CN102605099B

CN102605099B - 一种猪病毒基因芯片及其检测方法

Info

Publication number: CN102605099B
Application number: CN201110459083.7A
Authority: CN
Inventors: 穆祥; 董虹; 张涛; 姜代勋; 胡格; 段慧琴; 张岩; 王建舫; 李佳
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Priority date: 2011-12-31
Filing date: 2011-12-31
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2031-12-31
Also published as: CN102605099A

Abstract

本发明提供一种猪病毒基因芯片及其检测方法。所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针为选自以下病毒的特征片段：古典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）。本发明检测的病毒种类多样，基本涵盖了常见猪病毒；采用随机引物PCR、多重PCR并进行标记，避免了凝胶电泳对PCR结果进行检测容易导致的假阳性，实现在短时间内高通量的准确检测；本发明的基质载体为经过醛基化处理的玻璃片，因此有利于探针和靶标的结合，且不会给检测带来较大的噪音。

Description

一种猪病毒基因芯片及其检测方法

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种猪病毒基因芯片及其检测方法。所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针为选自以下病毒的特征片段：古典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）。

背景技术

动物检疫问题一直是国际社会和各国政府关注的热点问题，特别是在我国加入WTO以后，受技术性贸易措施的影响，国外对我国牲畜产品的卫生质量要求越来越高，要求检测项目越来越多，如致病性细菌、病毒等。同时，为了确保食品卫生质量，保护我国消费者健康安全，必须加强对牲畜产品的安全检测。目前用于猪患传染性病毒的检测的传统方法大致有：病毒分离法、电镜观察、聚合酶链式反应、间接免疫荧光试验、免疫组织化学技术、酶联免疫吸附试验等，上述方法存在较多的缺陷：聚合酶链式反应（PCR）方法的优点是灵敏度高，但是通过凝胶电泳对PCR结果进行检测有可能因为非特异扩增导致假阳性判断，或者有可能引物扩增条带信号很微弱在凝胶电泳上不可见，造成假阴性判断，而对PCR产物进行测序则比较繁琐并且费时。临床上表明猪患传染病常为多种病毒混合感染，而上述的方法检测通量都不高，操作起来费时费力，不利于同时大批量复合致病源的检测。生物芯片技术是近年来在生命科学领域中迅速发展并成熟的一项高新技术，主要是通过微加工技术和微电子技术在固相芯片表面构建的微型生物化学分析系统，可实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他多种生物成份的准确、快速、大量信息的检测。生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化。

我国专利“猪常见传染病诊断性基因芯片及其用途”（专利申请号200410078907.6）中，公开了一种猪常见传染病诊断性基因芯片，所述的基因芯片包括固定在固定载体上的与待测治病病原种类相对应的待测治病病原特征性DNA/cDNA片段，其中采用的特征性片段选自猪瘟病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、猪繁殖和呼吸综合症病毒原基因特征性片段；所述的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜；待测样品的标记采用生物素。该基因芯片每次检测的病毒种类较少，且灵敏度有限，不适用于大规模、高通量的猪病毒检测。所以，病毒检测领域需要提出一种能够同时检测多种猪病毒、灵敏度高的常见猪病毒检测芯片及其检测方法。

发明内容

本发明提供一种猪病毒基因芯片及其检测方法。所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针为选自以下病毒的特征片段：古典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）。本发明能够同时检测多种常见猪病毒、灵敏度高。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种猪病毒基因芯片，其特征在于：所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针选自以下病毒的特征片段：古典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）。所述的基质载体为经过醛基化处理的玻片。

本发明是通过以下另一技术方案实现的：一种猪病毒基因芯片检测猪病毒的方法，所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针选自以下病毒的特征片段：古典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）；该方法包括的步骤为：A、将已经感染上述病毒死亡的猪尸体内的粪便样品进行核酸提取处理，得到待测样品；B、将所述的待测样品进行PCR反应处理，得到扩增产物；再将所述的扩增产物进行纯化处理，得到纯化的扩增产物；C、将所述的纯化的扩增产物进行杂交处理，得到杂交产物；D、将所述的杂交产物进行扫描分析处理，得到检测结果。

本发明相比现有技术的有益效果为：1、本发明能够同时检测古典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV），因此检测的病毒种类多样，基本涵盖了常见猪病毒。2、本发明采用随机引物PCR、多重PCR并进行标记，都是在对病毒核酸进行有效扩增的基础上进行了芯片杂交，相当于进行了测序；因此避免了凝胶电泳对PCR结果进行检测容易导致的假阳性，实现在短时间内高通量的准确检测。3、本发明的基质载体为经过醛基化处理的玻璃片，因此有利于探针和靶标的结合；且不会给检测带来较大的噪音。

附图说明

图1：实施例2中玻片醛基修饰原理示意图。图2：实施例2中醛基修饰的玻片表面固定DNA的主要反应原理示意图。图3：实施例2中醛基修饰的玻片表面固定DNA的副反应原理示意图。图4：实施例2中基因芯片上探针的布局设计示意图。]图5：实施例3中基因芯片每个点阵中的探针排列示意图。图6：实施例3中HCLV杂交结果图。图7：实施例3中CSFV杂交结果图。图8：实施例3中BVDV杂交结果图。图9：实施例3中PCV I杂交结果图。图10：实施例3中PRV杂交结果图。图11：实施例3中PRRSV-1杂交结果。图12：实施例3中PRRSV-2杂交结果图。图13：实施例3中HCLV调整探针后杂交结果图。图14：实施例3中优化的基因芯片每个点阵中的探针排列示意图。图15：实施例4中基因芯片每个点阵中的探针排列示意图。图16：实施例4中PRRSV的理论杂交图和实际杂交图的对比示意图。图17：实施例4中CSFV的理论杂交图和实际杂交图的对比示意图。图18：实施例4中PCVⅠ的理论杂交图和实际杂交图的对比示意图。图19：实施例4中的PCVⅡ理论杂交图和实际杂交图的对比示意图。图20：实施例4中的PRV理论杂交图和实际杂交图的对比示意图。图21：实施例4中的PPV理论杂交图和实际杂交图的对比示意图。

具体实施方式

实施例1：

一种猪病毒基因芯片，所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针为选自以下病毒的特征片段：古典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）。所述的基质载体为经过醛基化处理的玻璃片。本实施例中的探针名称详见表4、表6、表9，各个探针的核苷酸序列详见表10。

一种猪病毒基因芯片检测猪病毒的方法，所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针选自以下病毒的特征片段：古典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）；该方法包括的步骤为：A、将已经感染上述病毒死亡的猪尸体内的粪便样品进行核酸提取处理，得到待测样品；B、将所述的待测样品进行PCR反应处理，得到扩增产物；再将所述的扩增产物进行纯化处理，得到纯化的扩增产物；C、将所述的纯化的扩增产物进行杂交处理，得到杂交产物；D、将所述的杂交产物进行扫描分析处理，得到检测结果。

本实施例中，选取的病毒基本涵盖了常见猪病毒。1、古典猪瘟( classical swine fever，CSF) 是由古典猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）引起的一种猪的高度传染性疾病。此病以出血和发热为主要特征，呈急性或慢性经过，除可引起败血症以外，还可引起一系列其它临床表现，如妊娠母猪流产、胎儿畸变、慢性营养性消耗及淋巴细胞和血小板减少等。CSFV为RNA病毒，含有单股正链RNA (+ssRNA)的基因组，长约12.3kb。含有一个开放阅读框（ORF）。它编码一个大的多聚蛋白，此多聚蛋白经病毒和宿主酶的作用，形成4个成熟的结构蛋白和至少7个非结构蛋白。CSFV病毒粒子的直径为 34-50nm，有二十面体对称的核衣壳，内部核心直径约30nm。病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜。在蔗糖密度梯度的浮密度为1.15-1.16g/cm3，等电点是4.8。猪瘟病毒不耐热，56℃ 60 分钟可被灭活。60℃ 10 分钟使其完全丧失致病力。猪瘟病毒在pH 5-10 稳定，但对乙醚、氯仿和去氧胆酸盐敏感，迅速丧失感染性。畜牧猪和野猪是古典猪瘟病毒的天然宿主，而且只有它们才是宿主。感染家猪及野猪的血液、分泌物、排泄物和组织均是猪瘟病毒不同的带毒源。已经证实在实验室条件下空气能够传播猪瘟病毒,但这很不容易实现。目前，猪瘟仍然是严重危害全球养猪业的重要传染病，该病流行于除北美和大洋洲外的世界上各大洲和地区。被国际兽疫局(Office of International des E’pizooties ,OIE) 列为16 种A 类动物传染病之一。也是我国主要的畜禽疫病之一，据统计，我近几年因各种疾病死亡的生猪占饲养总数的8%-10%，其中1/3 以上由猪瘟致死，每年直接经济损失有数十亿元，造成了巨大的人力和物力资源浪费。

2、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Respiratory and Reproduction Syndrome Virus，PRRSV)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Respiratory and Reproduction Syndrome Virus，PRRSV)引起的一种高度传染性疾病，又称“猪蓝耳病”。该病以怀孕母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍以及仔猪和育肥猪的呼吸道症状为特征。PRRSV为RNA病毒，其基因组为不分节的单股正链RNA，全长约15kb具有5’帽状结构和3’poly(A)尾。含9个开放阅读框，多数相邻的ORF之间存在部分重叠区。ORF1占全长的80％，编码病毒的RNA聚合酶等非结构蛋白，其余编码结构蛋白。PRRSV的病毒粒子呈球形或卵圆形，直径约为45～65 nm，呈20面体对称，囊膜表面有较小纤突，在蔗糖中的浮密度为1.14 g／mL，在氯化铯梯度中浮密度为1.19g／cms。PRRSV对外界环境的抵抗力相对较弱，对脂溶剂、热、低于5或高于7的pH值敏感。PRRSV分两种基因型，分别为欧洲型和美洲型，前者主要流行于欧洲，后者主要流行于美洲和亚太地区，但近来在欧洲也分离到美洲型毒株，在北美分离到类欧洲型的美洲型毒株。我国目前的流行毒株仍属于美洲型。不同的PRRSV毒株对猪的致病力差异很大，而且PRRSV还可引起免疫抑制和持续性感染。1987年该病首发于美国，随后2～3年内迅速在北美和欧洲广泛流行，以后蔓延至亚太地区，造成世界范围的大流行，给世界养猪业造成巨大的经济损失，成为危害当今养猪业的主要疫病之一。我国于1996年首次从PRRS血清阳性猪群中分离出PRRSV，证实我国也有该病流行。由于没有有效的防治手段，PRRS在国内愈演愈烈，直接和间接造成了2006年流行我国大部分省份的所谓“猪无名高热”，又称“猪高热综合症”。据粗略估计在2006年该病导致1000万-3000万头生猪死亡。

3、伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）

伪狂犬病（Pseudorabies）又称奥捷士奇病（Aujeszky’s disease, AD），是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是该病毒的自然宿主和贮存者。伪狂犬病可引起多种动物的发热、奇痒及脑脊髓炎等急性致死性感染症状并可引起潜伏性感染，已成为严重危害畜牧业的疾病之一。PRV为DNA病毒。基因组为线状双链DNA，大小约为150kb，由独特长区段（UL，101.1kb）、独特短区段（US，8.7kb）以及US 两侧的重复序列构成。PRV基因组含有70多个基因，可编码70-100种蛋白质。PRV呈圆形或椭圆形外观，直径约180nm 左右，分子量约9.5×106Da，对脂溶剂如乙醚、丙酮、氯仿、酒精等高度敏感，对消毒剂无抵抗力，最适pH 为6-8。猪是PRV 的贮存宿主，其它家畜如牛、羊、猫、犬，许多野生动物、肉食动物、野生啮齿类动物都易感，实验动物如兔、小鼠人工接种PRV 后也能发病。目前许多证据表明，空气传播是其主要传播途径。自1902 年发现以来，伪狂犬病已在全球范围内流行，欧、美、亚、非各洲均已报道有该病的发生，我国于1949 年首次报道。该病给全球养猪业造成了巨大的经济损失，成为严重危害养猪业的重大传染病之一。

4、猪圆环病毒(Porcine circovirus , PCV)猪圆环病毒(Porcine circovirus , PCV)，PCV 分2 种血清型，即PCV-1 和PCV-2。PCV-1在猪的原代和传代细胞中形成持续感染状态，不表现致细胞病变(CPE)作用，对猪没有致病性，所以通常认为可被动物免疫机制抵抗。PCV-2可引起部分断奶仔猪和育肥猪生长缓慢、消瘦、贫血及黄疸。剖检后可见淋巴结肿大，肝硬变、多灶性黏液性气管炎，间质性肺炎和肾炎，称为断奶仔猪多系统综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)。PCV为DNA病毒，基因组为单股环状双向DNA，病毒DNA及其在宿主细胞内复制的中间产物(cDNA)均指导病毒蛋白合成，编码7个潜在的开放阅读框。PCV-1和PCV-2基因组大小分别为1759bp1768 bp。PCV相同基因型不同毒株间序列同源性大于90%，不同基因型毒株间同源性为68%～79%。系统发生分析结果表明，PCV-1和PCV-2属于不同基因群，但其基因组仍存在较高的同源性，与病毒复制相关的DNA复制起始区(Ori)和复制酶编码基因(rep)序列同源性分别为79.5%和82%，衣壳蛋白编码基因(cap)存在较大差异，同源性仅为62%。病毒粒子直径约17～20 nm，二十面体对称，是迄今已知的最小的动物病毒之一。自1991年加拿大首次报道PMWS以来，已有许多国家相继报道此病，。目前，美国、日本、法国、中国等都有该病的报道。PMWS的流行给养猪业造成巨大的经济损失，为此各国进行了广泛深入的研究，证实PMWS 的发生与PCV-2 感染密切相关。最近又有报道称PCV-2感染可导致猪发生A2 型先天性震颤(congenital tremors type A2)及猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)。

5、猪细小病毒(Porcine parvo virus，PPV）

猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,可引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等，还可引起仔猪的皮炎和腹泻。成熟的PPV 病毒粒子基因组是一条长约5000bp的单股负链DNA , 主要有2 个开放的阅读框，编码区内基因相互重叠。PPV基因组在其3’端和5’端分别有两段折叠配对序列，长度约102bp和127bp，这种二级结构与其它脊椎动物细小病毒DNA十分相似。PPV病毒粒子呈圆形或六边形、无囊膜，直径为20nm，PPV病毒耐热性强，在56℃30min加热处理后其感染性和凝集红细胞的能力不丧失，在70℃2h仍不丧失起感染性和血凝活性，到85℃5min才失活。该病毒对各种消毒剂有很强的抵抗力。对乙醚、氯仿等脂溶剂不敏感，甲醛蒸汽和紫外线也需要很长时间才能杀死病毒。用0.5%漂白粉或氢氧化钠5min可杀死PPV，而2%戊二醛则需20分钟，3%甲醛需2小时。 PPV于1967年在英国首次报道，目前已广泛流行于世界各地。我国于1980年代初开始研究PPV，相关统计资料显示 PPV在我国污染非常严重，部分地区阳性率达90％以上。

实施例2：

本实施例为实施例1中基因芯片的制备方法。该方法的步骤如下：

A、选择合适的玻片。所述的玻片的应符合以下条件：选择光学载玻璃片作为醛基基片制备的原材料，尺寸为长75.5 mm ，宽25.2 mm，厚1.0 mm；根据大批量的玻璃片测定结果和点样仪对点样基片的要求，要求长宽尺寸误差小于等于正负0.2 mm，厚度误差小于等于正负0.05 mm；同时要求外观无划痕、无缺损。

本实施例中选用玻片是因为：基因芯片分析对基片表面的要求很高，而表面的制备是一个严格的过程。表面处理的优劣决定了目标分子在其上的固定程度、随后的生化反应效率、检测精确度以及最终数据结论的准确性。一个理想的芯片表面应该是尺寸精确，平滑，平整，均一，耐受性强，荧光惰性，反应效率高和可结合的。

用于固定DNA探针的基质载体包括尼龙膜、纤维素膜、玻璃片（玻片）、金属片、硅片、陶瓷片、各种有机高分子制作的薄膜等，其中以玻璃片的应用最为广泛。玻璃片的优点在于：来源方便；其表面经过化学处理后，能够共价结合DNA；玻璃片能耐受高温、高离子溶液环境；玻璃片表面光滑，对液体来说是非浸透性的，故杂交体系的体积可以很小，有利于探针和靶标的结合；玻璃片的背景荧光低，不会给检测带来较大的噪音。

本实施例中选用醛基化处理玻片是因为：

玻璃片表面要经过化学修饰后，才能牢固地固定DNA。现有的玻璃片表面化学修饰主要有氨基修饰、醛基修饰和巯基修饰。最常用的就是氨基修饰和醛基修饰，二者的比较见表1。

表1 氨基化表面和醛基化表面的比较：

对比项	氨基化表面	醛基化表面
			表面电荷	正电荷	中性
自发荧光	非常低	非常低
			表面亲疏水性	稍微亲水	疏水
点样样品扩散程度	较低	很低
			固定机理	吸附	共价键合
间隔臂	不需要	伯胺基
			固定化学	静电吸引（正-负）	脱水反应（希夫碱生成）反应）
固定形式	非特异	特异（末端固定）
			固定过程（核苷酸）	烘箱或紫外灯交联	室温脱水
失活方式（核苷酸）	沸水中进行	沸水中进行
			检测灵敏度（cDNA活蛋白）	很高	很高
检测灵敏度（寡聚核苷酸或多肽）	较高	很高
			检测背景荧光	非常低	低
使用方便程度	很方便	方便

在与PCR产物、cDNA和蛋白质等较大分子的实验中，使用氨基化表面问题不大。而与寡聚核苷酸（5-10个核苷）或多肽（5-20个氨基酸）的实验中，非特异吸附的机理会带来空间排列上的缺陷。因为目标分子是吸附在表面上，整个分子长度的非特异吸附会阻碍其与靶标分子进行有效的相互作用（见表1）。因此本实施例中选用醛基化处理玻片。

B、对所述的玻片进行醛基化处理，得到基质载体；具体步骤如下：

a、清洗：将所述的玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗，再用双蒸水冲洗，晾干；b、玻片氨基化：将清洗后的玻片浸入浓度为5%的3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，作用10-40min，优选为30min，取出水洗，晾干；c、玻片醛基化：将上述氨基化处理的玻片浸入2.5%的戊二醛PBS（0.2mol/L，pH8.0）溶液中，作用30-80min，优选为60min；再用PBS溶液清洗晾干；即得到基质载体。

所述的醛基化处理的原理为：一般的制作过程是硅羟基化的玻璃片用3-氨丙基三乙氧基硅烷处理，使玻璃片表面带上一层末端氨基，然后用戊二醛处理，戊二醛分子两端的醛基可以和玻璃片表面的氨基形成希夫碱，将它们以长链碳桥的形式连接起来。再用NaBH₄或NaCNBH₃还原希夫碱形成稳定的双键，此制备过程参见图1。

所述的基质载体应符合以下条件：1、亲疏水性能检测：通过接触角测量仪检测水在所述的基质载体表面的接触角情况，接触角在55度±5度范围的所述的基质载体此项检测指标合格。2、所述的基质载体背景检测：制备完成后的所述的基质载体经晶芯 LuxScanTM 10K 微阵列芯片扫描仪在PMT/Power=90/900的扫描参数下扫描，其Cy3通道荧光背景小于等于1000；Cy5通道荧光背景小于等于300为荧光背景合格所述的基质载体。3、所述的基质载体固定能力的检测：所述的基质载体核酸固定能力的检测主要是通过固定在醛基基片表面的激发波长为532nm的荧光标记oligo样品和要杂交的oligo样品分别判断所述的基质载体的表面化学特性和生物样品固定能力等指标。对于2.5 uM激发波长为532nm的荧光标记的oligo样品，在固定化处理后经晶芯 LuxScanTM 10K 微阵列芯片扫描仪在PMT/Power=90/750的扫描参数下，Cy3通道信号大于等于10000，且杂交后10.0uM 的PBH（一种Oligo样品）Cy3通道信号??15000的所述的基质载体，其固定能力合格。上述亲疏水性能力、荧光背景能力及固定能力检测项目均合格的基质载体为合格基质载体。

C、点样处理：将探针固定到所述的基质载体上，得到所述的基因芯片初产品；

所述的点样处理采用博奥生物有限公司生产的晶芯SmartArrayer48 微阵列芯片点样系统；

所述的探针的固定原理如下：合成的寡聚核苷酸探针使用5’连接氨基直接连接在醛基化表面上。键合发生于连接氨基上的非键电子对亲核进攻醛基基团上电正性的碳原子时。随后的脱水步骤在多数芯片点样过程（如，湿度<40%时）均会发生，使得在氨基化DNA分子和芯片表面间形成共价键。反应结果是形成了一个取代亚胺，通常被称为希夫碱(Schiff base)。醛基玻片固定DNA存在两个反应，其原理参见图2、图3。图2为醛基修饰的玻片表面固定DNA的主要反应，反应是DNA碱基上的氨基和醛基进行共价结合；图3为醛基修饰的玻片表面固定DNA的副反应，反应是PCR产物引物上修饰的氨基和醛基进行共价结合。

D、将所述的基因芯片初产品进行封闭处理，得到所述的基因芯片。所述的封闭处理的步骤为：先用0.2%硼氢化钠溶液将所述的基因芯片初产品处理60 min，再用0.01%磷酸缓冲液清洗5min，再用双蒸水清洗5min，晾干；记得到所述的基因芯片。

本实施例中，所述的基因芯片上探针的布局设计如下：如图4所示，所述的基因芯片1的设置有探针的表面2上，分为标签区3和探针区4；所述的探针以点阵（微阵列）的形式分布在所述的探针区4，所述的探针区设置有4个点阵；当所述的基因芯片1的设置有探针的表面2向上水平放置时，从所述的标签区3从左向右的4个点阵分别为点阵5a、点阵5b、点阵5c、点阵5d；所述的4个点阵之间的距离均为10-11cm，优选为10.8cm；所述的点阵5d的上边沿距离所述的基因芯片的上边沿的距离为10-12mm，优选为11mm；所述的点阵5d的右侧边沿距离所述的基因芯片的右侧边沿的距离为10-12mm，优选为11mm。

本实施例中，探针包括选自以下病毒的特征片段：古典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV），各个探针的名称、编号、序列详见表4、表6、表9、表10。本实施例中的探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

生物芯片的概念：生物芯片的概念来源于计算机芯片，是指将不同功能单元集成在一块微型器件上，生物芯片借用了计算机芯片的集成化的特点，把生物活性大分子（目前主要是核酸和蛋白）或细胞等，密集排列固定在固相载体上，形成微型的检测器件，固相载体通常是硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等，因此狭义的生物芯片也叫微阵列芯片。广义的生物芯片是指能对生物成分或生物分析进行快速处理和分析的、只有一个平方厘米大小的固体薄型器件，将微阵列技术与生物微机电技术相结合，通过微加工技术和微电子技术在固体基片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片能同时检测样本中的多个生物大分子，检测原理是利用分子间的相互作用，如核酸杂交、抗原-抗体特异性结合、蛋白-蛋白间特异性结合等，将待测样品标记后与生物芯片反应，样品中的标记分子与芯片上的探针“对号入座”，标记的待测样品与之结合，通过激光共聚焦荧光扫描仪等检测手段获取信息，由于芯片上可以固定成千上万的探针，因此可以同时检测成千上万的生物大分子，而传统的检测方法一次只能检测一个或几个生物大分子，因此一次芯片实验就成了成千上万个传统实验，即一次生物芯片实验是多次传统实验的集成。

生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化。芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列，能够在短时间内分析大量的生物分子，是人们快速的获取样品中的生物信息，效率可以是传统检测手段的成百上千倍。生物芯片和传统仪器相比具有体积小、重量轻、便于携带、无污染、分析过程自动化、分析速度快、所需样品和试剂少等诸多优点。生物芯片的出现正在给生命科学研究、疾病诊断、新药开发、司法鉴定以及食品卫生监督等领域带来一场革命。

芯片的起源：

芯片的基本原理是在固相支持物上固定核酸并通过杂交过程来检测核酸。此基本原理实际来自于20世纪70年代出现的Southern blot和Northern blot技术。80年代中期，国际上几个研究小组同时开发了杂交测序的技术，基本原理是在固相支持物上固定成百上千个8碱基长度的寡核苷酸片段，然后与待测序的DNA片段进行杂交，由于不同的寡核苷酸的碱基序列是相互覆盖的，通过计算机来分析杂交信号，便可以拼接出未知DNA的序列。Fodor等人1991年2月在Science杂志上发表论文，他们利用固相化学合成，光敏保护基团及光刻掩膜技术，在固相支持底物上高密度合成了多肽和寡核苷酸，并用合成的多肽在固相支持物上与抗体进行了亲和反应。随后，1991年9月Science杂志发表了一篇评论，介绍了Fodor等人在1.28cm2 的面积上原位光合成65,000个点的工作，第一次提出了DNA芯片（DNA chip）的概念。到1995年，Schena等人在Science杂志上发表论文，将45个拟南芥基因固定在一张玻片上，并行检测拟南芥植株不同组织及不同处理后45个基因表达的变化。此报导第一次将高精度机械手点样技术，荧光标记技术，双通道荧光扫描技术及数据分析软件结合在一起，可以说是DNA芯片技术在基因表达分析中第一次真正意义上的应用。随后，用于基因表达分析的DNA芯片技术发展迅速，在玻片上点样的密度越来越大。部分已经完成基因组测序的微生物的全基因组DNA芯片已经制备出来并应用于各项研究中：如酿酒酵母、结合杆菌、大肠杆菌以及白色念珠菌的全基因组DNA芯片。随着人类基因组计划的完成和功能基因组学研究的进展，制作出人类全基因组DNA芯片将只是一个时间上的问题。

现在用生物芯片技术分析的物种包括人、酵母、小鼠、大鼠、黑猩猩、大猩猩、果蝇、线虫、玉米、水稻、棉花、细菌和病毒等。目前有超过3000篇的论文与芯片分析有关。这些论文从不同的角度表明了微阵列技术的多样性、不同研究单位的研究侧重点以及此技术领域商业化产品的多样性。

基因芯片技术平台一般包括5个部分：芯片的基质材料、把DNA分配到芯片上的机械手、核酸杂交需要的控制系统、独取杂交信号的光学扫描系统以及读取和分析数据的计算机软件工具，由于不同的文献对探针（probe）和靶标（target）有不同的定义，这里我们的定义是固定在基质载体上的DNA被称为探针，而来自生物样品的核酸被称为靶标。

实施例3：

本实施例为实施例1基础上的优选方案，采用随机引物PCR法的基因芯片检测体系。本实施例采用实施例2中的基因芯片。一种猪病毒基因芯片检测猪病毒的方法，所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针包括选自以下病毒的特征片段：古典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV），该方法包括的步骤为：

A、提取病毒核酸，得到待测样品。本实施例采用古典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）7种病毒的标准核酸（DNA/RNA）作为标准样品，所述的标准样品购自北京加德通量生物技术有限公司；所述的标准样品的序号和样品编号详见表5。将上述的标准样品感染40-60日龄，优选为40日龄的身体健康的仔猪，待该仔猪出现症状并死亡后1h内解剖其尸体，从该尸体的直肠内取出粪便样品；从该粪便样品提取RNA待测样品和DNA待测样品；

a、RNA待测样品提取：采用目前普遍的TRIzol 方法，具体操作步骤如下：将所述的粪便样品用生理盐水或PBS溶液制成重量体积比（w/v）为1：5的粪便悬液，即1g粪便加入5 ml生理盐水或PBS溶液；再充分混匀，转速为4500r/min，离心20min，得到上清液；取所述的上清液200μl用于提取病毒核酸，置-20℃以下保存。取100μl 所述的上清液加入200μlTRIzol试剂；剧烈震荡60秒钟（vortex）；加入100μl氯仿；剧烈震荡15秒钟（vortex）；室温放置5分钟；12000g离心处理15分钟；将水相转移到新离心管内；加入500μl的异丙醇；4℃，12000g,离心10分钟；弃上清，用70%的乙醇洗RNA沉淀；4℃，12000g，离心处理2分钟；干燥处理10分钟，得到干燥沉淀；将所述的干燥沉淀溶于50-100μl的DEPC-水中，得到了粪便标本的总RNA，即为RNA待测样品。

b、DNA待测样品提取：将猪粪便样本用生理盐水或PBS溶液制成重量体积比（w/v）为1：5的粪便悬液，即1g粪便加入5 ml生理盐水或PBS溶液；再充分混匀，转速为4500r/min，离心20min，得到上清液；取所述的上清液200μl用于提取病毒核酸，置-20℃以下保存。采用目前普遍的DNAzol Reagent法，具体操作步骤如下：取25-50mg上清液加1ml DNAzol ，使用匀浆仪处理5-10 次；4-25℃，10000g 离心10分钟，将离心得到的上清液转入新离心管；向新离心管中的离心得到的上清液中加0.5ml的100%乙醇，颠倒新离心管混匀样品，至出现DNA沉淀，室温保存1-3分钟；尽可能去除新离心管中的新产生上清液，用枪头搅绕DNA沉淀贴附在离心管上端壁上；0.8-1ml 75％乙醇漂洗DNA 两次；用枪吸去残余的乙醇，将漂洗过的DNA沉淀晾干5-10秒中后立刻用200-300μl的8mMNaOH溶解，至此得到了样本的总DNA，即为DNA待测样品。

B、将所述的待测样品进行PCR反应处理，得到扩增产物；再将所述的扩增产物进行纯化处理，得到纯化的扩增产物；

a、将上述RNA/DNA待测样品中，加1μl primer A（40 pmol/μl）（表2），补水到10μl；

表2：PCR引物名称和序列

b、将a中的产物在65℃保存5min ，再室温保存5min；c、配制酶体系，共计10 μl：10× RT Bμffer：2.0 μl， 25 mM dNTP mix (final concentration 500 μM each nμcleotide)：0.4 μl，ddH₂O： 3.6 μl， 0.1M DTT： 2.0 μl ， Reverse Transcriptase ：2.0 μl；

d、向b中的产物加入上述c中10 μl酶体系后，42℃ 加热2h，再加入1 μl RNase H，37℃消化 30min；e、将d中产物于95℃ 加热3 min，冰上骤冷5 min；f、配制酶体系，共计10 μl：10× Klenow Bμffer：3.0 μl，Klenow 酶：1.0 μl，H₂O：6.0 μl；

g、将f中酶体系于37℃加热 1.5h，再65℃加热5min以终止反应；h、在g中的产物中补充加入Klenow 酶1 μl，于37℃加热1.5h，再65℃加热5min以终止反应；

i、取上述部分h中的产物进行PCR反应：PCR反应体系为：h中的产物：6.0 μl，10× PCR buffer：10 μl，25mM dNTP：1.0 μl，Primer B（100pmol/μl）： 1.0 μl，Taq（hot start）： 1.0 μl，ddH₂O： 81 μl；

PCR反应程序为： 94℃预变性30s；40℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，共40个循环；72℃ 延伸7 min；4℃保存；

j、取10μl上述i中的PCR产物，电泳（1% gel），看是否能出现500bp-1kb的smear条带，结果在250bp-750bp之间出现了明显的smear条带。

k、经过j步骤中的电泳检测的上述i中的PCR产物 10 μl 进行PCR标记反应：

将10 μl的经过j步骤中的电泳检测的上述i中的PCR产物加入1 μl的9N-TAMRA（1μg/μl），于95 C°加热3分钟，再冰浴5分钟，再加入以下成分：10× Klenow Bμffer：2.5 μl ，dNTP（2.5mM each）：2.5 μl，Klenow 酶：1.0 μl，ddH₂O： 8 μl；再与37 C°加热1.5h ，于70 C°加热5min，最后得到扩增产物。所述的PCR扩增结束后，得到所述的扩增产物，取2～3 μl 所述的扩增产物，1.5％琼脂糖电泳检测扩增情况，如果目的片段明显，则进行纯化处理，得到纯化的扩增产物用于杂交处理；该纯化处理采用德国MN公司的核酸纯化试剂盒；

C、将所述的纯化的扩增产物进行杂交处理，得到杂交产物；

a.取所述的纯化的扩增产物中按照表3中的杂交反应体系的成分配制得到杂交液；

表3：杂交反应体系

成分	加样量	终浓度
			20×SSC	2.25μl	3×SSC
10%SDS	0.3μl	0.2%
			甲酰胺	3.75μl	25%
50×Denhardt`s	1.5μl	5×
			杂交阳性对照	0.2μl
扩增产物	7μl

b. 将以上15μl的杂交液用移液器混匀后于3000rpm离心30s，再于95°C 热变性3 分钟（在PCR 仪中），再冰浴骤冷1min，再用移液器将四份冰浴后的杂交液分别注入所述的基因芯片的盖片上的四个小孔；注：每个点阵15μl，1张基因芯片共4个点阵，可以做杂交4份样本。c. 确认上述冰浴后的杂交液覆盖所述的基因芯片上的四个点阵以后，盖紧杂交盒盖，放入42°C恒温水浴锅中，杂交反应2小时，充分反应得到杂交产物；

D、将所述的杂交产物进行扫描分析处理，得到检测结果。

上述杂交反应结束后，使用晶芯芯片清洗仪对芯片及其上面的杂交产物进行清洗、干燥；将清洗干燥后的芯片放入晶芯Luxscan 10K扫描仪中进行扫描。

本实施例中，Hex探针的作用是确认核酸固定过程无误；NC芯片杂交阴性对照和PC芯片杂交阳性对照的作用是确认反应条件正常，以保证结果的有效性。正常情况下，阳性对照的样点有荧光信号，阴性对照则没有。本实施例中，所述的基因芯片的每个点阵中，探针和对照的设计参见表4，图5：表4：探针列表

本实施例采用包括猪瘟病毒在内的7种病毒的标准核酸（DNA/RNA）作为标准样品（如表5）进行实验，芯片结果如下。表5：本实施例实验用标准样品

注：前期随机引物扩增方案中，未涉及猪细小病毒，猪乙型脑炎病毒。

杂交结果图见图6-图13：图6为HCLV杂交结果：特异性杂交探针：CSFV-1、CSFV-2、CSFV-3、CSFV-L-1、CSFV-L-2、CSFV-L-3；非特异性杂交探针：BVDV2-1、BVDV2-L-2、BVDV1-L-3。图7为CSFV杂交结果：特异性杂交探针：CSFV-1、CSFV-2、CSFV-3；CSFV-L-1、CSFV-L-2、CSFV-L-3；非特异性杂交探针：PCV1-L-1、 BVDV2-L-2、BVDV1-L-3；备注：疫苗株与流行株不能很好地区分，单碱基的差异。图8为BVDV杂交结果：特异性杂交探针：BVDV2-1，非特异性杂交探针：PPV-L-3、PPV-L-4。图9为PCV I杂交结果：特异性杂交探针：PCV1-1、PCV1-3、PCV2、PCV1-L-1、PCV1-L-2、PCV-L-1、PCV-L-2；非特异性杂交探针：无。图10为PRV杂交结果：特异性杂交探针：PRV-1、PRV-2、PRV-4、PRV-5、PRV-6、PRV-7、PRV-8、PRV-9、PRV-10、PRV-12、PRV-L-1、PRV-L-2、PRV-L-4、PRV-L-5；非特异性杂交探针：PCV2-L-1、JEV-L-3。图11为PRRSV-1杂交结果：特异性杂交探针：PRRSV-6、 PRRSV-L-5；特异性杂交探针：无；备注：PRRSV-1为免疫株，与流行株的区别主要在于基因上缺失大约30bp左右碱基。图12为PRRSV-2杂交结果：特异性杂交探针：PRRSV-4、 PRRSV-6、PRRSV-L-2、 PRRSV-L-3、 PRRSV-L-4、PRRSV-L-5；非特异性杂交探针：无。图13为HCLV调整探针后杂交结果：特异性杂交探针：CSFV-1、CSFV-2、CSFV-3、CSFV-4、CSFV-6、CSFV-8、CSFV-L-1、 CSFV-L-2、 CSFV-L-3；非特异性杂交探针：BVDV2-1、 BVDV2-L-2、 BVDV1-L-3；备注：CSFV-4、CSFV-6、CSFV-8为HCLV弱毒株的分型探针，此次经调整后虽有杂交结果，但分型效果较差，后取消分型。

根据筛选后挑选特异性较好的探针，按照实施例2的方法重新点制基因芯片；优化后，所述的每个点阵中的探针排列如图14。各个探针名称及含义见表6：

表6：各探针名称及代表含义

本实施例中，上述系列实验表明随机引物PCR法可有效扩增不同样品中的多种猪病毒，成功用于猪病毒检测芯片平台。随机引物扩增体系的优势是能够对病原体进行无选择性的扩增，既可并行扩增多种目标病毒，又可有效扩增变异病毒（突变或重组），以及未知病毒。

实施例4：

本实施例为实施例3基础上的优选方案，采用多重PCR法的基因芯片检测体系。本实施例以样品核酸（DNA/RNA）为模板，以特异性引物进行多重PCR/RT-PCR，同时加入cy3标记的dCTP进行渗入荧光素标记，产物纯化后用于基因芯片杂交，以所述的基因芯片上探针与产物杂交结果判读病毒是否存在及病毒种类。

本实施例中，猪病毒基因芯片检测猪病毒的方法包括的步骤为：

A、提取病毒核酸，得到待测样品；本实施例中，RNA/DNA待测样品的提取方法参见实施例3；

B、将所述的待测样品进行PCR反应处理，得到扩增产物；ａ、经优化，采用两个多重PCR体系实现对多种病毒的扩增，其中“体系1”为四重PCR，引物包括CSFV_2600、PPV_NS1_370、US1341-1和PRRSV_NPS2_1341，“体系2”为三重PCR，引物包括PCV I、PCV II和PRV_pK_81，引物名称和序列见表7。

表7：多重PCR引物序列

b、本实施例中，两个多重PCR体系的配置如下：

ⅰ.体系1，共计20μL ：10×PCR Buffer：2 μL ，模板： 2 μL， DNTP(A：T：G：C=2.4mM：2.4mM：2.4mM：1.2mM)：1.6 μL ，CY3-DCTP(2.5mM)： 0.2 μL ，

引物体系1mix（4对引物等比例混合）： 4 μL，rTaq： 0.2 μL，

无核酸酶灭菌ddH₂O：补齐至20μL。

ⅱ.体系2，共计20μL：10×PCR Buffer ：2 μL ，模板：2 μL，

DNTP(A:T:G:C=2.4mM:2.4mM:2.4mM:1.2mM)：1.6 μL， CY3-DCTP(2.5mM)：0.2 μL，引物体系1mix（3对引物等比例混合）：4 μL ， rTaq ：0.2 μL ，无核酸酶灭菌ddH₂O：补齐至20 μL；

c、本实施例中，PCR扩增程序为：

94℃预变性10min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，共40个循环；72℃ 延伸7 min；4℃保存。所述的PCR扩增结束后，得到所述的扩增产物，取2～3 μl 所述的扩增产物，1.5％琼脂糖电泳检测扩增情况，如果目的片段明显，则进行纯化处理，得到纯化的扩增产物用于杂交处理；该纯化处理采用德国MN公司的核酸纯化试剂盒；

C、将所述的纯化的扩增产物进行杂交处理，得到杂交产物；

a.取所述的扩增产物中按照表8中的杂交反应体系的成分配制得到杂交液；

表8：杂交反应体系

试剂	体积	终浓度
			20×SSC	2.25μL	3×
10%SDS	0.3μL	0.2%
			甲酰胺	3.75μL	25%
50×Denhardt’s	1.5μL	5×
			杂交阳性对照	0.2μL
纯化的扩增产物	各3.5μL

b. 将以上15μl的杂交液用移液器混匀后于3000rpm离心30s，再于95°C 热变性3 分钟（在PCR 仪中），再冰浴骤冷1min，再用移液器将四份冰浴后的杂交液分别注入所述的基因芯片的盖片上的四个小孔；c. 确认上述冰浴后的杂交液覆盖所述的基因芯片上的四个点阵以后，盖紧杂交盒盖，放入42°C恒温水浴锅中，杂交反应2小时，充分反应得到杂交产物；

D、将所述的杂交产物进行扫描分析处理，得到检测结果。上述杂交反应结束后，使用晶芯芯片清洗仪对芯片及其上面的杂交产物进行清洗、干燥；将清洗干燥后的芯片放入晶芯Luxscan 10K扫描仪中进行扫描。本实施例中，Hex探针的作用是确认核酸固定过程无误；NC芯片杂交阴性对照和PC芯片杂交阳性对照的作用是确认反应条件正常，以保证结果的有效性。正常情况下，阳性对照的样点有荧光信号，阴性对照则没有。本实施例中，所述的基因芯片设计参见表9；每个点阵中的探针排列参见图15。

表9：探针列表

本实施例的基因芯片检测结果如下：取标准病毒核酸，该标准病毒核酸的序列及品质、来源与实施例3中相同，按上述PCR扩增体系分别进行体系1和体系2扩增，产物经电泳检测合格纯化后进行芯片杂交，验证芯片探针的特异性杂交结果图见图16-图21：其中，图16、图17、图21为通过上述体系1扩增得到的杂交结果；图18、图19、图20为通过上述体系2扩增得到的杂交结果。图16-18分别为PRRSV、CSFV、PCVⅠ、PCVⅡ、PRV、PPV的理论杂交图和实际杂交图的对比示意图；结果表明，经优化后，本实施例中的多重PCR体系和基因芯片的理论杂结果和实际杂交结果基本完全相同，可以成功用于猪病毒的平行检测。实施例3中表4、表6，实施例4中表9的探针的核苷酸序列详见表10：

表10：表4、表6、表9中探针的核苷酸序列

Claims

1.一种猪病毒基因芯片，其特征在于：所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针包括以下病毒的特征片段：古典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）；所述的探针由Hex、PC、NC、PRRSV-1、PRRSV-2、PRRSV-3、CSFV-1、CSFV-2、PCV1-1、PCV2-1、PCV2-2、PCV-1、PCV-2、PRV-2、PPV-2组成，其探针的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No: 1、SEQ ID No: 2、SEQ ID No: 3、SEQ ID No: 4、SEQ ID No: 5、SEQ ID No: 6、SEQ ID No: 10、SEQ ID No: 11、SEQ ID No: 23、SEQ ID No: 26、SEQ ID No: 27、SEQ ID No: 29、SEQ ID No: 30、SEQ ID No: 33、SEQ ID No: 48所示。

2.根据权利要求1所述的猪病毒基因芯片，其特征在于：所述的基质载体为经过醛基化处理的玻片。

3.一种猪病毒基因芯片检测猪病毒的方法，其特征在于：所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针包括以下病毒的特征片段：古典猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）；所述的探针由Hex、PC、NC、PRRSV-1、PRRSV-2、PRRSV-3、CSFV-1、CSFV-2、PCV1-1、PCV2-1、PCV2-2、PCV-1、PCV-2、PRV-2、PPV-2组成，其探针的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No: 1、SEQ ID No: 2、SEQ ID No: 3、SEQ ID No: 4、SEQ ID No: 5、SEQ ID No: 6、SEQ ID No: 10、SEQ ID No: 11、SEQ ID No: 23、SEQ ID No: 26、SEQ ID No: 27、SEQ ID No: 29、SEQ ID No: 30、SEQ ID No: 33、SEQ ID No: 48所示；

该方法包括的步骤为：

A、将已经感染上述病毒死亡的猪尸体内的粪便样品进行核酸提取处理，得到待测样品；

C、将所述的纯化的扩增产物进行杂交处理，得到杂交产物；

D、将所述的杂交产物进行扫描分析处理，得到检测结果；

B步骤中所述的PCR反应，为随机引物PCR反应；

所述的PCR反应的步骤为：

a、将上述待测样品中，加1μl 浓度为40 pmol/μl的 primer A，补水到10μl；

引物的名称和序列如下：

Primer A：GTTTCCCAGTCACGATANNNNNNNNN

Primer B：GTTTCCCAGTCACGATA

9N-TAMRA：TAMRA-NNNNNNNNN

b、将a中的产物在65℃保存5min ，再室温保存5min；

c、配制酶体系，共计10 μl：

10× RT Buffer：2.0 μl，

25 mM dNTP mix：0.4 μl，所述dNTP mix 的最终浓度为500 μM each nucleotide；

ddH₂O： 3.6 μl，

0.1M DTT： 2.0 μl ，

Reverse Transcriptase ：2.0 μl；

d、向b中的产物加入上述c中10 μl酶体系后，42℃ 加热2h，再加入1 μl RNase H，37℃消化 30min；

e、将d中产物于95℃ 加热3 min，冰上骤冷5 min；

f、配制酶体系，共计10 μl：

10× Klenow Buffer：3.0 μl，

Klenow 酶：1.0 μl，

H₂O：6.0 μl；

g、将e中产物与f中酶体系混合，于37℃加热 1.5h，再65℃加热5min以终止反应；

h、在g中的产物中补充加入Klenow 酶1 μl，于37℃加热1.5h，再65℃加热5min以终止反应；

i、取上述部分h中的产物进行PCR反应：

PCR反应体系为：

h中的产物：6.0 μl，

10× PCR buffer：10 μl，

25mM dNTP：1.0 μl，

浓度为100pmol/μl 的Primer B：1.0 μl，

hot start Taq： 1.0 μl，

ddH₂O： 81 μl；

PCR反应程序为：

94℃预变性30s；40℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，共40个循环；72℃ 延伸7 min；4℃保存；

j、取10μl上述i中的PCR产物，1% gel电泳，看是否能出现500bp-1kb的smear条带；

k、取上述i中的PCR产物 10 μl 进行PCR标记反应：

将上述i中的PCR产物加入1 μl的浓度为1μg/μl的9N-TAMRA，于95°C加热3分钟，再冰浴5分钟，再加入以下成分：

10× Klenow Buffer：2.5 μl ，

浓度为2.5mM each 的dNTP：2.5 μl，

Klenow 酶：1.0 μl，

ddH₂O： 8 μl；

再于37 °C加热1.5h，于70 °C加热5min，最后得到扩增产物。