CN114262759B

CN114262759B - 一种联合检测多种呼吸道病毒的pcr引物组及试剂盒

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Publication number: CN114262759B
Application number: CN202210129994.1A
Authority: CN
Inventors: 张祥林; 张劲松; 侯艳雯; 魏鹏; 胡秋萍
Original assignee: Chongqing Pasteur Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Chongqing Pasteur Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2022-02-11
Filing date: 2022-02-11
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2042-02-11
Also published as: CN114262759A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种联合检测多种呼吸道病毒的PCR引物组及试剂盒，所述PCR引物组包括甲型流感病毒检测引物对、甲型流感病毒H1N1检测引物对、甲型流感病毒H3N2检测引物对、乙型流感病毒检测引物对、人呼吸道合胞病毒检测引物对、人偏肺病毒检测引物对、鼻病毒/肠道病毒检测引物对。所述试剂盒中包括多重RT‑PCR反应物，所述多重RT‑PCR反应物中包括所述PCR引物组。本发明的引物组和试剂盒可以联合检测并鉴定七种呼吸道病毒，该方法操作简单、检测准确、灵敏高，特异性高，显著缩短检测时间，可以实现2‑3小时内可出检测结果。

Description

一种联合检测多种呼吸道病毒的PCR引物组及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种联合检测多种呼吸道病毒的PCR引物组及试剂盒。

背景技术

呼吸道感染的发病率、死亡率、住院率和医疗负担均较高，呼吸道病毒如流感病毒和人呼吸道合胞病毒主要原因，特别是在幼儿、孕妇、老年人和其他合并症患者中。流感病毒和人呼吸道合胞病毒也是获得性肺炎的主要病原体。除流感病毒和人呼吸道合胞病毒外，临床常见的可导致呼吸道感染的病毒还包括人偏肺病毒、鼻病毒、副流感病毒、冠状病毒、腺病毒、博卡病毒等。

目前常用的呼吸道病毒检测方法主要包括以下：病毒分离培养、病毒抗原检测、病毒抗体检测、病毒直接检测、病毒核酸检测方法等。呼吸道病毒分离培养目前仍然是病毒诊断的金标准。然而该方法存在以下缺点：(1)操作复杂繁琐，不易标准化；(2)培养周期长；(3)检测环节较多；(4)人员技术要求较高。病毒抗原检测特异度较好，阳性提示活动性病毒感染，但灵敏度较低，常有假阴性。病毒抗体检测是利用抗原与抗体的特异性反应原理进行检测，该方法灵敏性低，仅反映人体免疫反应情况，而不能反映患者真实感染情况，仅可以用于回顾性调查，但对早期诊断意义不大。病毒直接检测通过电子显微镜直接观察呼吸道标本中病毒的典型特征形态，但要求标本有大量的病毒且要求有经验的技术人员和昂贵的电子显微镜设备，操作复杂，技术要求高。病毒核酸检测方法迅猛发展，由于其快速、简便、高通量、高敏感度及高特异度的优势，成为诊断呼吸道病毒感染的主要方法。常用的检测方法是实时荧光定量PCR法。尽管其具有高特异性、敏感性和时效性，但也存在如下缺点：(1)通量低：受限于荧光通道，单管仅能检测3种病毒；(2)成本高：多种病毒同时检测，成本较高。因此，亟需开发操作简单、准确度高、通量高、检测成本低，且可以针对同一份标本检测多种呼吸道病毒的检测技术，实现快速准确检测呼吸道病毒，可以大大提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本，具有显著的卫生经济学与社会经济学效益，适用于临床检测、卫生防疫及流行病学调查等。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种联合检测多种呼吸道病毒的PCR引物组及试剂盒，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种联合检测多种呼吸道病毒的PCR引物组，所述PCR引物组包括甲型流感病毒检测引物对、甲型流感病毒H1N1检测引物对、甲型流感病毒H3N2检测引物对、乙型流感病毒检测引物对、人呼吸道合胞病毒检测引物对、人偏肺病毒检测引物对、鼻病毒/肠道病毒检测引物对。

本发明还提供所述PCR引物组在制备检测甲型流感病毒、甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒和鼻病毒/肠道病毒的试剂盒中的用途。

本发明还提供一种联合检测甲型流感病毒、甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒和鼻病毒/肠道病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括多重RT-PCR反应物，所述多重RT-PCR反应物中包括所述PCR引物组。

本发明还提供所述试剂盒在制备呼吸道病毒检测产品中的用途。

如上所述，本发明的联合检测多种呼吸道病毒的PCR引物组及试剂盒，具有以下有益效果：采用本发明的技术方案，可以联合检测并鉴定七种呼吸道病毒，该方法操作简单、检测准确、灵敏高，特异性高，显著缩短检测时间，可以实现2-3小时内可出检测结果。外源RNA内参可以确保从核酸提取、逆转录和PCR扩增的检测过程中对核酸质量进行质控，避免因核酸提取质量、反转录以及PCR扩增的问题导致假阴性的问题。多重PCR与毛细管片段分析法相结合，可以实现单管检测多重呼吸道病毒，保证检测的通量且成本较低，适合疾控中心、医院及其它医疗机构使用。

附图说明

图1为本发明实施例2中的人呼吸道合胞病毒的毛细管电泳分离结果图。

图2为本发明实施例2中的甲型流感病毒H1N1(2009)的毛细管电泳分离结果图。

图3为本发明实施例2中的阳性质控品的毛细管电泳分离结果图。

图4为本发明实施例2中的阴性质控品的毛细管电泳分离结果图。

图5为本发明实施例3特异性分析结果。

图6为本发明对比例2中引物对1的扩增效果。

图7为本发明对比例2中引物对2的扩增效果。

图8为本发明对比例2中引物对3的扩增效果。

具体实施方式

本发明提供一种联合检测多种呼吸道病毒的PCR引物组，所述PCR引物组包括甲型流感病毒检测引物对、甲型流感病毒H1N1检测引物对、甲型流感病毒H3N2检测引物对、乙型流感病毒检测引物对、人呼吸道合胞病毒检测引物对、人偏肺病毒检测引物对、鼻病毒/肠道病毒检测引物对。

所述引物组还包括以下特征：

1)甲型流感病毒检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物；

2)甲型流感病毒H1N1检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物；

3)甲型流感病毒H3N2检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物；

4)乙型流感病毒检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物；

5)人呼吸道合胞病毒检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的下游引物；

6)人偏肺病毒检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的下游引物；

7)鼻病毒/肠道病毒检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的下游引物。

所述甲型流感病毒包括甲型流感病毒H1N1、H1N2、H2N3、H3N2、H5N2、H9N2和H16N3。甲型流感病毒引物对以M基因相对保守序列为靶标设计，甲型流感病毒H1N1、H1N2、H2N3、H3N2、H5N2、H9N2和H16N3具有该共同序列。引物对以此序列为靶标设计，因此该引物对可以检测以上型别。

所述甲型流感病毒H1N1是指甲型流感病毒H1N1(2009)。

所述甲型流感病毒检测引物对和甲型流感病毒H1N1检测引物对共同检测甲型流感病毒H1N1。

所述甲型流感病毒检测引物对和甲型流感病毒H3N2检测引物对共同检测甲型流感病毒H3N2。

所述乙型流感病毒包括乙型流感病毒Yamagata系和Victoria系。乙型流感病毒引物对以HA基因相对保守序列为靶标设计，乙型流感病毒Yamagata系和Victoria系具有该共同序列。引物对以此序列为靶标设计，因此该引物对可以检测以上株系。

所述人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus，HRSV)属于副黏病毒科的肺病毒属。人呼吸道合胞病毒主要有两个亚型(A及B)。人呼吸道合胞病毒引物对以N基因相对保守序列为靶标设计，人呼吸道合胞病毒A型和B型具有该共同序列。引物对以此序列为靶标设计，因此该引物对可以检测以上亚型。

所述人偏肺病毒(human metapneumovirus，hMPV)，是2001年新发现的一种人类呼吸道病原体，由荷兰学者Van den Hoogen等人在呼吸道感染住院儿童的鼻咽部分泌物标本中分离得到的。

所述鼻病毒/肠道病毒属于微小RNA病毒科，单链RNA病毒，曾将鼻病毒划分在肠道病毒属中，后来发现两属病毒有很大差别，1963年将此病毒命名为鼻病毒。根据壳蛋白的血清学，鼻病毒有超过100种血清型。鼻病毒一般认为是导致感冒的原因，但是也可能促进哮喘发作及严重并发症。肠病毒分为四个组，包括至少89个不同型别。

所述鼻病毒/肠道病毒包括A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒、肠道病毒A组、肠道病毒B组、肠道病毒C组和肠道病毒D组。

所述鼻病毒/肠道病毒检测引物对能够特异性识别鼻病毒和肠道病毒，即能与鼻病毒/肠道病毒检测引物对特异性结合的序列要么为鼻病毒的序列，要么为肠道病毒的序列。

鼻病毒/肠道病毒引物对以5'UTR相对保守序列为靶标设计，A型鼻病毒、B型鼻病毒和C型鼻病毒、肠道病毒A组、肠道病毒B组、肠道病毒C组和肠道病毒D组具有该共同序列。引物对以此序列为靶标设计，因此该引物对可以检测以上型别。

对于上述的引物对具有的具体碱基序列而言，只要能够在PCR实施条件下特异性地识别各自的特异性识别区域(优选在单一的反应容器内使用的引物之间不发生退火及自退火)，则可以使1个或多个碱基替换为其他碱基，也可在3’端或5’端添加1个或多个碱基。此处，所谓多个，例如为2～3个。向引物添加1个或多个碱基的情况下，优选向引物的5’端添加。

将上述的引物对具体的碱基序列中的1个或多个碱基取代为其他碱基而得到的碱基序列、与被取代前的碱基序列(即，序列号所示碱基序列)的同一性优选为70％以上，更优选为75％以上，更优选为80％以上，更优选为85％以上，更优选为90％以上，更优选为95％以上均可。

对于各引物的长度而言，只要能够特异性地识别对应的特异性识别区域、且引物之间不发生杂交即可，没有特别限制，优选为15个碱基以上且40个碱基以下。更优选的是，引物的长度的下限为16个碱基以上，进一步优选为17个碱基以上，进一步优选为18个碱基以上。更优选的是，引物的长度的上限为39个碱基以下，进一步优选为38个碱基以下，进一步优选为37个碱基以下。

各检测引物物对可单独包装，也可以组合配成多重RT-PCR检测混合液。所述多重RT-PCR检测混合液中，上述各引物对的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。

也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的各组引物对，也可以是含有配制好的含有各组引物对的多重RT-PCR检测混合液。

进一步的，所述用途为在制备联合检测甲型流感病毒、甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒和鼻病毒/肠道病毒的试剂盒中的用途。

本发明的试剂盒采用多重RT-PCR技术在单管中同时进行七种呼吸道病毒的检测，根据扩增及检测情况可分析判断甲型流感病毒、甲型流感病毒H1N1(2009)、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒和鼻病毒/肠道病毒感染情况。因此，引物的设计是本发明试剂盒的关键。

所述多重RT-PCR反应物中还可以包括其他一些多重RT-PCR所需要的常规试剂，如：OneStep RT-PCR Enzyme MIX。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据用户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

进一步地，所述试剂盒还可以含有外源RNA内参扩增引物对，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的下游引物。

所述RT-PCR反应物可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用RT-PCR反应液与所述引物组混合后获得。例如，可以在OneStep RT-PCR Enzyme MIX中，加入本发明的所述引物组和内参扩增引物对即可获得RT-PCR反应物。在一种实施方式中，以所述多重RT-PCR反应物的总体积为基准，所述多重RT-PCR反应物中每条引物的浓度为50nmol/L～600nmol/L。

在一种实施方式中，所述试剂盒中还包括样品RNA提取试剂。所述样品RNA提取试剂可以市购或自行配制。

进一步地，所述试剂盒还可以含有阳性质控品。所述阳性质控品为含各目标病毒特异核酸片段和外源RNA内参特异核酸片段的pUC57质粒DNA，各质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～24所示。所述阳性质控品可单独市购或根据现有技术自行构建。

进一步地，所述试剂盒还可以含有阴性质控品。所述阴性质控品为TE缓冲液。所述阴性质控品可单独市购或根据现有技术自行配置。

本发明还提供前述检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1)样本进行前处理后，加入外源RNA内参，共同提取样本中RNA；

2)加样：将样品RNA、阳性质控品或阴性质控品分别与所述多重RT-PCR反应物混合，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管；

3)RT-PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行RT-PCR反应；

4)RT-PCR反应结束后，分析结果。

步骤(1)中，提取样本中RNA为现有技术。

优选地，步骤(3)中，RT-PCR反应的条件设置为：50℃30min循环1次；95℃15min循环1次；94℃30sec、60℃30sec、72℃1min、循环25次；72℃10min循环1次；4℃∞循环1次。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。实施例1试剂盒的制备及使用方法

分别合成甲型流感病毒检测引物对、甲型流感病毒H1N1(2009)检测引物对、甲型流感病毒H3N2检测引物对、乙型流感病毒检测引物对、人呼吸道合胞病毒检测引物对、人偏肺病毒检测引物对、鼻病毒/肠道病毒检测引物对，其核苷酸序列如下表1所示。

所述试剂盒还含有外源RNA内参扩增引物对，其核苷酸序列如下表1所示。

所述试剂盒还含有阳性质控品。所述阳性质控品为含各目标病毒特异核酸片段和外源RNA内参特异核酸片段的pUC57质粒DNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.24，见表2。

所述试剂盒还含有阴性质控品。所述阴性质控品为TE缓冲液。

所述试剂盒还含有OneStep RT-PCR Enzyme MIX(货号：210212，QIAGEN)、QIAampViral RNA Mini Kit试剂盒(货号：52906，QIAGEN)。

表1

表2

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实施例2试剂盒的检测效果评价

本发明实施例中提供一种本试剂盒的具体使用方式，将表1中序列所示的各检测引物对、外源RNA内参扩增引物对、与购于QIAGEN公司的OneStep RT-PCR Enzyme MIX混合均匀，获得多重RT-PCR反应物，多重PCR反应物中各引物的浓度见表3。

表3

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1、按照标准操作采集人呼吸道合胞病毒或甲型流感病毒H1N1(2009)感染患者的鼻咽拭子标本，采集后应立即放置于冰袋中，并马上送检。

2、样本进行前处理后，加入10μL的外源RNA内参，共同提取样本中RNA，获得待测RNA样本。

3、RT-PCR反应体系配制与检测

(1)根据检测需求设置排版方式，根据排版将RT-PCR反应液加入8联管或96孔板中，每孔加17.5μL，并往反应孔中分别依次加入2.5μL的阴性质控品(TE缓冲液)、待测RNA样本和阳性质控品(含目标病毒特异核酸片段和外源RNA内参特异核酸片段的pUC57质粒DNA)，盖好盖子。

(2)充分混匀并离心。

(3)上述配制好的试剂进行反应。

3、设置RT-PCR程序

(1)按照PCR仪操作说明书设置RT-PCR程序，RT-PCR反应扩增条件见下表4。

表4

(2)RT-PCR扩增结束后，将扩增板/管进行短暂离心，然后小心打开管盖，加矿物油密封，使用核酸片段分析仪进行检测。

整个检测流程约为2-3小时。

4、结果分析

结果判定方法：通过检测反应产物片段大小判断样本检测结果，各病毒对应的片段大小值见下表5。阴性对照管中应无反应产物片段。否则，此次实验结果无效，重新检测。阳性质控品检测反应体系中，在55-65bp和下表所示范围内各有一反应产物片段，否则此次实验结果无效，重新检测。对于样本检测反应体系，在55-65bp范围内应有内参反应产物片段，否则，此次实验结果无效，重新检测。若样本检测结果为阳性，根据反应产物信号强度和对应片段大小，判断出所感染的病毒类型。当甲型流感病毒和甲型流感病毒H1N1(2009)结果均为阳性，则判定标本感染甲型流感病毒H1N1(2009)。当甲型流感病毒和甲型流感病毒H3N2结果均为阳性，则判定标本感染甲型流感病毒H3N2。

结果如图1至图4所示，图3为阳性质控品的结果图，在55-65bp和表5所示片段范围内各有一反应产物片段。图4为阴性质控品的结果图，无反应产物片段。图1中在55-65bp范围内有内参反应产物片段，同时在245-260bp存在峰，表明该标本中含有人呼吸道合胞病毒。图2中在55-65bp范围内有内参反应产物片段，同时在185-205bp和215-230bp范围内均存在峰，表明该标本中含有甲型流感病毒H1N1(2009)。

表5

病毒种类	片段大小
		鼻病毒/肠道病毒	110-120bp
甲型流感病毒H3N2	130-140bp
		甲型流感病毒	185-205bp
甲型流感病毒H1N1(2009)	215-230bp
		人呼吸道合胞病毒	245-260bp
乙型流感病毒	375-385bp
		人偏肺病毒	460-480bp
外源RNA内参	55-65bp

实施例3试剂盒的灵敏度和特异性分析

灵敏度分析：

分别对将七种病毒检测靶标的阳性质控品进行10倍梯度稀释，浓度分别为1×10⁶copies/mL、1×10⁵copies/mL、1×10⁴copies/mL、1×10³copies/mL、1×10²copies/mL和10copies/mL，每个梯度稀释液重复3-5份样本，利用与实施例2中相同的，确定的七种病毒多重PCR检测体系，进行多重PCR扩增和片段分析检测，直至检测不到信号，每份进行20次的重复检测，以95％的阳性检出率水平作为最低检测下限(LOD)，即为灵敏度。

本发明试剂盒的检测灵敏度，如下表所示：

表6

特异性分析：

本发明建立的检测方法的特异性主要表现特异性引物的特异性。设计的引物都经过primer-blast比对分析，具有高度保守性和特异性，能特异性区分七种病毒。为了确定检测方法的特异性，选择巨细胞病毒、腺病毒、博卡病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、副流感病毒IV型、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、冠状病毒NL63、冠状病毒HKU1常见呼吸道病毒的临床阳性标本抽提的核酸作为模拟干扰样本，将以上得到的每种样本的总核酸与等量的外源RNA内参混合，作为模板进行多重RT-PCR扩增和片段分析，验证本发明试剂盒引物设计的特异性。

结果如图5显示，十一种无关呼吸道病毒的总核酸与等量的外源RNA内参为模板进行的多重PCR和片段分析，仅能扩增出61bp的外源RNA内参条带，无其他扩增条带。从以上数据可以看出，本发明试剂盒对这些常见呼吸道病毒的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其他微生物之间没有交叉反应，体现试剂盒检测病原体的特异性强。

实施例4试剂盒应用于临床样本检验

1、检测方法

应用本发明实施例2中相同试剂检测157份临床通过实时荧光RT-PCR检测验证标本。标本来源因呼吸道感染住院患儿的鼻咽拭子，患儿多具有常见呼吸道感染症状(发热、头痛、咳嗽等)。其中甲型流感病毒阳性标本32例，甲型流感病毒H1N1(2009)阳性标本23例，甲型流感病毒H3N2病毒阳性标本10例，乙型流感病毒阳性标本9例，人呼吸道合胞病毒阳性标本22例，人偏肺病毒阳性标本5例，鼻病毒/肠道病毒阳性标本38例，阴性标本18例。以实时荧光RT-PCR检测结果作为金标本，评估检测试剂盒性能。

2、检测结果

与实时荧光RT-PCR方法对比，本发明试剂盒阳性检出率为100％，一致性高，未出现漏检情况，结果具有统计学意义。本发明专利试剂盒检测临床样本与实时荧光RT-PCR方法比较，无明显差异，但是在多重检测、操作时间短、操作简单等方面具有明显的优势。

对比例1

按照实施例1的方法制备对比引物组1-12，见下表7。

表7

区别仅在于，将实施例1的引物组中SEQ ID NO.1-2所示的引物替换为SEQ IDNO.25-26所示的引物获得对比引物组1。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.3-4所示的引物替换为SEQ ID NO.27-28所示的引物获得对比引物组2。将实施例1的引物组中SEQ IDNO.5-6所示的引物替换为SEQ ID NO.29-30所示的引物获得对比引物组3。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.7-8所示的引物替换为SEQ ID NO.31-32所示的引物获得对比引物组4。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.9-10所示的引物替换为SEQ ID N.33-34所示的引物获得对比引物组5。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.11-12所示的引物替换为SEQ ID NO.35-36所示的引物获得对比引物组6。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.13-14所示的引物替换为SEQ ID NO.37-38所示的引物获得对比引物组7。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.15-16所示的引物替换为SEQ ID NO.39-40所示的引物获得对比引物组8。

最低检出限验证按照实施例3的方法进行最低检出限验证。实施例3与对比例的最低检出限对比如下表8。

表8

检测指标	实施例3，LOD(copies/mL)	对比例，LOD(copies/mL)
			甲型流感病毒	1000	1000
甲型流感病毒H1N1(2009)	1000	1000
			甲型流感病毒H3N2	1000	10000
乙型流感病毒	1000	1000
			人呼吸道合胞病毒	1000	10000
人偏肺病毒	1000	10000
			鼻病毒/肠道病毒	1000	1000

由表8可知，对于样本中痕量的甲型流感病毒H3N2病毒、人呼吸道合胞病毒病毒、人偏肺病毒的核酸，本公开试剂盒比对比例有更强的检测能力。

特异性验证按照实施例3的方法进行特异性验证。结果显示，对比例的引物对的反应结果均为阴性。

由实施例3和对比例的对比可以看出，本公开可以一次性检测出甲型流感病毒、甲型流感病毒H1N1(2009)、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒和鼻病毒/肠道病毒七种病毒，灵敏度高，特异性高，最低检出限更低，覆盖度更广。

对比例2

本对比例以甲型流感病毒为例，展示了在研发过程中发现的部分效果不理想的引物。甲型流感病毒引物序列及筛选：对3组引物组合，先用单重PCR扩增筛选引物扩增效果，单重检测结果发现引物对3扩增效率较低，引物对1和2可以基本满足后续实验需要(如图6-图8所示)，需要加入多重PCR法中做进一步验证。将引物对1和2分别加入多重PCR体系中进行扩增，检测结果如下：

引物对1

F-1：ACCTGAGTCTATGAGGGAAGAA(SEQ ID NO.41)

R-1：CTGATGGAACGATAGAGAGAACATA(SEQ ID NO.42)

引物对2

F-2：TTCTAACCGAGGTTGAAACG(SEQ ID NO.43)

R-2：CGGTGAGCGTGAAAACAA(SEQ ID NO.44)

引物对3

F-3：AAGAATATCGAAAGGAACAGCAGAA(SEQ ID NO.45)

R-3：TTTCAACCTCGGTTAGAAGG(SEQ ID NO.46)

引物对1加入多重PCR体系检测结果：引物对1使得甲型流感病毒H1N1(2009)扩增效率变低，可能引物对1和甲型流感病毒H1N1(2009)引物对之间有竞争抑制或者有引物二聚体导致该引物对扩增效率降低，从而影响后续检测的需求。引物对2加入多重PCR体系检测结果：各病毒引物对扩增效率基本无改变。从多方面综合考虑，选择引物对2为甲型流感病毒在多重PCR检测体系中的引物对，该体系经过反复验证，满足检测要求。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 重庆巴斯德生物医药科技有限公司

<120> 一种联合检测多种呼吸道病毒的PCR引物组及试剂盒

<160> 46

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttctaaccga ggttgaaacg 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggtgagcgt gaaaacaa 18

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgagggatc aagaagggag aatga 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaatgggag gctggtgttt 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggtggcaac aaccaatcc 19

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggcctgact agctatctcc atggc 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcaatgtga ctggcgtgat 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aattttactg gtagcgttag gg 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccaaattagc agcaggggat agatc 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcaccatagg cattcataaa ca 22

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cagctctagg gtcagagaga gtaca 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgctttgcc atactcaatg aacag 25

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcctccggcc cctgaatg 18

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cggacaccca aagtagttgg t 21

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcgcaattct aacagtttcc ctttc 25

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcggcaattt catcatcca 19

<210> 17

<211> 852

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acggaaggag tacctgagtc tatgagggaa gaatatcgaa aggaacagca gaatgctgtg 60

gatgctgacg acagtcattt tgtcagcata gagttggagt aaaatagata tagccttcta 120

accgaggttg aaacgtatgt tctctctatc gttccatcag gccccctcaa agccgagatc 180

gcgcagagac ttgaagatgt ctttgctggg aaaaacacag atcttgaggc tctcatggaa 240

tggctaaaga caagaccaat tctgtcacct ctgactaagg ggattttagg gtttgttttc 300

acgctcaccg tgcccagtga gcgaggactg cagcgtagac gctttgtcca aaatgccctc 360

aacgggaatg gagacccaaa taacatggac aaagcagtta aactgtatag gaaacttaag 420

agggagataa cgttccatgg ggccaaagaa atagctctca gttattctgc tggtgcactt 480

gccagttgca tgggcctcat atacaataga atgggggctg taaccactga agtggcattt 540

ggcctggtgt gtgcaacatg tgagcagatt gctgattccc agcacaggtc tcataggcag 600

atggtggcaa caaccaatcc attaataaaa catgagaaca gaatggtttt ggccagcact 660

acagctaagg ctatggagca aatggctgga tcaagtgaac aggcagcgga ggccatggag 720

atagctagtc aggccaggca gatggtgcag gcaatgagag ccattgggac tcatcctagt 780

tccagtactg gtctaagaga tgatcttctt gaaaatttgc agacctatca gaaacgaatg 840

ggggtgcaga tg 852

<210> 18

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tattcaactg tcgccagttc attggtactg gtagtctccc tgggggcaat cagtttctgg 60

atgtgctcta atgggtctct acagtgtaga atatgtatgc tggagcaaaa agcttctaca 120

aaaatttaat atggctagtt aaaaaaggaa attcataccc aaagctcagc aaatcctaca 180

ttaatgataa agggaaagaa gtcctcgtgc tatggggcat tcaccatcca tctactagtg 240

ctgaccaaca aagtctctat cagaatgcag atgcatatgt ttttgtgggg acatcaagat 300

acagcaagaa gttcaagccg gaaatagcaa taagacccaa agtgagggat caagaaggga 360

gaatgaacta ttactggaca ctagtagagc cgggagacaa aataacattc gaagcaactg 420

gaaatctagt ggtaccgaga tatgcattcg caatggaaag aaatgctgga tctggtatta 480

tcatttcaga tacaccagtc cacgattgca atacaacttg tcagacaccc aagggtgcta 540

taaacaccag cctcccattt cagaatatac atccgatcac aattggaaaa tgtccaaaat 600

atgtaaaaag cacaaaattg agactggcca caggattgag gaatgtcccg tctattcaat 660

ctagaggcct atttggggcc attgccggtt tcattgaagg ggggtggaca gggatggtag 720

atggatggta cggttatcac catcaaaatg agcaggggtc aggatatgca gccgacctga 780

agagcacaca gaatgccatt 800

<210> 19

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aatcagccta tctcaagcat caggaagaat cacagtctct accaaaagaa gccaacaaac 60

tgtaatcccg aatatcggat ctagacccag aataagcatc tattggacaa tagtaaaacc 120

gggagacata cttttgatta acagcacagg gaatctaatt gctcctcggg gttacttcaa 180

aatacgaagt gggaaaagct caataatgag atcagatgca cccattggca aatgcaattc 240

tgaatgcatc actccaaatg gaagcattcc caatgacaaa ccatttcaaa atgtaaacag 300

gatcacatat ggggcctgtc ccagatatgt taaacaaaac actctgaaat tggcaacagg 360

gatgcgaaat gtaccagaga aacaaactag aggcatattt ggcgcaatcg cgggtttcat 420

agagaatggt tgggagggaa tggtggacgg ttggtacggt ttcaggcatc aaaattctga 480

gggaacagga caagcagcag atctcaaaag cactcaagca gcaatcaacc aaatcaatgg 540

gaagctgaat aggttgatcg ggaaaacaaa cgagaaattc catcagattg aaaaagaatt 600

ctcagaagta gaagggagaa ttcaggacct cgagaaatat gttgaggaca ctaaaataga 660

tctctggtca tacaacgcgg agcttcttgt tgccctggag aaccaacata caattgatct 720

aactgactca gaaatgaaca aactgtttga aagaacaaag aagcaactga gggaaaatgc 780

tgaggatatg ggcaatggtt gtttcaaaat ataccacaaa tgtgacaatg cctgcatagg 840

gtcaatcaga aatggaactt atgaccatga 870

<210> 20

<211> 827

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agcttgccaa tggaaccaaa tatagacctc ctgcaaaact attgaaagaa aggggtttct 60

tcggagctat tgctggtttc ctagaaggag gatgggaagg aatgattgca gaaggcaata 120

attgtactac tcatggtagt aacatccaat gcagaccgaa tctgcactgg gataacatct 180

tcaaactcac ctcatgtggt caaaacagct actcaagggg aggtcaatgt gactggcgtg 240

ataccactga caacaacacc aacaaaatct tattttgcaa atctcaaagg aacaaggacc 300

agagggaaac tatgcccgga ctgtctcaac tgtacagatc tggatgtggc cttgggcagg 360

ccaatgtgtg tggggaccac accttctgct aaagcttcaa tactccatga ggtcagacct 420

gttacatccg ggtgctttcc tataatgcac gacagaacaa aaatcagaca actacccaat 480

cttctcagag gatatgaaaa gatcaggtta tcaacccaaa acgttatcga tgcagaaaaa 540

gcaccaggag gaccctacag acttggaacc tcaggatctt gccctaacgc taccagtaaa 600

attggatttt ttgcaacaat ggcttgggct gttccgaagg acaactacaa aaatgcaacg 660

aacccacaaa cagtggaagt accatacatc tgtacagaag gggaagacca aattactgtt 720

tgggggtttc attcggataa caaaacccaa atgaagagcc tctatggaga ctcaaatcct 780

caaaagttca cctcatctgc caatggagtg accacacatt atgtttc 827

<210> 21

<211> 887

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctcaaagaaa gtgtgattaa ctacagtgta ttagacttga cagcagaaga actagaggct 60

atcaaacatc agcttaagct cttagcaaag tcaagttgaa tgatacactc aacaaagatc 120

aacttctgtc atccagcaaa tacaccatcc aacggagcac aggagatagt attgatactc 180

ccaattatga tgtgcagaaa cacatcaaca agctatgtgg catgttatta atcacagaag 240

atgctaatca taaattcact ggggtaatag gtatgttata tgctatgtct agattaggaa 300

gagaagacac cataaaaata ctcagagatg cgggatatca tgtaaaagca aatggagtgg 360

atgtaacaac acatcgtcaa gacattaatg ggaaagaaat gaaatttgaa gtgttaacat 420

tggcaagctt aacaactgaa attcaaatca acattgagat agaatctaga aaatcctaca 480

aaaaaatgct aaaagaaatg ggagaggtgg ctccagaata caggcatgac tctcctgatt 540

gtgggatgat aatattatgt atagcagcat tagtaataac caaattagca gcaggggata 600

gatctggtct tacagctgta attaggagag ctaataatgt tctaaaaaat gaaatgaaac 660

gttataaagg cttactacca aaggatatag ccaacagctt ctatgaagtg tttgaaaaat 720

atcctcactt tatagatgtt tttgttcatt ttggtatagc acaatcttct accagaggtg 780

gcagtagagt tgaaggaatt tttgcaggat tgtttatgaa tgcctatggt gcagggcaag 840

tgatgttacg gtggggggtc ttagcaaaat cagttaaaaa tattatg 887

<210> 22

<211> 797

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cacctgagtg atctatcata caagcatgct atattaaaag agtctcagta cacaataaag 60

agagatgtag gaacaacaac agcagtgaca ccctcatcat tgcaacaaga aataacactg 120

ttgtgtggag aaattctata tgctaagcat actgattaca aatatgctgc agaaatagga 180

atacaatata ttagcacagc tctagggtca gagagagtac agcagattct aagaaactca 240

ggcagtgaag tccaagcggt tttaaccaga acgtactctc tggggaaagt taaaaacaat 300

aaaggggaag atttacagat gctggacata cacggagtag aaaaaagctg ggtggaagag 360

atagacaaag aagcaagaaa aacaatggca actttactca aagaatcatc aggcaatatt 420

ccacaaaatc agagaccttc agcaccagac acacctataa tcttattatg tgtaggtgcc 480

ttaatattta ccaaattagc atcaactata gaagtgggat tagagaccac agtcagaaga 540

gctaaccgtg tactaagtga tgcactcaaa agatacccta gaatggacat accaaaaatt 600

gctagatcct tctatgactt atttgaacaa aaagtgtatc acaggagtct gttcattgag 660

tatggcaaag cattaggctc atcctctaca ggcagcaaag cagaaagttt attcgttaac 720

atattcatgc aagcttatgg tgctggtcaa acaatgctga ggtggggagt catcgccagg 780

tcatctaaca atataat 797

<210> 23

<211> 471

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cacctgagtg atctatcata caagcatgct atattaaaag agtctcagta cacaataaag 60

agagatgtag gaacaacaac agcagtgatg tttccccggt tgatctagat atgcttcacc 120

cgaggcaaaa actaaatcaa tcgttatccg caaagtgcct acgggaagcc tagtaacact 180

ctgaaagcct atggttggtc gctccattgc aaacccagca atagacctgg cagatgaggc 240

tagacgtacc ccaccagcga tggtggtcta gcctgcgtgg ctgcctgcac accctcattg 300

ggtgtgaagc cagaaagtgg acagggtgtg aagagcctac tgtgctcact ttgagtcctc 360

cggcccctga atgtggctaa tcctaaccct gcagctgttg cacacaagcc agtgtgtatg 420

cagtcgtaac gagcaattgc gggatggaac caactacttt gggtgtccgt g 471

<210> 24

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccctctgtct ttaatgaagc tgaagattaa cgttaacgtt agtgaagtgt tgtatccgct 60

atgaaagatt tgaattttag aggtgtggtc cactttaata acggctgcgg agttctctgg 120

ctgcacttca gccgctgtga ctgtcgaagc agagcccatc agtttttcag gatctcggtg 180

atttttgagg ctagactatg aactgaaccg actgagagtg accgtccaga aatgctttag 240

tgtgaagtct ccgctcacga ggagtccgtg gactgactgc agatctgcga cgcagtaaca 300

cccggcggca gacacccgtt gaaatgcggt tgtgtaattg atcgcaggcg agggtggaag 360

aggatgtgaa acttcatttg tgtaaaattt agggagtggt cctggtgtga tgaatgtcga 420

aatctgttcc tttttactga gccctacgac tctggctgag tgccacaccg ccggcagccg 480

caaagcggct caaaccattg ccttttatgg taataatgag agaatgcaga gggacttcct 540

ttgtctggca tatctgaggc gcgcgctgtc actagcgccc accagcggtc agactgtaga 600

atgcagagca aaacaggaag ttgactccag atggtcacat gcttgctgaa acgcctctcc 660

ctggcagcag cgcaattcta acagtttccc tttcttttac agttcagcca tggatgatga 720

aattgccgca ctggttgttg acaacggatc cggtatgtgc aaagccggat tcgctggaga 780

tgatgcccct cgtgctgttt 800

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atggtggcaa caaccaatcc 20

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cctccgctgc ctgttcact 19

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tgagggatca agaagggaga a 21

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

caatcgtgga ctggtgtatc tg 22

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

agcattccca atgacaaacc 20

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cgtaccaacc gtccacca 18

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tcttcggagc tattgctggt t 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cctctggtcc ttgttccttt g 21

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ggtggctcca gaatacaggc 20

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gcaccatagg cattcataaa ca 22

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tattagcaca gctctagggt caga 24

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

agtgcatcac ttagtacacg gttag 25

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

agcctagtaa cactctgaaa gcc 23

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ccaaagtagt tggttccatc cc 22

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

agtgaagtgt tgtatccgct atga 24

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gaactccgca gccgttatt 19

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

acctgagtct atgagggaag aa 22

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ctgatggaac gatagagaga acata 25

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ttctaaccga ggttgaaacg 20

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

cggtgagcgt gaaaacaa 18

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

aagaatatcg aaaggaacag cagaa 25

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tttcaacctc ggttagaagg 20

Claims

1.一种联合检测多种呼吸道病毒的PCR引物组，其特征在于，所述PCR引物组包括甲型流感病毒检测引物对、甲型流感病毒H1N1检测引物对、甲型流感病毒H3N2检测引物对、乙型流感病毒检测引物对、人呼吸道合胞病毒检测引物对、人偏肺病毒检测引物对、鼻病毒和肠道病毒检测引物对；

1)甲型流感病毒检测引物对：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

2)甲型流感病毒H1N1检测引物对：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

3)甲型流感病毒H3N2检测引物对：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

4)乙型流感病毒检测引物对：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

5)人呼吸道合胞病毒检测引物对：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

6)人偏肺病毒检测引物对：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

7)鼻病毒和肠道病毒检测引物对：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

2.权利要求1所述的PCR引物组在制备检测甲型流感病毒、甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、鼻病毒和肠道病毒的试剂盒中的用途。

3.一种联合检测甲型流感病毒、甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、鼻病毒和肠道病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括多重RT-PCR反应物，所述多重RT-PCR反应物中包括权利要求1所述的PCR引物组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述多重RT-PCR反应物中还包括OneStep

RT-PCR Enzyme MIX和/或外源RNA内参扩增引物对。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述外源RNA内参扩增引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的下游引物。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，以所述多重RT-PCR反应物的总体积为基准，所述多重RT-PCR反应物中每条引物的浓度为50nmol/L～600nmol/L。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括样品RNA提取试剂、阳性质控品、阴性质控品中的任一项或多项。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含各目标病毒特异核酸片段和外源RNA内参特异核酸片段的质粒DNA，和/或，所述阴性质控品为TE缓冲液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品各质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～24所示。