CN107287350A - 一种检测猪圆环病毒3型的引物、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪圆环病毒3型的特异性检测引物、试剂盒及方法，所述引物如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示，所述方法是以所述检测引物对待检基因组DNA模板进行PCR扩增，扩增产物进行电泳鉴定，紫外灯下观察，阳性结果则出现特异性扩增条带，阴性结果则无条带出现。本发明的猪圆环病毒3型检测引物可以特异性地扩增猪圆环病毒3型，对其他常见病原无反应；方法敏感性高，特异性强，操作简单、实用，可用于猪圆环病毒3型的检测和流行病学调查，利于快速制定针对性的防控措施。

Description

一种检测猪圆环病毒3型的引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于动物病毒学及分子生物学技术领域，具体涉及一种检测猪圆环病毒3型的引物、试剂盒及方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circoviruses，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是目前发现的最小的无囊膜单股环状DNA病毒，基因组大小约为1.7kb。目前，已经确定有两种类型的PCV，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在PK细胞培养物中作为一种污染物被鉴定，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，其在临床条件下能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated diseases，PCVAD)。主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，肺炎，猪皮炎肾病综合症和繁殖障碍，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，对全世界生猪养殖造成了重大的经济损失。

最近，美国学者对疑似猪皮炎肾病综合征症状的病料样本检测时，常见的PCV2、PRV、PRRSV、CSFV等病原均未检测到。随后对其做宏基因组学分析，其中发现了一种新的病毒，由于其遗传结构与圆环病毒属非常相似，且其capsid蛋白的氨基酸序列与其他圆环病毒的同源性小于70％。他们提出了其属于新型猪圆环病毒，即猪圆环病毒3型(Porcinecircovirus 3,PCV3)(Palinski R,P,Shang P et al,2016.A Novel PorcineCircovirus Distantly Related to Known Circoviruses Is Associated with PorcineDermatitis and Nephropathy Syndrome and Reproductive Failure.J Virol,91(1).DOI:10.1128/JVI.01879-16)。随后，国内也报道了PCV3的出现(Shen H,Liu X,Zhang Pet al,2017.Genome characterization of a porcine circovirus type 3in SouthChina.Transbound Emerg Dis.DOI:10.1111/tbed.12639)。研究表明，PCV3能引起猪的皮炎肾病综合症、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应(Phan TG,Giannitti F,Rossow S etal,2016.Detection of a novel circovirus PCV3in pigs with cardiac and multi-systemic inflammation.Virol J,13(1):184.DOI:10.1186/s12985-016-0642-z)。而在上述报道病例中，常见的PCV2、PRV、PRRSV、CSFV等病原均未检测到，表明PCV3是一种重要的病原，需要我们值得警惕。

目前，国内尚无针对该病毒的特异性PCR检测方法，国外采用PCR方法对该病毒进行检测，但国外文献报道的是验证性引物，不是专门设计的检测性引物，运用国外的验证性引物方法对临床样品进行检测时常出现非特异性扩增条带，影响检测准确性，目前报道的PCV3检测方法有病毒分离鉴定和荧光定量PCR(Palinski R,P,Shang P et al,2016.A Novel Porcine Circovirus Distantly Related to Known Circoviruses IsAssociated with Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome and ReproductiveFailure.J Virol,91(1).DOI:10.1128/JVI.01879-16)。虽然病毒分离培养是鉴定PCV3的金标准，但由于病毒分离麻烦繁琐，需要专业人员操作、耗时较长、成本高；荧光定量PCR特异性强、灵敏度高，但荧光定量PCR仪器昂贵，探针合成周期长，检测成本高、不能观测到扩增产物大小等问题。对于基层实验室，需要进行疫病的早期初步诊断及流行病学调查，检测特异性好、周期短、操作简单的检测手段会更为实用。

可见，现有技术还需要改善。

发明内容

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种猪圆环病毒3型特异性检测引物、试剂盒及方法，可特异性地扩增猪圆环病毒3型，快速对临床样品进行检测、鉴别。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种检测猪圆环病毒3型(PCV3)的特异性引物，核苷酸序列如下：

上游引物：5’-CAAACTTCTTTCGTGCCGTA-3’(SEQ ID No:1)；

下游引物：5’-CATTACCCGCCTAAACGAG-3’(SEQ ID No:2)。

一种检测猪圆环病毒3型(PCV3)的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测猪圆环病毒3型的特异性引物。

一种检测猪圆环病毒3型的方法包括以下步骤：

(1)待检样本基因组DNA的提取；

(2)利用所述的特异性引物，PCR扩增步骤(1)中的样本基因组DNA；

(3)取步骤(2)中PCR反应产物进行电泳鉴定；

(4)结果判定。

进一步的，所述步骤(2)中PCR反应体系为：

Premix EX Taq	12.5μL
		SEQ ID No:1	0.5μL
SEQ ID No:2	0.5μL
		模板	2μL
灭菌蒸馏水	加至25μL

进一步的，所述步骤(2)中PCR扩增反应条件为：

进一步的，所述步骤(1)中的样本包括血清、肺脏、扁桃体和淋巴结样本。

本发明有益效果：

1、本发明提供了一对PCR引物，可以特异性地扩增猪圆环病毒3型，对其他常见病原如猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、日本脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒无反应。

2、本发明的检测猪圆环病毒3型的方法敏感性高，特异性强，操作简单、成本低、实用，可用于猪圆环病毒3型的检测和流行病学调查，利于快速制定针对性的防控措施。且目前国内尚无针对该病毒的特异性好、快速高效的普通PCR检测方法。

附图说明

图1为本发明的样本PCR扩增电泳结果。其中泳道1为阳性血清样本，泳道2为阴性对照。

图2为本发明的PCR特异性试验结果。其中泳道1为血清阳性样本，泳道2-8分别为猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、日本脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒，泳道9为阴性对照。

图3为本发明的PCR敏感性试验结果。其中泳道1-7代表的DNA浓度分别为1.72μg/μL、172ng/μL、17.2ng/μL、1.72ng/μL、172fg/μL、17.2fg/μL、1.72fg/μL。

图4为实施例1检测结果。其中泳道1为猪阳性血清样品，泳道2为猪肺脏样本1，泳道3为猪扁桃体样本2，泳道4猪淋巴结样本3，泳道5为阴性对照。

具体实施方式

为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。

以下实施例中涉及的实验材料如无特殊说明，均来源于市售，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。

实施例1一种检测猪圆环病毒3型的引物和方法

1、一种猪圆环病毒3型的PCR检测引物

对NCBI登陆的猪圆环病毒3型毒株cap基因序列(登录号：KY354038、KY354039、KX458235、NC-031753、KX778720和KX966193)比对分析，cap基因编码PCV3的核衣壳蛋白，是决定PCV3免疫原性的基因，它是对PCV3病原进行PCR检测的首选分子基因，通过Oligo7软件设计了以下PCR特异性引物：

上游引物：5’-CAAACTTCTTTCGTGCCGTA-3’(SEQ ID No:1)；

下游引物：5’-CATTACCCGCCTAAACGAG-3’(SEQ ID No:2)。

使用上述引物可特异性的扩增猪圆环病毒3型。

2、一种猪圆环病毒3型的PCR检测方法

(1)待检样本基因组DNA的提取：200μL阳性血清和临床3份各100mg病料(病料1为肺脏样本，病料2为扁桃体样本，病料3为淋巴结样本)样本作为待检样本，分别进行以下操作：

病料样本加入1mL PBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清液200μL，用AXYGEN AxyPep^TM Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep kit进行DNA抽提，抽提按照试剂盒说明书进行，最后加40μL的TE进行洗脱，洗脱后的DNA放于-20℃保存。

所述阳性血清样本测序结果为：

(2)将含有上述提取的样本基因组DNA的PCR反应体系置于PCR管内进行PCR扩增。

其中PCR反应体系为：

Premix EX Taq	12.5μL
		SEQ ID No:1(20pmol/μl)	0.5μL
SEQ ID No:2(20pmol/μl)	0.5μL
		样本基因组DNA	2μL
灭菌蒸馏水	加至25μL

(3)将步骤(2)的PCR管置于PCR仪上进行扩增反应。

其中扩增反应条件为：

(4)分别取10μL PCR反应产物在2％(质量比)的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。

(5)结果判定：

如果扩增出的片段大小在426bp左右则为阳性，无条带则为阴性。电泳图见图4，检测结果见表1。

表1待检样本检测结果

待检样本	结果判定
		阳性血清样本	阳性
病料样本1	阳性
		病料样本2	阳性
病料样本3	阳性

实施例2特异性检验

以阳性血清样本DNA作为阳性对照，以无菌蒸馏水为阴性对照，分别按实施例1步骤(2)、(3)进行扩增，按步骤(4)方法做电泳鉴定，结果如图1所示。

以检测阳性的血清样本作为阳性对照，对猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、日本脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒进行特异性检测，使用实施例1的方法与引物，结果除阳性对照在426bp处有条带，其他均无条带(见图2)。

实施例3敏感性检验

将实施例1中血清样本提取的基因组DNA用灭菌蒸馏水做10倍的梯度稀释，DNA含量分别为1.72μg/μL、172ng/μL、17.2ng/μL、1.72ng/μL、172fg/μL、17.2fg/μL、1.72fg/μL作为模板，每个稀释度各取2μL作为模板，按实施例1方法进行检测和电泳鉴定，观察阳性条带，以出现阳性预期条带所用模板量的最高稀释度计算其敏感性，结果表明最小检出量为3.44fg(见图3)。

目前报道的PCV3检测方法有病毒分离鉴定和荧光定量PCR。但由于病毒分离麻烦繁琐，需要专业人员操作、耗时较长、成本高，及荧光定量PCR仪器昂贵，探针合成周期长，检测成本高、不能观测到扩增产物大小等问题。与这些相比，本检发明的测方法操作简单、技术要求低、成本低和检测引物特异性好、灵敏度高等优点，适合于在基层实验室应用推广，可用于PCV3的临床检测及流行病学调查。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

<110> 广东温氏食品集团股份有限公司

<120> 一种检测猪圆环病毒3型的引物、试剂盒及方法

<160> 2

<170> Oligo7

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caaacttctt tcgtgccgta 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cattacccgc ctaaacgag 19

Claims (6)

1.一种检测猪圆环病毒3型的特异性引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQID No:1和SEQ ID No:2所示。

2.一种检测猪圆环病毒3型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测猪圆环病毒3型的特异性引物。

3.一种检测猪圆环病毒3型的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)待检样本基因组DNA的提取；

(2)利用权利要求1所述的特异性引物，PCR扩增步骤(1)中的样本基因组DNA；

(3)取步骤(2)中PCR反应产物进行电泳鉴定；

(4)结果判定。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR反应体系为：

Premix EX Taq 12.5μL SEQ ID No:1 0.5μL SEQ ID No:2 0.5μL 模板DNA 2μL 灭菌蒸馏水 加至25μL

5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增反应条件为：

6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的样本包括血清、肺脏、扁桃体和淋巴结样本。