CN101235416A - 实时荧光定量检测肺炎衣原体的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测临床样品中肺炎、支气管哮喘等疾病中的病原体肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae，CP)存在的方法及试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期诊断CP感染以及诊断CP持续感染或反复感染的方法及所使用的试剂盒。

Description

实时荧光定量检测肺炎衣原体的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及检测临床样品中肺炎、支气管哮喘等疾病中的病原体肺炎衣原体(CP)存在的方法及试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期诊断CP感染以及诊断CP持续感染或反复感染的方法及所使用的试剂盒。

背景技术

肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae，CP)是1989年定名的衣原体属中的一个新种，是一种专性真核细胞内寄生物。CP广泛分布于世界各地，是儿童和成人急性及慢性呼吸道感染的常见病原体，不仅可引起咽炎、鼻窦炎、中耳炎以及下呼吸道感染如急性支气管炎和肺炎(临床表现以肺炎为主)，而且与支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、结节病、心血管疾病的发病有密切关系。

由于CP感染没有典型的临床表现，诊断主要依靠实验室，常规方法有病原体分离培养、直接检出和血清学实验。(1)CP分离培养方法复杂，费时，而且敏感性不高，难于培养，一般不用于临床诊断。(2)病原体的直接检出主要有免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)，采用荧光标记或酶标记抗体检测标本中的衣原体，前者主要用于细胞培养中CP的识别，但灵敏度差；后者所用抗体为抗衣原体属特异性抗体，不能直接识别CP。均不适用于临床检测。(3)检测CP最常用的血清学方法是微量免疫荧光抗体检测法(MIF)，被公认为CP感染血清学诊断的金标准。人类感染CP后会出现抗CP血清抗体，初次感染时，大约在发病3周后出现IgM抗体，6-8周出现IgG抗体。由于病原体从进入机体进行复制和抗原刺激到产生抗体需要一段较长的窗口期(初次感染一般需要3周)，时间跨度长，不能满足早期病原体确诊的需要，不利于病人的早期诊断和治疗。

近年来，国内外对于CP感染机理和致病机制有深入了解，血清流行病学调查证实约50％的健康成人血清中肺炎衣原体IgG抗体阳性，而在呼吸道感染患者中阳性率更高。肺炎衣原体感染在人群中非常普遍，提示一方面可能人类易反复感染，另一方面可能与人体内存在持续感染有关。Maozed等发现(Moazed TC，Kuo CC，Grayston JT，et al.Evidence of systemic dissemin-ation of Chlamydia pneumoniae via macrophages in the mouse[J].J Infect Dis，1998，177(6)：1322-1325.)，肺炎衣原体可以隐藏在血内单核细胞中，故机体感染肺炎衣原体后，可通过单核巨噬系统在体内播散，导致持续感染。血清学检测是目前最常用的检查方法，但在诊断肺炎衣原体持续感染上的作用有限，需要测定比较前期和感染期血清抗体滴度，只能做回顾性诊断，不能有效确诊CP感染。因此，需要有一种方法来诊断肺炎衣原体持续感染。目前国内外有部分实验室采用聚合酶链反应(PCR)扩增靶核酸来检测外周血单核细胞(PBMC)中的CP，由于需要对PCR产物进行电泳或杂交分析等后处理，极易造成PCR产物污染，导致假阳性，不宜用于临床诊断；但提示，PBMC中的肺炎衣原体DNA可作为持续感染的标志。

实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM et al.Real-time PCR in virology.Nucleic Acids Res.2002 5；30(6)：1292-1305；Lie，Y.S.，Petropoulos，C.J.，Advances in quantitative PCR technology：5’nuclease assays.Current Opinion inBiotechnology 1998.9，43-48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。

与普通PCR相比，TaqMan PCR技术具有如下优点：通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摈弃普通PCR方法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对检测样品进行准确定量分析，从而有效监测药物治疗的效果；将DNA扩增与检测过程融合为一体，可以实时、动态监测DNA扩增的全过程，省掉了PCR后处理过程大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；由于采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；由于在普通PCR基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，进一步提高了检测靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。

美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒，如用于HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测的试剂盒。同样，中国目前也已批准了乙型肝炎、丙型肝炎、HIV和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒的生产和临床应用。因此，现在需要发展一种能够检测CP的实时荧光PCR方法，满足CP的检测与监测工作的需要。

众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析临床样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探针。本发明人在以往多年从事PCR技术特别是实时荧光定量PCR技术研究的基础上，将该技术应用于肺炎衣原体的所有已知变异体之基因组多核苷酸的检测和定量分析，成功地完成了本发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种使用实时荧光PCR技术实时定性与定量检测样品中CP的方法，特别是涉及在CP感染的早期和反复感染期实验室诊断中的应用。基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物和一条靶多聚核苷酸的特异性探针，在耐热DNA聚合酶、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg²⁺等PCR反应缓冲液中，通过DA7600、ABI 7000等荧光PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，从而达到快速、实时、定量检测靶多核苷酸的目的。

本发明提供的实时荧光定量PCR技术定性与定量检测临床样品中CP存在的方法包括：(1)提供包括(a)待检样品，(b)耐热DNA聚合酶和(c)2’-脱氧核苷三磷酸(dNTP)的扩增反应体系，以及包括(a)能够与待检双链靶多核苷酸的第一条互补链结合的正向引物，(b)能够与待检双链靶多核苷酸的第二条互补链结合的反向引物，以及(c)能够与双链靶多核苷酸的任一条链结合并且两末端分别标记有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针的荧光检测体系；(2)通过一次或多次聚合酶链反应扩增所说的靶多核苷酸；(3)退火后使所说的荧光发生基团通过探针与靶多核苷酸结合并产生荧光信号；(4)检测并确定荧光发生基团所产生的荧光量；(5)分析一次或多次扩增循环所发出的荧光量，以检测靶多核苷酸的存在；特征在于其中所说的靶多核苷酸是CP基因组多核苷酸，所使用的正向和反向寡核苷酸引物分别是CP-F：5’-gct act gga aca aag tct gcg a-3’(SEQ ID NO：1)和CP-R：5’-cat tgt actcca atg tat ggc act a-3’(SEQ ID NO：2)，以及由正向引物CP-F向5’端方向延伸5个碱基、向3’端方向延伸5个碱基范围内得到的引物序列或能与这段范围内的序列可以杂交的引物序列；以及由反向引物CP-R向5’端方向延伸5个碱基、向3’端方向延伸5个碱基范围内所得到的引物序列或能与这段范围内的序列可以杂交的引物序列；并且所使用的寡核苷酸探针是CP-P：5’-tta tca tga atg gca agt agg agc ctc tct atc tt-3’(SEQ ID NO：3)，特征在于所使用的寡核苷酸探针序列包括：寡核苷酸探针CP-P：5’-tta tca tga atg gca agt agg agc ctc tct atc tt-3’(SEQ ID NO：3)，以及由寡核苷酸探针CP-P向5’端方向延伸5个碱基、向3’端方向延伸5个碱基范围内得到的探针序列或能与这段范围内的序列可以杂交的探针序列。

与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR方法不同，实时定量聚合酶链反应方法可以在扩增反应的进程中实时监测扩增产物的产生，从而大大提高了定量检测的准确性和精密度。如众所周知，实时荧光定量PCR是在PCR扩增中，同时加入引物和5’、3’末端分别标记有荧光报告基团(例如6-FAM amidite羧基荧光素6)和荧光淬灭基团(例如6-羧基四甲基若丹明)的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，其序列保持完整，报告基团发射的荧光信号将被淬灭基团吸收，所以没有荧光信号产生；而当PCR扩增反应进行时，DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性将降解荧光探针，导致荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，因而荧光监测系统可接收并记录到荧光信号。每扩增一条DNA链即有一个荧光分子产生，从而实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，实时地监测整个PCR反应进程，并可借助标准曲线对未知靶多核苷酸(模板)进行定量分析。

如前所述，为了检测出临床样品中可能存在的所有CP，并能够准确有效地将CP感染与沙眼衣原体、畜类衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌、呼吸道合胞病毒、流感病毒等其他呼吸道感染相关病原体鉴别开来，设计并制备实现这些目的的寡核苷酸引物和探针是一个非常重要的技术环节。为此，我们在使用适当的核酸分析软件对已知的CP变异体的基因组核苷酸序列进行同源性比较并找出保守区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件(例如Primer Express 2)选择和临床样本筛选出具有下示核苷酸序列的寡核苷酸引物1：5’-gct act gga aca aag tct gcg a-3’(22mrs)(SEQ ID NO：1)，引物2：5’-cat tgt act cca atg tat ggc act a-3’(25mrs)(SEQ ID NO：2)；以及具有下示序列的寡核苷酸探针：5’-tta tca tga atg gca agt agg agc ctc tct atc tt-3’(35mrs)(SEQ ID NO：3)。引物所对应的扩增区段相当于CP外膜主要蛋白基因编码序列的保守区，长度为103bp。其中，引物1互补于CP基因组的第750-800位核苷酸；引物2互补于CP基因组的第830-880位核苷酸。探针则互补与第780-840位核苷酸。由于所设计的这些引物和探针均具有互补于CP基因组保守区的序列，而且与其他肺炎相关病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶，所以大大减少甚至避免了CP检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。

可使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报道基团)的6-FAM amidite，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的TAMRA。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，可使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20％)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。

使用常规DNA提取方法或市售的DNA提取试剂盒，从得自受试者的痰液、咽拭子、血清、外周血单核细胞等样品中提取DNA，然后在含有引物1和2(各14pmol)、dNTP(10mM)、耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、PCR缓冲液和水的反应体系中，使用DA7600、ABI 7500型等其他结构类型的自动荧光检测热循环仪上对如上得到的DNA序列进行PCR扩增。所使用的反应条件是93℃预变性2分钟后，93℃ 45秒，  55℃ 1分钟，进行10次循环后；93℃ 30秒，55℃ 45秒，共进行30次循环。反应完成后，借助装置上配置的自动分析系统分析结果。在本研究中，如果循环阈(Ct)值等于或大于28，结果即为阴性；如果Ct值小于28，结果则为阳性。其中以反应的前5-10个循环所产生的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置为3-8个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。一般说来，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系。起始拷贝数越多，Ct值越小。因为在扩增反应的Ct值之前的阶段，扩增系统中的酶、引物、探针和dNTPs均大大过量，而且系统的pH值和离子浓度等也相对稳定，所以此时扩增反应的效率是一个与模板数无关的饱和定值。与Ct值相关的只有起始模板数(多聚核苷酸样品的浓度)和与样品无关的PCR系统效率。

可利用已知起始CP浓度的标准品制作标准曲线，其中以靶多核苷酸起始浓度(CP个数/mL)的对数为横坐标，并以如上测得的Ct值为纵坐标。获得未知样品靶多核苷酸的Ct值后，即可从基于平行实验得到的数据制作的标准曲线上得知其起始CP浓度的对数，然后计算出该靶多核苷酸的起始CP浓度(当扩增循环达到Ct值即初始进入指数扩增期时，Ct值的重现性极好，即同一靶多核苷酸在不同时间扩增或同一时间在不同管内扩增所得到的Ct值总是恒定的)。也就是说，为了基于上述的扩增反应结果推算出靶多核苷酸的量(起始CP浓度)，本发明的方法还进一步包括：(1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，从而计算出样品中靶多核苷酸的量。

本发明的另一个目的是提供一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测临床样品中CP的试剂盒，该试剂盒包括：(1)分别装有DNA提取液、具有本领域已知的常规成分的PCR扩增反应液、阴性参考品、阳性参考品和阳性标准品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

根据本发明的一个优选实施方案，其中用于靶多核苷酸扩增体系的正向和逆向引物分别是CP-F：5’-gct act gga aca aag tct gcg a-3’(SEQ ID NO：1)和反向引物CP-R：5’-cat tgt actcca atg tat ggc act a-3’(SEQ ID NO：2)，其中正向引物CP-F可向5’和3’端方向各延伸5个碱基，反向引物CP-R可向5’和3’端方向各延伸5个碱基。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸是CP-P：5’-tta tca tga atg gca agt agg agc ctc tct atc tt-3’(SEQ ID NO：3)，其中该寡核苷酸探针序列可向5’和3’端方向各延伸5个碱基。

可按照如上所描述的和试剂盒中所附使用说明书中指出的方法使用本发明的试剂盒。

如前所述，为了检测出临床样品中可能存在的所有CP变异体，并能够准确有效地将CP感染与沙眼衣原体、畜类衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌、呼吸道合胞病毒、流感病毒等其他呼吸道感染相关病原体鉴别开来，本发明基于对这些变异体和相关病毒基因组核苷酸序列的同源性比较，特别设计了适用本发明试剂盒的寡核苷酸引物和探针。使用这些引物和探针完成的实时定量检测，大大减小了CP病毒多核苷酸检测的假阳性和假阴性。我们的实验证明，本发明检测CP基因组核苷酸的精确度几乎为100％，灵敏度达到1.0×10²个/ml。

值得特别说明的是，为了确保本发明的CP检测方法的准确性，我们还使用了来自美国ATCC的CP纯培养物(VR-2282)作为阳性参考品，并且，还利用麦氏比浊法测定上述CP纯培养物的浓度后10倍稀释成浓度梯度后作为CP定量检测标准品。借助这些额外参考品与定量标准品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测并制作所谓的外标定量标准曲线，以进一步验证本发明试剂盒的检测精确度和准确性，并作为生产本发明试剂盒的附加的质量控制标准。

另外，由于本发明试剂盒的扩增反应条件中所采用的退火温度为55℃，距离预定的实际退火温度65℃相差达10℃左右。所以，即使样品中的靶核苷酸只有单个核苷酸的变异，也足以保证荧光探针与靶核苷酸的结合及荧光信号的产生和释放。

本发明提供的实时荧光定量检测方法及试剂盒可以检测出1.0×10²个CP/ml的浓度，说明具有非常好的灵敏度。

本发明针对CP的外膜主要蛋白编码基因保守区设计特异引物探针，可检测出CP病原体，但不能检测出非CP病原体，说明具有很好的特异性。

本发明提供的实时荧光定量检测方法及试剂盒可以检测临床外周血及其单核细胞、痰液、咽拭子中的CP病原体，可为灵敏、快速早期诊断CP感染以及诊断CP持续感染或反复感染提供可靠的实验证据；同时由于能准确定量，所以可对临床用药进行有效监测。

附图说明

图1显示分析结果窗口下的标准曲线。针对模板数为1.0×10²～1.0×10⁷个CP/ml的反应体系进行TaqMan PCR分析。当CP个数为1.0×10²时，检测样品的Ct值在26左右，即检测下限灵敏度可达到1.0×10²个CP/mL。绘制得到的标准曲线斜率为-3.29，在Y轴截距为33.33，相关系数(R²)＝0.9965。

图2显示强中弱三份阳性标本的检测曲线。三份标本的Ct值分别是22.04、18.92和15.03；结合所绘制的扩增曲线呈S形，故可判定三份样品均为阳性。

图3显示阴性标本的检测曲线。三个标本的扩增曲线为比较平直的折线，与荧光检测阈值线没有交点，或者显示Ct值在28～30之间的范围内并且扩增曲线不具有S形特征。

图4显示阳性标本重复性实验的检测曲线，可看出不同的曲线均在同一Ct值范围，说明试剂盒的重复性好。

具体实施方式

实施例1：肺炎衣原体检测试剂的研制

1、引物探针的设计：通过对Genbank数据库已有的全部CP核酸序列以及国内外已发表文献中报导的核酸序列进行序列比对分析，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用软件和人工设计多对引物和探针。

2、临床样本的选择：根据国内外相关文献报到表明，对于初次感染CP或急性感染患者，宜选择清晨第一次痰液和咽拭子作为待检标本；而对于反复感染或持续感染CP患者，宜选择外周血单核细胞作为待检标本。

3、反应体系的建立与优化

样品的准备：以美国ATCC的标准株VR-2282作为CP检测的阳性标准品；以与沙眼衣原体、畜类衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌、呼吸道合胞病毒、流感病毒等作为阴性参考品。分别用DNA提取液煮沸法提取上述阳性标准品与阴性参考品的基因组DNA待用。

引物探针的筛选：以上述1中的3组引物探针分别检测3.1中的阳性标准品与阴性参考品的基因组DNA，经反复试验，筛选出特异性好的最佳引物探针组合为组合1。

引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.15μmol/L至0.5μmol/L浓度梯度的引物和从0.075μmol/L至0.25μmol/L浓度梯度的探针进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的引物浓度为0.35μmol/L、探针浓度为0.2μmol/L。

镁离子浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1mmol/L至2.5mmol/L浓度梯度的镁离子进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓度为2mmol/L。

酶用量的优化：在40μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1U(酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/人份进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的酶用量为3U/人份。

dNTPs浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/L至0.25mmol/L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为0.2mmol/L。

反应温度的优化：根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：93℃预变性2min；然后93℃ 45s，55℃ 1min，10个循环；最后93℃ 30s，55℃ 45s，30个循环。

4、灵敏度实验：以麦氏比浊法测定上述ATCC的CP标准株纯培养物的浓度为1.5×10⁹个/mL，先稀释成1.0×10⁷个/mL，然后10倍梯度稀释成1.0×10⁶个/mL、1.0×10⁵个/mL、1.0×10⁴个/mL、1.0×10³个/mL、1.0×10²个/mL、1.0×10¹个/mL、1.0×10⁰个/mL作为CP阳性定量标准品，检测结果表明，本发明方法的最低检测下限为1.0×10²个/mL(参见图1)。

实施例2：肺炎衣原体检测试剂盒及其使用

1、制备包括下列组成成分的试剂盒：DNA提取液(500μl/管)2管、PCR反应液20管、阴性参考品(100μl/管)1管、临界阳性参考品(50μl/管)1管、阳性定量标准品(50μl/管)4管。

2、标本采集、运送和保存

(1)标本采集(全血)：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。

(2)标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送时应采用0℃冰壶。

3、检测步骤

(1)标本处理与DNA提取

取全血1毫升至干燥玻璃试管中，加入生理盐水1毫升轻摇混匀；并取干燥玻璃试管加入500μl淋巴细胞分离液。然后将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中(注意沿着管壁，速度要慢)；2,000rpm离心20分钟(建议用水平离心机)后，吸取白细胞层(从上之下的第二层)，加入1.5ml离心管，12,000rpm离心5分钟；去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟，12,000rpm离心5分钟，备用。

(2)PCR反应与结果分析

分别取阴性参考品、标本、临界阳性参考品、定量标准品各5μl，加入PCR反应管中进行PCR扩增。PCR循环条件是：93℃预变性2min；然后93℃ 45s，55℃ 1min，10个循环；最后93℃ 30s，55℃ 45s，30个循环。

反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线图调节分析参数，使分析结果窗口下的标准曲线达到最佳(即相关性数值R²＞0.97)(参见图1所示)。由图2和图3可以看出，阳性标本的荧光曲线与设定的阈值线有一交点，由交点所在位置得出Ct值；由于阴性标本的荧光曲线低于阈值，故没有Ct值。最后由仪器自动分析装置计算出未知标本的测定数值(Qty)，即标本中CP的浓度(参加图2和图3)。

实施例3：临床标本检测的重复性测试

具体步骤同实施例2，不同的是所用标本为测序确定为CP阳性的标本。提取核酸后用本发明的试剂盒进行PCR扩增，每一份标本设置多个复管。在扩增的同时由仪器自动监测并收集荧光信号的变化。反应结束后分析，应用本发明的试剂盒检测结果显示同一标本不同的曲线均在同一Ct值范围内，此结果表明试剂盒具有良好的重复性。(参见图4)。

序列表

<110>中山大学达安基因股份有限公司

<120>实时荧光定量检测肺炎衣原体的方法及试剂盒

<140>

<141>

<160>3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>1

gctactggaa caaagtctgc ga

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>2

cattgtactc caatgtatgg cacta

<210>3

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。

<400>3

ttatcatgaa tggcaagtag gagcctctct atctt

Claims (9)

1. 一种使用实时荧光定量聚合酶链反应技术定量检测样品中肺炎衣原体(CP)存在的方法，该方法包括：(1)提供包括样品、核酸扩增体系，和荧光监测体系的反应与检测混合物，(2)通过扩增反应循环扩增所说的靶多核苷酸，(3)使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸间接结合，(4)确定荧光发生基团所产生的荧光量，(5)分析扩增循环后产生的荧光量以确定靶多核苷酸的存在及其相对量；其中核酸扩增体系包括可与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物，并且荧光监测体系包括可与靶多核苷酸结合的寡核苷酸探针，特征在于所使用的寡核苷酸引物序列是：正向引物CP-F：5’-gct act gga aca aag tct gcg a-3’(SEQ ID NO：1)和反向引物CP-R：5’-cat tgt act cca atg tat ggc act a-3’(SEQ ID NO：2)，由正向引物CP-F向5’端方向延伸5个碱基、向3’端方向延伸5个碱基范围内得到的引物序列或能与这段范围内的序列可以杂交的引物序列；以及由反向引物CP-R向5’端方向延伸5个碱基、向3’端方向延伸5个碱基范围内所得到的引物序列或能与这段范围内的序列可以杂交的引物序列。

2. 根据权利要求1中荧光监测体系包括的寡核苷酸探针，特征在于所使用的寡核苷酸探针序列包括：寡核苷酸探针CP-P：5’-tta tca tga atg gca agt agg agc ctc tct atc tt-3’(SEQ ID NO：3)，以及由寡核苷酸探针CP-P向5’端方向延伸5个碱基、向3’端方向延伸5个碱基范围内得到的探针序列或能与这段范围内的序列可以杂交的探针序列。

3. 根据权利要求1的方法，其中所说的样品选自但不限于外周血、痰液、咽拭子及血清。

4. 根据权利要求1的方法，其中所说的核酸扩增体系包括(a)耐热DNA聚合酶、(b)2’-脱氧核苷三磷酸、(c)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物，和(d)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物；其中所说的荧光检测体系包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。

5. 根据权利要求1的方法，所说的方法进一步包括：(1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，以计算出样品中靶多核苷酸的量。

6. 根据权利要求1的方法，其中所说的肺炎衣原体选自肺炎衣原体的任何一种变异株；其中所说的靶多核苷酸来自肺炎衣原体。

7. 一种使用实时荧光定量聚合酶链反应技术定量检测临床样品中肺炎衣原体的试剂盒，该试剂盒包括：(1)分别装有DNA提取液、PCR扩增反应液、稀释液、阴性参考品、阳性参考品和阳性标准品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

8. 根据权利要求7的试剂盒，其中用于靶多核苷酸扩增体系的正向和反向引物序列分别是5’-gct act gga aca aag tct gcg a-3’和5’-cat tgt act cca atg tat ggc act a-3’。

9. 根据权利要求7的试剂盒，其中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针序列是5’-tta tca tga atg gca agt agg agc ctc tct atc tt-3’。

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