CN107937616A - 检测pcv3的lamp引物组合物及其试剂盒与方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测PCV3的LAMP引物组合物及其试剂盒与方法；旨在提供一种灵敏度高，特异性强的PCV3检测引物和方法，其技术方案包括由正向内引物PCV3‑FIP、反向内引物PCV3‑BIP、正向外引物PCV3‑F3、反向外引物PCV3‑B3、正向环引物PCV3‑LF组成；检测方法为：1)从样品中提取病毒的RNA；2)以提取的RNA为模板，利用权利要求1)中所述的检测PCV3的LAMP引物组合物，建立LAMP扩增体系，在60℃‑65℃恒温条件下进行环介导等温扩增；3)利用deaou‑308c恒温荧光检测仪检测；属于生物检测技术领域。

Description

检测PCV3的LAMP引物组合物及其试剂盒与方法
技术领域
本发明公开了一种引物组合物，具体地说，是一种检测PCV3的LAMP引物组合物，本发明还公开了检测PCV3的试剂盒和方法；属于生物检测技术领域。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)为一种共价闭合、单股环状DNA病毒，是迄今发现最小动物病毒。2016年前，全球范围内仅发现PCV1和PCV2两个基因型，2015年6月，美国北卡罗来纳州某商品化猪场暴发PDNS疫情，与历史平均值相比，该猪场母猪死亡率升高10.2％、受孕率下降0.6％。患病母猪厌食、皮肤呈现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，所产胎儿(包括弱胎、死胎、木乃伊胎)具有相似临床症状。Palinski等借助新一代测序(NGS)技术，从患病母猪及流产胎儿体内首次鉴定出一种新病毒，该病毒与圆环病毒科病毒具有类似基因组结构和遗传相似性，但与其他圆环病毒衣壳蛋白氨基酸序列同源性低于70％，根据国际病毒分类委员会(ICTV)圆环病毒分类标准，将其归类为一种新型圆环病毒，命名为PCV3。目前常用的检测方法为普通PCR或荧光定量PCR方法，普通PCR和荧光定量PCR方法均需要核酸扩增仪来完成，不适用于现地检测。
发明内容
针对上述问题，本发明的第一个目的是提供一种检测PCV3的LAMP引物组合物；本发明的第二个目的是提供含上述引物的试剂盒；本发明的第三个目的是提供一种灵敏度高的检测PCV3的方法。
为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：
一种检测PCV3的LAMP引物组合物，包括由正向内引物PCV3-FIP、反向内引物PCV3-BIP、正向外引物PCV3-F3、反向外引物PCV3-B3、正向环引物PCV3-LF和反向环引物PCV3-LB组成；
引物PCV3-F3核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
引物PCV3-B3核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
引物PCV3-FIP核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
引物PCV3-BIP核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
引物PCV3-LB核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明提供的第二个技术方案是提供一种检测PCV3的试剂盒，该试剂盒金含LAMP引物组合物。
本发明提供的后一个技术方案是一种检测PCV3的方法，依次包括下述步骤：
1)从样品中提取病毒的RNA；
2)以提取的RNA为模板，利用权利要求1)中所述的检测PCV3的LAMP引物组合物，建立LAMP扩增体系，在60℃-65℃恒温条件下进行环介导等温扩增；
3)利用deaou-308c恒温荧光检测仪检测。
进一步的，上述的一种检测PCV3的方法，所述LAMP反应液为：总体积为25μL，反应缓冲液2.5μL；MgSO41.5μL；dNTP Mix 3.5μL；Primer mix 1μL；甜菜碱4μL；RNA 2.0μL；Bst2.0DNA聚合酶1μL；荧光染料0.5μL。
进一步的，上述的一种检测PCV3的方法，所述的MgSO4浓度为100mM，dNTP Mix浓度为10mM；甜菜碱浓度为5M；逆转录酶浓度为1U/μL；荧光染料浓度为5mM。
进一步的，上述的一种检测PCV3的方法，所述LAMP扩增为在63℃扩增1h。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：
1、本发明提供的技术方案采用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalampli-fication,LAMP)技术，依赖于能够识别靶序列上5个特异区域的引物和一种具解旋功能且使靶序列呈环介导等温扩增的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、特异地扩增靶序列。
2、本发明提供的技术方案采用LAMP扩增方式为环介导等温扩增，扩增效率高，由于LAMP识别的是核酸上的5个特异性的位点，所以其特异性强。
3、本发明提供的技术方案LAMP只在60℃-65℃进行恒温扩增，过程只需水浴锅即可，也不需要特殊的仪器，因此非常简便；且由于LAMP是恒温扩增，不需要反转录步骤及PCR仪升降温的时间，所以扩增时间短。
4、本发明提供的技术方案LAMP反应中加入荧光物质后，合成大量的DNA时，在荧光恒温扩增仪器上可以看到扩增曲线，扩增过程一目了然。
5、本发明提供的技术方案设计特异性引物，多病毒验证此方法的特异性，对LAMP技术检测值与RT-PCR检测值进行了比较，检验了其重复性与稳定性，建立了适用于现场检测测PCV3的快速检测方法。
附图说明
图1是本申请提供的技术方案特异性检测结果曲线图；
图2是本申请提供的技术方案特灵敏度检测结果曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，对于本申请为详细披露的信息，均按照本领域常规技术手段进行。
实施例1
本发明提供的一种检测PCV3的LAMP引物组合物，包括由正向内引物PCV3-FIP、反向内引物PCV3-BIP、正向外引物PCV3-F3、反向外引物PCV3-B3、正向环引物PCV3-LF和反向环引物PCV3-LB组成；
引物PCV3-F3核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
引物PCV3-B3核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
引物PCV3-FIP核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
引物PCV3-BIP核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
引物PCV3-LB核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
实施例2
本发明提供的一种检测PCV3的的试剂盒，该试剂盒含实施例1所述的LAMP引物组合物。
实施例3
本发明提供的一种检测PCV3的方法，所使用的材料如下：
DNA/RNA核酸抽提试剂盒TGUide Virus DNA/RNA Kit试剂盒(货号#Q5724天根生化科技有限公司)
核酸自动提取仪T-Guide OSE-M48(天根生化科技有限公司)
恒温荧光检测仪DEAOU-308C(广州迪澳生物科技有限公司)
Bst2.0聚合酶Bst 2.0(WarmStart DNA Polymerase货号#M5038L NEW ENGLANGBioLaBs公司)
100mM的硫酸镁溶液100mM(MgSO4solution货号#B1003S NEW ENGLANG BioLaBs公司)
10×反应缓冲液Isothermal Amplification Buffer(货号#B0537S NEW ENGLANGBioLaBs公司)，组分：20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，50mM KCl，0.1％Tween20，pH 8.8@25℃。
dNTP Mix(货号D7373碧云天生物技术公司)
甜菜碱(货号BCBS087V SIGMA公司)
SYTO 9荧光染料(SYTOTM9green fluorescent nucleic acid stain，货号S34854invitrogen公司)
一步法反转录PCR试剂盒PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒(货号#RR055A TAKARA公司)
一步法荧光定量PCR试剂盒One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect RealTime)试剂盒(货号#RR064A TAKARA公司)
RNA病毒
使用总核酸提取试剂盒(TGuide virusDNA/RNA Kit)，利用全自动核酸抽取机对接了PCV3的细胞上清液，用细胞培养的VSV、FMDV、SVDV的细胞液进行核酸抽取，抽取完放-20℃保存。
LAMP检测方法包括下述步骤：
1)设计引物
从NCBI下载50条PCV3的全基因序列，进行比对，挑选出相对保守序列(登录号:DQ641257.1)用lamp引物设计在线网站：http://primerexplorer.jp/e/设计引物，Lamp引物：
2)取步骤1)提取的RNA加入到LAMP反应液中混合，建立扩增体系，在63℃恒温条件下进行环介导等温扩增，扩增结束后在80℃灭活酶活性20min；
所述的LAMP反应液为：
3)利用deaou-308c恒温荧光检测仪检测，参数设置：时间60min检测间隔30s温度63℃阀值设置3-6min方差倍数10。
为了证明本申请提供的方案的优点，下面给出本申请提供的方法特异性检测、灵敏度检测和重复性检测实验。
1)特异性检测
PCV3特异性，用做PCV3、PCV2、PRS、FMDV、PEDV、CSFV、PRRSV做阴性核酸对照，并做空白对照，做一个重复，结果见图1。
2)灵敏度检测
用lamp外引物扩增片段，连接T载体，转化DH5a，扩增提质粒。浓度为229.13μg/μL。计算出拷贝数为7.32*1010，进行十倍稀释，用7.32*105、7.32*104、7.32*103、7.32*102、7.32*10、7.32*1并用ddH2O做空白对照，做一个重复，做-LAMP灵敏度测试，检测结果见图2。
3)重复性检测
对21个疑似患有pcv3的样品用PCR、荧光定量PCR、LAMP分别检测。
PCR(引用中国预防兽医学报Vol.39，No.9Sep.2017猪圆环病毒3型PC R检测方法的建立及应用徐朋丽等)
4)荧光定量PCR(引用Journal ofVirological MethodsVolume 248,October2017,Pages 177-180Development ofa TaqMan-based real-time PCR assay for thespecific detection of porcine circovirus 3Author JianchangWanga1)检测结果见表1。
表1
样品 PCR qPCR LAMP
1
2 + + +
3 + + +
4 + + +
5 + + +
6 + + +
7 + + +
8
9 + + +
10 + + +
11 + + +
12 + + +
13
14 + + +
15 + + +
16 + + +
17 + + +
18 + + +
通过上述的特异性引物，多病毒验证此方法的特异性，对LAMP技术检测值与RT-PCR检测值进行了比较，检验了本申请提供的技术方案的重复性与稳定性，说明本申请提供的技术方案建立了适用于现场检测测PCV3的快速检测方法。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州维佰生物科技有限公司
<120> 检测PCV3的LAMP引物组合物及其试剂盒与方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3(Porcine circovirus)
<400> 1
gcagtgctcc ccattgaac 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3(Porcine circovirus)
<400> 2
acacttggct ccaagacga 19
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3(Porcine circovirus)
<400> 3
gaactaccag cgctcaccca gggtggggtc atatgtgttg a 41
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3(Porcine circovirus)
<400> 4
tgggggtgaa gtaacggctg ttgcggaaag ttccactcgt a 41
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3(Porcine circovirus)
<400> 5
tttctccaga cccaccccat g 21

Claims (6)

1.一种检测PCV3的的LAMP引物组合物，其特征在于，包括由正向内引物PCV3-FIP、反向内引物PCV3-BIP、正向外引物PCV3-F3、反向外引物PCV3-B3、反向环引物PCV3-LB组成；各引物核苷酸序列如下所示：
引物PCV3-B3核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
引物PCV3-F3核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
引物PCV3-FIP核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
引物PCV3-BIP核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
引物PCV3-LB核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2.一种检测PCV3的试剂盒，其特征在于，含权利要求1所述的LAMP引物组合物。
3.一种检测PCV3的LAMP方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
1)从样品中提取病毒的RNA；
2)以提取的RNA为模板，利用权利要求1)中所述的检测PCV3的LAMP引物组合物，建立LAMP扩增体系，在60℃-65℃恒温条件下进行环介导等温扩增；
3)利用deaou-308c恒温荧光检测仪检测。
4.根据权利要求3所述的一种检测PCV3的方法，其特征在于，所述LAMP反应液为：总体积为25μL，反应缓冲液2.5μL；MgSO41.5μL；dNTP Mix 3.5μL；Primer mix 1μL；甜菜碱4μL；RNA 2.0μL；Bst 2.0DNA聚合酶1μL；荧光染料0.5μL。
5.根据权利要求3所述的一种检测PCV3的方法，其特征在于，所述的MgSO4浓度为100mM，dNTP Mix浓度为10mM；甜菜碱浓度为5M；逆转录酶浓度为1U/μL；荧光染料浓度为5mM。
6.根据权利要求3所述的一种检测PCV3的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增程序为63℃扩增1h。
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