는 프로브를 포함하는,
    실시간 다중 PCR (Polymerase Chain Reaction)에 적합한, 호흡기 바이러스 동시 진단용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군에서 선택된, 프라이머 세트 및 프로브의 세트를 1 이상 더 포함하는, 호흡기 바이러스 동시 진단용 조성물:
    (a) 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 34의 염기서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 35의 염기서열로 이루어지는 프로브, 및 서열번호 36의 염기서열로 이루어지는 프로브;
    (b) 서열번호 13 및 14의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 17 및 18의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 40의 염기서열로 이루어지는 프로브, 및 서열번호 42의 염기서열로 이루어지는 프로브;
    (c) 서열번호 19 및 20의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 21 및 22의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 43의 염기서열로 이루어지는 프로브, 및 서열번호 44의 염기서열로 이루어지는 프로브; 및
    (d) 서열번호 25 및 26의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및, 서열번호 27 내지 29 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머와 서열번호 30 또는 31의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머의 조합인, 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 46의 염기서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 47의 염기서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 48의 염기서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 49의 염기서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 50의 염기서열로 이루어지는 프로브, 및 서열번호 51의 염기서열로 이루어지는 프로브.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 세트 (c) 또는 (d)는 서열번호 23 및 24의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍과 서열번호 45의 염기서열로 이루어지는 프로브를 더 포함하거나; 또는 서열번호 32 및 33의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍 및 서열번호 52의 염기서열로 이루어지는 프로브를 더 포함하는, 호흡기 바이러스 동시 진단용 조성물.
  7. 제4항에 있어서, Hot start Taq DNA 중합효소, 역전사 효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 호흡기 바이러스 동시 진단용 조성물.
  8. 제4항에 있어서, 인터널 컨트롤인 RNase P를 증폭시키기 위한 서열번호 15 및 16의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 더 포함하는, 호흡기 바이러스 동시 진단용 조성물.
  9. 제4항에 있어서, 인터널 컨트롤인 RNase P를 검출하기 위한 서열번호 41의 염기서열로 이루어지는 프로브를 더 포함하는, 호흡기 바이러스 동시 진단용 조성물.
  10. 제4항의 조성물을 포함하는 호흡기 바이러스 동시 진단용 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 키트는 추가로 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군에서 선택된, 프라이머 세트 및 프로브의 세트를 1 이상 더 포함하는, 호흡기 바이러스 동시 진단용 키트:
    (a) 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 34의 염기서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 35의 염기서열로 이루어지는 프로브, 및 서열번호 36의 염기서열로 이루어지는 프로브;
    (b) 서열번호 13 및 14의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 17 및 18의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 40의 염기서열로 이루어지는 프로브, 및 서열번호 42의 염기서열로 이루어지는 프로브;
    (c) 서열번호 19 및 20의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및 서열번호 21 및 22의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 43의 염기서열로 이루어지는 프로브, 및 서열번호 44의 염기서열로 이루어지는 프로브; 및
    (d) 서열번호 25 및 26의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍, 및, 서열번호 27 내지 29 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 정방향 프라이머와 서열번호 30 또는 31의 염기서열로 이루어지는 역방향 프라이머의 조합인, 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트; 및 서열번호 46의 염기서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 47의 염기서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 48의 염기서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 49의 염기서열로 이루어지는 프로브, 서열번호 50의 염기서열로 이루어지는 프로브, 및 서열번호 51의 염기서열로 이루어지는 프로브.
  12. a) 제4항의 조성물에 Hot start Taq DNA 중합 효소 및 역전사 효소를 포함하는 효소 조성물을 혼합하는 단계;
    b) 상기 a) 단계에서 제조된 혼합물에 검체 DNA 또는 RNA를 첨가하는 단계; 및,
    c) 상기 b) 단계에서 제조된 검체 DNA 또는 RNA를 포함하는 반응액을 역전사 반응 및 실시간 PCR 반응을 수행하는 단계를 포함하는 호흡기 바이러스 동시 진단을 위한 정보의 제공방법.
  13. 제12항에 있어서, 2 내지 14종의 호흡기 바이러스를 1 내지 5개의 반응 용기에서 동시에 진단함을 특징으로 하는 호흡기 바이러스 동시 진단을 위한 정보의 제공방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 검체는 침 또는 가래인 것을 특징으로 하는 호흡기 바이러스 동시 진단을 위한 정보의 제공방법.
  15. 삭제
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