CN102181576B - 用液相芯片检测呼吸道传染病病原的引物和探针及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用液相芯片检测呼吸道传染病病原的引物和探针及方法，其用于9种临床常见呼吸道传染病病原的检测。本发明基于MASA液相芯片技术对9种临床常见呼吸道传染病病原进行检测，主要根据基因库中能够检索到的9种目标病毒所有的核苷酸序列分别进行同源性分析，设计简并引物和特异性探针，通过两轮PCR，分子杂交，再用Luminex100系统进行检测，从而确定样本中所含病原体的种类。本发明提供的对这9种临床常见呼吸道传染病病原的检测及早期诊断，其对于采取正确的治疗方案和及时的应对措施以防止疾病的传播至关重要。本发明具有检测速度快、操作简单、敏感性高、特异性好等优点，适合大范围的推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种涵盖9种临床常见呼吸道传染病病原的检测，尤其是一种借助液相芯片对9种临床常见呼吸道传染病病原进行检测，属于医学监测技术领域。
背景技术
人呼吸道合胞体病毒A型(HRSV-A)、人呼吸道合胞体病毒B型(HRSV-B)、流感病毒A型(InfV A)、流感病毒B型(InfV B)、SARS、副流感病毒I型(PIV-1)、副流感病毒II型(PIV-2)、副流感病毒III型(PIV-3)、腮腺炎病毒(Mumps virus)是我国临床常见的9种人类重大呼吸道传染病病原。其中流感病毒A型、B型，腮腺炎病毒为法定丙类传染病病原。这9种病原体主要通过呼吸道传播，传播速度快，易引起较大规模的流行，造成突发公共卫生事件，危机人民的健康和社会的稳定。对这些病原的早期诊断对于采取正确的治疗方案和及时的应对措施以防止疾病的传播至关重要。
目前临床用于病毒检测的常规方法主要有：病原体的培养和分离，免疫学检测和核酸PCR检测。病原体培养和分离检测方法是一种传统的检测技术，检测结果准确可靠，但是敏感性较低，检测周期较长，不利于病毒感染早期的诊断；免疫学检测敏感性和特异性较强，但是检测需要材料较多且测定的结果与抗体来源及亲和力有关；核酸PCR检测方法是目前灵敏度较高的一种检测方法，较病原体分离方法的检出率高，但是当PCR的靶序列发生突变则容易造成假阴性结果。
MASA液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array，多功能悬浮点阵仪)技术是20世纪90年代后期发展起来的一种新型芯片技术。该技术将流式检测技术与芯片技术有机的结合在一起，具有高灵敏性，高异性，高通量，操作简单的特点。液相芯片体系由许多大小均一的圆形微球构成，每种微球上固定有不同的探针分子，不同种类的微球带用不同的荧光染料编码，分子杂交在悬浮溶液中进行。检测过程中目的分子能够与偶联在微球上的探针特异性结合，使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白，当微球通过Luminex检测仪时，该检测仪上的红色和绿色激光分别对单个微球上的编码荧光和报告分子藻红蛋白进行检测，检测结果通过荧光值直接判读。由于液相芯片具有准确性高，灵活性好，操作简单，通量大等特点，目前已被广泛用在细胞因子的检测，激酶的检测，抗原决定簇的筛选，疾病病原体的检测，以及与各种抗原抗体反应相关的检测当中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种用液相芯片快速检测临床常见呼吸道传染病病原的引物和探针，还提供一种利用上述引物和探针检测临床常见呼吸道传染病病原的方法。
本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：
本发明提供的是一种基于MASA液相芯片对临床常见呼吸道传染病病原进行检测的引物，该引物根据基因库中能够检索到的目标病毒所有的核苷酸序列分别进行同源性分析和设计，具体是：
(1)用于检测人呼吸道合胞体病毒A型的引物F、引物R的DNA序列：
HRSV A-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCAGCTTATCAAATGGAGTTAGTG，
HRSV A-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCATTTGTTATAGGCATATCATTG；
(2)用于检测人呼吸道合胞体病毒B型的引物F、引物R的DNA序列：
HRSV B-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGGTGTAGGATCTGCAATAGC，
HRSV B-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCAATGTTGGAGATGCGACAGC；
(3)用于检测流感病毒A型的引物F、引物R的DNA序列：
InfV A-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGACAGCATCGGTCTCACAGAC，
InfV A-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCTTGAATCGCTGCATCTGCAC；
(4)用于检测流感病毒B型的引物F、引物R的DNA序列：
InfV B-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGTGAGCTTTCATGAAGCATTTG，
InfV B-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTTCATAGCTGAGACCATCTGC；
(5)用于检测SARS的引物F、引物R的DNA序列：
SARS-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTACACACCTCAGCGTTG，
SARS-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCACGAACGTGACGAAT；
(6)用于检测副流感病毒I型的引物F、引物R的DNA序列：
PIV-1-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGAGTGATTAAGTTTGATGA，
PIV-1-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCATTATTACCYGGACCAAG；
(7)用于检测副流感病毒II型的引物F、引物R的DNA序列：
PIV-2-F：：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCCTAAGTGATGGAATCAATCGC，
PIV-2-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAAGCCTAGATGATAGATCCCGC；
(8)用于检测副流感病毒III型的引物F、引物R的DNA序列：
PIV-3-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGATGCTTATACCTCRAATCTA，
PIV-3-R：：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTRGGATTTAAGTCAGGTACC；
(9)用于检测腮腺炎病毒的引物F、引物R的DNA序列：
Mumps virus-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGATTAGATTAGCAGATAGATCACC，
Mumps virus-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGATTAGTACACTGTAGCATCG。
本发明提供的用液相芯片检测呼吸道传染病病原的探针有9种，它们分别与上述的9种引物对应制成，这些探针为特异性检测探针，其DNA序列为：
(1)用于检测人呼吸道合胞体病毒A型的HRSV A-probe的DNA序列：
NH2-(CH2)12CTGGTAATCTCTAGTAGTCTG
(2)用于检测人呼吸道合胞体病毒B型的HRSVB-probe的DNA序列：
NH2-(CH2)12ATTTGATAGACTGACTACAGCT
(3)用于检测流感病毒A型的InfVA-probe的DNA序列：
NH2-(CH2)12GTACCATCTGCCTAGTCTGAT
(4)用于检测流感病毒B型的InfV B-probe的DNA序列：
NH2-(CH2)12AGCACAGAGCGTTCCTAGTT
(5)用于检测SARS的SARS-probe的DNA序列：
NH2-(CH2)12GATGAGTCTACGGTAGGTCAT
(6)用于检测副流感病毒I型的PIV-1-probe的DNA序列：
NH2-(CH2)12CTTCATTATCAATTGGTGATGCA
(7)用于检测副流感病毒II型的PIV-2-probe的DNA序列：
NH2-(CH2)12TATAATAATAGAAAGCAAGCAAGTCTCAG
(8)用于检测副流感病毒III型的PIV-3-probe的DNA序列：
NH2-(CH2)12CCTATATCCTGRCAACCTCGA
(9)用于检测腮腺炎病毒的Mumps virus-probe的DNA序列：
NH2-(CH2)12AGTAAGATTGGCGCGTGCAT。
本发明提供的用液相芯片检测呼吸道传染病病原的方法，其采用上述的引物和的探针，通过两轮PCR反应，分子杂交，再用Luminex100系统进行检测，从而确定样本中所含病原体的种类。
所述方法包括PCR产物的获得及与探针的杂交，检测结果的判定步骤。其中：
所述PCR产物的获得及与探针的杂交：用于液相芯片检测的PCR产物通过两轮PCR反应获得。第一轮反应用病毒特异性引物进行RT-PCR扩增目标基因片段。第二轮反应利用生物素标记的通用引物以第一轮反应产物为模板进行PCR，使所获得PCR产物带有生物素标记，同时第二轮PCR反应具有将第一轮PCR信号放大的作用，增加检测的灵敏度。获得的PCR产物与偶联在不同微球上的病毒特异性探针杂交。
所述检测结果的判定：杂交产物与报告分子亲和素-藻红蛋白孵育，亲和素-藻红蛋白可与杂交产物上的生物素特异性结合，使之带有荧光。通过Luminex检测仪读取微球上的荧光数值对检测结果进行判定。
本发明提供的方法用于9种临床常见呼吸道传染病病原的检测，该方法可以按下述步骤顺序进行：
a.提取样本中总RNA。
b.第一轮PCR反应为RT-PCR反应：
先以步骤a中提取的样本总RNA为模版，进行一步法RT-PCR，所用引物分别为权利要求1所述的9种引物；
在PCR管中加入下列物质：5×RT-PCR缓冲液5uL、四种脱氧核糖核苷酸1uL、酶1uL、RNA酶抑制剂0.5uL、浓度为20umol/L PCR引物F 0.25uL、浓度为20umol/L PCR引物R0.25uL、RNA模板1uL，加入超纯水21uL；
然后将PCR管放入Biometra T personal PCR仪中进行PCR反应，所得的产物为第一轮PCR扩增的目标基因片段。
c.第二轮PCR反应：
以含有第一轮PCR扩增的目标基因片段的溶液为模板进行第二轮PCR，在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液5uL，四种脱氧核糖核苷酸1uL，浓度为20umol/L的通用引物Universal-F 1uL，浓度为20umol/L的通用引物Universal-R 1uL，Taq DNA聚合酶1uL，第一轮PCR的产物2uL，超纯水39uL。
然后将PCR管放入PCR仪中进行第二轮PCR反应，得到第二轮PCR的产物为带有生物素标记的目标基因的溶液。
d.杂交反应：
分别把特异性检测探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释，使得每微升含有100个微球；所述杂交缓冲液为1.5×TMAC的氯化四甲铵。
将带有生物素标记的PCR产物分别与结合了特异性检测探针的微球在棕色容器中进行杂交，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物。
e.检测：
先用Luminex100仪器分别读取经步骤d杂交后的9种微球上的荧光标记的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值，然后根据荧光检测值判定是否含探针对应的病毒种类。
本发明使用Biometra T personal PCR仪进行第一轮RT-PCR反应时，其条件建议为：b1.50℃，30分钟；b2.94℃，15分钟；b3.94℃，30秒；b4.50℃，30秒；b5.72℃，30秒；b6.重复29次步骤b3～b5；b7.72℃，10分钟；b8.降温至4℃。
本发明将PCR管放入PCR仪进行第二轮PCR反应时，其条件建议为：c1.94℃，5分钟；c2.94℃，30秒；c3.60℃，30秒；c4.72℃，30秒；c5.重复29次步骤c2～c4；c6.72℃，10分钟；c7.降温至4℃。
本发明用于第二轮PCR的通用引物(生物素修饰的通用引物)序列为：
Universal-F：TACAGTCGGTCGCGTGCCTC
Universal-R：生物素(biotin)-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG。
本发明可以采用以下方法进行杂交：杂交体系为50uL，其中微球33uL，PCR反应产物5uL，加入TE补充体积至50uL；96℃变性5min后，55℃杂交15min，然后加入亲和素-藻红蛋白55℃杂交5min。
本发明可以采用以下方法根据荧光检测值判断是否含探针对应的病毒种类：对人呼吸道合胞体病毒A型、人呼吸道合胞体病毒B型、流感病毒A型、流感病毒B型、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、腮腺炎病毒的检测，当微球上的探针与带有生物素标记的PCR产物杂交后的荧光检测值＞200，则样品中含有该探针对应的病毒种类；当荧光检测值＜100，则样品中不含该探针对应的病毒种类；当100≤荧光检测值＜200时，不能确定样品中是否含探针对应的病毒种类。
本发明可以采用以下方法根据荧光检测值判断是否含探针对应的病毒种类：对SARS病原体的检测，当微球上的探针与带有生物素标记的PCR产物杂交后的荧光检测值＞1000，则样品中含有该探针对应的病毒种类；当荧光检测值＜500，则样品中不含该探针对应的病毒种类；当500≤荧光检测值＜1000时，不能确定样品中是否含探针对应的病毒种类。
本发明设计了针对9种临床常见呼吸道传染病病原的特异性引物和探针，使用9种荧光编码微球，利用液相芯片技术对标本进行了检测分析。发现基于液相芯片技术研制的针对9种临床常见呼吸道传染病病原的特异性引物和探针具有特异性高、灵敏度高的特点，对所有9种病原体都可进行明确的区分。
本发明提供的用液相芯片检测呼吸道传染病病原的方法，不仅检测速度快，完成一次检测仅需3.5小时，一次检测可以进行多个样本的同时检测，且操作简单，检测费用低，对每种病原的监测成本仅5元人民币，适合大范围推广应用。在对临床常见呼吸道传染病病原进行快速检测和进行早期诊断方面具有重要的应用价值。
总之，本发明具有速度快、操作简单、敏感性高、特异性好等优点，适合对9种临床常见呼吸道传染病病原的检测及早期诊断，因而能为这些常见呼吸道传染病病原的早期诊断和治疗及防止这些常见呼吸道传染病病原的传播作出重要贡献。
具体实施方式
本发明提供的方法是基于MASA液相芯片技术对病原进行检测。主要根据基因库中能够检索到的9种目标病毒所有的核苷酸序列分别进行同源性分析，设计简并引物和特异性探针，通过两轮PCR，分子杂交，再用Luminex100系统进行检测，从而确定样本中所含病原体的种类。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实例1：
已知样品1中含有人呼吸道合胞体病毒A型(HRSV-A)，按本发明的方法进行检测，具体步骤如下：
a.提取样本中总RNA。
b.以步骤a中提取的样本总RNA为模版，分别用各病毒的引物F和引物R进行PCR，各引物序列如下：
HRSV A-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCAGCTTATCAAATGGAGTTAGTG
HRSV A-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCATTTGTTATAGGCATATCATTG
HRSV B-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGGTGTAGGATCTGCAATAGC
HRSV B-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCAATGTTGGAGATGCGACAGC
InfV A-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGACAGCATCGGTCTCACAGAC
InfV A-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCTTGAATCGCTGCATCTGCAC
InfV B-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGTGAGCTTTCATGAAGCATTTG
InfV B-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTTCATAGCTGAGACCATCTGC
SARS-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTACACACCTCAGCGTTG
SARS-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCACGAACGTGACGAAT
PIV-1-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGAGTGATTAAGTTTGATGA
PIV-1-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCATTATTACCYGGACCAAG
PIV-2-F：：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCCTAAGTGATGGAATCAATCGC
PIV-2-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAAGCCTAGATGATAGATCCCGC
PIV-3-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGATGCTTATACCTCRAATCTA
PIV-3-R：：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTRGGATTTAAGTCAGGTACC
Mumps virus-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGATTAGATTAGCAGATAGATCACC
Mumps virus-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGATTAGTACACTGTAGCATCG。
c.第一轮PCR反应为RT-PCR反应：
在PCR管中加入下列物质：5×RT-PCR缓冲液5uL、四种脱氧核糖核苷酸1uL、酶1uL、每个反应中加入RNA酶抑制剂0.5uL、浓度为20umol/L PCR引物F 0.25uL、浓度为20umol/LPCR引物R 0.25uL、RNA模板1uL，加入超纯水21uL；
使用Biometra T personal PCR仪，其条件为：c1.50℃，30分钟；c2.94℃，15分钟；c3.94℃，30秒；c4.50℃，30秒；c5.72℃，30秒；c6.重复29次步骤c3～c5；c7、72℃10分钟；c8、降温至4℃；
所得的产物为第一轮PCR扩增的目标基因片段。
d.第二轮PCR：
以含有扩增的目标基因片段的溶液为模板进行第二轮PCR；
在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液5uL、四种脱氧核糖核苷酸1uL、浓度为20umol/L的通用引物Universal-F 1uL、浓度为20umol/L的通用引物Universal-R 1uL、Taq DNA聚合酶1uL、第一轮PCR的产物2uL和超纯水39uL；
将PCR管放入PCR仪，条件为：d1.94℃，5分钟；d2.94℃，30秒；d3.60℃，30秒；d4.72℃，30秒；d5.重复29次步骤d2～e4；d6.72℃，10分钟；d7.降温至4℃；
得到第二轮PCR的产物为带有生物素标记的目标基因溶液。
e.分别把特异性检测探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液(1.5×TMAC，氯化四甲铵)稀释，使得每微升含有100个微球，各探针序列如下：
HRSV A-probe：NH2-(CH2)12CTGGTAATCTCTAGTAGTCTG
HRSV B-probe：NH2-(CH2)12ATTTGATAGACTGACTACAGCT
InfV A-probe：NH2-(CH2)12GTACCATCTGCCTAGTCTGAT
InfV B-probe：NH2-(CH2)12AGCACAGAGCGTTCCTAGTT
SARS-probe：NH2-(CH2)12GATGAGTCTACGGTAGGTCAT
PIV-1-probe：NH2-(CH2)12CTTCATTATCAATTGGTGATGCA
PIV-2-probe：NH2-(CH2)12TATAATAATAGAAAGCAAGCAAGTCTCAG
PIV-3-probe：NH2-(CH2)12CCTATATCCTGRCAACCTCGA
Mumps virus-probe：NH2-(CH2)12AGTAAGATTGGCGCGTGCAT。
f.将带有生物素标记的PCR产物分别与结合了探针的微球在棕色容器中进行杂交，杂交体系为50uL，其中微球33uL，PCR产物5uL，加入TE补充体积至50uL。96℃变性5min后，55℃杂交15min。加入亲和素-藻红蛋白55℃杂交5min，得到荧光标记的目标基因与探针结合的产物。
g.用Luminex100仪器分别读取经步骤f杂交后的9种微球上的荧光标记的目标基因与探针结合的产物的荧光检测值；
h.当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒A型引物HRSVA-F及HRSVA-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒A型探针HRSVA-probe时，荧光检测值为981，确认样品中含有人呼吸道合胞体病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒B型引物HRSVB-F及HRSV B-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒B型探针HRSV B-probe时，荧光检测值为8，确认样品不含人呼吸道合胞体病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒A型引物InfVA-F及InfVA-R，步骤e的探针为流感病毒A型探针InfV A-probe时，荧光检测值为31，确认样品不含流感病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒B型引物InfVB-F及InfVB-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针InfV B-probe时，荧光检测值为23，确认样品不含流感病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为SARS引物SARS-F及SARS-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针SARS-probe时，荧光检测值为498，确认样品不含SARS病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒I型引物PIV-1-F及PIV-1-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-1-probe时，荧光检测值为19，确认样品不含副流感病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒II型引物PIV-2-F及PIV-2-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-2-probe时，荧光检测值为90，确认样品不含副流感病毒II型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒III型引物PIV-3-F及PIV-3-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-3-probe时，荧光检测值为59，确认样品不含副流感病毒III型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腮腺炎病毒引物Mumps virus-F及Mumps virus-R，步骤e的探针为腮腺炎病毒探针Mumps virus-probe时，荧光检测值为36，确认样品不含腮腺炎病毒；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例2：
已知样品中含有人呼吸道合胞体病毒B型(HRSV-B)，按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例1相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒A型引物HRSVA-F及HRSV A-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒A型探针HRSV A-probe时，荧光检测值为46，确认样品不含人呼吸道合胞体病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒B型引物HRSVB-F及HRSV B-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒B型探针HRSV B-probe时，荧光检测值为864，确认样品中含有人呼吸道合胞体病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒A型引物InfV A-F及InfVA-R，步骤e的探针为流感病毒A型探针InfV A-probe时，荧光检测值为45，确认样品不含流感病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒B型引物InfV B-F及InfVB-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针InfV B-probe时，荧光检测值为1，确认样品不含流感病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为SARS引物SARS-F及SARS-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针SARS-probe时，荧光检测值为279，确认样品不含SARS病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒I型引物PIV-1-F及PIV-1-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-1-probe时，荧光检测值为19，确认样品不含副流感病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒II型引物PIV-2-F及PIV-2-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-2-probe时，荧光检测值为27，确认样品不含副流感病毒II型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒III型引物PIV-3-F及PIV-3-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-3-probe时，荧光检测值为12，确认样品不含副流感病毒III型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腮腺炎病毒引物Mumps virus-F及Mumps virus-R，步骤e的探针为腮腺炎病毒探针Mumps virus-probe时，荧光检测值为31，确认样品不含腮腺炎病毒；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例3：
已知样品中含有流感病毒A型(InfVA)，按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例1相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒A型引物HRSVA-F及HRSV A-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒A型探针HRSV A-probe时，荧光检测值为12，确认样品不含人呼吸道合胞体病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒B型引物HRSVB-F及HRSV B-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒B型探针HRSV B-probe时，荧光检测值为34，确认样品不含人呼吸道合胞体病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒A型引物InfV A-F及InfVA-R，步骤e的探针为流感病毒A型探针InfV A-probe时，荧光检测值为1045，确认样品中含有流感病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒B型引物InfV B-F及InfVB-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针InfV B-probe时，荧光检测值为4，确认样品不含流感病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为SARS引物SARS-F及SARS-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针SARS-probe时，荧光检测值为279，确认样品不含SARS病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒I型引物PIV-1-F及PIV-1-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-1-probe时，荧光检测值为65，确认样品不含副流感病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒II型引物PIV-2-F及PIV-2-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-2-probe时，荧光检测值为37，确认样品不含副流感病毒II型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒III型引物PIV-3-F及PIV-3-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-3-probe时，荧光检测值为19，确认样品不含副流感病毒III型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腮腺炎病毒引物Mumps virus-F及Mumps virus-R，步骤e的探针为腮腺炎病毒探针Mumps virus-probe时，荧光检测值为56，确认样品不含腮腺炎病毒；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例4：
已知样品中含有流感病毒B型(InfVB)，按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例1相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒A型引物HRSVA-F及HRSV A-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒A型探针HRSV A-probe时，荧光检测值为23，确认样品不含人呼吸道合胞体病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒B型引物HRSVB-F及HRSV B-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒B型探针HRSV B-probe时，荧光检测值为31，确认样品不含人呼吸道合胞体病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒A型引物InfV A-F及InfVA-R，步骤e的探针为流感病毒A型探针InfV A-probe时，荧光检测值为10，确认样品不含流感病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒B型引物InfV B-F及InfVB-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针InfV B-probe时，荧光检测值为1240，确认样品中含有流感病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为SARS引物SARS-F及SARS-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针SARS-probe时，荧光检测值为283，确认样品不含SARS病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒I型引物PIV-1-F及PIV-1-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-1-probe时，荧光检测值为43，确认样品不含副流感病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒II型引物PIV-2-F及PIV-2-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-2-probe时，荧光检测值为91，确认样品不含副流感病毒II型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒III型引物PIV-3-F及PIV-3-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-3-probe时，荧光检测值为23，确认样品不含副流感病毒III型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腮腺炎病毒引物Mumps virus-F及Mumps virus-R，步骤e的探针为腮腺炎病毒探针Mumps virus-probe时，荧光检测值为16，确认样品不含腮腺炎病毒；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例5：
已知样品中含有副流感病毒I型(PIV-1)，按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例1相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒A型引物HRSVA-F及HRSV A-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒A型探针HRSV A-probe时，荧光检测值为22，确认样品不含人呼吸道合胞体病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒B型引物HRSVB-F及HRSV B-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒B型探针HRSV B-probe时，荧光检测值为13，确认样品不含人呼吸道合胞体病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒A型引物InfV A-F及InfVA-R，步骤e的探针为流感病毒A型探针InfV A-probe时，荧光检测值为56，确认样品不含流感病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒B型引物InfV B-F及InfVB-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针InfV B-probe时，荧光检测值为44，确认样品中不含流感病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为SARS引物SARS-F及SARS-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针SARS-probe时，荧光检测值为341，确认样品中不含SARS病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒I型引物PIV-1-F及PIV-1-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-1-probe时，荧光检测值为1243，确认样品中含有副流感病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒II型引物PIV-2-F及PIV-2-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-2-probe时，荧光检测值为19，确认样品不含副流感病毒II型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒III型引物PIV-3-F及PIV-3-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-3-probe时，荧光检测值为24，确认样品不含副流感病毒III型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腮腺炎病毒引物Mumps virus-F及Mumps virus-R，步骤e的探针为腮腺炎病毒探针Mumps virus-probe时，荧光检测值为23，确认样品不含腮腺炎病毒；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例6：
已知样品中含有副流感病毒II型(PIV-2)，按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例1相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒A型引物HRSVA-F及HRSV A-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒A型探针HRSV A-probe时，荧光检测值为45，确认样品不含人呼吸道合胞体病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒B型引物HRSVB-F及HRSV B-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒B型探针HRSV B-probe时，荧光检测值为21，确认样品不含人呼吸道合胞体病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒A型引物InfV A-F及InfVA-R，步骤e的探针为流感病毒A型探针InfV A-probe时，荧光检测值为13，确认样品不含流感病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒B型引物InfV B-F及InfVB-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针InfV B-probe时，荧光检测值为32，确认样品中不含流感病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为SARS引物SARS-F及SARS-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针SARS-probe时，荧光检测值为398，确认样品中不含SARS病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒I型引物PIV-1-F及PIV-1-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-1-probe时，荧光检测值为43，确认样品不含副流感病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒II型引物PIV-2-F及PIV-2-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-2-probe时，荧光检测值为1319，确认样品中含有副流感病毒II型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒III型引物PIV-3-F及PIV-3-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-3-probe时，荧光检测值为14，确认样品不含副流感病毒III型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腮腺炎病毒引物Mumps virus-F及Mumps virus-R，步骤e的探针为腮腺炎病毒探针Mumps virus-probe时，荧光检测值为29，确认样品不含腮腺炎病毒；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例7：
已知样品中含有副流感病毒III型(PIV-3)，按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例1相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒A型引物HRSVA-F及HRSV A-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒A型探针HRSV A-probe时，荧光检测值为40，确认样品不含人呼吸道合胞体病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒B型引物HRSVB-F及HRSV B-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒B型探针HRSV B-probe时，荧光检测值为11，确认样品不含人呼吸道合胞体病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒A型引物InfV A-F及InfVA-R，步骤e的探针为流感病毒A型探针InfV A-probe时，荧光检测值为21，确认样品不含流感病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒B型引物InfV B-F及InfVB-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针InfV B-probe时，荧光检测值为14，确认样品中不含流感病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为SARS引物SARS-F及SARS-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针SARS-probe时，荧光检测值为221，确认样品中不含SARS病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒I型引物PIV-1-F及PIV-1-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-1-probe时，荧光检测值为21，确认样品不含副流感病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒II型引物PIV-2-F及PIV-2-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-2-probe时，荧光检测值为32，确认样品中不含副流感病毒II型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒III型引物PIV-3-F及PIV-3-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-3-probe时，荧光检测值为1498，确认样品中含有副流感病毒III型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腮腺炎病毒引物Mumps virus-F及Mumps virus-R，步骤e的探针为腮腺炎病毒探针Mumps virus-probe时，荧光检测值为19，确认样品不含腮腺炎病毒；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
实例8：
已知样品中含有腮腺炎病毒(Mumps virus)，按本发明的方法进行检测，具体步骤与实例1相同，荧光检测值的结果如下：
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒A型引物HRSVA-F及HRSV A-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒A型探针HRSV A-probe时，荧光检测值为31，确认样品不含人呼吸道合胞体病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为人呼吸道合胞体病毒B型引物HRSVB-F及HRSV B-R，步骤e的探针为人呼吸道合胞体病毒B型探针HRSV B-probe时，荧光检测值为21，确认样品不含人呼吸道合胞体病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒A型引物InfV A-F及InfVA-R，步骤e的探针为流感病毒A型探针InfV A-probe时，荧光检测值为31，确认样品不含流感病毒A型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为流感病毒B型引物InfV B-F及InfVB-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针InfV B-probe时，荧光检测值为89，确认样品中不含流感病毒B型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为SARS引物SARS-F及SARS-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针SARS-probe时，荧光检测值为356，确认样品中不含SARS病毒；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒I型引物PIV-1-F及PIV-1-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-1-probe时，荧光检测值为24，确认样品不含副流感病毒I型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒II型引物PIV-2-F及PIV-2-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-2-probe时，荧光检测值为55，确认样品中不含副流感病毒II型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为副流感病毒III型引物PIV-3-F及PIV-3-R，步骤e的探针为流感病毒B型探针PIV-3-probe时，荧光检测值为18，确认样品中不含副流感病毒III型；
当步骤b第一轮PCR引物F及第一轮PCR引物R为腮腺炎病毒引物Mumps virus-F及Mumps virus-R，步骤e的探针为腮腺炎病毒探针Mumps virus-probe时，荧光检测值为1119，确认样品中含有腮腺炎病毒；
该检测结果与样品已知的结果完全一致。
上述实施例中，因为有些样品中可能含有一种以上的病原体，因此，即使已检测到某一种病原体，还需要检测其是否还含有其它种类的病原体。
上述实施例中，所采用的试剂盒由MASA液相芯片制成。
序列表
<110>中国科学院武汉病毒研究所
<120>用液相芯片检测呼吸道传染病病原的引物和探针及方法
<140>
<141>
<160>1
<170>
<210>1
<211>43
<212>DNA
<213>用于检测人呼吸道合胞体病毒A型的引物HRSV A-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>1
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCAGCTTATCAAATGGAGTTAGTG
<210>2
<211>44
<212>DNA
<213>用于检测人呼吸道合胞体病毒A型的引物HRSV A-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>2
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCATTTGTTATAGGCATATCATTG
<210>3
<211>41
<212>DNA
<213>用于检测人呼吸道合胞体病毒B型的引物HRSV B-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>3
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGGTGTAGGATCTGCAATAGC
<210>4
<211>41
<212>DNA
<213>用于检测人呼吸道合胞体病毒B型的引物HRSV B-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>4
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCAATGTTGGAGATGCGACAGC
<210>5
<211>40
<212>DNA
<213>用于检测流感病毒A型的引物InfV A-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>5
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGACAGCATCGGTCTCACAGAC
<210>6
<211>41
<212>DNA
<213>用于检测流感病毒A型的引物InfV A-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>6
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCTTGAATCGCTGCATCTGCAC
<210>7
<211>43
<212>DNA
<213>用于检测流感病毒B型的引物InfV B-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>7
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGTGAGCTTTCATGAAGCATTTG
<210>8
<211>41
<212>DNA
<213>用于检测流感病毒B型的引物InfV B-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>8
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTTCATAGCTGAGACCATCTGC
<210>9
<211>37
<212>DNA
<213>用于检测SARS的引物SARS-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>9
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTACACACCTCAGCGTTG
<210>10
<211>36
<212>DNA
<213>用于检测SARS的引物SARS-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>10
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCACGAACGTGACGAAT
<210>11
<211>40
<212>DNA
<213>用于检测副流感病毒I型的引物PIV-1-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>11
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGAGTGATTAAGTTTGATGA
<210>12
<211>38
<212>DNA
<213>用于检测副流感病毒I型的引物PIV-1-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>12
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCATTATTACCYGGACCAAG
<210>13
<211>42
<212>DNA
<213>用于检测副流感病毒II型的引物PIV-2-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>13
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCCTAAGTGATGGAATCAATCGC
<210>14
<211>42
<212>DNA
<213>用于检测副流感病毒II型的引物PIV-2-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>14
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAAGCCTAGATGATAGATCCCGC
<210>15
<211>40
<212>DNA
<213>用于检测副流感病毒III型的引物PIV-3-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>15
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGATGCTTATACCTCRAATCTA
<210>16
<211>40
<212>DNA
<213>用于检测副流感病毒III型的引物PIV-3-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>16
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTRGGATTTAAGTCAGGTACC
<210>17
<211>43
<212>DNA
<213>用于检测腮腺炎病毒的引物Mumps virus-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>17
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGATTAGATTAGCAGATAGATCACC
<210>18
<211>41
<212>DNA
<213>用于检测腮腺炎病毒的引物Mumps virus-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>18
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGATTAGTACACTGTAGCATCG
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>用于检测人呼吸道合胞体病毒A型的探针HRSVA-probe
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>19
NH2-(CH2)12CTGGTAATCTCTAGTAGTCTG
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>用于检测人呼吸道合胞体病毒B型的探针HRSV B-probe
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>20
NH2-(CH2)12ATTTGATAGACTGACTACAGCT
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>用于检测流感病毒A型的探针InfV A-probe
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>21
NH2-(CH2)12GTACCATCTGCCTAGTCTGAT
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>用于检测流感病毒B型的探针InfV B-probe
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>22
NH2-(CH2)12AGCACAGAGCGTTCCTAGTT
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>用于检测SARS的探针SARS-probe
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>23
NH2-(CH2)12GATGAGTCTACGGTAGGTCAT
<210>24
<211>23
<212>DNA
<213>用于检测副流感病毒I型的探针PIV-1-probe
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>24
NH2-(CH2)12CTTCATTATCAATTGGTGATGCA
<210>25
<211>29
<212>DNA
<213>用于检测副流感病毒II型的探针PIV-2-probe
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>25
NH2-(CH2)12TATAATAATAGAAAGCAAGCAAGTCTCAG
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>用于检测副流感病毒III型的探针PIV-3-probe
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>26
NH2-(CH2)12CCTATATCCTGRCAACCTCGA
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>用于检测腮腺炎病毒的探针Mumps virus-probe
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>27
NH2-(CH2)12AGTAAGATTGGCGCGTGCAT
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>第二轮PCR的通用引物Universal-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>28
TACAGTCGGTCGCGTGCCTC
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>第二轮PCR的通用引物Universal-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>29
biotin-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG
Claims (3)
1.一种用于检测呼吸道传染病病原的液相芯片，其特征是该液相芯片用于检测人呼吸道合胞体病毒A型，其由HRSV A-probe探针制成，该探针的DNA序列为：
NH2-(CH2)12CTGGTAATCTCTAGTAGTCTG。
2.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征是所述的探针由以下引物F、引物R的DNA序列设计而成：
HRSV A-F：CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCAGCTTATCAAATGGAGTTAGTG
HRSV A-R：TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCATTTGTTATAGGCATATCATTG。
3.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征在于：将液相芯片制成试剂盒。
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Legal Events
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Granted publication date: 20130213 Termination date: 20200321 |
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