CN112779357B - 人冠状病毒核酸多重检测试剂盒 - Google Patents

人冠状病毒核酸多重检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了人冠状病毒核酸多重检测试剂盒。具体地，本发明通过多重rRT‑PCR的方法同时检测人类冠状病毒OC43、229E、HKU1、NL63、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS‑CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS‑CoV)和急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS‑CoV‑2)这七种冠状病毒的核酸RNA，能够实现对多种样本来源的人冠状病毒核酸进行快速检测和分析。

Description

人冠状病毒核酸多重检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于检测七种人感染冠状病毒核酸的检测试剂盒。
背景技术
2019-nCoV属于冠状病毒科β冠状病毒属，与严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)近缘,都会导致严重的肺炎症状。该病毒经飞沫，接触等途径传播，潜伏期3-7天，最长可达14天，潜伏期患者即具备较强传播性。截至目前，累计已确诊病例达到两千多万。目前数据表明，2019-nCoV比SARS-CoV毒力弱，但传播力强；造成其能够跨物种传播的受体可能与SARS-CoV一致，都是血管紧张素转化酶Ⅱ(ACE2)。此次疾病暴发后，科技人员投入大量精力开展研究，快速开发出诊断试剂，初步确定病原特性，
筛选出可能抑制该病毒的临床药物，也在加快疫苗的研发进程。 2019-nCoV的出现再次提醒人们建立系统的冠状病毒监测网络的重要性。
新型冠状病毒2019-nCoV是继SARS-CoV和MERS-CoV后从野生宿主跨越种系感染人类的第3种可引起严重肺炎表现的冠状病毒，也是人类感染的第7种冠状病毒，此前还包括NL63/229E/OC43/HKU1这4种冠状病毒，这4种在人群中较为常见，致病性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道症状。
冠状病毒引起的人类疾病主要是呼吸系统感染。该病毒对温度敏感，通常在冬季和早春季节流行。新型冠状病毒引发的肺炎就是由上呼吸道病毒感染、向下蔓延所致的肺部炎症。感染冠状病毒一般会引起以下症状：打喷嚏；流鼻水；疲劳；咳嗽；极少情况会发烧、喉咙痛、加重哮喘。
由于冠状病毒均会引起呼吸道感染，且感染途径、前期感染症状都较为相似，但不同类型的冠状病毒毒性和传染能力大不相同。目前还没有能够建立系统高效、便捷快速的对整个冠状病毒网络进行检测的方法。因此有必要开发一种能使用较少的样本、同时对7种冠状病毒进行全面系统检测的方法，来满足临床需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、系统、便捷快速、灵敏度高的多重人类冠状病毒检测试剂盒，从而大大节省时间、试剂和经费，用有限的样本为临床提供更多准确的诊断信息。
本发明的第一方面，提供了一种用于多重检测冠状病毒核酸的PCR 引物对组，所述引物对组包括：
第一引物对(特异性检测新型冠状病毒2019-nCoV)，所述第一引物对包括如SEQID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:2所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对组还包括：
第二引物对(特异性检测SARS-CoV)，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.:3所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:4所示的反向引物；和/或
第三引物对(特异性检测MERS-CoV)，所述第三引物对包括如SEQ ID NO.:5所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:6所示的反向引物；和/或
第四引物对(特异性检测冠状病毒OC43)，所述第四引物对包括如 SEQ ID NO.:7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:8所示的反向引物；和/或
第五引物对(特异性检测冠状病毒229E)，所述第五引物对包括如 SEQ ID NO.:9所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:10所示的反向引物；和/或
第六引物对(特异性检测冠状病毒NL63)，所述第六引物对包括如 SEQ ID NO.:11所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:12所示的反向引物；和/或
第七引物对(特异性检测冠状病毒HKU1)，所述第七引物对包括如 SEQ ID NO.:13所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:14所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对组还包括：
第八引物对(内标引物对)，所述第八引物对包括如SEQ ID NO.:15 所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:16所示的反向引物。
本发明的第二方面，提供了一种用于多重检测冠状病毒核酸的引物探针混合液，所述引物探针混合液包括本发明第一方面所述的PCR引物对组和选自下组的一个或多个探针：
第一探针：特异性靶向新型冠状病毒2019-nCoV目标序列；
第二探针：特异性靶向SARS-CoV目标序列；
第三探针：特异性靶向MERS-CoV目标序列；
第四探针：特异性靶向冠状病毒OC43目标序列；
第五探针：特异性靶向冠状病毒229E目标序列；
第六探针：特异性靶向冠状病毒NL63目标序列；
第七探针：特异性靶向冠状病毒HKU1目标序列；和
第八探针：特异性靶向内标目标序列。
在另一优选例中，所述引物探针混合液包括选自下组的一个或多个探针：
如SEQ ID NO.:17所示的第一探针；
如SEQ ID NO.:18所示的第二探针；
如SEQ ID NO.:19所示的第三探针；
如SEQ ID NO.:20所示的第四探针；
如SEQ ID NO.:21所示的第五探针；
如SEQ ID NO.:22所示的第六探针；
如SEQ ID NO.:23所示的第七探针，和
如SEQ ID NO.:24所示的第八探针。
在另一优选例中，所述第一探针、所述第二探针、和所述第三探针具有第一荧光标记；所述第四探针、和所述第五探针具有第二荧光标记；所述第六探针、和所述第七探针具有第三荧光标记；所述第八探针具有第四荧光标记；并且，所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记互不相同；优选地，所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各自独立地选自： ATTORho101荧光标记、FAM荧光标记、ATTO532荧光标记和ATTO647N 荧光标记。
在另一优选例中，所述第一探针、所述第二探针、和所述第三探针的 Tm值互不相同；优选地，所述第一探针的Tm值为67±2℃；所述第二探针的Tm值为72±2℃；所述第三探针的Tm值为60±2℃。
在另一优选例中，所述第四探针、和所述第五探针的Tm值互不相同；优选地，所述第四探针的Tm值为68±2℃；所述第五探针的Tm值为63±2℃。
在另一优选例中，所述第六探针、和所述第七探针的Tm值相同，或者不相同。优选地，所述第六探针的Tm值为59±2℃；所述第七探针的 Tm值为59±2℃。
在另一优选例中，所述第八探针的Tm值为66±2℃。
本发明的第三方面，提供了一种用于多重检测冠状病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的PCR引物对组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器包含本发明第二方面所述的引物探针混合液。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器包含 PCR反应酶系；优选地，所述PCR反应酶系包括逆转录酶、热启动Taq 酶。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括阴性质控品。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括阳性质控品。
本发明的第四方面，提供了一种多重检测冠状病毒核酸的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测样本，所述样本中含有人冠状病毒核酸；
(2)制备扩增反应体系，进行扩增反应：
其中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本、本发明第一方面所述的引物对组。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的。例如，可以对环境样本进行检测，已判断病毒污染环境。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的引物探针混合液的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测人冠状病毒核酸。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1至图7显示了本发明用七重冠状病毒检测试剂盒检测阳性样本的验证结果：
图1是229E检测结果(Tm＝63.45)；
图2是OC43的检测结果(Tm＝68.88)；
图3是HKU1的检测结果(Tm＝59.36)；
图4是NL63的检测结果(Tm＝59.67)；
图5是SARS的检测结果(Tm＝70.86)；
图6是MERS的检测结果(Tm＝58.96)；
图7是CoV-2019的检测结果(Tm＝65.89)；
图8是MERS(T1＝59.16)和CoV-2019(T2＝65.83)双阳性样本的检测结果；
图9是对照引物对检测结果。
具体实施方式
本发明涉及同时对七种不同类型的人类冠状病毒核酸RNA进行检测，具体是通过多重rRT-PCR的方法同时检测人类冠状病毒OC43、229E、 HKU1、NL63、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2) 这七种冠状病毒的核酸RNA。本发明的引物探针组合能够很好地解决多重荧光PCR体系引物间互相干扰抑制的难题。本发明的试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒，能够快速实现对多种样本(如鼻咽拭子、血液、肺泡灌洗液、痰等样本)中的人类冠状病毒核酸RNA 的检测和分析。
多重PCR
多重实时荧光PCR法，通过在同一个反应体系内使用多种荧光标记就可以实现对多重病原体的同时检测，而且特异性强，灵敏度高，操作简便快捷，所用仪器容易普及，易于推广使用。
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR 反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多，比如：
(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
本申请的测定方法基于多重PCR技术和熔解曲线分析。本试剂盒使用优化后的体系，其中包含有针对7种冠状病毒和内部质控设计的特异性引物探针。
探针包含5'端的荧光基团和3'端的淬灭基团。荧光和淬灭基团靠近，淬灭基团会抑制荧光信号。PCR产品形成时，探针结合其互补链，这会导致荧光团的释放，防止淬灭，并检测到荧光。达到荧光高于检测阈值所需的PCR周期数(Ct值)与原始模板DNA量成反比。
这种方法的检测能力受PCR仪器荧光通道数量限制。一般来说不足以同时检测7个冠状病毒和内部质控。为了克服这个问题，本试剂盒结合使用PCR的熔解曲线分析。将混合物变性，快速冷却，使探针与各自的PCR产品结合(也导致荧光增加)，然后加热。同时，对荧光和温度的函数进行测量。一旦达到探针的Tm值，将分离，荧光将下降。从而将产生熔解。
在本发明的一个优选地实施方式中，探针的设计方式使OC43和229E 可以在同一绿色(FAM荧光标记)荧光通道中被检测，具有不同的Tm 值。HKU1和NL63在黄色(ATTO532荧光标记)通道中一起检测(同一 Tm值，因此不区分)。MERS、SARS-CoV和SARS-CoV-2在橙色(ATTORho101荧光标记)通道中检测到不同的Tm值。IC在红色 (ATTO647N荧光标记)通道中检测。
多重PCR技术和熔解曲线分析的结合，对探针的要求极高，探针Tm 值尤为重要。另外，引物与探针的组合效果，对扩增效果也有重要的影响。
使用本发明的试剂盒进行检测，所用PCR仪需要包括四个荧光通道，若ATTORho101橙色荧光通道检测到Tm值为67℃对应的熔解峰曲线，则判定新型冠状病毒(SARS-CoV-2)阳性；若ATTORho101橙色荧光通道检测到Tm值为72℃对应的熔解峰曲线，则判定SARS-CoV为阳性；若 ATTORho101橙色荧光通道检测到Tm值为60℃对应的熔解峰曲线，则判定MERS-CoV阳性；若FAM绿色荧光通道检测到Tm值为68℃对应的熔解峰曲线，则判定OC43阳性；若FAM绿色荧光通道检测到Tm值为63℃对应的熔解峰曲线，则判定229E阳性；若ATTO532黄色荧光通道检测到Tm值为59℃对应的熔解峰曲线，则判定NL63或HKU1两者之一为阳性或均为阳性；若ATTO647N红色荧光通道检测到Tm值为66℃对应的熔解峰曲线，则判定内部质控合格。
本试剂盒采用多重PCR荧光探针法检测上述几种病原体，选择各病原体高度保守结构域为扩增靶片段，人工设计多对引物和探针，再对其进行优化选择并验证，最终确定包含如下引物和探针序列的检测冠状病毒核酸检测试剂盒。各病原体详细引物序列见表1所示：
表1引物和探针序列
Figure RE-GDA0003009859060000061
Figure RE-GDA0003009859060000071
其中，F为正向引物，R为反向引物，P为探针。
除上面提到的引物和探针外，本发明提供的用于多重检测冠状病毒核酸的试剂盒，还包括Tris-HCl、三磷酸脱氧核糖核苷、(NH4)2SO4、MgCl2、 KCl、M-MLV反转录酶(购自Promega公司，货号：M1701)、RNA酶抑制剂(购自NEB公司，货号：M0307L)、热启动Taq酶(购自Thermo 公司，货号：14966001)。
所述检测试剂盒中各组分的具体含量如下：
表2
Figure RE-GDA0003009859060000072
本发明的主要优点在于：
本发明的冠状病毒核酸检测试剂盒是基于多重荧光定量PCR技术来实现的，与现有的冠状病毒检测技术相比，有以下几点优势：
①高效。目前大部分检测技术都只针对一种冠状病毒的核酸进行检测，一个PCR反应管只能得到一种冠状病毒的检测结果。而使用本试剂盒，能够在一个PCR反应管中得到七种冠状病毒的检测结果，高效省时；
②系统性。已发现能够感染人的七种冠状病毒均会引起呼吸道感染，感染途径、前期症状也较为类似，并且考虑到以后可能还会有新的冠状病毒被发现，因此对多种冠状病毒进行全面的检测监控是很重要的，而本试剂盒能很好的完成这个任务，仅使用很少的样本便能得出全面系统的分析结果；
③灵敏度高。本发明的试剂盒对于微量的病原体核酸也能达到较好的检测效果。
因此，本发明将7种冠状病毒的特异性引物和酶浓缩在一个反应体系里，产品使用便捷，能大大减少临床样本的用量，适合推广。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1
人的七重冠状病毒核酸检测试剂盒的检测方法如下：
样本：各种呼吸道样品，如拭子、痰、肺泡灌洗液
储存条件：室温(18-30℃)，不超过48小时；冷藏温度(2-8℃)，不超过72小时；低于-20℃，可长期储存。
操作步骤：
1.样本核酸的提取。
加5uL内部质控(IC)到200uL的样本中，提取核酸最后用100uL 体积洗脱。注意试剂盒中提供的阴性对照(NC)应该和其他检测样本一样加入内部质控(IC)后提取核酸。而试剂盒中的阳性对照(PC)不需要核酸提取。
2.rRT-PCR步骤
2.1rRT-PCR反应溶液的配制。
室温溶解CoV检测缓冲液和CoV酶混合液，轻弹混匀后离心10秒。计算需要加样反应数n(n＝样本数+NC+PC+0.5)。根据表3按照倍数扩大来加样。每一个PCR孔中分装10μL。
表3.rRT-PCR反应溶液的制备
组分 体积/反应
CoV引物探针混合液 19μl
CoV酶混合液 1μl
总体积 20μL
2.2添加样本。
从试剂盒中取出CoV阳性对照，室温融化，轻弹混匀后离心10秒。加5μL提取的核酸样品、提取的阴性对照、阳性对照分别到每个PCR管中，并轻轻吹打3次混匀。添加样品后，盖上管盖或密封膜，短暂离心。
3.RT-PCR运行程序见表4。
表4.RT-PCR运行程序
Figure RE-GDA0003009859060000081
Figure RE-GDA0003009859060000091
*在绿色、黄色、橙色和红色通道中获取荧光。
4.检测结果解读
4.1熔融曲线分析。
使用PCR仪器自动得到的Tm值。并将这个Tm值与表5中给出可接受的范围进行比较。
表5.样本检测通道及Tm值的可接受范围。
检测目标 检测通道 Tm(℃，±2)
CoV OC43 FAM(绿色) 68
CoV 229E FAM(绿色) 63
CoV HKU1 ATTO532(黄色) 59
CoV NL63 ATTO532(黄色) 59
MERS-CoV ATTORho101(橙色) 60
SARS-CoV ATTORho101(橙色) 72
SARS-CoV-2 ATTORho101(橙色) 67
内部质控 ATTO647N(红色) 66
对临床样本：如果临床样本的检测结果得到表3中可接受范围内的 Tm值，则样本应被视为该病原体阳性。如果未得到接受范围内的Tm值，但内部质控IC检测到正常的Tm值，则样本对于所有病原体都是阴性。如果未得到接受范围内的Tm值，内部质控IC也没有检测到Tm值，则样本无效。该样本需要重新进行检测，重新提取核酸以及后续步骤。
对于阴性对照：所有病原体的检测都应为阴性，并且能检测到内部控制(IC)信号。如果有一个冠状病毒检测到阳性结果，这说明实验过程中发生了污染。其他所有临床样本的这一项检测结果作废，需要重新提取核酸，重新检测结果。如果阴性对照的结果中没有检测到内部质控的信号，那么阴性对照无效。这意味着无法监测实验是否可能受到污染，那么该实验中的所有样本都要重新检测，从核酸提取开始。
对于阳性对照：阳性对照样本在四个荧光通道中Tm值的范围都应该在66±2℃的范围内。
Ct值的确定：使用二阶导数法来确定Ct值。这将提供有关病毒载量的半定量信息。
注意：Tm值是优先于Ct值的。如果软件未获得可接受范围内的Tm 值，即使能够确认Ct值，样本也应被视为病原体阴性。
实施例2特异性和灵敏度测定
特异性试验
以甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌的核酸为阳性模板，以巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型、人冠状病毒NL63、人博卡病毒、EB病毒、副流感病毒1型、偏肺病毒、肠道病毒/鼻病毒、结核分枝杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌核酸为阴性模板，经呼吸道病原体多重检测试剂盒检测，结果显示，检测试剂可以准确检测出甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌的核酸，并且未出现错检，漏检等情况；而巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型、人冠状病毒NL63、人博卡病毒、 EB病毒、副流感病毒1型、偏肺病毒、肠道病毒/鼻病毒的核酸等未出现假阳性结果。
灵敏度试验
将229E、OC43、HKU1、NL63、SARS-CoV、MERS-CoV、2019-nCoV 的核酸进行梯度稀释，在100copies/mL到500copies/mL之间设置了5种不同的浓度，经荧光PCR检测，检测结果为：浓度为300copies/mL的阳性率均为100％；最低能检测到浓度为200copies/mL的OC43病毒和 2019-nCoV病毒，其他5种病毒的灵敏度均为300copies/mL，因此本试剂盒的灵敏度为300copies/mL。
实施例3临床样本检测
利用本发明所建立的呼吸道病体原多重检测体系，对60例阳性患者核酸样本及20例阴性样本进行检测，并采用市售相关单重PCR检测试剂盒进行同步检测，并对阳性样本进行测序验证。
结果显示60例阳性样本中，市售相关单重荧光定量PCR和本发明的多重荧光PCR法均检出60例阳性，阳性检出率为100％，20例阴性样本检测均为阴性，两种方法一致性高，结果具有统计学意义。
具体到不同型别，结果显示2019-nCoV病毒6例，MERS-CoV病毒1 例，OC43病毒23例，229E病毒11例，NL63病毒13例，HKU1病毒6 例，未出现漏检情况。
实施例4抗干扰能力验证
根据2019版《分子诊断检验程序性能验证指南》规定，“抗干扰能力”是指临床样本中可能存在的干扰物质对检测结果不产生影响的能力。
目前临床检测中多使用拭子样本进行检测，比如临床采集的咽拭子样本。临床咽拭子样本中，经常会掺杂一些血液，血液成分复杂，因此需要验证检测试剂对血液污染样本的抗干扰能力。另外，硫酸沙丁胺醇是临床呼吸道疾病常见的药物，也需要将其作为干扰物质进行验证。
本实施例例举了针对2019-nCoV病毒核酸的抗干扰能力。
向临床确认的3例2019-nCoV病毒弱阳性咽拭子样本中分别加入5％体积的全血和1.5mg/ml的硫酸沙丁胺醇，对照组加入等量的无菌水。
将血液组、硫酸沙丁胺醇组和对照组分别用本发明试剂盒检测3次。
结果表明，本发明检测试剂的结果符合率为100％。
对比例1
本发明对229E病毒、OC43病毒、HKU1病毒、NL63病毒SARS-CoV 病毒、MERS-CoV病毒和2019-nCoV病毒的基因序列，进行深入比对分析后，针对各目标序列设计了数十对以上引物和探针，由于多重反应体系引物之间的竞争抑制、引物特异性差异、退火温度不一致、以及引物二聚体等原因，很难获得有效的多重PCR扩增引物以及探针序列。
本发明人通过大量的实验，对设计的引物和探针进行优化选择并验证，最终确定了可以用于多重PCR扩增的引物和探针序列及其组合。
本对比例以229E病毒、MERS-CoV为例，展示了部分效果不理想的引物和探针。
229E病毒引物探针序列及筛选：
对照引物对1：
DF-1：GGGTAGATGGTAAATTTAGTTA(SEQ ID NO.:25)
DR-1：GAAGGTATAGCTTTATTTATGTC(SEQ ID NO.:10)
对照引物对2：
DF-2：GGTTCTCCTGTTATGACA(SEQ ID NO.:27)
DR-2：GCAACAAGAGGATTTAAAAC(SEQ ID NO.:28)
对照引物对3：
DF-3：CTGTGTTTATTAGTGCATTAG(SEQ ID NO.:29)
DR-3：GCAACAAGAGGATTTAAAAC(SEQ ID NO.:30)
对照引物对4：
DF-4：AGCTGCAGAGTCTAAAGC(SEQ ID NO.:31)
DR-4：CCTGTTGTGTGAGATTTAAC(SEQ ID NO.:32)
对照引物对5(本发明第一引物对)：
DF-5：GACTCTATGCTTACTTTGG(SEQ ID NO.:9)
DR-5：GAAGGTATAGCTTTATTTATGTC(SEQ ID NO.:10)
先用单重荧光PCR扩增筛选引物扩增效果，单重检测结果发现对照引物对1、3、4扩增效率低(如图9所示)，与对照引物对2和5相比 Ct值均靠后或荧光值低，对照引物探针对2和5可以基本满足后续实验要求，需要加入到多重荧光PCR法中做进一步验证。
对照引物对2加入到多重荧光PCR体系检测结果：对照引物对2扩增低，可能和其他引物对之间有竞争抑制或者有引物二聚体导致扩展效率变低；
对照引物对5加入到多重荧光PCR体系检测结果：各靶序列扩增效率不变，且荧光值和Ct值均满足要求；
从多方面综合考虑，最终选择对照引物对5(本发明第一引物对)做为多重PCR荧光检测体系中的引物，该体系经过反复验证，均能满足要求。
MERS-CoV引物探针序列及筛选(展示部分对照引物)：
对照引物对6：
DF-6：CTCAGACTTGCTTGTTAA(SEQ ID NO.:33)
DR-6：CACCTTCTTCTAAATCTGAA(SEQ ID NO.:34)
对照引物对7(本发明第三引物对)：
DF-7：TGGTCTTCTACTATGATCTTC(SEQ ID NO.:5)
DR-7：CTCTGATTCACCTTCTTCTA(SEQ ID NO.:6)
对照引物对8：
DF-8：GAAGCAGAAGATGTTACTG(SEQ ID NO.:35)
DR-8：CGCAATATCTTCAACAGG(SEQ ID NO.:36)
对照引物探针对6-8可以单重体系中进行正常扩增，需要加入到多重荧光PCR法中做进一步验证。
特异性试验结果表明，含有对照引物对6的多重检测体系中，无法检出OC43病毒，而且229E病毒的扩增曲线受抑制。
含有对照引物对8的多重检测体系的试验结果表明，该体系对浓度为 1×103copies/mL MERS-CoV样品的阳性率仅为70％，灵敏度较低。
从多方面综合考虑，最终选择对照引物对7(本发明第三引物对)做为多重PCR荧光检测体系中的引物，该体系经过反复验证，均能满足要求。
探针序列的筛选
本发明中多重PCR技术和熔解曲线分析的结合，对探针的要求极高，探针Tm值尤为重要。另外，引物与探针的组合效果，对扩增效果也有重要的影响。
因此，本发明需要对具有稳定Tm值的探针进行筛选。
例如，针对2019-nCoV特异性探针的筛选，本发明设计的如下四对探针检测结果均为单峰，但对照探针3和4Tm值偏高，会导致难以与本发明第二探针的Tm值区分开。对照探针1和2的Tm值均稳定且符合要求。
对照探针1：AGCAGCAATATCACCAAGGCAATC(本发明第一探针， SEQ ID NO.:17)
对照探针2：CAGCAATATCACCAAGGCAATCACC(SEQ ID NO.:37)
对照探针3：TAGCAGCAATATCACCAAGGCAATC(SEQ ID NO.:38)
对照探针4：AGCAGCAATATCACCAAGGCAAT(SEQ ID NO.:26)
采用实施例4的方法进行抗干扰能力验证，结果表明对照探针2在含 5％全血的样本检测中，检测信号较弱，结果符合率仅为33％(3/9)，因此最终选择对照探针1(本发明第一探针)作为多重PCR荧光检测体系中的探针。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海捷诺生物科技有限公司
<120> 人冠状病毒核酸多重检测试剂盒
<130> 0036001
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ctggcttcat caaacaata 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
aaggccgtta aacttttg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ctctgctcac tgatgata 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gccattgaac ctatatgc 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tggtcttcta ctatgatctt c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ctctgattca ccttcttcta 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
gagactaccg atatggtta 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
acgctctaac aatacataac 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
gactctatgc ttactttgg 19
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
gaaggtatag ctttatttat gtc 23
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
ggtgattatg ttcttactga a 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
aggacctaca actactttag 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
gctagtccta tgaagtca 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
cagcgacaat ctatcttc 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
tctcctctga cttcaaca 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
gagcttgaca aagtggtc 18
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
agcagcaata tcaccaaggc aatc 24
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
attgctgcct acactgctgc 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
agaacactcc tcgtcacact cg 22
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
tgtgttctcg catcaggtcc a 21
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
agcagcacta agcacaccac ta 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
cgagcatcac gaacaccacg 20
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
cctctactgg tcaagcgatg gaa 23
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
cacccactcc tccacctttg a 21
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
gggtagatgg taaatttagt ta 22
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
agcagcaata tcaccaaggc aat 23
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggttctcctg ttatgaca 18
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
gcaacaagag gatttaaaac 20
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
ctgtgtttat tagtgcatta g 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
gcaacaagag gatttaaaac 20
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
agctgcagag tctaaagc 18
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
cctgttgtgt gagatttaac 20
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
ctcagacttg cttgttaa 18
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
caccttcttc taaatctgaa 20
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gaagcagaag atgttactg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
cagcaatatc accaaggcaa tcacc 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
tagcagcaat atcaccaagg caatc 25

Claims (10)

1.一种用于多重检测冠状病毒核酸的引物探针混合液，其特征在于，所述引物探针混合液包括PCR引物对组，所述引物对组包括：
特异性检测新型冠状病毒2019-nCoV的第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ IDNO.:1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:2所示的反向引物；
特异性检测SARS-CoV的第二引物对，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.:3所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:4所示的反向引物；
特异性检测MERS-CoV的第三引物对，所述第三引物对包括如SEQ ID NO.:5所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:6所示的反向引物；
特异性检测冠状病毒OC43的第四引物对，所述第四引物对包括如SEQ ID NO.:7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:8所示的反向引物；
特异性检测冠状病毒229E的第五引物对，所述第五引物对包括如SEQ ID NO.:9所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:10所示的反向引物；
特异性检测冠状病毒NL63的第六引物对，所述第六引物对包括如SEQ ID NO.:11所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:12所示的反向引物；
特异性检测冠状病毒HKU1的第七引物对，所述第七引物对包括如SEQ ID NO.:13所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:14所示的反向引物；和，
作为内标引物对的第八引物对，所述第八引物对包括如SEQ ID NO.:15所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:16所示的反向引物；
以及：
如SEQ ID NO.:17所示的第一探针；
如SEQ ID NO.:18所示的第二探针；
如SEQ ID NO.:19所示的第三探针；
如SEQ ID NO.:20所示的第四探针；
如SEQ ID NO.:21所示的第五探针；
如SEQ ID NO.:22所示的第六探针；
如SEQ ID NO.:23所示的第七探针，和
如SEQ ID NO.:24所示的第八探针。
2.如权利要求1所述的引物探针混合液，其特征在于，所述第一探针、所述第二探针、和所述第三探针具有第一荧光标记；所述第四探针、和所述第五探针具有第二荧光标记；所述第六探针、和所述第七探针具有第三荧光标记；所述第八探针具有第四荧光标记；并且，所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记互不相同。
3.如权利要求2所述的引物探针混合液，其特征在于，所述第一探针、所述第二探针、和所述第三探针的Tm值互不相同；
所述第四探针、和所述第五探针的Tm值互不相同；
所述第六探针、和所述第七探针的Tm值相同或者不相同。
4.如权利要求3所述的引物探针混合液，其特征在于，所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各自独立地选自：ATTORho101荧光标记、FAM荧光标记、ATTO532荧光标记和ATTO647N荧光标记。
5.一种用于多重检测冠状病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器包含权利要求1所述的引物探针混合液。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器包含PCR反应酶系。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品。
9.一种非诊断目的的多重检测冠状病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
（1）提供待检测样本，所述样本中含有人冠状病毒核酸；
（2）制备扩增反应体系，进行扩增反应：
其中，所述扩增反应体系包括步骤（1）提供的待检测样本、权利要求1所述的引物探针混合液。
10.权利要求1所述的引物探针混合液的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测人冠状病毒核酸。
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