CN101638693A - 实时荧光定量pcr检测人肠道病毒的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及实时荧光PCR检测试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断人肠道病毒感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对粪便、血清、咽拭子、脑脊液、疱疹液等样品中的人肠道病毒的快速早期检测和定量分析。

Description

实时荧光定量PCR检测人肠道病毒的试剂盒

技术领域

本发明涉及实时荧光PCR检测试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断人肠道病毒感染的试剂盒。通过本发明的试剂盒实现对粪便、血清、咽拭子、脑脊液、疱疹液等样品中的人肠道病毒的检测和定量分析。

背景技术

肠道病毒(enterovirus，EV)属于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，本属病毒具有相同的理化生物学特性，包括脊髓灰质炎病毒(Poliomyelitis Virus，PV)、柯萨奇病毒(Coxsackie virus，CV)、致肠细胞病变人孤儿病毒(enterocytopathic human orphan virus，简称埃可病毒，ECHOV)及新型肠道病毒等70多个血清型，本属病毒感染广泛分布于世界各地，夏秋季发生流行较多，同一地区每年流行的病毒型别常有改变。普遍易感，但发病以小儿为多，成人多为隐性感染，但初发地区亦可见成人间的暴发流行。肠道病毒感染临床表现复杂多变，病情轻重差别甚大。同型病毒可引起不同的临床症候群，而不同型的病毒又可引起相似的临床表现。肠道病毒71型、A组柯萨奇病毒和埃可病毒的某些血清型感染可引起婴幼儿手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)及疱疹性咽峡炎，其中肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)还能引起神经系统相关疾病，严重者致人死亡。自2008年5月2日起，手足口病纳入丙类传染病管理。

人是肠道病毒唯一宿主，患者和隐性感染者均为本病的传染源。肠道病毒主要经由肠胃道(粪口、水、食物污染)或呼吸道(飞沫、咳嗽或打喷嚏)传染，亦可经接触病人皮肤、粘膜泡疹液而感染，并具有起病急、传播快等特点。

由肠道病毒引起的手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以中枢神经系统为主要临床特征的EV71流行，1975年保加利亚报告病例750例，其中149人致瘫，44人死亡；1994年英国发生一起由CoxA16引起的手足口病暴发，患者大多为1-4岁婴幼儿；1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，4-8月共有2628人发病，4-6月有29例病人死亡。我国于1981年上海首次报道本病，此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、青海和广东等10几个省份均有本病报道。1983年天津发生Cox A16引起的手足口病暴发，5-10月间发生了7000余病例。1998年，台湾地区发生EV71感染引起的手足口病和疱疹性咽峡炎流行，共报告129106例病例，其中重症病人405例，死亡78例，大多为5岁以下的幼儿，重症病例的并发症包括脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性软瘫和心肌炎。2008年4月，在我国安徽省阜阳暴发EV71引起的手足口病，短短2周时间内造成23例儿童死亡，随后全国手足口病报告病例数直线上升，截止5月9日全国共累计因EV71、CoxA16等肠道病毒引起的手足口病例近25000例，34名患儿死亡，给婴幼儿身体健康、社会稳定带来严重威胁。由于肠道病毒引起的手足口病等疾病无特效治疗药物和疫苗，而且传播规律和致病机理不清，快速、准备的检测是控制和预防肠道疾病传播的有效手段。

目前肠道病毒的常规诊断方法还是组织培养、中和抗体实验以及免疫学诊断等方法。组织培养需要一定的实验设备和技术水平，并相当耗时，等培养结果明确时已无益于患者的治疗；而且，约25％～35％的肠道病毒，尤其是柯萨奇病毒A组，不能在组织培养中生长(LipsonSM et al.J Clin Microbiol，1988：26：1298～1303.)，必须接种到裸鼠体内才能检测到，因此，该方法繁杂，一般需要6-8天，周期太长，不适合标准化推广。中和抗体实验必须采集、比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体的滴度才有意义，这对于由EV71、CoxA16等致病性强的病毒引起的急性、重症疾病来说，显然无益于患者的诊断。免疫学方法诊断肠道病毒感染受到不同血清型间抗原性分化的限制，由于肠道病毒血清型繁多，变异快，缺乏能有效用于免疫学诊断的共同抗原。更重要的是，目前国内外缺乏标准诊断试剂，市面上还没有一个可用的诊断试剂盒，因此，开发早期、快速、特异、敏感的检测试剂盒非常必要。

近年来，随着分子诊断技术的飞速发展，聚合酶链反应(PCR)技术已经广泛应用于RNA病毒基因水平的研究，也给微生物的快速鉴定提供了可能。PCR技术克服传统方法费时、费力且无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要的缺点，一般12小时内可以出结果，已成为肠道病毒快速诊断的重要手段。Rotbart等(Rotbart HA et al.Diagnosis of EnteroviralMeningitis with the Polymerase Chain Reaction.J Pediatr，1990，117：85-89.)对一些患有手足麻痹可疑为脑膜炎的病儿进行病原学检查，在临床诊断为无菌性脑膜炎的12例病人的脑脊液标本中，用PCR方法全部检出肠道病毒RNA的存在；Sawyer等(Sawyer MH et al.Diagnosisof enteroviral central nervous system infection by polymerase chain reaction during a largecommunity outbreak.Pediatr Infect Dis J，1994，13：177-182.)在肠道病毒感染大面积流行时，用PCR技术对感染有中枢神经系统疾病的患儿进行病原学分析，在112例肠道病毒培养阳性的脑脊液标本中，PCR检测出109例(97％)含有肠道病毒RNA；53例肠道病毒培养阴性或没做肠道病毒培养鉴定的脑脊液标本中，PCR检测出35例(66％)肠道病毒为阳性。Nix WA等(Nix WA et al.Identification of enteroviruses in naturally infected captiveprimates.J Clin Microbiol.2008 Jul 2.)以及梅元武等(梅元武等.病毒性脑炎患者肠道病毒RT-PCR检测的临床意义初探.中华神经医学杂志，2006，5(1)：33-37)分别用PCR技术检测出脑膜炎患者标本中的肠道病毒，并论证了PCR技术在临床肠道病毒诊断中的积极意义。

实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM et al.Real-time PCR in virology.Nucleic Acids Res.2002 5；30(6)：1292-1305；Lie，Y.S.，Petropoulos，C.J.，Advances in quantitative PCR technology：5’nuclease assays.Current Opinion inBiotechnology 1998.9，43-48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。

与普通PCR相比，TaqMan PCR技术具有如下优点：通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃普通PCR方法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对检测样品进行准确定量分析，从而有效监测药物治疗的效果；将DNA扩增与检测过程融合为一体，可以实时、动态监测DNA扩增的全过程，省掉了PCR后处理过程大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；由于采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；由于在普通PCR基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，进一步提高了检测靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。

美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒，如用于HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测的试剂盒。同样，中国目前也已批准了乙型肝炎、丙型肝炎、HIV和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒的生产和临床应用。因此，通过实时荧光PCR技术能够开发一种检测肠道病毒核酸的试剂盒，满足肠道病毒快速检测与监测工作的需要。

众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析临床样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探针。本发明人将实时荧光定量PCR技术开发了应用于肠道病毒的检测和定量分析，成功地完成了本发明。

发明内容

本发明涉及检测粪便、血清、咽拭子、脑脊液、疱疹液等样品中的肠道病毒存在的试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断肠道病毒感染的试剂盒。

因此，本发明的目的是提供一种使用实时荧光PCR技术来定性及定量检测样品中肠道病毒的试剂盒，特别是涉及肠道病毒的早期感染在实验室诊断中的应用。基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物和一条靶多聚核苷酸的特异性探针，在耐热DNA聚合酶(Taq酶)、逆转录酶(RT酶)、RNA酶抑制剂(RNasin)、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg²⁺等PCR反应缓冲液中，通过DA7600、ABI7500等荧光PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，从而达到快速、实时、定量检测靶多核苷酸的目的。

本发明所提供的检测临床样品中肠道病毒的试剂盒包括：(1)分别装有RNA提取液(即TRIZOL核酸抽提试剂)、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其特征在于PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的正向引物EV-F和反向引物EV-R的序列分别是：5′-GGTAGTGTGTCGTAATGGGCAACTCAC-3′(SEQ ID NO：1)和5′-TTCTATAATTGTCACCATAAGCAGTCA-3′(SEQ ID NO：2)，其中正向引物EV-F可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，反向引物EV-R可向5’和3’端方向各延伸10个碱基。

根据本发明的一个优选实施方案，PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针EV-P的序列是5′-CGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTT-3′(SEQ ID NO：3)，其中该寡核苷酸探针序列可向5’和3’端方向各延伸10个碱基。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液由(a)耐热DNA聚合酶(Taq酶)、(b)逆转录酶(RT酶)、(c)RNA酶抑制剂(RNasin)、(d)脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、(e)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物，(f)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物，(g)和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针组成。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增反应液中的最佳引物浓度为0.40μmol/L、探针浓度为0.20μmol/L；

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增反应液中的最佳镁离子浓度为2.0mmol/L、Taq酶最佳用量为5U/反应、RT酶最佳用量为100U/反应、RNasin最佳用量为20U/反应、脱氧核糖核苷三磷酸最佳浓度为0.21mmol/L。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为：40℃逆转录25min；然后94℃预变性3min；最后93℃15s，55℃45s，40个循环。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阴性质控品为生理盐水。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阳性质控品为灭活肠道病毒71型(ATCC VR-784)纯培养上清液，包括1×10⁶PFU/ml的强阳性质控品和1×10³PFU/ml的临界阳性质控品。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中定量参考品为灭活肠道病毒71型(ATCC VR-784)纯培养上清液，包括4个浓度梯度：1.0×10⁷PFU/ml、1.0×10⁶PFU/ml、1.0×10⁵PFU/ml、1.0×10⁴PFU/ml。

本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可以检测出肠道病毒的最低浓度为5.0×10²PFU/ml，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。

本发明针对肠道病毒5’端非编码区保守基因片段设计特异引物和探针，可检测出肠道病毒，但不能检测出非肠道病毒病原体，说明本试剂盒具有很好的特异性。

本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可以检测粪便、血清、咽拭子、脑脊液、疱疹液等样品中的肠道病毒；可为灵敏、快速早期诊断肠道病毒感染提供可靠的实验证据；同时由于能准确定量，所以可对临床用药进行有效监测。

附图说明

图1显示线性与灵敏度参考品的检测结果图。针对模板数为5.0×10¹～5.0×10⁷PFU/ml的线性与灵敏度参考品进行TaqMan PCR检测分析，检测结果表明，当病毒量为5.0×10²PFU/ml时，检测样品的Ct值在34左右，即检测下限灵敏度可到达5.0×10²PFU/ml。

图2显示定量参考品扩增结果的标准曲线图。针对模板数为1.0×10⁴～1.0×10⁷PFU/ml的定量参考品进行TaqMan PCR检测分析，绘制得到的标准曲线斜率为-3.85，在Y轴截距为44.60，相关系数(R²)＝0.9977。

图3显示8个阳性参考品的检测结果图。8个阳性参考品的荧光扩增曲线有明显指数增长期，并与设定的阈值线有一交点，由交点所在位置得出Ct值分别为17.42，19.69，20.96，21.42，22.87，25.39，27.00，28.48，可明确判定为阳性。8个阳性参考品分别为肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)、柯萨奇病毒B组2型(CoxB2)、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒以及新型肠道病毒68型、69型和70型。

图4显示10个阴性参考品的检测结果图。10个阴性参考品的扩增曲线平直或斜向下且与阈值线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。10个阴性参考品分别为与肠道病毒感染有相似症状的腺病毒、轮状病毒、诺沃克病毒、流感病毒A以及6份正常人的粪便样品。

图5显示同一份阳性参考品(5×10⁴PFU/ml)7次重复性实验的检测结果图。可看出不同扩增曲线的Ct值均在27至28之间，计算得出变异系数CV＝5％，说明试剂盒的重复性好。

图6显示6个临床阳性标本的扩增曲线。6个标本的Ct值分别是19.01，20.16，23.14，23.63，25.43，28.80；结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：人肠道病毒荧光PCR检测试剂的研制

1、引物和探针的设计：通过对Genbank数据库已有的肠道病毒核酸序列以及国内外已发表文献中报导的核酸序列进行序列比对分析，以肠道病毒的5’非编码区保守基因片段为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用软件和人工设计多对引物和探针。

2、样本的选择：根据国内外相关文献报道表明，可以选择粪便、血清、咽拭子、脑脊液、疱疹液等样品。

3、反应体系的建立与优化

样品的准备：以病毒培养和测序鉴定为阳性的8种肠道病毒作为阳性参考品，分别为肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)、柯萨奇病毒B组2型(CoxB2)、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒以及新型肠道病毒68型、69型和70型；以腺病毒、轮状病毒、诺沃克病毒、流感病毒A型以及6份正常人的粪便样品，共10份样品作为阴性参考品。分别用TRIZOL提取上述阳性参考品与阴性参考品的RNA待用。

引物探针的筛选：以上述1中设计的多组引物探针分别检测上述的阳性参考品与阴性参考品的RNA，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合(如序列表中SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3)。

引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.15μmol/L至0.5μmol/L浓度梯度的引物和从0.075μmol/L至0.5μmol/L浓度梯度的探针进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的引物浓度为0.40μmol/L、探针浓度为0.20μmol/L。

Taq酶用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1U(酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的Taq酶用量为5U/反应。

RT酶用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从50U(酶单位)至400U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RT酶用量为100U/反应。

RNasin用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从5U(酶单位)至40U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RNasin用量为20U/反应。

dNTPs浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/L至0.25mmol/L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为0.21mmol/L。

反应温度的优化：根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：40℃逆转录25min；然后94℃预变性3min；最后93℃15s，55℃45s，40个循环。

4、灵敏度实验：测定出浓度为5.0×10¹⁰PFU/mL的灭活肠道病毒71型(ATCC VR-784)纯培养上清液，10倍梯度稀释成5.0×10⁷PFU/mL、5.0×10⁶PFU/mL、5.0×10⁵PFU/mL、5.0×10⁴PFU/mL、5.0×10³PFU/mL、5.0×10²PFU/mL、5.0×10¹PFU/mL作为线性与灵敏度参考品，进行TaqMan PCR检测分析，检测结果如附图1所示，当病毒量为5.0×10²PFU/ml时，检测样品的Ct值在34左右，即检测下限灵敏度可到达5.0×10²PFU/ml。

5、标本检测；以粪便、血清、咽拭子、脑脊液、疱疹液等作为待检标本，分别用TRIZOL提取标本的RNA后，经上述优化建立的核酸扩增体系检测，结果表明本试剂盒可以很灵敏的检测出临床标本中的肠道病毒。

实施例2：人肠道病毒荧光PCR检测试剂盒及其使用

1、制备包括下列组成成分的试剂盒：RNA提取液(50ml/管)1管、PCR扩增反应液(20μl/管)24管、阴性质控品(100μl/管)1管、阳性质控品(100μl/管)1管、定量参考品(50 μl/管)4管。

2、标本采集、运送和保存

(1)标本采集：标本采集对象是暴发疫情出现时手足口病的临床诊断病例和病例发病所在社区(村)的临近无病例的社区(村)或托幼机构的5岁以下的儿童(作为健康对照人群)。

标本应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如标本编号、发病日期和标本采集日期。

(2)标本保存和运送：

①粪便标本

采集病人发病7日内的粪便标本，采集量5～8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。

②咽拭子标本

采集病人发病3日内的咽拭子标本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液(维持液或生理盐水，推荐使用维持液)的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。4℃暂存立即(12h内)送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。

③血清标本

静脉采集3～5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于-20℃以下冰箱中冷冻保存。

④疱疹液

同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75％的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液(维持液或生理盐水，推荐使用维持液)的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即(12h内)送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。

⑤脑脊液标本

出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0～2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。

3、检测步骤

(1)RNA提取

水样粪便、血清、脑脊液、疱疹液等液态样本各100μl(样品不足100μl时请补加适量生理盐水重悬)，放置于1.5ml灭菌离心管，加入200μl Trizol试剂及100μl氯仿，用振荡器强力振荡20秒后静置3分钟；

2～8℃下12,000rpm离心10min，吸取上清至另一干净的1.5ml离心管；

加入0.2ml氯仿，盖紧盖子，手动用力颠倒摇动15s(不可用振荡器)，室温孵育2～3min；

2～8℃下12000rpm离心15 min后，取最上层的上清液至另一干净的1.5ml离心管；

加入0.5ml预冷的异丙醇，缓慢颠倒充分混匀后，-20℃静置15min，2～8℃，12000rpm离心10min，小心弃尽上清液；

加入1ml预冷的70％的冰冷乙醇，手动颠倒数次洗涤沉淀，2～8℃，8000rpm离心5min，小心弃尽上清液；

空气或真空干燥5～10min，加入50μl DEPC H₂O，55～60℃下孵育10min，手指轻轻弹打管底，使其充分溶解，直接取上清用于PCR实验或-70℃保存备用。

(2)PCR反应与结果分析

分别取阴性质控品、标本、阳性质控品、定量参考品各5μl，加入PCR反应管中进行PCR扩增。PCR循环条件是：40℃逆转录25min；然后94℃预变性3min；最后93℃15s，55℃45s，40个循环。

反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线图调节分析参数，使标准曲线(Std curve)窗口下的定量参考品标准曲线达到最佳(即相关性数值绝对值＞0.97)(参见附图2所示)。由附图3可以看出，8个阳性参考品的荧光扩增曲线有明显指数增长期，并与设定的阈值线有一交点，由交点所在位置得出Ct值分别为17.42，19.69，20.96，21.42，22.87，25.39，27.00，28.48；在附图4中，由于10个阴性参考品的扩增曲线平直或斜向下且与阈值线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。最后由仪器自动分析装置计算出未知标本的测定数值。

实施例3：肠道病毒荧光PCR检测试剂盒重复性实验

以5.0×10⁴PFU/ml的阳性参考品作为待检样品，按照实施例2中的方法用3个生产批次的7个肠道病毒荧光PCR检测试剂盒同时检测5.0×10⁴PFU/ml的阳性参考品，结果如附图5所示：不同扩增曲线的Ct值均在27至28之间，计算得出变异系数CV＝5％，说明试剂盒的重复性好。

实施例4：应用肠道病毒荧光PCR检测试剂盒定量检测临床样品

临床样品来自广东省疾病预防控制中心，包括粪便、咽拭子、血清、脑脊液等样品类型；标本RNA提取、PCR反应与结果分析参照实施例2进行。

PCR反应结束后，根据扩增曲线先调节分析参数，使标准曲线(Std curve)窗口下的定量参考品标准曲线达到最佳(即相关性数值绝对值＞0.97)，然后分析临床样品。临床样品的检测结果如附图6所示：6个临床阳性标本扩增曲线的Ct值分别是19.01、20.16、23.14、23.63、25.43、28.80，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性；参照同一次试验中定量参考品的标准曲线图(如附图2所示)可以判定6个临床阳性标本的肠道病毒浓度分别为：1.05×10⁶PFU/ml、5.64×10⁵PFU/ml、1.15×10⁵PFU/ml、8.80×10⁴PFU/ml、3.36×10⁴PFU/ml、5.54×10³PFU/ml。

序列表

<110>中山大学达安基因股份有限公司

<120>实时荧光定量PCR检测人肠道病毒的试剂盒

<140>

<141>

<160>3

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>1

ggtagtgtgtcgtaatgggcaactcac

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>2

ttctataattgtcaccataagcagtca

<210>3

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。

<400>3

cggaaccgactactttgggtgtccgtgtttccttt

Claims (10)

1、一种检测样品中人肠道病毒存在的试剂盒，该试剂盒包括：(1)分别装有RNA提取液、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR扩增反应液包括耐热DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、脱氧核糖核苷三磷酸、正向引物、反向引物，两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针，其特征在于PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别为：

正向引物EV-F：5’-GGTAGTGTGTCGTAATGGGCAACTCAC-3’

反向引物EV-R：5’-TTCTATAATTGTCACCATAAGCAGTCA-3’

其中正向引物EV-F可向5’和3’端方向各延伸10个碱基，反向引物EV-R可向5’和3’端方向各延伸10个碱基。

2、根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中所使用的寡核苷酸探针EV P的序列为：5’-CGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTT-3’，该寡核苷酸探针序列可向5’和3’端方向各延伸5个碱基。

3、根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中正向引物浓度为0.40μmol/L、反向引物浓度为0.40μmol/L、寡核苷酸探针浓度为0.20μmol/L。

4、根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中耐热DNA聚合酶的浓度为5U/反应。

5、根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中逆转录酶的浓度为100U/反应。

6、根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中RNA酶抑制剂的浓度为20U/反应。

7、根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的浓度为0.21mmol/L。

8、根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于用于PCR扩增的反应温度和时间为：40℃逆转录25min；然后94℃预变性3min；最后93℃15s，55℃45s，40个循环。

9、根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于所检测的样品可选自但不局限于粪便、血清、咽拭子、脑脊液、疱疹液等样品。

10、根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于所检测的人肠道病毒包括但不局限于脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒和新型肠道病毒68型、69型、70型和71型。

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