CN111349721B - 用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 - Google Patents

用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1‑34所示的引物和SEQ ID NO.37‑53所示的探针。本公开通过以上所述的引物和探针建立了检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定。

Description

用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、 系统及方法。
背景技术
呼吸道感染(Respiratory tract infection，RTI)是一种常见疾病，广泛发生于任何年龄、性别及地 域的人群中，对个人、家庭和社会造成了严重的疾病负担。病毒感染是引发呼吸道感染的重要因素， 在发达国家，急性病毒性呼吸道感染是导致婴幼儿和儿童住院的首要因素；在发展中国家，急性病毒 性呼吸道感染是导致婴幼儿和儿童死亡的首要因素。除病毒外，介于病毒和细菌间的肺炎支原体和肺 炎衣原体常引起非典型性的肺炎，引起呼吸道感染以外的症状，容易在人口密集的地方引发流行。根 据流行病学，引起呼吸道感染常见的病原体有甲型流感病毒(Influenza A virus，InfluA)、乙型流感病 毒(Influenza B virus，InfluB)、呼吸道合胞病毒A型(respiratory syncytial virusestype A，RSVA)、 呼吸道合胞病毒B型(respiratory syncytial viruses typeB，RSVB)、腺病毒(adenovirus，ADV)、人 副流感1型病毒(Parainfluenza 1virus，PIV1)、人副流感2型病毒(Parainfluenza 2virus，PIV2)、人 副流感3型病毒(Parainfluenza 3virus，PIV3)、冠状病毒NL63(human Coronavirus NL63，HCoV-NL63)、 冠状病毒HKUI(humanCoronavirus HKUI，HCoV-HKUI)、冠状病毒229E(human Coronavirus 229E， HCoV-229E)、冠状病毒OC43(human Coronavirus OC43，HCoV-OC43)及肺炎支原体(MycoplasmaPneumoniae，MP)。
新型冠状病毒是2019年末首次发现的一种呼吸道感染病毒，被命名为2019-nCoV，能够引发严 重的肺炎症状，严重时可以导致患者死亡。因此，早日对具有相似症状的新型冠状病毒感染和其它常 见的呼吸道病原体感染进行诊断，早日对新型冠状病毒感染的患者进行隔离和治疗，对于遏制疫情发 展、缓解社会压力极为重要。
病毒的分离培养是呼吸道感染病毒检验的常用方法，其检验结果常被作为呼吸道病毒感染确诊的 “金标准”，常用的培养细胞由人肺癌细胞(A59)、马丁达比犬肾细胞(MDCK)等，根据培养样本 的不同，不同病毒培养的时间也有所不同，一般需要花费数日到两周不等，培养时间较长，不利于新 型冠状病毒感染的快速检测，容易导致延误治疗，而且该方法的特异性和敏感性均较差，不适用于感 染程度较轻时的早期诊断。
因此，亟需一种能够快速区别诊断具有相似症状的新型冠状病毒感染和其它常见的呼吸道病原体 感染的方法。
发明内容
本公开的目的是提供一种能够快速、准确的检测新型冠状病毒和其它常见的呼吸道感染病原体的 核酸试剂、试剂盒、系统及方法。
为了实现上述目的，本公开提供一种用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂，其中，所述核酸试 剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-34所示的引物和SEQ ID NO.37-53所 示的探针。
可选地，相对于1μmol的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-34所示的引物的用 量各自为0.4-0.7μmol、0.8-1.0μmol、0.4-0.6μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.6-1.0μmol、0.5-0.7μmol、 0.8-1.0μmol、0.4-0.5μmol、0.6-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.6-1.0μmol、0.4-0.5μmol、0.6-1.0μmol、0.1-0.3μmol、 0.6-1.0μmol、0.5-0.7μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、 0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol、0.2-0.4μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、 0.8-1.0μmol和0.4-0.6μmol，分别由SEQ ID NO.37-53所示的探针的用量各自为0.1-0.3μmol、 0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol、0.2-0.4μmol、0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol、0.2-0.4μmol、0.1-0.3μmol、0.2-0.4μmol、 0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol、0.2-0.4μmol、0.2-0.4μmol、0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol和0.1-0.3μmol。
可选地，所述核酸试剂还包括阳性内质控；
所述阳性内质控含有SEQ ID NO.35-36所示的引物和SEQ ID NO.54所示的探针；相对于1μmol 的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.35-36所示的引物的用量各自为0.8-1.0μmol和 0.4-0.6μmol，由SEQ ID NO.54所述的探针的用量为0.1-0.3μmol。
可选地，所述核酸试剂包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQ ID NO.1-12、35-36所示 的引物和SEQ ID NO.37-42、54所示的探针；B管含有SEQ ID NO.13-24、35-36所示的引物和SEQ ID NO.43-48、54所示的探针；C管含有SEQ ID NO.25-30、35-36所示的引物和SEQID NO.49-51、54 所示的探针；D管含有SEQ ID NO.31-34、35-36所示的引物和SEQ IDNO.52-53、54所示的探针。
可选地，SEQ ID NO.37、38、43、44、49、52所示的探针具有第一荧光标记；SEQ IDNO.39、 40、45、46、50、53所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.41、42、47、48、51所示的探针具 有第三荧光标记；SEQ ID NO.54所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光 标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧 光标记、CY5荧光标记、ROX荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标记和Quasar670荧光标记中的 一种。
可选地，所述呼吸道感染病原体包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合 胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、腺病毒、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病 毒3型、中东呼吸综合征相关冠状病毒、严重呼吸综合征相关冠状病毒、冠状病毒NL63、冠状病毒 HKUI、冠状病毒229E、冠状病毒OC43和肺炎支原体中的至少一种。
本公开还提供一种用于检测呼吸道感染病原体的试剂盒，该试剂盒含有上述任意一项所述的核 酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子、dNTP 和水中的至少一种。
本公开还提供上述任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测呼吸道感染病原体的试剂盒中的用 途。
本公开还提供一种用于检测呼吸道感染病原体的系统，该系统包括具有A管检测器、B管检测 器、C管检测器和D管检测器的PCR仪、计算装置和输出装置，所述A管检测器、B管检测器、C 管检测器和D管检测器分别为装载有上述任意一项所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述PCR 仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二 荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE 荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道或Quasar670荧光通道； 所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述 存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若阳性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道检测到Tm值为65℃和60℃对应的熔解峰曲线，则判定新型冠状病毒阳 性；若A管第二荧光通道检测到Tm值为63℃对应的熔解峰曲线，则判定甲型流感病毒阳性；若A 管第二荧光通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定乙型流感病毒阳性；若A管第三荧 光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定呼吸道合胞病毒A型阳性；若A管第三荧光 通道检测到Tm值为55℃对应的熔解峰曲线，则判定呼吸道合胞病毒B型阳性；若A管第四荧光通道 检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若B管第一荧光通道检测到Tm值为63℃对应的熔解峰曲线，则判定腺病毒阳性；若B管第一 荧光通道检测到Tm值为58℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感1型病毒阳性；若B管第二荧光 通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感2型病毒阳性；若B管第二荧光通道 检测到Tm值为54℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感3型病毒阳性；若B管第三荧光通道检测 到Tm值为65℃对应的熔解峰曲线，则判定中东呼吸综合征相关冠状病毒阳性；若B管第三荧光通 道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定严重呼吸综合征相关冠状病毒阳性；若B管第四 荧光通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若C管第一荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒NL63阳性；若 C管第二荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒OC43阳性；若C管第三 荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒HKUI阳性；若C管第四荧光通 道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若D管第一荧光通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒229E阳性；若 D管第二荧光通道检测到Tm值为56℃对应的熔解峰曲线，则判定肺炎支原体阳性；若D管第四荧 光通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格。
本公开还提供一种用于检测呼吸道感染病原体的方法，其中，该方法包括：采用上述任意一项 所述的核酸试剂，对待测样本的核酸进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括第一荧光通道、 第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧 光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、CY5荧光通 道、ROX荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道或Quasar670荧光通道；并且进行如下的判别：
若阳性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道检测到Tm值为65℃和60℃对应的熔解峰曲线，则判定新型冠状病毒阳 性；若A管第二荧光通道检测到Tm值为63℃对应的熔解峰曲线，则判定甲型流感病毒阳性；若A 管第二荧光通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定乙型流感病毒阳性；若A管第三荧 光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定呼吸道合胞病毒A型阳性；若A管第三荧光 通道检测到Tm值为55℃对应的熔解峰曲线，则判定呼吸道合胞病毒B型阳性；若A管第四荧光通道 检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若B管第一荧光通道检测到Tm值为63℃对应的熔解峰曲线，则判定腺病毒阳性；若B管第一 荧光通道检测到Tm值为58℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感1型病毒阳性；若B管第二荧光 通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感2型病毒阳性；若B管第二荧光通道 检测到Tm值为54℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感3型病毒阳性；若B管第三荧光通道检测 到Tm值为65℃对应的熔解峰曲线，则判定中东呼吸综合征相关冠状病毒阳性；若B管第三荧光通 道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定严重呼吸综合征相关冠状病毒阳性；若B管第四 荧光通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若C管第一荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒NL63阳性；若 C管第二荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒OC43阳性；若C管第三 荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒HKUI阳性；若C管第四荧光通 道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若D管第一荧光通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒229E阳性；若 D管第二荧光通道检测到Tm值为56℃对应的熔解峰曲线，则判定肺炎支原体阳性；若D管第四荧 光通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格。
本公开的有益效果在于：
本公开通过ParaDNA及Hybeacon探针技术检测呼吸道病原新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型 流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、腺病毒、人副流感病毒1型、人副流感病 毒2型、人副流感病毒3型、中东呼吸综合征相关冠状病毒、严重呼吸综合征相关冠状病毒、冠状病 毒NL63、冠状病毒HKUI、冠状病毒229E、冠状病毒OC43和肺炎支原体的多重系统检测方法，能 够实现形态学、免疫学及RT-PCR检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达 到如下的检测效果：
(一)较高的多重检测能力
近几年关于呼吸道病原的检测报道中大多采用RT-PCR的方法进行检测，该方法虽然可以实现多 目标的检测，但是受荧光通道数目的限制，需要多个扩增体系联检才能实现，增加了操作的复杂性。 本公开所建立的检测方法可以一次性检测包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道 合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、腺病毒、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感 病毒3型、中东呼吸综合征相关冠状病毒、严重呼吸综合征相关冠状病毒、冠状病毒NL63、冠状病 毒HKUI、冠状病毒229E、冠状病毒OC43和肺炎支原体在内的十六种呼吸道病原体，检测流程简单， 结果自动判读且可靠，节省了时间、人力和物力成本。
(二)简易的操作环节
临床样本可通过采样器直接放置于ParaDNA的反应器中直接检测即可获得可靠的结果，避免了 昂贵费时的样本提取步骤，实现了除专业实验室外的应急检测，适用于随时随地进行新型冠状病毒的 快速检测。
(三)较高程度的检测一体化
本公开针对快速检测并区分新型冠状病毒与其它常见呼吸道感染病原体的需求，提供了一套全面、 快速、准确及操作简便的检测新型冠状病毒及其它常见呼吸道感染病原体的一体化解决方案，包括了 核酸的快速提取、荧光PCR扩增及自动化结果的判定。
(四)特异性好
Hybeacon探针可识别引物结合区的SNP，使得其对非检测目标有极强的辨识能力。本公开所建 立的检测方法特异性还体现在一整套引物探针的特异性：所有引物探针都经过blast比对分析，具有 高度的保守性和特异性；同时经过特异性实验验证能够很好的区分包括鼻病毒、博卡病毒、麻疹病毒、 肠道病毒、巨细胞病毒、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟 菌、百日咳杆菌等呼吸道感染的其他病原体。
(五)最低检出限
本公开所建立的检测方法的最低检出限可达到1拷贝/反应，能够准确检测鉴别出新型冠状病毒 感染早期的患者，有助于新型冠状病毒感染患者的尽早隔离和治疗，对于控制新型冠状病毒感染疫情 的发展具有重要意义。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于 说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面提供一种用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别 彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-34所示的引物和SEQID NO.37-53所示的探针。
本公开通过ParaDNA及Hybeacon探针技术检测呼吸道感染病原体，避免了涂片、培养及RT-PCR 检测等方法操作时间长及操作繁琐，能够快速、准确、高通量的并行检测多种呼吸道感染病原体，实 现了新型冠状病毒与其它常见呼吸道感染病原体的快速、准确地检测和鉴别，能够快速确定受试者是 否感染有新型冠状病毒，有助于新型冠状病毒感染者的早日隔离和治疗，对于新型冠状病毒感染疫情 的控制具有重要意义。
Hybeacon探针技术对探针的要求较高，探针的Tm值尤为重要；此外，探针与引物的组合效果对 扩增效果也有重要的影响。上述引物和探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因的引物和探针 在一个反应体系内共扩增的问题，即评估Tm值、目标对应探针的Tm值的差值、GC含量、避免出 现发夹结构及二聚体等情况，而且要保证备选引物和探针区段分别能够全面覆盖多种呼吸道感染病原 体，特异性良好并且覆盖度高。
根据本公开，上述引物和探针的相对用量可以在较大范围内变化，例如，相对于1μmol的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-34所示的引物的用量各自可以为0.4-0.7μmol、0.8-1.0μmol、 0.4-0.6μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.6-1.0μmol、0.5-0.7μmol、0.8-1.0μmol、0.4-0.5μmol、0.6-1.0μmol、 0.3-0.5μmol、0.6-1.0μmol、0.4-0.5μmol、0.6-1.0μmol、0.1-0.3μmol、0.6-1.0μmol、0.5-0.7μmol、0.8-1.0μmol、 0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol、 0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol、0.2-0.4μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol和0.4-0.6μmol，分别 由SEQ ID NO.37-53所示的探针的用量各自可以为0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol、0.2-0.4μmol、 0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol、0.2-0.4μmol、0.1-0.3μmol、0.2-0.4μmol、0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol、 0.2-0.4μmol、0.2-0.4μmol、0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol和0.1-0.3μmol。
根据本公开，为做好质量控制，所述核酸试剂还可以包括阳性内质控(InternalAmplification Control， IAC)。进一步地，所述阳性内质控选用人核糖核酸酶P(RNaseP)基因，其含有SEQ ID NO.35-36 所示的引物和SEQ ID NO.54所示的探针。这时，相对于1μmol的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由 SEQ ID NO.35-36所示的引物的用量各自可以为0.8-1.0μmol和0.4-0.6μmol，由SEQ ID NO.54所述的 探针的用量可以为0.1-0.3μmol。所述阳性内质控可以有效提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造 成的假阴性检测结果。
根据本公开，为了进一步增强检测结果的准确性，可以将所述核酸试剂分为多管进行存储和使用， 例如，所述核酸试剂可以包括A管、B管、C管和D管；A管可以含有SEQ IDNO.1-12、35-36所示 的引物和SEQ ID NO.37-42、54所示的探针；B管可以含有SEQ IDNO.13-24、35-36所示的引物和 SEQ ID NO.43-48、54所示的探针；C管可以含有SEQ IDNO.25-30、35-36所示的引物和SEQ ID NO.49-51、54所示的探针；D管可以含有SEQ IDNO.31-34、35-36所示的引物和SEQ ID NO.52-53、 54所示的探针。
进一步地，可以根据探针各自的Tm值进行荧光标记的排列组合，使得同一体系中的不同探针的 扩增被分别识别。例如，作为一种实施方式，SEQ ID NO.37、38、43、44、49、52所示的探针具有 第一荧光标记；SEQ ID NO.39、40、45、46、50、53所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.41、 42、47、48、51所示的探针具有第三荧光标记；SEQ ID NO.54所示的探针具有第四荧光标记；所述 第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地 选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、CY5荧光标记、ROX荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标 记和Quasar670荧光标记中的一种。作为一种特别优选的实施方式，SEQ ID NO.37、38、43、44、49、 52所示的探针具有FAM荧光标记；SEQ IDNO.39、40、45、46、50、53所示的探针具有JOE荧光 标记；SEQ ID NO.41、42、47、48、51所示的探针具有CY5荧光标记；SEQ ID NO.54所示的探针具 有ROX荧光标记。为了增强熔解峰效果，上述目标探针均可为双标记探针。探针中FAM为6-羧基 荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，CY5为5H-吲哚菁，ROX为6-羧基-X-罗丹明。
根据本公开，所述呼吸道感染病原体可以包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼 吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、腺病毒、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副 流感病毒3型、中东呼吸综合征相关冠状病毒、严重呼吸综合征相关冠状病毒、冠状病毒NL63、冠 状病毒HKUI、冠状病毒229E、冠状病毒OC43和肺炎支原体中的至少一种。
本公开第二方面提供一种用于检测呼吸道感染病原体的试剂盒，该试剂盒含有上述任意一项所述 的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子、 dNTP和水中的至少一种。
本公开的试剂盒能够实现快速、准确、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对包括新 型冠状病毒在内的多种呼吸道感染病原体进行检测的敏感性、特异性和简便性，实现了新型冠状病毒 与其它常见呼吸道感染病原体的快速、准确地检测和鉴别，能够快速确定受试者是否感染有新型冠状 病毒，有助于新型冠状病毒感染者的早日隔离和治疗，对于新型冠状病毒感染疫情的控制具有重要意 义。
本公开第三方面提供上述任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测呼吸道感染病原体的试剂盒 中的用途。
本公开第四方面提供一种用于检测呼吸道感染病原体的系统，该系统包括具有A管检测器、B管 检测器、C管检测器和D管检测器的PCR仪、计算装置和输出装置，所述A管检测器、B管检测器、 C管检测器和D管检测器分别为装载有上述任意一项所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述PCR 仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二 荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE 荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道或Quasar670荧光通道； 所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述 存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若阳性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道检测到Tm值为65℃和60℃对应的熔解峰曲线，则判定新型冠状病毒阳性； 若A管第二荧光通道检测到Tm值为63℃对应的熔解峰曲线，则判定甲型流感病毒阳性；若A管第 二荧光通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定乙型流感病毒阳性；若A管第三荧光通 道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定呼吸道合胞病毒A型阳性；若A管第三荧光通道 检测到Tm值为55℃对应的熔解峰曲线，则判定呼吸道合胞病毒B型阳性；若A管第四荧光通道检 测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若B管第一荧光通道检测到Tm值为63℃对应的熔解峰曲线，则判定腺病毒阳性；若B管第一 荧光通道检测到Tm值为58℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感1型病毒阳性；若B管第二荧光 通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感2型病毒阳性；若B管第二荧光通道 检测到Tm值为54℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感3型病毒阳性；若B管第三荧光通道检测 到Tm值为65℃对应的熔解峰曲线，则判定中东呼吸综合征相关冠状病毒阳性；若B管第三荧光通 道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定严重呼吸综合征相关冠状病毒阳性；若B管第四 荧光通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若C管第一荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒NL63阳性；若C 管第二荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒OC43阳性；若C管第三荧 光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒HKUI阳性；若C管第四荧光通道 检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若D管第一荧光通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒229E阳性；若D 管第二荧光通道检测到Tm值为56℃对应的熔解峰曲线，则判定肺炎支原体阳性；若D管第四荧光 通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格。
本公开第五方面提供一种用于检测呼吸道感染病原体的方法，其中，该方法包括：采用上述任意 一项所述的核酸试剂，对待测样本的核酸进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括第一荧光 通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述 第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、CY5 荧光通道、ROX荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道或Quasar670荧光通道；并且进行如下的 判别：
若阳性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道检测到Tm值为65℃和60℃对应的熔解峰曲线，则判定新型冠状病毒阳性； 若A管第二荧光通道检测到Tm值为63℃对应的熔解峰曲线，则判定甲型流感病毒阳性；若A管第 二荧光通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定乙型流感病毒阳性；若A管第三荧光通 道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定呼吸道合胞病毒A型阳性；若A管第三荧光通道 检测到Tm值为55℃对应的熔解峰曲线，则判定呼吸道合胞病毒B型阳性；若A管第四荧光通道检 测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若B管第一荧光通道检测到Tm值为63℃对应的熔解峰曲线，则判定腺病毒阳性；若B管第一 荧光通道检测到Tm值为58℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感1型病毒阳性；若B管第二荧光 通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感2型病毒阳性；若B管第二荧光通道 检测到Tm值为54℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感3型病毒阳性；若B管第三荧光通道检测 到Tm值为65℃对应的熔解峰曲线，则判定中东呼吸综合征相关冠状病毒阳性；若B管第三荧光通 道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定严重呼吸综合征相关冠状病毒阳性；若B管第四 荧光通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若C管第一荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒NL63阳性；若C 管第二荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒OC43阳性；若C管第三荧 光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒HKUI阳性；若C管第四荧光通道 检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若D管第一荧光通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒229E阳性；若D 管第二荧光通道检测到Tm值为56℃对应的熔解峰曲线，则判定肺炎支原体阳性；若D管第四荧光 通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格。
其中，所述待测样本可以为采集自病人的咽拭子和/或痰液，所述PCR扩增的条件可以为：50℃， 10min，98℃，60s，(98℃，10s，65℃，10s，35个循环)；溶解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s， 降率为1.0℃/s；80℃，5s，升率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。
优选地，本公开的用于检测呼吸道感染病原体的方法不用于诊断，或者说呼吸道感染病原体的定 性与定量结果与疾病是否发生没有一一对应的相关性，不属于诊断结果，但是呼吸道感染病原体的检 测结果能够作为中间信息，供临床医生参考。
本公开的方法能快速、敏感、特异地实现多种呼吸道感染病原体的系统筛检，检测流程简单，结 果自动判读且可靠，节省了时间、人力和试剂成本。
以下通过实施例进行进一步详细说明本公开，但是本公开并不因此受到任何限制。
以下实施例中试剂均为商购产品，引物、探针均在Biosearch(USA)公司合成。
实施例
1、引物、探针合成
按照表1所示的引物序列和表2所示的探针序列，进行序列合成。序列中Y代表简并碱基T/C； R代表简并碱基A/G。探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，CY5 为5H-吲哚菁，ROX为6-羧基-X-罗丹明。表2的探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记， 括号中的内容表示荧光标记的选择。
表1
Figure BDA0002418179070000061
表2
Figure BDA0002418179070000062
Figure BDA0002418179070000071
2、样本处理
采用ParaDNA配套的采样器采集咽拭子和/或痰液等临床样本，直接置于ParaDNA的反应器中即 可扩增。
3、构建Hybeacon探针技术检测体系
聚合酶Phire Hot Start II DNA Polymerase(货号F122L)，Mg2+、dNTPS购自ThermoFisher公司， 逆转录酶GoScriptTM(货号A5001)购自Promega；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯；荧光 检测仪为ParaDNA。
按照如下操作配制反应体系：总体系30μL，5×Goscript Buffer 5μL，氯化镁溶液3-4mM，dNTPS 为1-1.5mM，上游引物0.8-1.0μM，下游引物0.2-0.5μM，Hybeacon探针100-300nM，逆转录酶1-2μL， 具体引物和探针含量见表3，剩余用水补足。
表3
SEQ ID NO 终浓度(μM) SEQ ID NO 终浓度(μM) SEQ ID NO 终浓度(μM)
1 1 21 1 41 0.25
2 0.6 22 0.4 42 0.2
3 1 23 1 43 0.3
4 0.5 24 0.4 44 0.2
5 1 25 1 45 0.3
6 0.4 26 0.4 46 0.2
7 1 27 1 47 0.2
8 0.6 28 0.4 48 0.2
9 1 29 1 49 0.3
10 0.45 30 0.3 50 0.3
11 1 31 1 51 0.2
12 0.4 32 0.4 52 0.2
13 1 33 1 53 0.2
14 0.45 34 0.5 54 0.2
15 1 35 1
16 0.2 36 0.5
17 1 37 0.2
18 0.6 38 0.2
19 1 39 0.2
20 0.4 40 0.3
试剂盒含有5×Goscript Buffer、Phire Hot Start II DNA Polymerase，逆转录酶、10×引物探针混合 液A管、10×引物探针混合液B管、10×引物探针混合液C管、10×引物探针混合液D管、阳性对 照、阴性对照、超纯水。A管含有上表1中SEQ ID NO.1-12、35-36所示的引物和上表2中SEQ ID NO.37-42、54所示的探针；B管含有上表1中SEQ ID NO.13-24、35-36所示的引物和上表2中SEQ ID NO.43-48、54所示的探针；C管含有上表1中SEQ IDNO.25-30、35-36所示的引物和上表2中SEQ ID NO.49-51、54所示的探针；D管含有上表1中SEQ ID NO.31-34、35-36所示的引物和上表2中SEQ ID NO.52-53、54所示的探针。
将PCR管放入荧光定量PCR仪中，选择FAM、JOE、CY5和ROX作为报告基团，反应程序如 下：50℃，10min，98℃，60s，(98℃，10s，65℃，10s，35个循环)；熔解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s，降率为1.0℃/s；80℃，5s，升率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。
反应结果判断：
若阳性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道检测到Tm值为65℃和60℃对应的熔解峰曲线，则判定新型冠状病毒阳性； 若A管第二荧光通道检测到Tm值为63℃对应的熔解峰曲线，则判定甲型流感病毒阳性；若A管第 二荧光通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定乙型流感病毒阳性；若A管第三荧光通 道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定呼吸道合胞病毒A型阳性；若A管第三荧光通道 检测到Tm值为55℃对应的熔解峰曲线，则判定呼吸道合胞病毒B型阳性；若A管第四荧光通道检 测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若B管第一荧光通道检测到Tm值为63℃对应的熔解峰曲线，则判定腺病毒阳性；若B管第一 荧光通道检测到Tm值为58℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感1型病毒阳性；若B管第二荧光 通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感2型病毒阳性；若B管第二荧光通道 检测到Tm值为54℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感3型病毒阳性；若B管第三荧光通道检测 到Tm值为65℃对应的熔解峰曲线，则判定中东呼吸综合征相关冠状病毒阳性；若B管第三荧光通 道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定严重呼吸综合征相关冠状病毒阳性；若B管第四 荧光通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若C管第一荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒NL63阳性；若C 管第二荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒OC43阳性；若C管第三荧 光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒HKUI阳性；若C管第四荧光通道 检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若D管第一荧光通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒229E阳性；若D 管第二荧光通道检测到Tm值为56℃对应的熔解峰曲线，则判定肺炎支原体阳性；若D管第四荧光 通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格。
4、特异性验证
选择鼻病毒、博卡病毒、麻疹病毒、肠道病毒、巨细胞病毒、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、 表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、百日咳杆菌等呼吸道感染的其他病原体的临床样本(上 述样本均来源于中国医学科学院病原生物学研究所)作为特异性评估样本，采用系统检测中的采样器 采集痰液(液化)样本后，利用前期建立和优化的反应条件在ParaDNA上进行检测。
结果显示在阳性对照成立的条件下，待检目标均无特异性的熔解峰，表明本公开的核酸试剂能够 有效区分检测目标与非检测目标，具有较好的特异性。
5、最低检出限验证
评估用检测样本：选取初始浓度为105拷贝/μL的呼吸道病原新型冠状病毒(2019-nCoV)、甲型 流感病毒(InfluA)、乙型流感病毒(InfluB)、呼吸道合胞病毒A型(RSVA)、呼吸道合胞病毒B型 (RSVB)、腺病毒(ADV)、人副流感病毒1型(PIV1)、人副流感病毒2型(PIV2)、人副流感病毒 3型(PIV3)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-COV)、严重呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)、 冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、冠状病毒HKUI(HCoV-HKUI)、 冠状病毒229E(HCoV-229E)、肺炎支原体(MP)的核酸，梯度稀释为104拷贝/μL、103拷贝/μL、 102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL，作为最低检出限评估的模板，并利用前期建立和优化的反应 条件在ParaDNA上进行检测。
结果显示本公开试剂盒检测目标呼吸道感染病原体核酸的最低检出限均可达到1拷贝/反应。
6、覆盖度验证
选择160株评价用咽拭子或痰液样本作为覆盖度评估用模板。按照以上所述反应体系及反应程序 进行试验。
结果显示对所有样本均可覆盖检测出。
7、试剂盒的保存期试验
以100拷贝/μL的新型冠状病毒(2019-nCoV)、甲型流感病毒(InfluA)、乙型流感病毒(InfluB)、 呼吸道合胞病毒A型(RSVA)、呼吸道合胞病毒B型(RSVB)、腺病毒(ADV)、人副流感病毒1 型(PIV1)、人副流感病毒2型(PIV2)、人副流感病毒3型(PIV3)、中东呼吸综合征相关冠状病毒 (MERS-COV)、严重呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)、冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、冠状 病毒OC43(HCoV-OC43)、冠状病毒HKUI(HCoV-HKUI)、冠状病毒229E(HCoV-229E)、肺炎 支原体(MP)的临床样本或假病毒(SARS和MERS)作为评估用样本。
在第0天时，分装成10份冻存于-80℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、 10、15、30、60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。
结果显示本公开试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，表明该试剂盒的保存期 至少为一年。
对比例
1、引物、探针合成
按照表4和表5所示的引物、探针序列，进行序列合成。探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为 2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，CY5为5H-吲哚菁，ROX为6-羧基-X-罗丹明。表5的探针序列 中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。
表4
Figure BDA0002418179070000081
Figure BDA0002418179070000091
表5
Figure BDA0002418179070000092
2、特异性验证
按照实施例的方法进行特异性验证。结果显示，对比例的引物、探针的反应结果均为阴性。
3、最低检出限验证
按照实施例的方法进行最低检出限验证。实施例与对比例的最低检出限对比如下表6。
表6
检测目标 实施例 对比例
2019-nCoV-ORF1ab基因 1拷贝/反应 50拷贝/反应
2019-nCoV-N基因 1拷贝/反应 50拷贝/反应
InfluA 1拷贝/反应 50拷贝/反应
InfluB 1拷贝/反应 50拷贝/反应
RSVA 1拷贝/反应 100拷贝/反应
RSVB 1拷贝/反应 100拷贝/反应
ADV 1拷贝/反应 100拷贝/反应
PIV1 1拷贝/反应 100拷贝/反应
PIV2 1拷贝/反应 50拷贝/反应
PIV3 1拷贝/反应 50拷贝/反应
MERS-CoV 1拷贝/反应 100拷贝/反应
SARS-CoV 1拷贝/反应 50拷贝/反应
HCoV-NL63 1拷贝/反应 100拷贝/反应
HCoV-HKUI 1拷贝/反应 50拷贝/反应
HCoV-OC43 1拷贝/反应 100拷贝/反应
HCoV-229E 1拷贝/反应 100拷贝/反应
MP 1拷贝/反应 100拷贝/反应
由表6可知，对于样本中痕量的呼吸道感染病原2019-nCoV、InfluA、InfluB、RSVA、RSVB、 ADV、PIV1、PIV2、PIV3、MERS-COV、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKUI、HCoV-229E、MP核酸，本公开试剂盒比对比例有更强的检测能力。
4、覆盖度验证
按照实施例的方法进行覆盖度验证。实施例与对比例的覆盖度对比如下表7。
表7
检测目标 实施例 对比例
2019-nCoV-ORF1ab基因 10 10
2019-nCoV-N基因 10 10
InfluA 10 9
InfluB 10 9
RSVA 10 9
RSVB 10 8
ADV 10 8
PIV1 10 10
PIV2 10 8
PIV3 10 7
MERS-CoV 10 9
SARS-CoV 10 9
HCoV-NL63 10 8
HCoV-HKUI 10 8
HCoV-OC43 10 7
HCoV-229E 10 7
MP 10 7
由表7可知，本公开试剂盒的检测覆盖度远远大于对比例的检测覆盖度。
由实施例和对比例的对比可以看出，本公开可以检测出呼吸道感染病原2019-nCoV、InfluA、InfluB、 RSVA、RSVB、ADV、PIV1、PIV2、PIV3、MERS-COV、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-OC43、 HCoV-HKUI、HCoV-229E、MP，特异性高，最低检出限更低，覆盖度更广。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在 本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开 的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可 以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说 明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其 同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司
中国医学科学院病原生物学研究所
<120> 用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法
<130> 16239ABT
<160> 108
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctgtgggtt ttacacttaa a 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgattgtgca tcagctgact gaa 23
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acttctcctg ctagaatgg 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagacatttt gctctcaa 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgagatcgcg cagagacttg aa 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcctcgctc actgggcacg g 21
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgaagagag aaaagcaatt ggagtaa 27
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcacctctc tggtgttgag gggt 24
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggatgaatt tatggagg 18
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
attcacatgg tctactactg actgt 25
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aggccaaaaa gttgtt 16
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tctataagct ggtattg 17
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcgatgctgc cccaatggg 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagacaccta cttcaatctg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aacccacaag gcaacaacat 20
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggtctacaa cccgaaa 17
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tctcttaaat caattccta 19
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggtctcatgg attccgatga tt 22
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctggaagcac accaaccacg g 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atgttatctt gttggtgagc t 21
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tggatggacg attttgagg 19
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aatgcgtagg cactaatggg tttt 24
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtagagaatc ctgacatctt acg 23
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atcctgatta tctaatgtca gtacg 25
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aattgggccg atgacagagc tgc 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
accaataggg acaagattcc tgg 23
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tccagtagta gagcgtcctc tggaa 25
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggtttgaaca tttctaaact ggtc 24
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aatcaaacca acgtagtgcc c 21
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ttgggtaaac cttggggtcg gcgct 25
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tgggctgatg agtctgagca gcagc 25
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tcaccttcca aggttgttca ctg 23
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gatgatataa ccgcgcc 17
<210> 34
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gaacgcgaac cactt 15
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cgaggcggtt ctcggtgggg gccgag 26
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
caccaacgga cgtgaagccg gtgag 25
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctgtaccgtc tgcggtatg 19
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cggtgatgct gctcttgctt tgct 24
<210> 39
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gatctcgagg ctctcatgga atggctaaag acaa 34
<210> 40
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ccgtctgctg gaattgaagg gtttgagcca t 31
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tagcatagga actcttgggt taacat 26
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gtcaattatt tacaccggtt aaca 24
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cacatcgccg gacaggatgc ttcgga 26
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ctatacaaac gatggctgaa aagg 24
<210> 45
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
actgccacaa ttcttggaat atgcacattg a 31
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ctggtaatga gctggagaca tcc 23
<210> 47
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cctaaaggca aatatgccca gaatctgctt aaga 34
<210> 48
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
atgctaactt aggtgagcgt gtacgccaat ca 32
<210> 49
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
taggaagaaa tttcctcctc cttcatttta catgc 35
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gtctggtaat ggcatcctca agtgggc 27
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gcattacatt tggtggaccc acagattcaa 30
<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tggtcgtcag ggtagaatcc cttattccgt ttatag 36
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tarattccgc tggacgaccc cg 22
<210> 54
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ccgccgattc ttccccccga gcggctc 27
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tctgtaccgt ctgcggtatg tgg 23
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gcgaacccat gcttcagtc 19
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
atggcggtga tgctgctctt 20
<210> 58
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
agcttgagag caaaa 15
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
caagtgagca ggcagcggaa g 21
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ctgcagttgc actcccatcc g 21
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ggattgatta cccttcaacc c 21
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
ttcaatctat gtagagttga ta 22
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ggctatggca agactcagga atgaagaa 28
<210> 64
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
taggacattg tattgaacag cagctgt 27
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
atgtttaggc aaatccaaat ctta 24
<210> 66
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gtccacagtt tttgacacca gccctca 27
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
aatattcaac tatggaagat cctg 24
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
cccatccaca gtggatccca tg 22
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ggtgccgaag ggaggctact taa 23
<210> 70
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
tgcgtacagt gtggttgtag caacatt 27
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
taattgctgg tccgactagt gga 23
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
tatattgcag agcgtattat tgacc 25
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
attactgggg gtcagaagga agg 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
tgctccctgt gggatttagt gga 23
<210> 75
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
aaaacccatt agtgcctacg cattttt 27
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ttgttcttta atgtgatgaa gcc 23
<210> 77
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
gcgatgctat gcgtgatgca ggcatt 26
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
tcagcaatga gtaatatgaa tcc 23
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
ataattcatc tcgtgctagc agt 23
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
tccaacgagg tttcttcaac tg 22
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
caacttcact tacaccatgt ggct 24
<210> 82
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ataatctcct ttactgtagg ctgtt 25
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
tgtggcggtt gctattatgt t 21
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gcgtatactt aaatcttcaa tc 22
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
aacgcactgt ttgtttttct gtc 23
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
ggtaggtctg ttgtaacgat aat 23
<210> 87
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
aacacgcgag cgggtggttc gggg 24
<210> 88
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gctgcgtcgc atcacttgca tcca 24
<210> 89
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
cgcggcggtg ggggtgccgt cccgccg 27
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
gagggggcgc cgggggcggg aac 23
<210> 91
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
aggttatggc tgtagttgtg at 22
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
ttgctgcttg acagattgaa cca 23
<210> 93
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
cttattgaaa atttgcaggc ttacc 25
<210> 94
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
cctcaaacac cccaatggat acaagt 26
<210> 95
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
gatactatag ttacaaaaaa agatgggg 28
<210> 96
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
tcatgttgtt aatcttaatg aagttgat 28
<210> 97
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
ccaccatggg caggagttcg tcagaa 26
<210> 98
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
tgcatatcca ctatcccctg atgc 24
<210> 99
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
ataccaagac tgagtttgta actaagattc 30
<210> 100
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
tggatgtata acaggagtat atact 25
<210> 101
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
tggctgatgt tgaagcggac gtcgcagcac gtgctg 36
<210> 102
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
gatttcgtac aagtagcacc aggctgcgga gt 32
<210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
aagctcctgt tgctgccgaa cctac 25
<210> 104
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
tctggtactt ccactcctaa gaaacc 26
<210> 105
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
catgttggac tcttggatca agcatggag 29
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
cttttgctaa ctctgttttt aatat 25
<210> 107
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
ggttcagaat taacattgaa gca 23
<210> 108
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
gagcgtcggc tccgcctggg ccct 24

Claims (8)

1.一种用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-34所示的引物和SEQ ID NO.37-53所示的探针；
所述呼吸道感染病原体包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、腺病毒、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病毒3型、中东呼吸综合征相关冠状病毒、严重呼吸综合征相关冠状病毒、冠状病毒NL63、冠状病毒HKUI、冠状病毒229E、冠状病毒OC43和肺炎支原体中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，相对于1μmol的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-34所示的引物的用量各自为0.4-0.7μmol、0.8-1.0μmol、0.4-0.6μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.6-1.0μmol、0.5-0.7μmol、0.8-1.0μmol、0.4-0.5μmol、0.6-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.6-1.0μmol、0.4-0.5μmol、0.6-1.0μmol、0.1-0.3μmol、0.6-1.0μmol、0.5-0.7μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol、0.2-0.4μmol、0.8-1.0μmol、0.3-0.5μmol、0.8-1.0μmol和0.4-0.6μmol，分别由SEQ ID NO.37-53所示的探针的用量各自为0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol、0.2-0.4μmol、0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol、0.2-0.4μmol、0.1-0.3μmol、0.2-0.4μmol、0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol、0.2-0.4μmol、0.2-0.4μmol、0.1-0.3μmol、0.1-0.3μmol和0.1-0.3μmol。
3.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，所述核酸试剂还包括阳性内质控；
所述阳性内质控含有SEQ ID NO.35-36所示的引物和SEQ ID NO.54所示的探针；相对于1μmol的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.35-36所示的引物的用量各自为0.8-1.0μmol和0.4-0.6μmol，由SEQ ID NO.54所述的探针的用量为0.1-0.3μmol。
4.根据权利要求3所述的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQ ID NO.1-12、35-36所示的引物和SEQ ID NO.37-42、54所示的探针；B管含有SEQ IDNO.13-24、35-36所示的引物和SEQ ID NO.43-48、54所示的探针；C管含有SEQ ID NO.25-30、35-36所示的引物和SEQ ID NO.49-51、54所示的探针；D管含有SEQ ID NO.31-34、35-36所示的引物和SEQ ID NO.52-53、54所示的探针。
5.根据权利要求4所述的核酸试剂，其中，SEQ ID NO.37、38、43、44、49、52所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.39、40、45、46、50、53所示的探针具有第二荧光标记；SEQ IDNO.41、42、47、48、51所示的探针具有第三荧光标记；SEQ ID NO.54所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、CY5荧光标记、ROX荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标记和Quasar670荧光标记中的一种。
6.一种用于检测呼吸道感染病原体的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1～5中任意一项所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子、dNTP和水中的至少一种。
7.权利要求1～5中任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测呼吸道感染病原体的试剂盒中的用途。
8.一种用于检测呼吸道感染病原体的系统，该系统包括具有A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器的PCR仪、计算装置和输出装置，所述A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器分别为装载有权利要求4～5中任意一项所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道或Quasar670荧光通道；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若阳性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道检测到Tm值为65℃和60℃对应的熔解峰曲线，则判定新型冠状病毒阳性；若A管第二荧光通道检测到Tm值为63℃对应的熔解峰曲线，则判定甲型流感病毒阳性；若A管第二荧光通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定乙型流感病毒阳性；若A管第三荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定呼吸道合胞病毒A型阳性；若A管第三荧光通道检测到Tm值为55℃对应的熔解峰曲线，则判定呼吸道合胞病毒B型阳性；若A管第四荧光通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若B管第一荧光通道检测到Tm值为63℃对应的熔解峰曲线，则判定腺病毒阳性；若B管第一荧光通道检测到Tm值为58℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感1型病毒阳性；若B管第二荧光通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感2型病毒阳性；若B管第二荧光通道检测到Tm值为54℃对应的熔解峰曲线，则判定人副流感3型病毒阳性；若B管第三荧光通道检测到Tm值为65℃对应的熔解峰曲线，则判定中东呼吸综合征相关冠状病毒阳性；若B管第三荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定严重呼吸综合征相关冠状病毒阳性；若B管第四荧光通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若C管第一荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒NL63阳性；若C管第二荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒OC43阳性；若C管第三荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒HKUI阳性；若C管第四荧光通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格；
若D管第一荧光通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定冠状病毒229E阳性；若D管第二荧光通道检测到Tm值为56℃对应的熔解峰曲线，则判定肺炎支原体阳性；若D管第四荧光通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定阳性内质控合格。
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