CN110423846A - 一种能区分猪圆环病毒2型和3型的分型检测的lamp的引物组合、检测方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种能区分猪圆环病毒2型和3型的分型检测的LAMP的引物组合、检测方法及试剂盒。本发明所述引物组合能分别检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型，并且与猪其它病毒(如圆环病毒1型、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、高致病猪蓝耳病毒等)无交叉反应。本发明在LAMP反应体系中加入荧光染料，可实现一步法检测猪圆环病毒2型和/或3型，结合荧光定量实现全程实时监控，1小时之内即可出结果，检测灵敏度可以达到100拷贝/μL。本发明所述检测方法既具有简便、快速、灵敏、特异的优势，又避免了人为判定引起的误差以及开盖引起的环境污染。

Description

一种能区分猪圆环病毒2型和3型的分型检测的LAMP的引物组 合、检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能区分猪圆环病毒2型和3型的分型检测的LAMP的引物组合、检测方法及试剂盒，用于检测区分猪圆环病毒2型和3型。
背景技术
猪圆环病毒(PCV，Porcine circovirus)在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属的成员，属于单股环状DNA病毒，是迄今发现的最小的动物病毒之一。最早根据PCV的致病性、核酸序列和抗原性，可将PCV分为两个血清型，即PCV1和PCV2，两者在核苷酸序列上约有80％的同源性，PCV1无致病性，PCV2则是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、皮炎与肾病综合征(PNDS)的主要病原。2016年在美国首次发现了PCV3病毒，其capsid蛋白氨基酸序列与其它圆环病毒同源性小于70％。随后在中国也发现了PCV3病毒。研究表明PCV3也能引起猪的皮炎与肾病综合征(PNDS)、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。猪是圆环病毒的主要宿主，各种年龄的猪对圆环病毒均有较强易感性。胚胎期或出生后早期感染的猪，往往在断奶后才发病，一般集中在5周龄-18周龄，尤其在6周龄-12周龄最多见。圆环病毒3型(PCV3)引起的感染尤为严重，可造成严重的繁殖障碍，导致母猪发情率增加、产木乃伊胎、流产以及死产和产弱仔等，给养猪业带来严重威胁和巨大的经济损失。因此，感染的早期诊断和病猪的淘汰成为PMWS防治的重点。开发出一种检测区分猪圆环病毒2型和3型的快速检测方法，对于疫情的防范控制具有重要意义。
检测猪圆环病毒常用方法有：酶联免疫吸附反应(ELISA)、定性PCR技术、实时荧光定量PCR技术和环介导等温扩增技术(LAMP)。ELISA灵敏度较高，但检测结果可能包括假阳性。定性PCR技术成本低、易于操作，但灵敏度比较低，且由于其扩增产物需通过凝胶电泳分析一次，极易产生污染。实时荧光定量PCR技术虽有高灵敏度、高特异性等特点，但该实验对检测人员要求较高且实验操作步骤需要频繁的进行升温和降温过程，光检测耗时至少需要1h以上。
环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。LAMP针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。因此LAMP技术的核心之一是引物设计，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素，需要经过多次的引物筛选和验证才能找到与反应体系相适应的高效、特异、灵敏的LAMP引物组合。而且目前多数建立的LAMP反应方法需要琼脂糖凝胶电泳或者需要开盖后加入显色剂，这样容易造成实验室污染或导致假阳性结果出现。此外LAMP方法用于直接观察的显色法大多数是反应结束后开盖加入荧光染料进行显色反应，观察是否有显色来判读试验结果，这样既造成气溶胶污染并且无法区分特异性扩增与非特异性扩增，因此增加了假阳性诊断结果的机率；而且对于弱阳性反应，通过人为肉眼判读的方式很可能误判为阴性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中的存在的问题，提供一种速度快、灵敏度高、特异性强的猪圆环病毒2型和3型的环介导等温扩增的引物组合、检测方法及试剂盒。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种能区分猪圆环病毒2型和3型的分型检测的LAMP的引物组合，包括引物组1和引物组2，所述引物组1包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的2个外引物、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的2个内引物、以及SEQ ID NO.5所示的1个环引物，所述引物组2包括SEQID NO.6和SEQ ID NO.7所示的2个外引物、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的2个内引物、以及SEQ ID NO.10所示的1个环引物。
所述引物组1为猪圆环2型病毒的环介导等温扩增用引物组，具体如下(5’→3’)：
外引物PCV2-F3：5’-ATTGTTCTGTAGCATTCTTCC-3’(SEQ ID NO.1)
外引物PCV2-B3：5’-TGACTTTTATGGCTGGCTG-3’(SEQ ID NO.2)
内引物PCV2-FIP：5’-CGTTGGAATGGTACTCCTCAACTAAGTAATCCTCCGATAGAGAGCT-3’(SEQ ID NO.3)
内引物PCV2-BIP：5’-AACGGGGTCTGATTGCTGGTAATCTGTGATCGATATCCATTGACT-3’(SEQ ID NO.4)
环引物PCV2-LB：5’-GGCCAAAAAAGGTACAGTTCCACC-3’(SEQ ID NO.5)
所述引物组2为猪圆环3型病毒的环介导等温扩增用引物组，具体如下(5’→3’)：
外引物PCV3-F3：5’-GCGGAAAGTTCCACTCGTAA-3’(SEQ ID NO.6)
外引物PCV3-B3：5’-CCGGGACATAAATGCTCCAA-3’(SEQ ID NO.7)
内引物PCV3-FIP：5’-GGTGAGCGCTGGTAGTTCCCAAAAACACAGCCGTTACTTCAC-3’(SEQID NO.8)
内引物PCV3-BIP：5’-TCTTTTTCTCCAGACCCACCCCAGCAGTGCTCCCCATTGAAC-3’(SEQID NO.9)
环引物PCV3-LB：5’-TGGCTCAACACATATGACCC-3’(SEQ ID NO.10)。
本发明还提供了一种能区分猪圆环病毒2型和3型的分型检测的LAMP的试剂盒，包括上述的引物组合，其中所述引物组合中各引物均独立包装。
作为优选，本发明所述的试剂盒还包括含有荧光染料的反应液和/或灭菌纯水。
在一些实施方案中，所述反应液为博奥生物集团有限公司的产品，产品目录号为CP.440020。所述反应液中包含荧光染料。
进一步的，本发明所述的试剂盒中所述引物组合中的各引物组中的2个外引物的摩尔数相同，2个内引物的摩尔数相同，各引物组中的外引物:内引物:环引物的摩尔比为(0.58-0.62)：(4.6-5.0)：(0.9-1.1)。如引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP和引物LB的摩尔比为(0.29-0.31)：(0.29-0.31):(2.3-2.5):(2.3-2.5)：(0.9-1.1)。
在一些实施方案中，各引物组中的外引物:内引物:环引物的摩尔比为0.6：4.8：1。
在一些具体实施例中，所述引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP和引物LB的摩尔比为0.3：0.3：2.4：2.4：1。
本发明还提供了一种能区分猪圆环病毒2型和3型的分型检测的LAMP的检测方法，使用上述的引物组合进行LAMP扩增，通过观察实时荧光PCR仪“S”型扩增曲线开始出现的时间判断检测结果。
其中，本发明所述的检测方法中所述LAMP扩增的反应体系为0.3mM的外引物各0.12μL、2.4mM的内引物各0.96μL、1mM的环引物0.4μL、2×含有荧光染料的反应液10μL、2μL的待测样品DNA，加灭菌纯水补至20μL。在一些实施方案中，所述反应体系为0.3mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1mM的环引物LB各0.4μL；2×含有荧光染料的反应液10μL；2μL的待测样品DNA，加灭菌纯水补至20μL。
优选的，所述的检测方法中所述LAMP检测反应条件为60℃-65℃恒温50min。更优选为，所述LAMP检测反应条件为65℃恒温50min。
分别利用猪圆环病毒2型的Rep基因和猪圆环病毒3型cap基因的保守区段设计LAMP引物，发明内容涉及猪圆环病毒2型和3型的特异性引物组，和利用该引物组建立的检测方法。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种猪圆环病毒2型和3型的环介导等温扩增的引物组合、检测方法及试剂盒。本发明分别利用猪圆环病毒2型的Rep基因和猪圆环病毒3型cap基因的保守区段设计多套LAMP引物，最终筛选出特异性好，灵敏度高的猪圆环病毒2型和3型的环介导等温扩增的引物组合。所述引物组合能分别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)，并且与猪其它病毒(如圆环病毒1型(PCV1)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、高致病猪蓝耳病毒(HP-PRRSV)等)无交叉反应。本发明在LAMP反应体系中加入荧光染料，可实现一步法检测猪圆环病毒2型和/或3型，结合荧光定量实现全程实时监控，1小时之内即可出结果，检测灵敏度可以达到100拷贝/μL。本发明所述检测方法既具有简便、快速、灵敏、特异的优势，又避免了人为判定引起的误差以及开盖引起的环境污染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1-6分别为引物组PCV2-1—PCV2-6的扩增曲线；
图7-12分别为引物组PCV3-1—PCV3-6的扩增曲线；
图13为采用引物组PCV2-1特异性检测的扩增曲线；
图14为采用引物组PCV2-2特异性检测的扩增曲线；
图15为采用引物组PCV2-5特异性检测的扩增曲线；
图16为采用引物组PCV3-2特异性检测的扩增曲线；
图17为采用引物组PCV3-6特异性检测的扩增曲线；
图18采用引物组PCV2-1在基因组拷贝数为104、103检测时的扩增曲线；其中，E4为在基因组拷贝数为104检测时的扩增曲线，E3为在基因组拷贝数为103检测时的扩增曲线；
图19采用引物组PCV2-2在基因组拷贝数为104、103检测时的扩增曲线；其中，E4为在基因组拷贝数为104检测时的扩增曲线，E3为在基因组拷贝数为103检测时的扩增曲线；
图20采用引物组PCV3-2在基因组拷贝数为104、103检测时的扩增曲线；其中，E4为在基因组拷贝数为104检测时的扩增曲线，E3为在基因组拷贝数为103检测时的扩增曲线；
图21采用引物组PCV3-6在基因组拷贝数为104、103检测时的扩增曲线；其中，E4为在基因组拷贝数为104检测时的扩增曲线，E3为在基因组拷贝数为103检测时的扩增曲线；
图22-24分别为在基因组拷贝数103、102、101时采用引物组PCV2-1的扩增曲线；
图25-27分别为在基因组拷贝数103、102、101时采用引物组PCV3-2的扩增曲线。
具体实施方式
本发明公开了一种检测猪圆环病毒2型和3型的环介导等温扩增的引物组合、检测方法及检测试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的材料、试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。其中，含有荧光染料的反应液为博奥生物集团有限公司的产品，产品目录号为CP.440020。
猪瘟病毒石门株AV1411(04/08/87)和高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-JXA1)购自中国兽药监察所，猪流感病毒(VR-333TM)购自ATCC，猪伪狂犬病毒(BNCC 129649)、猪细小病毒(BNCC124946)和猪圆环病毒2型(BNCC128527)购自北纳生物BNCC。猪圆环病毒1型(PCV1 TJ0901株)和猪圆环病毒3型(PCV3TJ1701株)由北京农学院提供。
DNA拷贝数的计算方法如下：
1A260吸光度值＝dsDNA 50μg/ml；
核酸浓度＝(OD260)×(稀释倍数)×(50)＝x ng/μl；
平均分子量(MW)代表克/摩尔，单位道尔顿(dolton)，即1dolton＝1g/mol；
摩尔＝6.02×1023；
平均分子量(MW):dsDNA＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；
拷贝数计算公式:
(6.02×1023copies/摩尔)×(x ng/μl×10-9)/(DNA长度×660)＝copies/μl。
实施例1、引物组合的筛选制备
一、引物组合的筛选
1、所用引物序列由生工公司合成，针对猪圆环病毒2型Rep基因设计多组引物组合，针对猪圆环病毒3型cap基因设计多组引物组合，各组引物组序列如表1所示。
表1引物组序列
上述的引物组合中，各单链DNA均各自独立包装。
上述的引物组合中，引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB的摩尔比均为0.3：0.3：2.4：2.4：1：1。若引物组中缺少引物LF则用纯水代替。
2、以猪圆环病毒2型和3型检测基因质粒DNA为模板，分别采用步骤1制备的引物组对模板进行环介导等温扩增检测。
猪圆环病毒2型检测基因质粒：在pUC57质粒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)的SacI位点插入Genebank号为HQ113119.1、HQ113118.1、GU938302.1、KM460823.1压缩的保守序列的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为猪圆环病毒2型检测基因质粒。
猪圆环病毒3型检测基因质粒：在pUC57质粒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)的SacI位点插入Genebank号为KY354061.1、MF769811.1、MF374980.1、MF589110.1压缩的保守序列的DNA分子，得到重组质粒，该质粒即为猪圆环病毒3型检测基因质粒。
反应体系(20μL)：10μL含有荧光染料的反应液(博奥生物集团有限公司产品，产品目录号：CP.440020)、2.96μL引物混合物、2μL模板DNA(5pg-50pg)，补灭菌纯水至20μL。引物混合物即引物组合中的各条引物组成的混合物。反应体系中，0.3mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1mM的环引物LF和LB各0.4μL。若引物组中缺少引物LF则用纯水代替。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
每个反应体系设置3次重复。
如果在45min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在45min内没有出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
猪圆环病毒2型引物筛选实验结果：引物组1的检测结果如图1，引物组2的检测结果如图2，引物组合3如图3、引物组合4如图4、引物组合5如图5、引物组合6如图6。结果显示，引物组合1、2和5出峰时间短，三次检测重复性好。
猪圆环病毒3型引物筛选实验结果：引物组1的检测结果如图7，引物组2的检测结果如图8，引物组合3如图9，引物组合4如图10，引物组合5如图11，引物组合6如图12。结果显示，引物组合2和6出峰时间短，三次检测重复性好。
实施例2、特异性实验
所用样本如下：猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流感病毒(SIV)、高致病猪蓝耳病毒(HP-PRRSV)、猪细小病毒(PPV1)
各个待测样本分别进行如下步骤：
1、提取待测样本的基因组DNA或RNA。
2、以步骤1提取的基因组核酸为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组进行环介导等温扩增。
反应体系(20μL)：10μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，产品目录号：CP.440020)、2.96μL引物混合物、2μL基因组模板(5pg-50pg)，0.5μL AMV逆转录酶(模板为RNA时加入)，RNase-free water补水至20μL。引物混合物即引物组合中的各条引物组成的混合物。反应体系中，0.3mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1mM的环引物LF和LB各0.4μL。若引物组中缺少引物LF则用纯水代替。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号
采用引物组PCV2-1和引物组PCV2-2的结果见图13和图14，只有当待测样本为猪圆环病毒2型的基因组时显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。当待测样本为猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流感病毒(SIV)、高致病猪蓝耳病毒(HP-PRRSV)、猪细小病毒(PPV1)的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组PCV2-5结果见图15，当待测样本为猪圆环病毒3型(PCV3)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流感病毒(SIV)、高致病猪蓝耳病毒(HP-PRRSV)、猪细小病毒(PPV1)的时候均不显示阳性扩增曲线。但是当待测样本为猪圆环病毒2型和猪圆环病毒1型的基因组时，都有阳性扩增曲线，说明该套引物的特异性差，应舍弃。
采用引物组PCV3-2和引物组PCV3-6的结果见图16和图17，只有当待测样本为猪圆环病毒3型的基因组时显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)。当待测样本为猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流感病毒(SIV)、高致病猪蓝耳病毒(HP-PRRSV)、猪细小病毒(PPV1)的时候均不显示阳性扩增曲线。
实施例3、灵敏度初筛
待测样本：实施例1制备的猪圆环病毒2型和3型的质粒。
1、提取待测样本的质粒DNA，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。
2、以步骤1得到的稀释液为模板，采用实施例1和2筛选出的引物组合进行环介导等温扩增。
反应体系(20μL)：10μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，产品目录号：CP.440020)、2.96μL引物混合物、2μL模板稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数分别为104和103)，补水至20μL。引物混合物即引物组合中的各条引物组成的混合物。反应体系中，0.3mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1mM的环引物LF和LB各0.4μL。若引物组中缺少引物LF则用纯水代替。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
根据稀释液中基因组拷贝数的不同，共如下2个反应体系：
反应体系1：1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为104；
反应体系2：1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为103；
每个反应体系设置3次重复。
如果在45min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在45min内没有出现阳性扩增曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
引物组PCV2-1检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为104和103(图18)时，3个检测均可检测出来且重复性好，而引物组PCV2-2在基因拷贝数为104(图19)时3个检测可完全出峰且重复性较好，但基因拷贝数在103时，3个检测不可完全出峰且重复性较差，因此选择引物组PCV2-1进行灵敏度复筛。
引物组PCV3-2检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为104和103(图20)时，3个检测均可检测出来且重复性好，而引物组PCV3-6在基因拷贝数为104(图21)时3个检测可完全出峰且重复性较好，但基因拷贝数在103时，3个检测重复性较差，因此选择引物组PCV3-2进行灵敏度复筛。
实施例4、灵敏度复筛
待测样本：实施例1制备的猪圆环病毒2型和3型的质粒。
1、提取待测样本的质粒DNA，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。
2、以步骤1得到的稀释液为模板，采用最终筛选出的引物组合进行环介导等温扩增。
反应体系(20μL)：10μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，产品目录号：CP.440020)、2.96μL引物混合物、2μL模板稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数分别为103、102或101)，补水至20μL。引物混合物即引物组合中的各条引物组成的混合物。反应体系中，0.3mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1mM的环引物LF和LB各0.4μL。若引物组中缺少引物LF则用纯水代替。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
根据稀释液中基因组拷贝数的不同，共如下3个反应体系：
反应体系1：1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为103；
反应体系2：1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为102；
反应体系3：1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为101；
每个反应体系设置20次重复。
如果在45min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为典型的“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的猪圆环病毒2型基因组含量可以被检测出来。如果在45min内没有出现阳性扩增曲线，表明反应体系中的猪圆环病毒2型基因组含量不能被检测出来。
引物组PCV2-1检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为103(图22)和102(图23)时，20个检测均可检测出来且重复性好，拷贝数为101(图24)时20个检测不可完全出峰且重复性较差，因此引物组合的灵敏度为100个拷贝数/μL。
引物组PCV3-2检测靶标基因在1μL稀释液中基因组拷贝数为103(图25)和102(图26)时，20个检测均可检测出来且重复性好，拷贝数为101(图27)时20个检测不可完全出峰且重复性较差，因此引物组合的灵敏度为100个拷贝数/μL。
申请人按照上述实施例的方法，改变反应体系，在一些实施例中反应体系为0.29mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.3mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；0.9mM的环引物LF和LB各0.4μL。在另一些实施例中反应体系为0.31mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.5mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1.1mM的环引物LF和LB各0.4μL。若引物组中缺少引物LF则用纯水代替。结果显示，特异性和灵敏度与上述实施例结果相似。
综上所述，针对猪圆环病毒2型Rep基因筛选出最优的用于检测猪圆环病毒2型的引物组合如下(5’→3’)：
PCV2-F3：5’-attgttctgtagcattcttcc-3’(SEQ ID NO.1)
PCV2-B3：5’-tgacttttatggctggctg-3’(SEQ ID NO.2)
PCV2-FIP：5’-cgttggaatggtactcctcaactaagtaatcctccgatagagagct-3’(SEQ IDNO.3)
PCV2-BIP：5’-aacggggtctgattgctggtaatctgtgatcgatatccattgact-3’(SEQ IDNO.4)
PCV2-LB：5’-ggccaaaaaaggtacagttccacc-3’(SEQ ID NO.5)。
针对猪圆环病毒3型Cap基因筛选出最优的用于检测猪圆环病毒3型的引物组合如下(5’→3’)：
PCV3-F3：5’-gcggaaagttccactcgtaa-3’(SEQ ID NO.6)
PCV3-B3：5’-ccgggacataaatgctccaa-3’(SEQ ID NO.7)
PCV3-FIP：5’-ggtgagcgctggtagttcccaaaaacacagccgttacttcac-3’(SEQ IDNO.8)
PCV3-BIP：5’-tctttttctccagacccaccccagcagtgctccccattgaac-3’(SEQ IDNO.9)
PCV3-LB：5’-tggctcaacacatatgaccc-3’(SEQ ID NO.10)。
序列表
<110> 博奥生物集团有限公司
北京市动物疫病预防控制中心
<120> 一种能区分猪圆环病毒2型和3型的分型检测的LAMP的引物组合、检测方法及试剂盒
<130> MP1905395
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attgttctgt agcattcttc c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgacttttat ggctggctg 19
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgttggaatg gtactcctca actaagtaat cctccgatag agagct 46
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacggggtct gattgctggt aatctgtgat cgatatccat tgact 45
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggccaaaaaa ggtacagttc cacc 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcggaaagtt ccactcgtaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgggacata aatgctccaa 20
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtgagcgct ggtagttccc aaaaacacag ccgttacttc ac 42
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tctttttctc cagacccacc ccagcagtgc tccccattga ac 42
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggctcaaca catatgaccc 20

Claims (9)

1.一种能区分猪圆环病毒2型和3型的分型检测的LAMP的引物组合，包括引物组1和引物组2，所述引物组1包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的2个外引物、SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示的2个内引物、以及SEQ ID NO.5所示的1个环引物，所述引物组2包括SEQ IDNO.6和SEQ IDNO.7所示的2个外引物、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的2个内引物、以及SEQ ID NO.10所示的1个环引物。
2.一种能区分猪圆环病毒2型和3型的分型检测的LAMP的试剂盒，包括权利要求1所述的引物组合，其中所述引物组合中各引物均独立包装。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，还包括含有荧光染料的反应液和/或灭菌纯水。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，所述引物组合中的各引物组中的2个外引物的摩尔数相同，2个内引物的摩尔数相同，各引物组中的外引物:内引物:环引物的摩尔比为(0.58-0.62)：(4.6-5.0)：(0.9-1.1)。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，各引物组中的外引物:内引物:环引物的摩尔比为0.6：4.8：1。
6.一种能区分猪圆环病毒2型和3型的分型检测的LAMP的检测方法，使用权利要求1所述的引物组合进行LAMP扩增，通过观察实时荧光PCR仪“S”型扩增曲线开始出现的时间判断检测结果。
7.根据权利要求6所述的检测方法，所述LAMP扩增的反应体系为0.3mM的外引物各0.12μL、2.4mM的内引物各0.96μL、1mM的环引物0.4μL、2×含有荧光染料的反应液10μL、2μL的待测样品DNA，加灭菌纯水补至20μL。
8.根据权利要求6所述的检测方法，所述LAMP检测反应条件为：60℃-65℃恒温50min。
9.根据权利要求6所述的检测方法，所述LAMP检测反应条件为：65℃恒温50min。
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