CN110273026B

CN110273026B - 呼吸道感染多重检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN110273026B
Application number: CN201910536096.6A
Authority: CN
Inventors: 蒋析文; 黄桃生; 李欣钰; 郑若楠
Original assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Current assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2039-06-20
Also published as: CN110273026A

Abstract

本发明提供了呼吸道感染多重检测试剂盒及检测方法，具体地，本发明对多重呼吸道病原体PCR扩增体系进行了设计及实验验证，获得了检测多种呼吸道病原体的多重荧光PCR扩增体系，单一体系可同时检测3种呼吸道病原体。本发明的试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒，能够实现对鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰等样本中的多重呼吸道病原体快速检测和分析。

Description

呼吸道感染多重检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种呼吸道感染多重检测试剂盒及检测方法。

背景技术

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection，ARTI)是全球范围内人类最常见的传染性疾病之一，发病率居急性传染病的首位，平均每年下呼吸道感染导致大约4000 000患者死亡。在全球范围内，呼吸道感染是导致5岁以下儿童死亡的主要原因。ARTI—般由细菌和病毒引起，其中大约90％为呼吸道病毒所导致，但死亡及重症的病例主要由细菌感染引起的。面对当前呼吸道传染病防治的复杂形势，加强传染流行病株病疫情信息的监测，可为制订相关传染病的防控策略提供依据；临床上及早明确病原体的型别，进行针对性的抗感染治疗则是控制感染的关键环节。

感染呼吸道系统的病原体种类很多，同时也因季节的不同流行的病原体种类不同。引起患儿出现急性呼吸道感染的病毒主要为甲型流感病毒(Influence A,IVA)、乙型流感病毒(Influence B,IVB)、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)及腺病毒(Adenovirus,ADV)等；引起患儿出现急性呼吸道感染的细菌是肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae，CP)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,SP)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila，LP)及流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae,HI)等。在人群中，尤其是儿童中，急性呼吸道感染往往是病毒和细菌混合感染或者继发感染，或单一及多种病毒感染，随着病情的持续发展，混合感染成为一种普遍现象。这对于患儿病情的检测和病原体的确定增加了难度。因此进行呼吸道病原体实验室监测，最大可能地对呼吸道传染病疫情进行预测预警，以期在疫情暴发流行早期及时发现并采取快速的应对措施，减少对社会和经济发展的影响。

目前常用的检测呼吸道病原体的检测方法：培养法、血清学检测、分子生物学检测方法等。

培养法是诊断细菌性感染和病毒感染最可靠的方法，也是诊断的金标准。但这种方法复杂，操作繁琐，周期长，灵敏度低，对样本的要求比较高，而且易出现假阴性的结果。

血清学检测是基于抗原抗体反应原理进行检测，检测周期短，但特异性和灵敏度低，易出现假阴性和假阳性的结果，具有一定的局限性。

因此，本领域技术人员致力于开发准确度高、操作简单，可同时检测多种呼吸道病原体的检测技术，以快速准确的检测呼吸道病原体疫情。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高灵敏度、使用便捷的呼吸道感染多重检测试剂盒及检测方法。

本发明的第一方面，提供了一种用于呼吸道感染多重检测的PCR引物对组，所述引物对组包括第一引物对集，所述第一引物对集包括：

第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:20所示的正向引物；和，如SEQID NO.:21所示的反向引物；

第二引物对，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.:23所示的正向引物；和，如SEQID NO.:24所示的反向引物；和

第三引物对，所述第三引物对包括如SEQ ID NO.:26所示的正向引物；和，如SEQID NO.:27所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对组还包括第二引物对集，所述第二引物对集包括：

第四引物对，所述第四引物对包括如SEQ ID NO.:11所示的正向引物；和，如SEQID NO.:12所示的反向引物；

第五引物对，所述第五引物对包括如SEQ ID NO.:14所示的正向引物；和，如SEQID NO.:15所示的反向引物。

第六引物对，所述第六引物对包括如SEQ ID NO.:17所示的正向引物；和，如SEQID NO.:18所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对组还包括第三引物对集，所述第三引物对集包括：

第七引物对，所述第七引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:2所示的反向引物。

第八引物对，所述第八引物对包括如SEQ ID NO.:4所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:5所示的反向引物。

第九引物对，所述第九引物对包括如SEQ ID NO.:7所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:8所示的反向引物。

在另一优选例中，所述第一引物对集任选地包括第十引物对。

在另一优选例中，所述第二引物对集任选地包括第十引物对。

在另一优选例中，所述第三引物对集任选地包括第十引物对。

本发明的第二方面，提供了一种用于呼吸道感染多重检测的探针组，所述探针组包括：如SEQ ID NO.:22所示的第一探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:6所示的第二探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:9所示的第三探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:10所示的第四探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:13所示的第五探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:16所示的第六探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:19所示的第七探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:3所示的第八探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:25所示的第九探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:28所示的第十探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:31所示的第十一探针。

本发明的第三方面，提供了一种用于呼吸道感染多重检测的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的PCR引物对组。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针组。

在另一优选例中，所述试剂盒包括第一引物探针混合液，所述第一引物探针混合液包括：

所述第一引物对集，和如SEQ ID NO.:22所示的第一探针、如SEQ ID NO.:25所示的第二探针、如SEQ ID NO.:28所示的第三探针。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二引物探针混合液，所述第二引物探针混合液包括：

所述第二引物对集，和如SEQ ID NO.:13所示的第四探针、如SEQ ID NO.:16所示的第五探针、如SEQ ID NO.:19所示的第六探针。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三引物探针混合液，所述第三引物探针混合液包括：

所述第三引物对集，和如SEQ ID NO.:3所示的第七探针、如SEQ ID NO.:6所示的第八探针、如SEQ ID NO.:9所示的第九探针、如SEQ ID NO.:10所示的第十探针。

在另一优选例中，所述第一引物探针混合液任选地包括第十一探针。

在另一优选例中，所述第二引物探针混合液任选地包括第十一探针。

在另一优选例中，所述第三引物探针混合液任选地包括第十一探针。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种独立包装的组分：

Tris-HCl、三磷酸脱氧核糖核苷、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂、KCl、C-MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、热启动Taq酶。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括阴性质控品。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括阳性质控品。

本发明的第四方面，提供了一种检测呼吸道感染的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测样本，所述样本中含有呼吸道病原体的基因；

(2)制备扩增反应体系，进行扩增反应：

其中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本、本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组。

在另一优选例中，所述步骤(2)中制备三个反应体系，分别包括所述第一引物探针混合液、所述第二引物探针混合液、和所述第三引物探针混合液。

在另一优选例中，所述方法为非诊断目的。

本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测呼吸道病原体。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了甲流的灵敏度检测结果。

图2显示了乙流的灵敏度检测结果

图3显示了呼吸道合胞病毒A型灵敏度检测结果。

图4显示了呼吸道合胞病毒B型灵敏度检测结果。

图5显示了腺病毒型别中1型灵敏度检测结果。

图6显示了流感嗜血杆菌灵敏度检测结果。

图7显示了嗜肺军团菌灵敏度检测结果。

图8显示了肺炎衣原体灵敏度检测结果。

图9显示了肺炎支原体灵敏度检测结果。

图10显示了肺炎链球菌灵敏度检测结果。

图11显示了内标灵敏度检测结果。

图12显示了腺病毒检测结果。

图13显示了乙流检测结果。

图14显示了呼吸道合胞病毒检测结果。

图15显示了甲流检测结果。

图16显示了流感嗜血杆菌检测结果。

图17显示了嗜肺军团菌检测结果。

图18显示了甲流引物对1扩增结果。

图19显示了甲流引物对2扩增结果。

图20显示了甲流引物对3扩增结果。

图21显示了甲流引物对4扩增结果。

图22显示了甲流引物对5扩增结果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，对多重呼吸道病原体PCR扩增体系进行了设计及实验验证。经过深入研究和反复实验，获得了检测多种呼吸道病原体的多重荧光PCR扩增体系，可同时检测9种呼吸道病原体。该技术中将呼吸道病原体分为三组体系进行多重荧光PCR扩增，这三种组合，每种组合均能够很好地解决多重荧光PCR体系引物间互相干扰抑制的最大难题。本发明的试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒，能够实现对鼻咽拭子、血液、肺泡灌洗液、痰等样本中的多重呼吸道病原体快速检测和分析。

多重PCR

多重实时荧光PCR法，在在同一个反应体系内使用多种荧光标记就可以实现对多重病原体的同时检测，而且特异性强，灵敏度高，操作简便快捷，所用仪器容易普及，易于推广使用。

多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

影响多重PCR反应的因素有很多，比如：

(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。

(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。

(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。

(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。

虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。

从呼吸道感染相关的病原体中选择常见的病毒：甲型流感病毒型、乙型流感病毒型、呼吸道合胞病毒、腺病毒；细菌：肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、嗜肺军团菌和流感嗜血杆菌为研究对象，设计了引物和探针，再对设计的引物和探针进行优化选择并验证，最终确定了可以用于多重PCR扩增的引物以及探针序列，在此基础上开发了用于常见呼吸道病原体检测的多重PCR荧光法检测试剂盒。

如本文所用，术语“呼吸道病原体”包括本试剂盒检测范围内的9种呼吸道病原体：甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌。

本发明人在研究过程中，对多重呼吸道病原体PCR扩增引物进行了设计及实验验证。结果表明，使用多重荧光PCR扩增体系，由于检测方法的限制性一管体系同时检测9种呼吸道病原体的难度极大。经过深入研究和反复实验，本发明人将呼吸道病原体分为三组体系进行多重荧光PCR扩增，这三种组合，每种组合均能够很好地解决多重荧光PCR体系引物间互相干扰抑制的最大难题，同时本试剂盒采用MGB探针能够提高本试剂盒检测的灵敏度和特异性。

因此，本发明提供的试剂盒包括所述第一引物探针混合液、所述第二引物探针混合液、和/或所述第三引物探针混合液。

所述第一引物探针混合液包括：

所述第一引物对集，和如SEQ ID NO.:3所示的第一探针、如SEQ ID NO.:6所示的第二探针、如SEQ ID NO.:9所示的第三探针、如SEQ ID NO.:10所示的第四探针。

所述第二引物探针混合液包括：

所述第二引物对集，和如SEQ ID NO.:13所示的第五探针、如SEQ ID NO.:16所示的第六探针、如SEQ ID NO.:19所示的第七探针。

所述第三引物探针混合液包括：

所述第三引物对集，和如SEQ ID NO.:22所示的第八探针、如SEQ ID NO.:25所示的第九探针、如SEQ ID NO.:28所示的第十探针。

本试剂盒涉及一种多重PCR荧光法检测多种呼吸道病原体检测试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒，实现对鼻咽拭子、血液、肺泡灌洗液、痰等样本中的多重呼吸道病原体快速检测和分析。

本试剂盒采用多重PCR荧光探针法检测上述几种呼吸道病原体，选择各病原体高度保守结构域为扩增靶片段，人工设计多对引物和探针，再对其进行优化选择并验证，最终确定包含如下引物和探针序列的一种多重呼吸道病原体检测试剂盒。各病原体详细引物序列见表1所示：

表1呼吸道病原体引物和探针序列

在本发明优选的实施方案中，针对不同的呼吸道病原体型分别设计引物和探针。其中，F为正向引物，R为反向引物，P为探针，其中探针采用了MGB探针，能够提高探针的Tm值，同时能够提高试剂盒检测的灵敏度和特异性。

在本方面优选的实施方案中，引物的Tm值在50～60℃，结合搭配的正向或反向引物，避免了引物二聚体的产生，同时选用MGB探针，使探针的Tm值在60～70℃，避免了探针的序列过长与其他非特异性序列的结合，同时也避免了探针相互之间行成的引物二聚体以及发夹结构，有效地提高了PCR扩增的特异性和效率。

在本发明进一步优选的实施方案中，为达到检测目的，所有呼吸道病原体的探针均带有荧光报告基团和荧光淬灭基团，甲型流感病毒、腺病毒和肺炎衣原体的荧光报告基团选自FAM，；乙型流感病毒、流感嗜血杆菌和肺炎支原体荧光报告基团选自Texas Red，；呼吸道合胞病毒、嗜肺军团菌和链球菌的荧光报告基团CY5，以上荧光淬灭基团均为MGB。

除上面提到的引物和探针外，一种多重呼吸道病原体检测试剂盒，还包括Tris-HCl(购自Sigma公司，货号：T1503)、三磷酸脱氧核糖核苷(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，货号：U1515)、(NH₄)₂SO₄(购自Sigma公司，货号：A4418)、MgCl₂(购自Sigma公司，货号：M2670)、KCl(购自Sigma公司，货号：P9541)、C-MMLV逆转录酶(来自中山大学达安基因股份有限公司，货号：E0101)、RNA酶抑制剂(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，货号：SN251XS)、热启动Taq酶(来自中山大学达安基因股份有限公司，货号：E0201)。

所述检测试剂盒中各组分的具体含量如下：

本发明提供的一种多重PCR荧光法检测呼吸道病原体，按以下步骤进行：

(1)提取待测样品RNA或DNA核酸；

(2)以待测样品核酸为模板，按以上组分配制成反应体系，进行多重荧光PCR反应；

所述PCR反应条件为：50℃15分钟，95℃预变性15分钟，然后按94℃15秒→55℃45(收集荧光)秒扩增45个循环。

本发明的主要优点在于：

(1)可以同时检测3种常见的呼吸道病原体：肺炎衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌；

(2)采用MGB探针，提高了检测结果的特异性和灵敏度；

(3)加入内标基因，减少提取问题导致假阳性，且加入了阴阳性质控品，能够对试剂的质量和环境是否存在污染进行把控，提高试剂盒的准确性，结果更真实可靠；

(4)操作简单，自动化程度高。

本发明通过多重荧光PCR法，建立针对肺炎衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌的多重检测方法，在此基础上建立了9种常见的呼吸道病原体：甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌的快速检测方法。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1

1、材料与方法

1.1 模拟样本

病毒液：甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒；质粒：腺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌，质粒由上海生工生物工程有限公司合成，病毒液由中山大学达安基因股份有限公司制备。

1.2 临床样本

50例呼吸道病原体阳性样本和20例阴性样本。

1.3 引物和探针

通过对Genebank数据库和国内外已发表文献中报道的呼吸道病原体相关核酸序列进行序列比对分析，选择无二级结构且高度保守的区段为扩增靶片段，人工设计多对引物和探针。引物和探针均由上海生工生物股份有限公司合成，具体序列特征和探针标记如上所述。

1.4 RNA或DNA核酸提取

提取采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法)，按试剂盒说明书进行操作。提取后的核酸置于-20℃冰箱中。

1.5 多重荧光PCR反应体系的优化

多重荧光PCR采用三管25μl反应体系，其中体系1主要包含MgCl₂，KCl，C-MMLV逆转录酶，RNA酶抑制剂，热启动Taq酶，4对引物和4条探针以及5ul扩增模板；体系2主要包括MgCl₂，KCl，C-MMLV逆转录酶，RNA酶抑制剂，热启动Taq酶，4对引物和4条探针以及5ul扩增模板；体系3主要包括MgCl₂，KCl，C-MMLV逆转录酶，RNA酶抑制剂，热启动Taq酶，4对引物和4条探针以及5ul扩增模板。采用ABI 7500PCR仪进行扩增，扩增条件为：50℃15分钟，95℃预变性15分钟，然后按94℃15秒→55℃45秒(收集荧光)扩增45个循环。

体系的优化实验，每对引物和探针用相同用量，以梯度稀释的阳性核酸为模板进行检测，单重条件下初步筛选扩增效率高的引物探针对；将筛选的引物探针对进行分管组合，测试每种组合中引物探针对之间是否有竞争抑制及非特异扩增情况；选择效果较好的分管组合，根据荧光值的高低和Ct值情况对引物探针用量进行优化，利用正交实验优化Buffer中镁离子的浓度，同时优化dNTP、热启动酶、CMMLV酶的用量。

1.6 特异性和灵敏度测定

利用确定的多重呼吸道病原体体系分别对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌的人鼻咽拭子核酸进行检测，评价其特异性。

将已标定浓度的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌的人鼻咽拭子核酸进行梯度稀释，检测其灵敏度。

1.7 临床样本检测

利用本发明所建立的呼吸道病体原多重检测体系，对50例未知阳性患者核酸进行检测，并采用中山大学达安基因股份有限公司生产的相关单重呼吸道病原体PCR检测试剂盒(如IVA、IVB、LP、CP、MP等)进行同步检测，并对阳性样本进行测序验证。

2 结果

2.1 单重荧光PCR反应体系

2.1.1 单重荧光PCR反应体系1

2.1.2 单重荧光PCR反应体系2

2.1.3 单重荧光PCR反应体系3

2.1.4 单重荧光PCR反应体系4

2.1.5 单重荧光PCR反应体系5

2.1.6 单重荧光PCR反应体系6

2.1.7 单重荧光PCR反应体系7

2.1.8 单重荧光PCR反应体系8

2.1.9 单重荧光PCR反应体系9

2.1.10 单重荧光PCR反应体系10

2.2 多重荧光PCR体系

2.2.1 多重荧光PCR体系1

2.2.2 多重荧光PCR体系2

2.2.3 多重荧光PCR体系3

2.3 特异性试验

以甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌的核酸为阳性模板，以巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型、人冠状病毒NL63、人博卡病毒、EB病毒、副流感病毒1型、偏肺病毒、肠道病毒/鼻病毒、结核分枝杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌核酸为阴性模板，经呼吸道病原体多重检测试剂盒检测，结果显示，检测试剂可以准确检测出甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌的核酸，并且未出现错检，漏检等情况；而巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型、人冠状病毒NL63、人博卡病毒、EB病毒、副流感病毒1型、偏肺病毒、肠道病毒/鼻病毒的核酸等未出现假阳性结果。

2.4 灵敏度试验

将甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌的核酸进行梯度稀释，浓度均分别是1×10⁴copies/mL，1×10³copies/mL，1×10²copies/mL，5×10copies/mL经荧光PCR检测，检测结果为：浓度为1×10⁴copies/mL和1×10³copies/mL的阳性率均为100％；浓度为1×10²copies/mL的阳性率为95％，5×10copies/mL的阳性率为60％。因此，本试剂盒的灵敏度为1×10²copies/mL。

2.5 临床样本检测

采用本发明所建立的呼吸道病原体多重荧光PCR法对50例呼吸道感染临床样本以及20例阴性样本进行检测，并采用中山大学达安基因股份有限公司生产的对应型别单重荧光定量PCR检测试剂盒进行对照验证，结果显示50例呼吸道感染临床样本中，荧光定量PCR和呼吸道病原体多重荧光PCR法均检出50例阳性，阳性检出率为100％，20例阴性样本检测均为阴性，两种方法一致性高，结果具有统计学意义。

具体到不同型别，多重荧光PCR法与单重荧光PCR法比较，结果显示甲型流感病毒21例，乙型流感病毒9例，呼吸道合胞病毒5例，腺病毒8例，肺炎支原体3例，肺炎衣原体1例，肺炎链球菌1例，嗜肺军团菌1例，流感嗜血杆菌1例，未出现漏检情况。

对比例1

本试剂盒对呼吸道病原体各型别的基因序列，进行深入比对分析后，针对各目标序列设计了5对以上引物和探针，由于多重反应体系引物之间的竞争抑制、引物特异性差异、退火温度不一致、以及引物二聚体等原因，很难获得有效的多重PCR扩增引物以及探针序列。本发明人通过大量的实验，对设计的引物和探针进行优化选择并验证，最终确定了可以用于多重PCR扩增的引物和探针序列及其组合。

即使在已经基本确定针对各目标核酸的引物对和探针序列的情况下，不同引物对组合进行多重扩增的效果也存在显著地差异。例如，在多重PCR步骤中，将上述多重反应体系1和反应体系2种的腺病毒和甲型流感病毒的引物探针对调，然后进行检测，其它检测步骤和条件同实施例1。

特异性试验结果表明，嗜肺军团菌和呼吸道合胞病毒均不能检出，而且腺病毒的扩增曲线受抑制。反应体系1检测结果如图12-14；反应体系2检测结果如图15-17。

灵敏度试验结果表明，浓度为1×10³copies/mL样品的阳性率仅为70％，甲型流感病毒和乙型流感病毒、流感嗜血杆菌，腺病毒部分型别检测结果阳性，嗜肺军团菌和呼吸道合胞病毒、腺病毒部分型别检测结果阴性。

对比例2特异性扩增甲型流感病毒引物和探针优化

本试剂盒针对各目标序列分别设计了5对以上引物和探针序列，本对比例以甲型流感病毒为例，展示了部分效果不理想的引物和探针。

甲型流感病毒引物探针筛选，将设计好的甲型流感病毒引物和探针，先用单重荧光PCR扩增筛选扩增效率较高的引物，将筛选出的引物探针加入到多重荧光PCR法进行测试。

甲型流感病毒引物探针序列及筛选：

对5组引物探针组合，先用单重荧光PCR扩增筛选引物扩增效果，单重检测结果发现引物探针对2、4、5扩增效率低(如图18-22所示)，与引物探针对1和3相比Ct值均靠后或荧光值低，引物探针对1和3可以基本满足后续实验要求，需要加入到多重荧光PCR法中做进一步验证。

将引物对1、3分别加入到多重荧光PCR体系中进行扩增，检测结果如下：

引物对1：

2F-1：GAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC(SEQ ID NO.:32)

2R-1：CAGAGGTGACAGGATTGGTCT(SEQ ID NO.:33)

引物对2：

2F-2：GAGYCTTCTAACCGAGGTCGAAAC(SEQ ID NO.:34)

2R-2：CAGAGGTGACAGGATTGGTCT(SEQ ID NO.:35)

引物对3：

2F-3：TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAG(SEQ ID NO.:36)

2R-3：GAAATCTCGGCTTTGAGGGGGCC(SEQ ID NO.:37)

引物对4：

2F-4：TTGAAAAGAGGGCCTKCTACGG(SEQ ID NO.:38)

2R-4：GACAAAATGACCATCGTCAACATCCAC(SEQ ID NO.:39)

引物对5：

2F-5：GCCTGAGTCTATGAGGGAAGARTATC(SEQ ID NO.:40)

2R-5：GCTCTATGYTGACAAAATGACCATCG(SEQ ID NO.:41)

引物对1加入到多重荧光PCR体系检测结果：引物对1扩增低，可能和其他引物对之间有竞争抑制或者有引物二聚体导致扩展效率变低；

引物对3加入到多重荧光PCR体系检测结果：各型别扩增效率不变，且荧光值和Ct值均满足要求；

从多方面综合考虑，最终选择引物对3做为甲型流感病毒在多重PCR荧光检测体系中的引物，该体系经过反复验证，均能满足要求。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中山大学达安基因股份有限公司

<120> 呼吸道感染多重检测试剂盒及检测方法

<130> 000031

<160> 41

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

tattggtctc agggagcaaa agcaggtag 29

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

gaaatctcgg ctttgagggg gcc 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

cctcgctcac tgggcacggt 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

atggagaagg caaagcagaa c 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

ccattccaag gcrgagtcta gg 22

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

actgttggtt yggtggga 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

tggctcttag caaagtcaag t 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

tgcacatcat aattrggagt gt 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

atcaacttct atcatccagc aa 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

accatccaac ggagcacagg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11

ttgccaaagg accccatcca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

agccactcct ccaactggtg 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 13

ttcttcccga tcggctcgca tc 22

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 14

ggtgccgatt tgggga 16

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 15

tgagcgccac tcatagcg 18

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 16

catgccttta gccattgctt c 21

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 17

ccagtaatgt cgtattta 18

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 18

gttcctctaa caacgatgc 19

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 19

tcagcaacag agtatccg 18

<210> 20

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 20

gcaaccgtac cgcca 15

<210> 21

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 21

tcagtcccac aaaccg 16

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 22

cgaactatcc gcccagttga 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 23

caaagtctgc gaccatcaat 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 24

tccaatgtat ggcactaaag ag 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 25

tgaatggcaa gtaggagcct c 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 26

caccttcttc gttgaaatag t 21

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 27

tggaggaagc acacagac 18

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 28

agccatttcg cctgagttgt cg 22

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 29

ctccgtacac tctcctaccc tc 22

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 30

acacctctgg atgccact 18

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 31

ccattgccag tccgccgtc 19

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 32

gagtcttcta accgaggtcg aaac 24

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 33

cagaggtgac aggattggtc t 21

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 34

gagycttcta accgaggtcg aaac 24

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 35

cagaggtgac aggattggtc t 21

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 36

tattggtctc agggagcaaa agcag 25

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 37

gaaatctcgg ctttgagggg gcc 23

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 38

ttgaaaagag ggcctkctac gg 22

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 39

gacaaaatga ccatcgtcaa catccac 27

<210> 40

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 40

gcctgagtct atgagggaag artatc 26

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 41

gctctatgyt gacaaaatga ccatcg 26

Claims

1.一种引物探针混合液，其特征在于，所述引物探针混合液包括PCR引物对组和探针组；

所述PCR引物对组包括第一引物对集，所述第一引物对集包括：

第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.20所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.21所示的反向引物；

第二引物对，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.23所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.24所示的反向引物；和

第三引物对，所述第三引物对包括如SEQ ID NO.26所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.27所示的反向引物；

所述探针组包括：如SEQ ID NO.22所示的第一探针、如SEQ ID NO.25所示的第二探针、和如SEQ ID NO.28所示的第三探针。

2.一种用于呼吸道感染多重检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一引物探针混合液，所述第一引物探针混合液包括：

第一引物对集，以及如SEQ ID NO.22所示的第一探针、如SEQ ID NO.25所示的第二探针、和如SEQ ID NO.28所示的第三探针；

其中，所述第一引物对集包括：

第三引物对，所述第三引物对包括如SEQ ID NO.26所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.27所示的反向引物。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一引物探针混合液还包括：如SEQID NO.29所示的正向引物、如SEQ ID NO.30所示的反向引物和如SEQ ID NO.31所示的第十一探针。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二引物探针混合液，所述第二引物探针混合液包括：

第二引物对集，和如SEQ ID NO.13所示的第四探针、如SEQ ID NO.16所示的第五探针、如SEQ ID NO.19所示的第六探针；

其中，所述第二引物对集包括：

第四引物对，所述第四引物对包括如SEQ ID NO.11所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.12所示的反向引物；

第五引物对，所述第五引物对包括如SEQ ID NO.14所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.15所示的反向引物；

第六引物对，所述第六引物对包括如SEQ ID NO.17所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.18所示的反向引物。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第二引物探针混合液还包括：如SEQID NO.29所示的正向引物、如SEQ ID NO.30所示的反向引物和如SEQ ID NO.31所示的第十一探针。

6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三引物探针混合液，所述第三引物探针混合液包括：

第三引物对集，和如SEQ ID NO.3所示的第七探针、如SEQ ID NO.6所示的第八探针、如SEQ ID NO.9所示的第九探针、如SEQ ID NO.10所示的第十探针；

其中，所述第三引物对集包括：

第七引物对，所述第七引物对包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物；

第八引物对，所述第八引物对包括如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物；

第九引物对，所述第九引物对包括如SEQ ID NO.7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.8所示的反向引物。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述第三引物探针混合液还包括：如SEQID NO.29所示的正向引物、如SEQ ID NO.30所示的反向引物和如SEQ ID NO.31所示的第十一探针。

8.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品；和/或阳性质控品。

9.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种独立包装的组分：

Tris-HCl、三磷酸脱氧核糖核苷、（NH₄）₂SO₄、MgCl₂、KCl、C-MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、和热启动Taq酶。

10.一种非诊断目的的检测呼吸道感染的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

（1）提供待检测样本，所述样本中含有呼吸道病原体的基因；

（2）制备扩增反应体系，进行扩增反应：

其中，所述扩增反应体系包括步骤（1）提供的待检测样本、引物对组和探针组；

其中，所述引物对组包括第一引物对集，所述第一引物对集包括：