CN101660001B

CN101660001B - 一种轮状病毒核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN101660001B
Application number: CN2008101980092A
Authority: CN
Inventors: 周高英; 朱坤; 李明; 程钢; 何蕴韶
Original assignee: Daan Gene Co Ltd Zhongshan University
Current assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Priority date: 2008-08-27
Filing date: 2008-08-27
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2028-08-27
Also published as: CN101660001A

Abstract

本发明涉及轮状病毒检测试剂盒，特别是涉及一种利用实时荧光PCR技术检测轮状病毒(Rotavirus)核酸的试剂盒。该试剂盒通过对样本中的轮状病毒核酸进行定性检测，由于其具有高灵敏度、高特异性、操作简单、检测速度快的特点，可广泛应用于轮状病毒感染的辅助诊断。

Description

一种轮状病毒核酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及轮状病毒检测试剂盒，特别是涉及一种利用实时荧光PCR技术检测轮状病毒(Rotavirus)核酸的试剂盒。该试剂盒通过对样本中的轮状病毒核酸进行定性检测，可广泛应用于轮状病毒感染的辅助诊断。

背景技术

轮状病毒是病毒性肠胃炎中最常见的一种病原体。A组轮状病毒主要感染婴幼儿，有报道称发展中国家每年病例数超过1.3亿，而死亡人数超过87万。B组轮状病毒(也称成人腹泻轮状病毒)则可引起青壮年胃肠炎的暴发流行。1973年，澳大利亚学者Bishop等在急性非细菌性肠胃炎儿童十二指肠粘膜的超薄切片中首次发现，1974年将之命名为轮状病毒。[WhiteGB，Ashton CI，Roberts C，Parry HE.1974.Letter：″otavirus″n gastroenteritis.Lancet.2(7882)：726；Bryden AS，Davies HA，Hadley RE，Flewett TH..1975.Rotavirus enteritis in the WestMidlands during 1974.Lancet.2(7928)：241-3.]这种病原能引发接种动物发生呼吸道感染，并可自感染动物体内分离。轮状病毒基因含有11个节段。11个段的分子量在0.2-2.2×10⁶MDa范围，总分子量约10-14×10⁶MDa。在所有病毒中唯独轮状病毒的基因组分为11个片段，全长约18550bp，因此可以用聚丙烯酰胺凝胶直接鉴定。每个片段含一个开放读码框架，分别编码6个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和5个非结构蛋白(NSP1-NSP5)。按照基因结构和群抗原上差异，RV至少可分A、B、C、D、E、F(G)6(7)个不同的组群。[ChanockSJ，Wenske EA，Fields BN.1983.Human rotaviruses and genome RNA.J Infect Dis.148(1)：49-50；Konno T.1987.Antigen detection with monoclonal antibodies.Rinsho Byori.35(5)：535-8；Desselberger U，McCrae MA.1994.The rotavirus genome.Curr Top MicrobiolImmunol.185：31-66.Prasad BV，Chiu W.1994.Structure of rotavirus.Curr Top MicrobiolImmunol.185：9-29.]。

轮状病毒在世界各地均有分布，A、B、C组轮状病毒能引起人类和动物腹泻，D-G组只引起动物腹泻。A组主要流行的血清型为G1P8、G2P4、G3P8和G4P8，在所有就诊病例中占到80％以上。年长儿童和成人常呈无症状感染，通常称病毒携带者。传染源是病人和无症状带毒者，病人每克粪便中排出的病毒体可达10¹⁰个。无论在发达或发展中国家，A组RV引起的腹泻都有较高的发病率，是婴幼儿发病和致死的重要病因。在发展中国家，为婴幼儿致死的仅次于呼吸道感染的第二位病因。粪-口是RV传播的主要途径，此外水源污染，呼吸道空气传播，院内和幼托所及家庭成员中的密切接触均可造成流行，还有人推测，动物可能是作为人感染RV的重要传染源。病毒侵入人体后在小肠粘膜绒毛细胞内增殖，病毒外壳蛋白VP4为主要致病因子，它造成细胞溶解死亡，微绒毛萎缩、变短、脱落；腺窝细胞增生、分泌增多，导致严重腹泻，水和电解质的丧失。病毒的潜伏期只有一到两天，然后突然发烧、水样腹泻、呕吐脱水，凭自身免疫可完全恢复。但当婴儿营养不良或已有脱水，若不及时治疗，就会导致婴儿死亡。由于病毒本身变异较大，针对性疫苗难以实现产业化，世界卫生组织(WHO)推荐以预防为主，注意婴幼儿营养和卫生状况来达到降低病毒的感染率。[Hamilton JR.1985.Treatment of acute diarrhea.Pediatr Clin North Am.32(2)：419-27.Diggle L.2007.Rotavirusdiarrhoea and future prospects for prevention.Br J Nurs.16(16)：970-4.Posfay-Barbe KM，Zerr DM，Pittet D.2008.Infection control in paediatrics.Lancet Infect Dis.8(1)：19-31]

传统检测RV感染的方法主要依赖于电镜(EM)或免疫学测定，如酶联免疫吸附(ELISA)等等。近年随着分子遗传学等的发展，建立了更为特异和敏感的检测方法，如RNA核酸杂交，RT-PCR等用于检测核酸的方法。现分述如下：

1.电镜观察：有时也用免疫电镜和超薄切片电镜检查法，此法在诊断中的作用受到高度评价，但由于受设备限制，较难推广。

2.酶免疫吸附试验：双夹心法(double sandwich method)是目前最为常用的检测方法，WHO将此法列为诊断RV的标准方法，国内外都已有相关产品上市销售，但这种快速检测方法的灵敏度有比较大的欠缺。

3.PAGE法：RV在粪便中含量高达10¹⁰病毒颗粒/克，故可从粪便中直接提取dsRNA、其对RNA酶的降解有强的抵抗力，另外粪便中其它肠道病毒核酸不会进入用于检测RV dsRNA的聚丙烯酰胺凝胶，提取的dsRNA经10％PAGE分离，EB和AgNO₃染色后，呈现RV特有的11条带，此法敏感，特异准确可靠，在诊断RV感染，确定流行期病毒种类，病毒漂移和转变及基因重排分析等方面有重要的参考价值。

4.核酸探针杂交：首先从标本中提取病毒dsRNA，其可在溶液中或在固相支持物上(如NC膜或尼龙膜)，与其互补的P2标记的DNA或RNA probe进行杂交，通过检测标记的probe观察是否有阳性杂交反应，杂交的敏感性与probe序列的长度成正比。

5.逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)：PCR自1985已被大量地用于检测人体内病毒核酸序列，具有敏感特异，简便和快速等优点，针对基因的保守序列，合成两个引物，将抽提mRNA一步法进行体外扩增，加上特异性荧光探针的配合使用，可即时证实RV的存在。此法操作简单易行，而且准确灵敏，适用于商品化试剂盒。

本发明设计的试剂盒利用实时荧光RT-PCR一步法，对感染者排泄物中的轮状病毒RNA进行检测，在了解患者患病程度，预测、评价治疗效果方面有十分重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种实时荧光RT-PCR一步法检测轮状病毒的试剂盒(下面简称一步法试剂盒)，该试剂盒包括：(1)RNA提取试剂、RT-PCR反应液、RT-PCR反应酶系、经焦炭酸乙二脂(DEPC)处理的纯水、阴性质控品、阳性质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

为了解决上述任务，本发明的具体技术路线为：

(1)针对轮状病毒保守序列设计的能够与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针。

(2)寡核苷酸探针标记荧光发生基团，使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多聚核苷酸间接结合。

(3)适宜于RT-PCR扩增的反应体系和荧光检测体系。核酸扩增反应体系包括逆转录酶、耐热DNA聚合酶、2’-脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液。

(4)从待测样本中提取RNA，加入前述的反应体系中，直接经一步法RT-PCR扩增，从荧光扩增曲线判断是否存在轮状病毒基因。

根据本发明一个优选的实施方案，其中一步法试剂盒的RT-PCR反应液由5×RT-PCR缓冲液、正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、DEPC水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是5’-GGC TTT AAA AGC GAG AAT TTC CG-3’(SEQ ID NO：1)和5’-AGAATT GTG GTA TAT TCA ATA CCA TAC AT-3’(SEQ ID NO：2)，用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针是5’-X-AAA GGA GCT AAC CGC TAG CCA GAC GG-Y-3’(SEQ ID NO：3)，其中X/Y表示荧光标记基团，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。RT-PCR反应酶系包含逆转录酶mMLV、Taq酶和RNA酶抑制剂(RNasin)。

根据本发明另一个优选的实施方案，其中经焦炭酸乙二脂(DEPC)处理的纯水用于病毒核酸溶解或者无RNase相关试剂的配制。

本发明所述的一步法试剂盒中的阴性质控品为经焦炭酸乙二脂(DEPC)处理的纯水，阳性质控品为轮状病毒灭活阳性样本，用于实际检测中的质量控制。

根据本发明提供的一步法试剂盒，对轮状病毒进行检测，该方法包括下列步骤：

(1)用RNA提取试剂进行阴、阳性质控品和待测样本(主要为粪便)的RNA提取。RNA提取试剂除本发明提及的方法外，还可以使用其它成熟的RNA提取方法和试剂盒。

(2)将提取的RNA加入到含有RT-PCR反应液和RT-PCR反应酶系的RT-PCR反应管中，进行RT-PCR扩增，使用荧光定量PCR检测仪进行检测。

本发明所述的一步法试剂盒针对轮状病毒检测中的特殊性，对反应体系中引物探针浓度、Mg²⁺浓度，退火温度等均进行优化，结合荧光RT-PCR技术，用于轮状病毒的核酸检测，并研制出用于轮状病毒核酸检测试剂盒，灵敏度可达到103拷贝/ml病毒粒子。

本发明与现有技术相比，具有下列优点：

(1)特异性更强，灵敏度更高。

(2)全封闭反应，提取病毒RNA后，直接用于RT-PCR检测，避免了污染发生；

(3)检测速度快，整个过程不超过3小时；

(4)操作简单，可控性强，可进行大批量样品检测，有利于产业化。

附图说明

图1显示一步法试剂盒检测轮状病毒的条件设置。

图2显示一步法试剂盒检测轮状病毒时不同浓度样本的扩增曲线，三个标本的扩增曲线为S形，均能够判定为阳性。

图3显示一步法试剂盒三个阴性标本的扩增曲线，均不具S形特征，能够判定为阴性。

图4显示阳性质控品扩增曲线。图示扩增曲线为S型曲线，说明检测体系有效扩增了轮状病毒核酸。

图5显示阴性质控品扩增曲线。图示扩增曲线为较平直的折线，与荧光检测阈值线没有交点，且曲线不呈S型，说明检测过程中没有轮状病毒核酸的污染。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：轮状病毒的一步法试剂盒检测方法

(1)标本采集、运送和保存

将待检标本，水样泻状物取500-1000μl，装入无菌1.5ml离心管，可直接送检或于-20℃保存，保存期不要超过六个月。用干冰密封进行运送，避免冻融。

(2)核酸提取

a)取水样排泄物(如已干燥可加适量纯水或生理盐水重悬)各100μl，放置于1.5ml灭菌离心管，加入200μl裂解液及100μl氯仿，用振荡器强力振荡20秒后静置3分钟，然后12,000rpm离心2分钟。阴阳性质控品同以上操作。

b)小心取出无色上层液体(注意不可触及中间絮状层)，转移至新灭菌的1.5ml离心管，然后加入10μl玻璃乳(充分混匀后吸取)，再用振荡器充分混匀，8,000rpm离心1分钟后，小心弃去所有液体；

c)加入75％DEPC乙醇400μl，充分振荡混匀，8,000rpm离心1分钟，尽可能将液体抽干(残液利用枪头引流，避免触及沉淀颗粒)；

d)将装有沉淀的离心管摆在通风橱中风干15分钟(也可使用开放式加热器于60℃干燥5分钟，需防止样本交叉污染)，然后加入30μl DEPC H₂O，用适当的移液器充分重悬，静置1分钟后8,000rpm离心1分钟。

e)小心将上清液(以不带出沉淀为原则)转移至新的1.5ml灭菌离心管(或0.2ml PCR反应管)，95℃变性5分钟，迅速置于冰上冷却。处理过的样品可直接用于PCR检测或暂存于-20℃。若保存一个月以上，可存于-70℃。

)RT-PCR检测

a)配制体系

将35μl引物探针混合物，40μl反应酶系，100μl一步法反应液充分混合，然后分装7μl至每个PCR反应管。体系可暂存于-20℃一周。

b)加样

将13μl待检样品(或阴阳性质控品)的提取物分别加入PCR反应管，盖紧管盖，3,000rpm离心10秒后，放入扩增仪进行扩增。

扩增程序设置

ABI7300/7500荧光PCR扩增仪的参数设置如下：

Reporter Dye：FAM

Quencher Dye：TAMRA

Passive Reference：none

如使用Roche LightCycler和达安的DA7600无需设定以上参数。

扩增温度参数统一设置如下：

40℃15分钟；

94℃3分钟；

35个循环(93℃15秒→58℃35秒)，荧光检测选择在58℃35秒这一环节；

25℃30秒。

保存文件，运行。

(4)结果分析

如果使用ABI7300/7500，在Results—>Amplification Plot界面下检视扩增曲线，进行分析(点击绿色三角或Analyze按钮)。界面右方的Start值一般在6-15之间选择，Stop值一般在S型曲线拐点前1-2个循环，阈值Threshold采用默认值，用户可根据实际情况自行调整。调整后，在Results—>Report界面下可获取单个样品的Ct值。如果使用DA7600，调整完Start和Stop两个数值后，点选“分析”方框即可。若使用Roche LightCycler，应选择F1/F2通道，点击Quantification按钮，Baseline Adjustment最好选择Proportional模式。

假如机器给出的Ct值明显与目测不符，应将阈值线适当拉高予以修正后再次进行分析。(5)结果判定

如果扩增无S型曲线，则判定该样品为阴性；

如果扩增曲线呈明显S型，则判定为阳性样品。在此基础上，如果Ct值大于18，则判定样品为一般阳性，标记为“+”；若Ct值小于等于18，则判定为强阳性，标记为“++”。

实施例2：轮状病毒核酸检测试剂盒中质控品的使用

轮状病毒核酸检测试剂盒中质控品包括阳性质控品和阴性质控品，用于临床试验中质量控制，操作方法同待检样本。

质量控制标准如下：

阴性质控品扩增曲线无明显S型增长；

阳性质控品扩增曲线呈S型且Ct值小于30；

以上要求须在同一次实验中同时满足，否则，本次实验视作无效，需重新进行。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110>中山大学达安基因股份有限公司

<120>一种轮状病毒核酸检测试剂盒

<140>

<141>

<160>3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>1

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>2

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。

<400>3

Claims

1.一种检测轮状病毒核酸的试剂盒，该试剂盒包括：(1)RNA提取试剂、RT-PCR反应液、RT-PCR反应酶系、经焦炭酸乙二脂处理的纯水、定量参考品、阴性质控品、阳性质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中RT-PCR反应液由5×RT-PCR缓冲液、正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、DEPC水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5’-GGC TTT AAA AGC GAG AAT TTC CG-3’和5’-AGA ATT GTG GTA TATTCA ATA CCA TAC AT-3’，用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针的序列是5’-X-AAAGGA GCT AAC CGC TAG CCA GAC GG-Y-3’，其中X/Y表示荧光标记基团，分别为荧光发生基团和荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于阴性质控品为经焦炭酸乙二脂处理的纯水，阳性质控品为轮状病毒阳性样本。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于RT-PCR反应酶系包含逆转录酶mMLV、Taq酶和RNA酶抑制剂。