CN104328218B - 同步检测五种猪病毒的液相基因芯片的核酸及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一组用于同步检测鉴别五种猪病毒的液相基因芯片的核酸，包括猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV‑2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪细小病毒(PPV)五种猪病毒的上、下游引物和杂交探针。本发明还提供上述五种猪病毒多重液相芯片高通量分子生物学检测方法。该方法通过提取待检样品中的猪病毒核酸，进行多重不对称核酸扩增联合多重液相基因芯片(悬浮芯片)检测，实现同步准确检测鉴别待测样品中上述五种猪病毒，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简便，并具有高通量快速检测的优势。

Description

同步检测五种猪病毒的液相基因芯片的核酸及其检测方法
技术领域
本发明属生物技术领域。具体而言，提供一组用于同步快速检测鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪细小病毒(PPV)共五种猪病毒的五重液相基因芯片高通量检测的核酸及其检测方法。
背景技术
(一)、造成猪繁殖障碍等疾病的几种重要猪病毒
猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)感染猪引起猪繁殖与呼吸系统综合病症(PRRS)，以母猪繁殖障碍、仔猪和育肥猪呼吸道症状为主要特征，是一种高度免疫抑制病和高度传染性疫病。
猪圆环病毒2型(PCV-2)。猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。PCV有PCV1和PCV2两个血清型，其中PCV1为非致病性病毒，PCV2具有致病性。PCV-2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic WastingSyndrome,PMWS)的主要病原，PCV-2所引起的疾病是当今养猪业密切关注的重大传染病之一。PCV-2目前已在世界范围内广泛存在，已被公认为是继猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)之后新发现的引起猪免疫障碍的重要传染病。已证实PCV-2可在猪群中垂直传播，而猪精液是传播PCV-2的重要途径。
猪伪狂犬病病毒(Aujeszky’s disease virus,PRV)。伪狂犬病病毒(PRV)属疱疹病毒科(Herpesviridae)、猪疱疹病毒属。PRV在全世界广泛分布。猪是PRV的贮存宿主，PRV主要通过已感染猪排毒而传给健康猪，猪群中PRV主要通过鼻分泌物传播，也可通过乳汁和精液传播方式。感染PRV对15日龄以内的仔猪发病死亡率可达100％，断奶仔猪发病率可达40％，死亡率20％左右；可引起种猪不育症、生长停滞、增重缓慢等。
猪瘟病毒(CSFV)。猪瘟病毒病(Classical swine fever)是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒(CSFV)感染引起的猪的急性、热性、具有高度致死性(死亡率达90％以上)和高度传染性的疫病，被OIE列入疫病名录，被我国列为一类烈性传染病。猪瘟在世界范围内流行，在我国流行多年并引起巨大经济损失。目前虽然已有多个国家开展猪瘟根除计划，但通过接触野猪使猪瘟重返养殖猪群的情况仍时有发生。在育龄猪群中，猪瘟感染并不一定显现明显的临床和病理症状，猪瘟病毒感染力强，防控难度较大。
猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)。猪细小病毒病是由猪细小病毒(PPV)引起的一种繁殖机能障碍性疾病，引起母猪繁殖障碍，全球均有发生。
上述五种猪病毒是引起猪繁殖障碍疾病的重要病原，所引起的疫病在养猪业常见多发、防治难度大。其中PRRSV和PCV-2还是造成猪呼吸道疾病综合征的主要致病原。此外，这五种猪病毒在猪体中发生混合感染的情况比较普遍，临床已多次发现2种或3种猪病毒混合感染的情况，在养猪业已造成严重危害。
针对猪群中存在多种临床症状类似的病原体感染的情况，同步检测多种猪病原体的技术能显著提高检测速度，有助于早发现，早防疫。及时发现猪群携带的病原体，可实行消毒、隔离等防疫措施，不仅能及时控制病原体的传播，还能有效降低生产损失。然而，目前已报道的同步检测多种猪病原体的多重检测技术存在非特异干扰、敏感性不理想等问题。
(二)、猪病原体同步快速检测技术现状与液相芯片技术研究概况
猪可感染多种病原，并且呈现相似甚至临床难于鉴别的病症，给疾病的准确诊断带来困难。各国科学家均努力研究开发能同步检测鉴别多种传染病病毒的方法，分子生物学技术的飞速发展为实现猪疫病毒高通量鉴别检测提供了技术基础。
国内外目前已建立的针对猪传染病病毒的同步快速检测技术主要有多重常规PCR、多重荧光PCR和传统固相芯片技术。
在猪疫病病毒检测方面，国内外已公开发表的多重常规PCR方法主要为二重和三重方法，已公开发表的多重实时荧光PCR方法主要为二重或三重荧光PCR方法。但上述已发表的多重方法的实际检测效果均不理想。目前多重常规PCR或多重实时荧光PCR遇到的主要问题是多重反应带来的检测灵敏度和特异性下降，这主要由于在多重体系中多条引物、探针相互之间竞争模板、dNTP、酶等资源以及交叉反应问题；在多重实时荧光PCR方面，仪器分辨力以及可选荧光基团的组合是制约多重荧光PCR检测通量的关键因素，现有的设备平台和可供选用的荧光染料不能很好解决不同检测通道荧光信号交叉干扰以及仪器对不同荧光基团分辨敏感性差异问题。上述因素限制了多重PCR技术的发展，当前常规多重PCR技术普遍存在检测通量不高、检测效果不理想、实际推广应用受限等不足。
国内外已发表采用传统固相基因芯片技术检测猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒病病毒、日本乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征等一些猪疫病病毒的研究工作。传统的生物芯片是通过微加工技术将大量生物识别分子，如核酸片段、多肽分子等固定在芯片片基上，利用生物分子间的特异识别反应，实现对基因、配体、抗原等生物活性物质的检测分析，但传统生物芯片技术的弱点是信息质量的稳定性和可重复性较差、操作繁琐，并且需要点样仪、杂交仪、扫描仪等多种专用设备，临床应用受到限制。
液相芯片技术的核心技术是乳胶微球包被、荧光色编码、液相分子杂交和激光信号检测，可用于核酸检测、免疫学、蛋白质和基因研究等领域。
截至目前，虽然国外已有一批应用液相芯片技术进行人类疾病病毒研究的报道，但关于动物疫病病毒的液相芯片检测研究工作较少。关于猪病病毒检测，目前国内仅有一项应用液相蛋白芯片技术进行猪传染性胸膜肺炎抗体检测分型的申请专利；国外关于猪病病毒的液相芯片研究报道也较少，涉及到的研究工作有应用液相蛋白芯片检测PRRSV抗体、应用液相基因芯片检测鉴别CSFV、BVDV和边界病毒(BDV)。
综上所述，液相芯片高通量检测技术在动物疫病病毒检测方面的研究尚处起步阶段、关于猪疫病病毒的液相芯片高通量检测研究鲜有报道，主要是由于要实现多种病毒要同时检测，必须保证检测这几种病原所采用的引物、探针及扩增产物，相互之间不能出现交叉反应，否则，容易出现假阳性结果，尤其是检测病毒因子越多，设计引物、探针的难度越大。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的发明人通过研究，建立一种同步检测鉴别五种猪病毒的新型检测方法，其具有高通量、快速、特异、灵敏、并且操作简便、稳定性好、成本低等特点。同时开发出可用于同步检测鉴别五种猪病毒的检测试剂。
因此，本发明的目的在于：提供一组用于检测鉴别五种重要猪病毒的核酸序列。
本发明的另一个目的在于：提供一组用于检测鉴别五种重要猪病毒的检测试剂盒。
本发明的再一个目的在于：提供一种用于高通量快速检测鉴别PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV五种猪病毒的液相基因芯片检测方法。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一组用于同步检测鉴别五种猪病毒的液相基因芯片的核酸序列，包括猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪细小病毒(PPV)五种猪病毒的上、下游引物和杂交探针，其中，
所述PRRSV的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，该上游引物序列5’端标记生物素，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，杂交探针如SEQ ID No.3所示；
所述PCV-2的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示，该下游引物5’端标记生物素，杂交探针如SEQ ID No.7；
所述PRV的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示，该下游引物5’端标记生物素，杂交探针如SEQ ID No.11所示；
所述CSFV的上游引物序列如SEQ ID No.13所示，下游引物序列如SEQ ID No.14所示，该下游引物5’端标记生物素，杂交探针如SEQ ID No.15所示；
所述PPV的上游引物序列如SEQ ID No.17所示，下游引物序列如SEQ ID No.18所示，该下游引物5’端标记生物素，杂交探针如SEQ ID No.19所示；
其中，所述SEQ ID No.2的第10个碱基i为次黄嘌呤，所述SEQ ID No.3的第13位碱基i为次黄嘌呤；
所述五种猪病毒的杂交探针的5’端均标记氨基。
如上所述的核酸，还包括检测PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV的阳性扩增产物序列，其中，
所述检测PRRSV的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.4所示的序列；
所述检测PCV-2的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.8所示的序列；
所述检测PRV的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.12所示的序列；
所述检测CSFV的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.16所示的序列；
检测PPV的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.20所示的序列。
一种用于同步检测鉴别五种猪病毒的液相基因芯片的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV五种病毒上下游引物、杂交探针。
一种用于同步检测鉴别五种猪病毒的液相基因芯片的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV五种病毒上下游引物、杂交探针和五种病毒相对应的阳性扩增产物。
如上所述的试剂盒还包括Mg2+、dNTP、PCR缓冲液、反转录酶和Taq聚合酶混合酶(RT/Taq mix)。
一种同步检测鉴别PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV五种猪病毒的液相基因芯片检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)、提取待检样品的核酸；
(2)、利用如权利要求1中所述检测鉴别PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV五种猪病毒的液相基因芯片的上、下游引物对上述步骤(1)提取的待检样品的核酸进行不对称RT-PCR扩增，获得扩增产物；
(3)、利用如权利要求1中所述PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV的杂交探针，与步骤(2)获得的扩增产物进行杂交反应；
(4)、用液相芯片仪检测步骤(3)杂交反应后的荧光值，根据检测的本底值，判定检测结果；
其中，
所述本底值的设定：同步平行设定3个空白对照进行上述步骤(2)、步骤(3)的反应，其中在所述空白对照，用水取代待测样品模板，其余试剂成分与反应条件不变；计算3个空白对照的测得荧光值的平均值，作为本底值；
结果判定：将被检样品的MFI值减去本底值，作为样品的MFI净值；当被检样品的MFI净值大于或等于2倍本底值时，判为阳性，否则判为阴性。
如上所述的液相基因芯片检测方法，优选地，步骤(2)中，所述PCR扩增的扩增体系，包括PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV五种病毒上下游引物、Mg2+、dNTP、PCR缓冲液、反转录酶和Taq聚合酶混合酶(RT/Taq mix)、待检样品模板和水；所述PRRSV上游引物的终浓度为800nmol/L，下游引物的终浓度为100nmol/L；所述PCV-2上游引物的终浓度为40nmol/L，下游引物终浓度为400nmol/L；所述PRV上游引物终浓度为100nmol/L，下游引物终浓度为800nmol/L；所述CSFV上游引物终浓度为40nmol/L，下游引物终浓度为400nmol/L；所述PPV上游引物终浓度为40nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L。
所述PCR扩增的扩增反应条件为：反应温度为50℃，反应15分钟进行反转录；94℃预变性2分钟；接着进行PCR循环反应：94℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸10秒，共进行40个循环；最后72℃延伸1分钟；
所述步骤(3)包括：
a.将所述5种猪病毒的杂交探针偶联到聚苯乙烯乳胶微球，所述聚苯乙烯乳胶微球带有COOH；
b.将步骤(1)获得的扩增产物与上述步骤a中偶联聚苯乙烯乳胶微球的杂交探针进行杂交反应；
c.杂交反应后，进行洗涤，之后加入链亲和素藻红蛋白(SAPE)进行温育，
d.取温育后的混合液，检测荧光值；
其中，所述步骤b中杂交反应的条件为95℃，5min，57℃，300rpm，恒温杂交10min；所示步骤c加入所述SAPE的浓度6.7μg/mL，室温57℃温育10min。
如上所述的液相基因芯片检测方法，优选地，该方法具体包括以下步骤：
(1)、提取待检样品的核酸；
(2)、对步骤(1)提取的病毒核酸进行五重一步法不对称RT-PCR扩增，所述RT-PCR扩增的扩增反应体系采用50μL体系，包括：
检测PRRSV的特异扩增引物，上游序列如SEQ ID No.1所示，5’端标记生物素，其终浓度为800nmol/L；下游序列如SEQ ID No.2所示，其终浓度为100nmol/L；
检测PCV-2病毒的特异性引物，上游序列如SEQ ID No.5所示，其终浓度为40nmol/L；下游序列如SEQ ID No.6所示，5’端标记生物素，其终浓度为400nmol/L；
检测PRV病毒的特异性引物，上游序列如SEQ ID No.9所示，其终浓度为100nmol/L；下游序列如SEQ ID No.10所示，5’端标记生物素，其终浓度为800nmol/L；
检测CSFV病毒的特异性引物，上游序列如SEQ ID No.13所示，其终浓度为40nmol/L；下游序列如SEQ ID No.14所示，5’端标记生物素，其终浓度为400nmol/L；
检测PPV病毒的特异性引物，上游序列如SEQ ID No.17所示，其终浓度为40nmol/L；下游序列如SEQ ID No.18所示，5’端标记生物素，其终浓度为200nmol/L；
Mg2+终浓度1.2mmol/L；
dNTP终浓度200μmol/L；
PCR缓冲液；
反转录酶和Taq聚合酶混合(RT/Taq mix)酶用量1-2unit；
模板2-5μL，用灭菌双蒸水补足总体积为50μL；
所述RT-PCR扩增的反应条件：
50℃15分钟进行反转录；
94℃预变性2分钟；接着进行PCR循环反应：94℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸10秒，共进行40个循环；最后72℃延伸1分钟，获得扩增产物；
(3)、利用如上所述PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV的杂交探针，与步骤(2)获得的扩增产物进行杂交反应，具体包括：
A.寡核苷酸探针偶联到聚苯乙烯乳胶微球：
将5种猪病毒杂交探针分别偶联到不同编码微球上，所述5种猪病毒杂交探针包括：
PRRSV特异的寡核苷酸探针，序列如SEQ ID No.3所示，5’端标记氨基；
PCV-2特异的寡核苷酸探针，序列如SEQ ID No.7所示，5’端标记氨基；
PRV特异的寡核苷酸探针，序列如SEQ ID No.11所示，5’端标记氨基；
CSFV特异的寡核苷酸探针，序列如SEQ ID No.15所示，5’端标记氨基；
PPV特异的寡核苷酸探针，序列如SEQ ID No.19所示，5’端标记氨基；
可以按Luminex公司提供的标准程序进行探针偶联；
B.对多重核酸扩增产物进行多重微球悬浮杂交检测：
①、用1.5×氯化四甲铵(Tetramethylammonium chloride，TMAC)缓冲液将微球稀释成微球工作液，使每管含5种偶联微球各1000个，分装适量微球工作液至PCR管中；每管中加入适量PCR产物，加pH8.0的1×TE补足反应体积；
②把PCR管放入PCR仪，95℃，5min；然后将PCR管放入恒温混匀仪，57℃300rpm杂交10min；反应结束后，离心收集微球沉淀；
④、用1×TMAC洗涤微球3次；同时用1×TMAC将链亲和素藻红蛋白(SAPE)稀释至6.7μg/mL，作为TMAC-SAPE报告液；
⑤、在每管微球沉淀中，加入TMAC-SAPE报告液，充分混匀；置恒温混匀仪，57℃温育10min；
⑥、取温育后的混合液，用LuminexTM 200system液相芯片仪或其他等效设备测量荧光值(MFI值)；
(4)、检测结果的判定：
a.本底值的测定：同步平行进行3个空白对照样品的上述步骤(2)和步骤(3)反应，在所述空白对照样品的反应体系中，以扩增反应用水取代核酸模板，其余试剂成分与反应条件与检测样品一致；计算3个空白对照样品的MFI值平均值，作为本底值；
b.结果判定：将被检样品的MFI值减去所述本底值，作为样品的MFI净值；当被检样品的MFI净值大于或等于2倍所述本底值时，判为阳性，否则判为阴性。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了了一组检测鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪细小病毒(PPV)等五种重要猪病毒的核酸，该组核酸可用于单一病毒的检测，也可用于几种病毒同步检测的多重扩增使用。用于同步检测这五种猪病毒时，其检测灵敏度高，特异性强，经过验证，对47株病毒株进行检测，相互之间不发生交叉反应。
本发明还提供了一种能够同步快速检测鉴别五种重要猪病毒的新型高通量检测方法。其技术原理是依托xMAP液相芯片这一国际新型高通量分子检测技术平台，所建立的方法适合应用于畜牧养殖业、进出境动物检验检疫等领域进行生猪疫病防控、进出口动物检疫把关、猪精液质量卫生监控等，能够通过一次检测反应，准确检测鉴别待测样品中五种猪病毒，可准确判断是单一病毒感染或是多种病毒混合感染，检测效率显著超越现有常规技术，对于促进猪养殖业发展、加强进出口猪及猪遗传物质口岸把关、促进猪及其产品国际贸易均具有重要意义。其具有以下特点：
(1)高通量、样品用量少。在同步检测目标数量和检测样品量方面均体现高通量的检测能力：采用本发明的液相基因芯片方法，能够同步检测鉴别多种病毒靶基因，可对大量样品进行连续自动化快速检测。由于单个微球可结合的目标分子数量达106，检测五种病毒仅需几微升核酸样品。
(2)操作简便。本发明方法采用微球悬浮杂交原理，避免了传统固相芯片技术需要多台专用设备、操作繁琐、不利于临床应用的不足；本发明方法的扩增、杂交等主要操作步骤均可利用常规PCR仪、混匀仪等普通设备完成，仅在最后信号检测步骤需要专用设备。一方面避免固相芯片需配置多台专用设备的高成本、高投入，同时降低了技术操作难度，更适合临床应用。偶联了探针的微球可在4℃长期储存，平时检测仅需完成扩增和杂交反应操作，不仅方便而且缩短检测时间。
(3)反应快速、灵敏度高。其反应环境为液相，微球上固定的探针与待检样品均在溶液中反应，彼此间碰撞几率与速度相对于固相芯片反应模式，可增加10倍以上，因此可提高反应速度及灵敏度。由于引入了激光检测技术和数字信息处理技术，使检测快速、灵敏的特点更为突出。本发明方法对纯化核酸的检测可在2小时内完成，检测速度可媲美荧光PCR方法。
(4)特异性强、重复性、稳定性好。采用接近生物系统内部环境的完全液相反应体系，更有利于核酸分子的空间相互作用，不仅有利于探针和待检物的反应，也更能保证反应的特异性和稳定性。检测系统采用双束激光，检测结果仅识别对应特定荧光编码的绿色报告荧光，使检测结果的特异性更有保障。检测时，仪器根据所设定参数抽取一定数量的微球进行检测读数，最终检测值取所有被检测微球读数值的平均值，从而使检测结果的重复性好。
本发明方法可准确检测鉴别PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV、PPV五种猪病毒，五种病毒相互之间、以及对其它常见猪病原体均没有交叉反应，能够准确识别多重感染的情况。其组内和组间检测反应变异系数均低于10％，显示很好的检测重现性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，其并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
以下实施例所用的试剂如无特殊说明，均为常规试剂。
实施例1 五重液相基因芯片反应体系中扩增引物与杂交探针的设计与制备
首先分别筛选五种病毒的特异目标基因，根据检测目的，对每种病毒从GenBank下载多条病毒基因序列，进行比对分析，选取保守区，采用Array Designer 4.0software软件辅助设计扩增引物及适合液相基因芯片反应体系的杂交探针。
液相基因芯片检测是在普通PCR检测的基础上，进一步通过设计杂交探针，PCR扩增产物解链后与杂交探针进行杂交反应，检测杂交反应后荧光值判定检测结果，所以液相基因芯片检测的前提是要进行PCR扩增反应，扩增反应之间的引物及产物需尽量避免交叉反应，再进一步保证杂交探针与各个扩增产物、引物均不应有交叉反应。最终选定：
PRRSV特异的液相基因芯片引物与探针以该病毒基因组GP2基因为模板设计：PCV-2特异的液相基因芯片引物与探针以该病毒基因组核衣壳蛋白基因(capsid proteingene)为模板设计：PRV特异的液相基因芯片引物与探针以该病毒基因组gD基因为模板设计：CSFV特异的液相基因芯片引物与探针以该病毒基因组polyprotein基因为模板设计；PPV特异的液相基因芯片引物与探针以该病毒基因组NS1基因为模板设计。分别设计出PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV、PPV特异的多条引物序列和杂交探针序列，采用NCBI Blast在线分析软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对拟选用的探针和引物组合进行序列同源性和适配性分析评估，并通过检测试验最终选定五种病毒特异且适合液相基因芯片反应体系的引物与探针组合。
对于每种病毒设计的扩增引物首先要进行单病毒的扩增检测，确认单个病毒扩增检测没有非特异性扩增后，再进行多重病毒的扩增，设计引物就需要尽量避免发生交叉反应，还要考虑扩增条件要尽量一致，最终通过杂交反应排除交叉反应；根据上述设计、生物信息学分析和发明人的经验设计及大量实验检测试验筛选结果确定以下序列：
PRRSV特异的扩增引物对和杂交探针：如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.3所示的杂交探针序列；其中，为了提高对各种PRRSV变异株的检出率，在SEQ ID No.2下游引物序列、SEQ ID No.3探针序列中分别采用了次黄嘌呤碱基，具体为所述SEQ ID No.2的第10个碱基i为次黄嘌呤，所述SEQ ID No.3的第13位碱基i为次黄嘌呤；
PCV-2特异的扩增引物对和杂交探针：如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.7所示的特异探针序列；
PRV特异的扩增引物对和杂交探针：如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示的特异扩增上下游引物，以及如SEQ ID No.11所示的杂交探针序列；
CSFV特异的扩增引物对和杂交探针：如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.15所示的特异探针序列；
PPV特异的扩增引物对和杂交探针：如SEQ ID No.17、SEQ ID No.18所示的特异扩增引物对，以及如SEQ ID No.19所示的特异探针序列；
扩增引物和杂交探针均委托英潍捷基上海有限公司合成,其中PRRSV上游引物(序列如SEQ ID No.1)以及其他四种病毒的下游引物(序列如SEQ ID No.6、SEQ ID No.10、SEQID No.14、SEQ ID No.18)的5’端标记生物素，HPLC纯化，其余引物PAGE纯化；5条探针的5’端均标记氨基，HPLC纯化。
实施例2 五重液相基因芯片检测反应方法的建立与优化
1、五重一步法不对称RT-PCR扩增反应体系中引物浓度的优化
在扩增反应阶段，关键在于标记引物与非标记引物的比例，是液相芯片反应体系的关键因素，对检测敏感性影响大。这个步骤中发明人做了大量优化实验，先对五种病毒，分别逐一筛选标记引物和非标记引物的用量比，具体做法如下：将非标记引物和标记引物按1:1-1:20的不同比例加入反应体系中，其余反应条件保持相同，比较不同引物浓度比对应的最终检测MFI值，优选能使MFI值达到最高且本底值、阴性样品值低的引物比值。按每一种病毒筛选得到的最佳引物浓度比值将五对引物添加到五重扩增反应体系中，并与其他引物浓度比值组合进行比较，确定五重反应体系中五对引物的添加浓度。五重扩增反应体系中最优选的5种病毒特异的浓度和比值如下：PRRSV标记上游引物和常规下游引物浓度和比值为800nmol/L:100nmol/L，PCV-2常规上游引物和标记下游引物浓度和比值为40nmol/L:400nmol/L，PRV常规上游引物和标记下游引物浓度和比值为100nmol/L:800nmol/L，CSFV常规上游引物和标记下游引物浓度和比值为40nmol/L:400nmol/L，PPV常规上游引物和标记下游引物浓度和比值为40nmol/L:200nmol/L。
2、五重一步法扩增反应条件的优化
对扩增反应条件的温度和时间进行优化。反转录温度和时间的选择：对45℃-55℃温度范围和10-25分钟反转录时间范围进行筛选，采用棋盘法，在梯度PCR仪上设定温度变化从45℃每次递增1℃，在同一温度条件下比较时间从10分钟每次递增5分钟，其他反应条件保持不变，比较PRRSV、CSFV两种RNA病毒的最终检测MFI值，选取MFI值最高且本底值和阴性样品值低的反转录反应条件为最优条件。优选为50℃15分钟。
PCR扩增阶段退火温度和时间的选择：根据病毒特异扩增引物的Tm值，对53℃-60℃温度范围和10-30秒的退火时间范围进行筛选，采用棋盘法，在梯度PCR仪上设定温度变化从53℃每次递增1℃，在同一温度条件下比较时间从10秒每次递增5秒，其他反应条件保持不变，比较五种病毒的最终检测MFI值，选取MFI值最高且本底值和阴性样品值低的扩增反应条件为最优条件。优选PCR扩增反应中退火温度和时间为55℃15秒。
3、微球悬浮杂交反应条件的优化
杂交反应温度和时间的优化：根据探针的Tm值，对55℃-60℃的杂交温度范围和5-25分钟的杂交时间范围进行筛选，采用棋盘法，设定温度变化从55℃每次递增1℃，在同一温度条件下比较时间从5分钟每次递增5分钟，其他反应条件保持不变，比较最终检测MFI值，优先选取阳性样品MFI值最高且本底值和阴性样品值低的杂交反应条件。优选最佳杂交反应温度和时间为57℃10分钟。
SAPE工作浓度的优化：将SAPE用1×TMAC稀释成:1:100、1:150、1:200、1:300、1:400、1:500不同浓度；分别采用上述不同SAPE浓度进行检测，其他条件一致，比较不同SAPE工作浓度下得到的检测MFI值，选取阳性样品MFI值最高且本底值和阴性样品值低的工作浓度。SAPE最佳工作浓度优选为1:150(6.7μg/mL)。
4、五重液相基因芯片整体反应体系及优选的反应条件
包括五重不对称一步法RT-PCR、微球悬浮杂交反应在内的整体反应体系中优选的反应条件如下：
一种同步检测及鉴别PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV五种猪病毒的液相基因芯片检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)采集猪临床样品，提取病毒核酸。
本发明方法可用于检测猪血样、精液和组织等临床样品中的病毒。样品经过研磨、离心等前处理后，可采用TRIzol提取法或商品化硅基质柱试剂盒提取法提取纯化病毒核酸。
(2)采用五重一步法不对称RT-PCR扩增纯化的待测样品核酸。
对纯化的待测样品核酸，采用五重一步法不对称RT-PCR进行扩增反应，可同时扩增五种病毒核酸。
所述PCR扩增的扩增体系，包括PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV五种病毒上下游引物、Mg2+、dNTP、PCR缓冲液、反转录酶和Taq聚合酶混合酶(RT/Taq mix)、待检样品模板和水；
所述PRRSV上游引物的终浓度为800nmol/L，下游引物的终浓度为100nmol/L；PCV-2上游引物的终浓度为40nmol/L，下游引物终浓度为400nmol/L；PRV上游引物终浓度为100nmol/L，下游引物终浓度为800nmol/L；CSFV上游引物终浓度为40nmol/L，下游引物终浓度为400nmol/L；PPV上游引物终浓度为40nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L。
扩增反应条件如下：50℃15分钟进行反转录；94℃预变性2分钟；接着进行PCR循环反应：94℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸10秒，共进行40个循环；最后72℃延伸1分钟；
(3)采用液相基因芯片方法对扩增产物进行检测
a.将所述5种猪病毒的杂交探针偶联到聚苯乙烯乳胶微球，所述聚苯乙烯乳胶微球带有COOH；
b.将步骤(1)获得的扩增产物与上述步骤a中偶联聚苯乙烯乳胶微球的杂交探针进行杂交反应；
c.杂交反应后，进行洗涤，之后加入链亲和素藻红蛋白(SAPE)进行温育，
d.取温育的混合液，检测荧光值；
其中，所述步骤b中杂交反应的条件为95℃，5min，57℃，300rpm，恒温杂交10min；所示步骤c加入所述SAPE的浓度6.7μg/mL，室温57℃温育10min。
(4)检测结果的判定
1)本底值的测定：每次检测同时设3个空白对照样品，对空白对照样品同步进行多重核酸扩增和多重微球悬浮杂交，在空白样品反应体系中，以扩增反应用水取代核酸模板，其余试剂成分与反应条件与检测样品一致；计算3个空白对照样品的MFI值平均值，作为本底值；
2)结果判定：将被检样品的MFI值减去本底值，作为样品的MFI净值；当被检样品的MFI净值大于或等于2倍本底值时，判为阳性，否则判为阴性。
实施例3 五重液相基因芯片检测方法特异性、敏感性、重复性检测试验及评价
1特异性检测试验
本发明发明人为了验证本发明的检测核酸及检测方法，能够对检测的五种病毒是否是特异，只能检测鉴定这五种猪病毒，而不会与其它病毒发生交叉反应，产生假阳性或者说非特异性扩增，进行了特异性试验，具体如下:
采用本发明方法(具体可采用实施例2优选的反应条件)对上述五种目标病毒的各种毒株和疫苗株样品以及其他各种常见猪病原体样品、猪组织全基因组核酸、常用的传代细胞全基因组核酸样品进行检测试验，结果显示，仅PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV、PPV五种病毒或其疫苗株样品呈现阳性反应，每种病毒或疫苗样品所测得对应探针的荧光值(MFI)值均显著高于空白对照值，与理论推导相符。五种病毒相互间无交叉反应，其他各种病原体、传代细胞或猪基因组核酸样品均呈典型阴性反应，其测得的MFI值与空白对照本底值无显著差异。说明本发明方法检测上述五种猪病毒特异可靠，与各种常见猪病原体和猪组织等无非特异性交叉反应。详见表1，其中，所用的样品由广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心提供。
表1 五重液相芯片特异性检测试验
2敏感性检测试验
2.1重组质粒模板的制备。
采用上述特异扩增引物以对应的病毒核酸为模板，分别进行PCR或RT-PCR扩增，回收并纯化扩增产物，按常规基因克隆操作把扩增产物分别克隆到pMD-19T质粒载体(购自大连宝生物有限公司)，并转化感受态大肠杆菌，采用常规PCR和测序对重组质粒进行验证。将含重组质粒的大肠杆菌进行增菌培养后，采用质粒提取试剂盒(购自大连宝生物工程有限公司)纯化重组质粒DNA。对纯化的重组质粒DNA分别测其OD260吸光度值，换算浓度值，根据公式：质粒拷贝数/μL＝{总含量(μg/μL)}/{质粒分子量}×6.02×1017换算成对应基因拷贝数。
2.2检测灵敏度的测定
检测样品的灵敏度，就是说病毒的检出限，能判断检测方法能检测出样品中病毒量的多少，检测灵敏度是评价一个检测方法关键数值，能检测到病毒的量越小，说明检测灵敏度就越高，能有效避免假阴性结果，进一步说，能避免因漏检错检而造成损失。
将每种重组质粒DNA模板采用无RNase，无DNase水进行10倍系列稀释，取各稀释度样品2μL，采用本发明方法进行检测，每个稀释度均做3个平行重复试验，根据检测终点稀释度推算检测终点对应的基因拷贝数和DNA模板用量。
检测结果显示，本发明方法对PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV重组核酸模板的检测低限可达2.2×101,2.2,3.3,1.6×101和3.4拷贝/μL(相当于6.8,7.4×10-1,1.1,5.3×10-1和1.1fg/μL)。检测低限达到fg级，说明本发明方法检测敏感性高。
3重复性检测试验
为了验证本发明基因芯片检测方法对检测结果的重现性，即检测方法的稳定性、可靠性，本发明人进行了以下试验。
采用本发明方法对PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV病毒基因组核酸进行组内和组间重复性检测试验。
组间(intra-assay)重复性检测试验：对上述病毒基因组核酸分别进行6组平行的五重液相基因芯片检测(包括五重扩增和五重微球杂交检测)试验，并计算每种病毒目标基因MFI检测值的差异(即组间变异系数，inter-assay CV％)。
组内重复性检测试验：对上述病毒基因组核酸的同一管扩增产物进行6次平行的五重微球杂交和检测试验，记录每种病毒目标基因对应的MFI检测值，并计算6次平行试验所得检测值的差异(组内变异系数，intra-assay CV％)。
检测结果显示，本发明方法对五种病毒的组内检测变异系数达2.5％～5.4％，组间检测变异系数达4.1％～7.6％。其组内和组间检测反应变异系数均低于10％，显示很好的检测重现性。
实施例4 应用五重液相基因芯片检测方法检测猪临床样品
采用本发明方法，对来自发生疑似疫情猪场的42份猪组织样品和34份猪精液样品进行检测。按以下操作步骤进行：
1采集猪临床样品，提取病毒核酸。
本发明方法可用于检测猪血样、精液和组织等临床样品中的病毒。样品经过研磨、离心等前处理后，可采用TRIzol提取法或商品化硅基质柱试剂盒提取法提取纯化病毒核酸。
1.1样品前处理
1.1.1猪组织样品前处理：猪内脏、肌肉等组织样品取适量，剪碎并研磨后，按1：5(W/V)比例加入灭菌PBS缓冲液,移入离心管，振荡混匀后，冻融3次，5000g离心1min，取上清进行后续核酸提取纯化；
1.1.2猪精液样品前处理：取适量猪精液样品分装入离心管，振荡混匀后，冻融3次，5000g离心1min，取上清液进行后续核酸提取纯化；
1.1.3猪血样等液体样品(猪精液除外)可不需前处理，直接用于核酸提取；也可取适量样品进行5000g离心1min后，取上清液进行后续核酸提取纯化。
2硅基质柱提取法(采用商品化病毒核酸提取试剂盒)
本发明方法采用的硅基质柱病毒核酸提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司(Cat.#DP315)。其他品牌等效商品化试剂盒也适用。
2.1吸取Proteinase K溶液加入微量离心管，每管加入20uL；
2.2每管加入200uL上述经前处理的样品上清液，并做好标记；
2.3每管加入200uL carrierRNA工作液，盖上管盖，涡旋震荡15s充分混匀；
2.4置水浴锅，56℃水浴15min；
2.5简短离心以收集管壁上液体，小心打开管盖，向其中加入250uL预冷无水乙醇(此时可能出现絮状沉淀)，盖上管盖涡旋振荡30s，室温放置5min；
2.6简短离心以收集管壁及管盖上的液体；
2.7将硅柱放入收集管中，仔细将离心管中的液体和絮状沉淀全部转移至吸附柱上，盖上管盖做好标记；
2.86000g室温离心1min，弃掉废液；
2.9向硅柱中加入500uL洗涤工作液，盖上管盖静置2min,6000g室温离心1min，弃废液；
2.10重复步骤2.9一次；
2.11小心打开盖子，加入500uL无水乙醇，盖上管盖，6000g室温离心1min；
2.12弃废液，13000g室温离心3min；
2.13取出硅柱并放入1.5mlRNase-free离心管，向柱膜中央加入50uL RNase-freeddH2O，盖上盖子室温放置5min；
2.1413000g离心1min，在确定离心管底部有约50uL液体后，弃掉硅柱，得到的纯化核酸液体可直接用于后续检测，或贮存于低温备用(-20℃以下)。
3五重一步法不对称RT-PCR。
对纯化的待测样品核酸，采用五重一步法不对称RT-PCR进行扩增反应，可同时扩增五种病毒核酸。
采用优化的扩增反应体系如下：
采用上文所述优化的扩增反应条件：
50℃15分钟进行反转录；94℃预变性2分钟；接着进行PCR循环反应：94℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸10秒，共进行40个循环；最后72℃延伸1分钟；
4采用多重液相基因芯片方法对扩增产物进行检测
4.1寡核苷酸探针偶联到聚苯乙烯乳胶微球。
将5条病毒特异的寡核苷酸探针分别偶联到不同编码微球上，包括：
PRRSV特异的寡核苷酸探针，序列如SEQ ID No.3所示，5’端标记氨基；PCV-2特异的寡核苷酸探针，序列如SEQ ID No.7所示，5’端标记氨基；PRV特异的寡核苷酸探针，序列如SEQ ID No.11所示，5’端标记氨基；CSFV特异的寡核苷酸探针，序列如SEQ ID No.15所示，5’端标记氨基；PPV特异的寡核苷酸探针，序列如SEQ ID No.19所示，5’端标记氨基；
探针偶联到微球的具体操作步骤如下：
4.1.1在1.5ml离心管中加入600μL 0.1mmol/L MES(2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)(pH4.5)溶液；
4.1.2取出原管带有COOH的微球，涡旋振荡器全速震荡几秒，用吸嘴充分混匀，取20μL/管，分装到相应MES溶液中；
4.1.3置微量离心机，12，000×g离心10min，同时配EDC(1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride)溶液(10mg/ml)；
4.1.4弃上清，留约50μL液体，加入3μL氨基标记探针(10μM)及10μL EDC溶液(10mg/ml)，铝箔包好后用涡旋振荡器充分混匀，摇床25℃100rpm慢速摇动30min。
4.1.5重新配一管EDC，重复步骤4；
4.1.6加入900μL 0.02％Tween-20，用吸嘴充分混匀，全速震荡1min；
4.1.715，000×g离心10min，吸弃上清，留约50μL液体；
4.1.8加入900μL 0.1％SDS，用吸嘴充分混匀，全速震荡1min；
4.1.915，000×g离心10min，吸弃上清，留约50μL液体；
4.1.10加900μL 1×TE(pH8.0)，全速震荡1min，15，000×g离心10min，吸弃上清，留约50μL液体；
4.1.11加入1×TE(pH8.0)至100μL，全速震荡1～3min，用吸嘴充分混匀；
4.1.12取8μL微球，用ddH2O稀释10倍(80μL)，用芯片仪进行微球计数；
4.1.13其余微球用铝箔包好，置4℃贮存。
5对多重核酸扩增产物进行多重微球悬浮杂交检测。
采用优化的反应条件如下；
5.1用1.5×TMAC(Tetramethylammonium chloride)缓冲液将微球稀释成微球工作液，分装微球工作液33μL/管至PCR管中，微球数达每管含每种探针偶联微球1000个，包含上述5种偶联了不同探针的微球；
5.2每管中加入5μL-10μL PCR产物，加1×TE(pH8.0)至总体积为50μL。涡旋振荡全速震荡30s，把PCR管放入PCR仪，95℃，5min；
5.3将PCR管放入恒温混匀仪，恒温57℃，振速300rpm，杂交10分钟；10，000rpm离心5分钟，收集微球沉淀；
5.4用1×TMAC洗涤微球3次，每次5000rpm离心3分钟；
5.5同时用1×TMAC将SAPE(Streptavidin-phycoerythrin)稀释至6.7μg/mL(即1:150稀释)，作为TMAC-SAPE报告液；
5.6在每管微球沉淀中，加入80μL TMAC-SAPE报告液，充分混匀；
5.7置恒温混匀仪，57℃温育10分钟；
6上机检测
取80μL完成杂交反应的微球悬浮液，即温育后的混合液，按设定的条件，用LuminexTM 200system液相芯片仪或其他等效设备，测量荧光值(MFI值)。
7检测结果的判定
(1)本底值的测定：同步平行进行3个空白对照样品的多重核酸扩增和多重微球悬浮杂交，在空白样品反应体系中，以扩增反应用水取代核酸模板，其余试剂成分与反应条件与检测样品一致；计算3个空白对照样品的MFI值平均值，作为本底值；
(2)结果判定：将被检样品的MFI值减去本底值，作为样品的MFI净值；当被检样品的MFI净值大于或等于2倍本底值时，判为阳性，否则判为阴性。
8对上述自然采集的猪临床样品的检测结果
采用本发明方法按以上操作步骤，从上述76份临床样品中检出PRRSV阳性34份(组织22份、精液12份)，PCV-2阳性7份(组织5份、精液2份)，PRV阳性17份(组织12份、精液5份)、CSFV阳性7份(组织2份、精液5份)和PPV阳性12份(精液8份、组织4份)，其中，有23份样品(组织11份、精液12份)被检出混合感染2～3种病毒。
9对人工制备带毒猪精液样品的检测结果
为了验证本发明方法检测样品的实际检测能力，进行人工模拟样品的检测，具体如下：
人工带毒猪精液样品的制备：将五种猪病毒液等体积混合后，用PBS缓冲液进行10倍系列稀释，把不同稀释度混合病毒液按1:20比例(V:V)添加到自然猪精液中，制备成不同带毒量猪精液样品，采用本发明方法检测。
结果显示，采用本发明方法可检出猪精液中添加的10-1000倍稀释的含5种病毒的混合病毒液样品；分别测定混合前各病毒液对应的核酸浓度，推算每个反应中各稀释度和添加浓度对应的各病毒核酸浓度，换算得出本发明方法对添加混合病毒液的人工带毒猪精液中PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV、PPV病毒的检测低限分别达89.6pg、13.9pg、1.1pg、14.0pg和91.7pg病毒核酸。

Claims (5)

1.一组用于同步检测鉴别五种猪病毒的液相基因芯片的核酸，其特征在于，包括猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪细小病毒(PPV)五种猪病毒的上、下游引物和杂交探针，其中，
所述PRRSV的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，该上游引物序列5’端标记生物素，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，杂交探针序列如SEQ ID No.3所示；
所述PCV-2的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示，该下游引物5’端标记生物素，杂交探针序列如SEQ ID No.7所示；
所述PRV的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示，该下游引物5’端标记生物素，杂交探针序列如SEQ ID No.11所示；
所述CSFV的上游引物序列如SEQ ID No.13所示，下游引物序列如SEQ ID No.14所示，该下游引物5’端标记生物素，杂交探针序列如SEQ ID No.15所示；
所述PPV的上游引物序列如SEQ ID No.17所示，下游引物序列如SEQ ID No.18所示，该下游引物5’端标记生物素，杂交探针序列如SEQ ID No.19所示；
其中，所述SEQ ID No.2的第10个碱基i为次黄嘌呤，所述SEQ ID No.3的第13位碱基i为次黄嘌呤；
所述五种猪病毒的杂交探针的5’端均标记氨基。
2.如权利要求1所述的核酸，其特征在于，该组核酸还包括检测PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV的阳性扩增产物序列，其中，
所述检测PRRSV的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.4所示的序列；
所述检测PCV-2的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.8所示的序列；
所述检测PRV的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.12所示的序列；
所述检测CSFV的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.16所示的序列；
所述检测PPV的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.20所示的序列。
3.用于同步检测鉴别五种猪病毒的液相基因芯片的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或/和权利要求2所述的核酸。
4.一种非诊断目的的同步检测鉴别PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV五种猪病毒的液相基因芯片检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)、提取待检样品的核酸；
(2)、利用如权利要求1中所述检测鉴别PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV五种猪病毒的液相基因芯片的上、下游引物对上述步骤(1)提取的待检样品的核酸进行不对称RT-PCR扩增，获得扩增产物；
(3)、利用如权利要求1中所述PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV的杂交探针，与步骤(2)获得的扩增产物进行杂交反应；
(4)、用液相芯片仪检测步骤(3)杂交反应后的荧光值，根据检测的本底值，判定检测结果；
其中，
所述本底值的设定：同步平行设定3个空白对照进行上述步骤(2)、步骤(3)的反应，其中在所述空白对照，用水取代待测样品模板，其余试剂成分与反应条件不变；计算3个空白对照的测得荧光值的平均值，作为本底值；
结果判定：将被检样品的MFI值减去本底值，作为样品的MFI净值；当被检样品的MFI净值大于或等于2倍本底值时，判为阳性，否则判为阴性。
5.如权利要求4所述的液相基因芯片检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增的扩增体系，包括PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV五种病毒上下游引物、Mg2+、dNTP、PCR缓冲液、反转录酶和Taq聚合酶混合酶(RT/Taq mix)、待检样品模板和水；
所述PRRSV上游引物的终浓度为800nmol/L，下游引物的终浓度为100nmol/L；PCV-2上游引物的终浓度为40nmol/L，下游引物终浓度为400nmol/L；PRV上游引物终浓度为100nmol/L，下游引物终浓度为800nmol/L；CSFV上游引物终浓度为40nmol/L，下游引物终浓度为400nmol/L；PPV上游引物终浓度为40nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L；
所述PCR扩增的扩增反应条件为：反应温度为50℃，反应15分钟进行反转录；94℃预变性2分钟；接着进行PCR循环反应：94℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸10秒，共进行40个循环；最后72℃延伸1分钟；
所述步骤(3)包括：
a.将所述5种猪病毒的杂交探针分别偶联到不同编码的聚苯乙烯乳胶微球，所述聚苯乙烯乳胶微球带有COOH；
b.将步骤(1)获得的扩增产物与上述步骤a中5种偶联聚苯乙烯乳胶微球的杂交探针进行杂交反应；
c.杂交反应后，进行洗涤，之后加入链亲和素藻红蛋白(SAPE)进行温育，
d.取温育的混合液，检测荧光值；
其中，所述步骤b中杂交反应的条件为95℃，5min，57℃，300rpm，恒温杂交10min；所示步骤c加入所述SAPE的浓度6.7μg/mL，室温57℃温育10min。
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