CN104830995A - 一种用于同时检测或诊断猪多种病毒感染的多重rt-pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于同时检测或诊断猪多种病毒感染的多重rt-pcr检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于同时检测或诊断猪多种病毒感染的多重RT-PCR检测试剂盒及其应用，本发明的试剂盒中包括分别用于检测PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV以及JEV 6种病毒的特异性引物。6种病毒核酸混合物进行单一PCR，结果表明本发明设计的引物对PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV以及JEV的检测限值分别是2.5、7.3、4.8、3.9、3.8、0.4pg/μl。采用本发明的多重RT-PCR方法检测PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV以及JEV的核酸混合物，其检测限值分别是6.6、96、12.9、10.5、51、46pg/μl。使用本发明试剂盒同时检测猪多种常见病毒具有灵敏度高、特异性强等特点，可即时检测和区别PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV以及JEV 6种病毒抗原，对猪类病毒混合感染的监测和防控、养殖场生物安全、减少养殖业损失、食品安全和检疫等有重要意义。

Description

一种用于同时检测或诊断猪多种病毒感染的多重RT-PCR检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于病毒检测的试剂盒，特别涉及一种用于同时检测或诊断猪多种病毒混合感染的多重RT-PCR检测试剂盒及其应用。本发明属于病毒检测技术领域。
背景技术
近几年病毒病对畜牧业造成危害，在大规模的养猪产业中，经常发生猪多种病毒的混合感染，其中猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)是引起猪生殖系统破坏和造成养殖企业经济损失的主要病原。另外PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV这5种病毒能够引起猪的免疫系统损伤，同时容易导致猪体感染其他病原。
因此，实现对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)的快速检测和诊断是疾病检测、监测、防控的重要必须的环节。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种实现对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)快速检测和诊断的方法。
本发明的目的是通过以下技术手段实现的：
本发明利用多重RT-PCR的原理开发了一种快速检测和区别六种猪经常流行传染病毒的试剂盒，可实现一次反应立时检测引起猪呼吸与生殖疾病的6种病毒，包括3种RNA病毒和3种DNA病毒。通常对病毒的核酸检测，尤其是RNA病毒检测，需要进行逆转录后再扩增，本发明合2步反应为1步反应，节约了时间和检测试剂。
本发明的一种用于同时检测或诊断多种猪病毒感染的多重RT-PCR检测试剂 盒，其特征在于所述试剂盒中包括分别用于猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)检测的特异性引物对，其中，用于猪伪狂犬病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示，用于猪细小病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示，用于猪圆环病毒2型检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示，用于猪繁殖与呼吸综合症病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.8所示，用于猪瘟病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.10所示，用于猪乙型脑炎病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.11以及SEQ ID NO.12所示。
多聚酶链反应中，高度特异引物设计对检测特异性至关重要，本发明中PRV引物特异扩增猪伪狂犬病毒保守序列gE，PPV引物特异扩增猪细小病毒的保守序列NS1，PCV2引物特异扩增圆环病毒2型的ORF2片段，PRRSV引物特异扩增猪繁殖与呼吸综合症的ORF7片段(N蛋白基因)，CSFV引物特异扩增猪瘟病毒E2基因片段，JEV引物特异扩增乙型脑炎病毒的E基因片段。同时提供了提高特异性反应的引物浓度，可混合配制到一起装入试剂盒，用时按标准要求浓度加入引物即可。同时克服了引物的核苷酸G/C含量过高或过低或形成颈-环结构降低检测特异性的风险，优化了退火温度为56.4℃。
在本发明所述的试剂盒中，优选的还包括反应混合液，逆转录酶和Taq DNA多聚酶混合液以及不含RNase的双蒸水。
采用本发明的试剂盒用于同时检测或诊断猪多种病毒感染时，优选的，多重RT-PCR的反应体系包括：25微升2×One Step Buffer，2微升PrimeScriptTM One Step Enzyme Mix，浓度分别为500pmol/mL的PPV、PCV2、PRRSV、JEV正反引物各1.0微升，浓度分别为500pmol/mL的PRV和CSFV正反引物各1.5微升，提取的浓度为1-10ng/微升样本DNA/RNA混合物5-8微升，DEPC水加至50微升。
优选的，用于同时检测或诊断猪多种病毒感染时，反应条件：50℃，40min反应一次，94℃变性5min，按94℃变性30s、56.4℃复性30s、72℃延伸30s，进行35次循环，最后72℃延伸10min。
灵敏度实验表明本发明设计的引物对PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV以及JEV的检测限值分别是2.5、7.3、4.8、3.9、3.8、0.4pg/μl。采用本发明的多重RT-PCR方法检测PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV以及JEV的核酸混合物，其检测限值分别是6.6、96、12.9、10.5、51、46pg/μl。特异性实验表明本发明设计的引物 对猪流感病毒(SIV)、大肠杆菌或猪病的主要细菌病原，包括冠状病毒以及猪1型圆环病毒并无非特异性扩增产物出现。说明使用本发明试剂盒同时检测猪多种常见病毒具有灵敏度高、特异性强等特点，可即时检测和区别PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV以及JEV 6种病毒。
因此，进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备同时检测或诊断猪多种病毒感染试剂中的应用，所述的猪多种病毒包括猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、经典猪瘟病毒(CSFV)以及猪乙型脑炎病毒(JEV)。
本发明对猪病毒混合感染的监测和防控、养殖场生物安全、减少养殖业损失、食品安全和检疫等有重要意义。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1、试剂盒的制备和组装
1、引物的设计及合成
按照基因库公开序列和国内局部地区的流行株序列设计并合成了分别用于检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)检测的特异性引物对，其中，用于猪伪狂犬病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示，用于猪细小病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示，用于猪圆环病毒2型检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示，用于猪繁殖与呼吸综合症病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.8所示，用于猪瘟病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.10所示，用于猪乙型脑炎病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.11以及SEQ ID NO.12所示。
2、其他成分 
RT-PCR反应混合液，PCR反应混合液，逆转录酶、DNA多聚酶混合液、dNTP混合物以及不含RNase的双蒸水。 
实施例2本发明的多重RT-PCR检测试剂盒在同时检测或诊断多种猪病毒感染中的应用
1、材料
1.1.病毒和细胞 
PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、JEV由山西隆克尔生物制药有限公司分离和保存-80℃备用，用于建立标准的多重RT-PCR方法。大肠杆菌、猪流感病毒用于特异性分析，由山西隆克尔生物制药公司分离保存。Vero、BHK-21、Marc-145、PK-15细胞购自美国ATCC，检测应不含外源因子和PCV1和PCV2，满足生物制品细胞基质要求。细胞培养液DMEM含适量抗生素、8-10％胎牛血清。为检测本发明方法的检测效率，用病毒感染细胞培养液作为样本。PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2购自大连TaKaRa公司。
1.2.临床样本
收集2012-2014年甘肃兰州猪场20头流产猪胎的扁桃体、肺、肾、淋巴结、脾，称为第一组，编号LZ1-20；22头饲养仔猪的组织为第二组，编号BP1–22；33头哺乳期乳猪，称为第三组，编号NP 1–33；28头育成猪的组织器官为第四组，编号FP1–28。
1.3.引物
按照基因库公开序列和国内局部地区的流行株序列设计并合成了以PRV gE、PPV NS1、PCV2ORF2、PRRSV ORF7、CSFV E2、JEV E为目标片段的6对特异性引物。引物以及反应产物的大小见表1。
表1扩增猪6种病原的特异性引物(划线碱基改变以调整优化退火温度)
2、方法
2.1.核酸提取
各组织器官匀浆混合样本、细胞培养物样本用RNA/DNA Mini kit试剂盒提取。组织器官(扁桃体、肺、肾、肝、淋巴结、脾)各500mg加入DMEM研磨成匀浆，离心后使用或放置-80℃备用。
2.2.单一PCR扩增PRV、PPV、PCV2：
反应体系：总体积25微升，包含12.5微升2×One Step Buffer、1微升1单位PrimeScriptOne Step Enzyme Mix、1.0微升10pmol/mL的正反向引物、2.5微升病毒核酸、7.0微升无菌水。
反应条件：95℃变性5min，进行35次循环，每次循环95℃变性30s，60℃(PRV)或53℃(PPV)或57℃(PCV2)退火30s,72℃延伸30s；最后72℃延10min。
PCR产物分析：1.2％琼脂糖胶TE(40mmol/L Tris-acetate,pH8.0,1mmol/L EDTA)配制，0.5微克/毫升的溴乙锭。紫外灯下观察。
2.3.单一PCR扩增PRRSV、CSFV、JEV：
反应体系：总体积为25微升，包含12.5微升2×One Step Buffer、1微升1单位PrimeScript One Step Enzyme Mix、1.0微升10pmol/mL正反向引物、2.5微升病毒核酸、7.0微升无菌水。
反应条件：94℃变性5min，进行35次循环，每次循环包括94℃变性30s,57℃(PRRSV)或56℃(CSFV)或58℃(JEV)退火30s,72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。PCR产物分析如2.2节所述。
2.4.多重RT-PCR
2.4.1.多重RT-PCR检测病毒感染的细胞，将各个病毒感染的细胞培养物混合，用RNA/DNA Minikit试剂盒提取核酸，进行多重RT-PCR检测。
多重RT-PCR分别进行JEV和PRRSV；JEV和CSFV；JEV、PRV、PPV和PCV2；PRRSV、PRV、PPV和PCV2；以及PRRSV、CSFV和JEV不同组合的检测，每次试验进行2次重复。
2.4.2.多重RT-PCR的建立：
6种病毒的6对引物按不同的参数混合，如退火温度、上下游引物浓度，6种病毒的模板数量。
进行多次的不同条件下的多重RT-PCR，获得优化的反应程序和条件，包括退火温度50-60℃、引物浓度5-20pmol/mL、循环次数30-35次。
RT-PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶、0.5μg/ml溴乙锭电泳分析。
2.5.灵敏度检测： 
病毒核酸浓度采用光度计(BioPhotometerPlus，德国Eppendorf公司产品)进行测定，然后进行多重RT-PCR样品的5倍系列稀释，以及进行单一PCR的样品10倍稀释。
2.6.特异性检测： 
猪流感病毒(SIV)、大肠杆菌或猪病的主要细菌病原、冠状病毒、猪1型圆环病毒和6种病毒的病原核酸抽提后，采用优化的多重RT-PCR程序进行检测。将扩增产物片段克隆于pGEM-T质粒并测序。
2.7.临床样品检测：
分别提取103份田间样品的核酸，并测定各自核酸浓度，分别用单一PCR和多重RT-PCR进行检测。
同时为验证本发明方法的准确性，采用玻片ELISA对样本进行了同步检测。玻片ELISA检测方法的步骤具体如下：
1)、血清、层析纯化多克隆抗体的制备
免疫用抗原经细胞培养、蔗糖密度梯度超速离心、分子筛纯化制成高纯度抗原。
2)、玻片ELISA检测PRRSV
冻干PRRSV疫苗用1％PBS(pH7.4)复溶，用50-100微升涂于干净无油的玻边上，热固定，在长方形染色缸中用1％PBS(phosphatebuffer saline,pH 7.4)洗涤三次，每次5分钟。无水酒精配制0.3–3％H2O2浸泡，并在暗处放置孵育15分钟以灭活内源性的过氧化物酶，1％PBS洗涤三次，每次15分钟。为封闭非特异抗原，玻片小心干燥并擦干涂点周围，用150–200微升5％正常羊血清(用1％PBS配制，pH7.4)覆盖，室温下湿箱孵育30分钟。室温下1％PBS洗涤三次，每次5分钟。100-50微升第一抗体(兔源亲和亲和层析纯化抗体按1：1000稀释到1％BSA的PBS)覆盖涂点，涂片在37℃孵育0.5-1h，室温下1％PBS洗涤三次，每次5分钟。100-150微升辣根过氧化物酶偶联羊抗兔IgG抗体(第二抗体用1％PBS1000倍稀释)覆盖 玻片涂区，涂片在保湿箱室温孵育1h。室温下1％PBS洗涤三次，每次5分钟，涂点上加底物[AEC(3-Amino-9-ethylcarbazole)]覆盖涂点，室温孵育3分钟，在阴性对照通常染色背景出现以前蒸馏水洗涤2-3分钟终止反应。在显微镜高倍镜(40X)下观察病毒阳性信号为玫瑰红到棕红色。阴性血清对照为1％BSA(100–150微升)，代替第一抗体，其他操作步骤和试剂一样。阴性病毒对照为50-100微升PRRSV阴性细胞液代替阳性涂片，其他操作步骤和试剂一样。
3)、玻片ELISA检测PRV、PCV2、CSFV、JEV病毒
冻干病毒用无菌的1％PBS(pH 7.4)复溶，50–100微升涂于干净无油的玻片上，热固定后1％PBS(pH 7.4)洗涤3次，每次5分钟。无水酒精配制0.3–3％H2O2浸泡，并在暗处放置孵育15分钟以灭活内源性的过氧化物酶。1％PBS(pH 7.4)洗涤3次，每次5分钟。用5％正常羊血清(1％PBS配制,pH 7.4)150–200微升封闭非特异性抗原，室温下湿箱孵育30分钟。1％PBS(pH 7.4)洗涤3次，每次5分钟。1％PBS(pH 7.4)洗涤3次，每次5分钟。PRV、PCV2、CSFV、JEV病毒的兔源亲和层析多克隆抗体分别用含1％BSA的PBS稀释1000倍,分别加入到各自的玻片涂点上，涂片在37℃孵育1h，室温下1％PBS洗涤三次，每次5分钟。辣根过氧化物酶偶联羊抗兔IgG用1％PBS1000倍稀释，涂点区加100-150微升，涂片在保湿箱室温孵育。用1％PBS(pH 7.4)洗涤3次，每次5分钟.，涂点上加底物[AEC(3-Amino-9-ethylcarbazole)]覆盖涂点，室温孵育3分钟，在阴性对照通常染色背景出现以前蒸馏水洗涤2-3分钟终止反应。在显微镜下高倍镜(40X)下观察病毒阳性信号为玫瑰红到棕红色。阴性血清对照，在同样同步操作中，1％牛血清白蛋白(BSA)代替各自病毒的特异亲和层析纯化抗体(PRV、PCV2、CSFV、JEV)，病毒的阴性对照用1％PBS(pH 7.4)50–100微升代替病毒液涂片。
4)、病毒的半定量
PRRSV纯化抗原稀释每毫升为10TCID50、100TCID50、1000TCID50、10000TCID50、100000TCID50滴度的液体，分别取10微升涂在玻片1平方厘米(cm2)区域，分别按上述方法进行SELISA，阳性信号数目通过显微镜((40×)计数。计数各个滴度有阳性信号(玫瑰红色或棕红色的40个视野，且平均计算每个视野的阳性信号数，线性回归分析信号数与滴度的关系。
5)、玻片ELISA与RT-PCR法的比较
已知PRRSV阳性的细胞培养液稀释到含101-105-TCID50/mL单位溶液,分别用玻片ELISA、RT-PCR检测。为了确定玻片ELISA检测极限值，PRRSV以10TCID50 单位溶液10倍稀释，分别用玻片ELISA法和RT-PCR法检测。
3、结果
3.1 6种病原的单一PCR检测分析： 
单一PCR电泳结果显示PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、JEV各自反应的产物在琼脂糖凝胶上观察分别显示178bp、271bp、353bp、433bp,、508bp、1015bp的片段。
3.2多重RT-PCR方法的建立和优化：
PCV2、PPV、PRV的DNA和CSFV、PRRSV、JEV cDNA为模板，使用同一反应体系，对不同退火温度从50-60℃进行试验，选择了56.4℃为最佳退火温度。改变不同引物浓度，从5-20pmol/mL筛选，选择PRV特异的引物浓度15pmol/mL，CSFV特异的引物浓度15pmol/mL，PPV、PCV2、PRRSV、JEV的特异引物的浓度分别为10pmol/mL。最佳的循环次数30次，每次循环的优化了最佳参数：25微升2×One Step Buffer，2微升PrimeScript One Step Enzyme Mix，PPV、PCV2、PRRSV、JEV正反引物各1.0微升(500pmol/mL),PRV和CSFV正反引物各1.5微升(500pmol/mL)，1微升PPV、PCV2、PRRSV、JEV核酸(10pmol/mL)模板，1.5微升PRV和CSFV核酸(15pmol/mL)模板，DEPC水加至50微升。
优化的反应条件：50℃，40min反应一次，94℃变性5min，按94℃变性30s、56.4℃变性30s、72℃延伸30s；进行35次循环，最后72℃延伸10min。
3.3单一PCR以及多重PCR的灵敏度分析 
6种病毒模板分别10倍梯度稀释后进行单一PCR检测，结果表明单一PCR对PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、JEV检测限值分别是2.5、7.3、4.8、3.9、3.8、0.4pg/μl。6种病毒模板混合后进行5倍梯度稀释后进行多重PCR检测，结果表明多重PCR对PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、JEV检测限值分别是6.6、96、12.9、10.5、51、46pg/μl。
3.4多重RT-PCR特异性分析 
将扩增产物片段克隆于pGEM-T质粒病测序。分别得到片段大小为178bp、271bp、353bp、433bp、508bp、1015bp的扩增片段，而且与PRV、PPV、PCV2和3种RNA病毒PRRSV、CSFV、JEV所对应的序列一致。
以上结果说明本发明设计的引物、无论用优化的单一扩增和多重扩增法对PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、JEV进行扩增都可产生各自病毒相对应特定大小的片段，且与目标产物的预期序列一致。而阴性对照、大肠杆菌、猪流感病毒、 冠状病毒以及猪1型圆环病毒并没有反应产物。
3.5多重PCR的临床验证 
多重RT-PCR的反应体系包括：25微升2×One Step Buffer，2微升PrimeScriptTM One Step Enzyme Mix，浓度分别为500pmol/mL的PPV、PCV2、PRRSV、JEV正反引物各1.0微升，浓度分别为500pmol/mL的PRV和CSFV正反引物各1.5微升，提取的浓度为5.8ng/微升样本DNA/RNA混合物7微升，DEPC水加至50微升。
反应条件：50℃，40min反应一次，94℃变性5min，按94℃变性30s、56.4℃复性30s、72℃延伸30s；进行35次循环，最后72℃延伸10min。
多重RT-PCR检测103份临床样本，结果表明PCV2的阳性率85.4％(88/103)PCV2和PRRSV混合感染阳性率52.4％(54/103)，PPV、PCV2、PRRSV混合感染阳性率5/103，CSFV感染的阳性率为4.8％(5/103)，见表2。
表2.猪不同样本经多重RT-PCR检测和玻片ELISA检测确证检测结果
单一PCR/多重RT-PCR检测确证含PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV、JEV的病毒冻干液，复溶用于本发明。玻片ELISA法检测5种病毒，玻片在显微镜下具有玫瑰色到棕红色凝聚物，为阳性信号，病毒阴性或抗体阴性对照显微镜下没有观察到有颜色的凝聚物。对PRRSV病毒，重复26次玻片LEISA，显微镜下观察到 玫瑰红或棕红的凝聚物，PRV、PPV、PCV2、CSFV、JEV病毒进行20次玻片LEISA，在显微镜下观察到玫瑰红或棕红的凝聚物。
PRRSV半定量结果显示每个视野的阳性信号与PRRSV对应，对应关系为视野中有2个阳性信号，对应10TCID50的病毒；5个阳性信号对应102TCID50病毒；9个阳性信号对应103TCID50病毒；17个阳性信号对应104TCID50病毒；39个阳性信号对应105TCID50病毒。玻片ELISA和RT-PCR最小可检测到PRRSV病毒含10TCID50单位的稀释液。含10TCID50单位PRRSV阳性稀释液10倍稀释，多重PCR可检出102稀释液阳性；玻片ELISA可检出100稀释液阳性，灵敏度低于多重100倍。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种用于同时检测或诊断猪多种病毒感染的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中包括分别用于猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)检测的特异性引物对，其中，用于猪伪狂犬病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示，用于猪细小病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示，用于猪圆环病毒2型检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示，用于猪繁殖与呼吸综合症病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.8所示，用于猪瘟病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.10所示，用于猪乙型脑炎病毒检测的特异性引物对序列如SEQ ID NO.11以及SEQ ID NO.12所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中还包括反应混合液，逆转录酶和Taq DNA多聚酶混合液以及不含RNase的双蒸水。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于用于同时检测或诊断猪多种病毒感染时，多重RT-PCR的反应体系包括：25微升2×One Step Buffer，2微升PrimeScriptTM One Step Enzyme Mix，浓度分别为500pmol/mL的PPV、PCV2、PRRSV、JEV正反引物各1.0微升，浓度分别为500pmol/mL的PRV和CSFV正反引物各1.5微升，浓度为1-10ng/微升样本DNA/RNA提取混合物5-8微升，DEPC水加至50微升。
反应条件：50℃，40min反应一次，94℃变性5min，按94℃变性30s、56.4℃复性30s、72℃延伸30s，进行35次循环，最后72℃延伸10min。
4.权利要求1-3任一项所述的试剂盒在制备同时检测或诊断猪多种病毒感染试剂中的应用，所述的猪多种病毒包括猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、经典猪瘟病毒(CSFV)以及猪乙型脑炎病毒(JEV)。
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105420412A (zh) * 2015-12-31 2016-03-23 河南农业大学 猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重rt-pcr检测引物及检测方法
CN105483291A (zh) * 2015-12-31 2016-04-13 河南农业大学 猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重rt-pcr检测引物
CN106957925A (zh) * 2017-04-14 2017-07-18 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种能同时检测和鉴别伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的检测试剂盒及引物和探针
CN107385115A (zh) * 2017-08-28 2017-11-24 黑龙江珍宝岛药业股份有限公司 一种检测病毒的引物组合及应用、试剂盒
CN107988435A (zh) * 2018-01-05 2018-05-04 青岛农业大学 一种检测pcv2、prv、prrsv的多重pcr引物组
CN107988436A (zh) * 2018-01-09 2018-05-04 河南牧业经济学院 一种检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的pcr体系及检测方法
CN108754027A (zh) * 2018-06-21 2018-11-06 河南牧业经济学院 一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备及其应用方法
CN108753936A (zh) * 2018-06-21 2018-11-06 河南牧业经济学院 一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重pcr体系及检测方法
CN109468416A (zh) * 2018-12-29 2019-03-15 博奥生物集团有限公司 特异检测猪流感病毒的rt-lamp检测引物及其应用、检测试剂和方法
CN111088396A (zh) * 2019-11-14 2020-05-01 河南科技学院 一种同时检测副猪嗜血杆菌、猪细小病毒、猪圆环病毒2型的三重实时荧光pcr方法
CN113186355A (zh) * 2021-05-28 2021-07-30 宜宾职业技术学院 一种采用二联pcr检测猪ppv、jev的试剂及方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101260442A (zh) * 2007-03-09 2008-09-10 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量pcr方法
CN102071259A (zh) * 2009-11-25 2011-05-25 河南农业大学 猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重实时荧光pcr检测引物及方法
CN102605099A (zh) * 2011-12-31 2012-07-25 北京农学院 一种猪病毒基因芯片及其检测方法
CN103397109A (zh) * 2013-08-14 2013-11-20 曲哲会 猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒多重rt-pcr检测引物及试剂
CN104328223A (zh) * 2014-11-26 2015-02-04 哈药集团生物疫苗有限公司 同时检测四种猪rna病毒的rt-pcr引物组及试剂盒
CN104328218A (zh) * 2014-10-30 2015-02-04 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 同步检测五种猪病毒的液相基因芯片的核酸及其检测方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101260442A (zh) * 2007-03-09 2008-09-10 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量pcr方法
CN102071259A (zh) * 2009-11-25 2011-05-25 河南农业大学 猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重实时荧光pcr检测引物及方法
CN102605099A (zh) * 2011-12-31 2012-07-25 北京农学院 一种猪病毒基因芯片及其检测方法
CN103397109A (zh) * 2013-08-14 2013-11-20 曲哲会 猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒多重rt-pcr检测引物及试剂
CN104328218A (zh) * 2014-10-30 2015-02-04 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 同步检测五种猪病毒的液相基因芯片的核酸及其检测方法
CN104328223A (zh) * 2014-11-26 2015-02-04 哈药集团生物疫苗有限公司 同时检测四种猪rna病毒的rt-pcr引物组及试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘志杰等: "猪繁殖障碍病毒性疫病六重PCR检测方法的建立及应用", 《畜牧兽医学报》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105483291B (zh) * 2015-12-31 2018-11-23 河南农业大学 猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重rt-pcr检测引物
CN105483291A (zh) * 2015-12-31 2016-04-13 河南农业大学 猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒多重rt-pcr检测引物
CN105420412B (zh) * 2015-12-31 2018-09-04 河南农业大学 猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重rt-pcr检测引物及检测方法
CN105420412A (zh) * 2015-12-31 2016-03-23 河南农业大学 猪德尔塔冠状病毒和猪流行性腹泻病毒多重rt-pcr检测引物及检测方法
CN106957925A (zh) * 2017-04-14 2017-07-18 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种能同时检测和鉴别伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的检测试剂盒及引物和探针
CN107385115A (zh) * 2017-08-28 2017-11-24 黑龙江珍宝岛药业股份有限公司 一种检测病毒的引物组合及应用、试剂盒
CN107988435A (zh) * 2018-01-05 2018-05-04 青岛农业大学 一种检测pcv2、prv、prrsv的多重pcr引物组
CN107988436A (zh) * 2018-01-09 2018-05-04 河南牧业经济学院 一种检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的pcr体系及检测方法
CN108754027A (zh) * 2018-06-21 2018-11-06 河南牧业经济学院 一种用于检测猪五种繁殖障碍性病毒病基因芯片的制备及其应用方法
CN108753936A (zh) * 2018-06-21 2018-11-06 河南牧业经济学院 一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重pcr体系及检测方法
CN109468416A (zh) * 2018-12-29 2019-03-15 博奥生物集团有限公司 特异检测猪流感病毒的rt-lamp检测引物及其应用、检测试剂和方法
CN111088396A (zh) * 2019-11-14 2020-05-01 河南科技学院 一种同时检测副猪嗜血杆菌、猪细小病毒、猪圆环病毒2型的三重实时荧光pcr方法
CN113186355A (zh) * 2021-05-28 2021-07-30 宜宾职业技术学院 一种采用二联pcr检测猪ppv、jev的试剂及方法

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