CN112795704B

CN112795704B - 检测猪伪狂犬病病毒的raa引物对和探针组合及试剂盒

Info

Publication number: CN112795704B
Application number: CN202110255280.0A
Authority: CN
Inventors: 郭鑫; 涂飞; 张永宁; 杨汉春; 盖新娜; 周磊; 韩军
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2021-03-09
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2041-03-09
Also published as: CN112795704A

Abstract

本发明是关于动物疫病检测技术领域，具体涉及一种可快速检测猪伪狂犬病病毒的重组酶介导等温扩增方法，具体包括检测过程中使用的引物对和探针、试剂盒。本发明所述检测猪伪狂犬病病毒的RAA引物对和探针以及相应的试剂盒，可以实现对猪伪狂犬病病毒的快速检测，具有简单快速、反应灵敏、特异性好的特点，扩增所得产物可以通过便携式蓝光仪进行肉眼可视化的结果判断，可以真正实现便携式快速核酸检测。

Description

检测猪伪狂犬病病毒的RAA引物对和探针组合及试剂盒

技术领域

本发明是关于动物疫病检测技术领域，具体涉及一种可快速检测猪伪狂犬病病毒的重组酶介导等温扩增(Recombinase-aided amplification，RAA)方法，具体包括检测过程中使用的引物对和探针、试剂盒。

背景技术

猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的猪的急性传染病，该病在猪中呈暴发性流行，可引起妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎、公猪不育、育肥猪呼吸困难、生长停滞、新生仔猪大量死亡等症状，是严重危害世界养猪业的主要疫病之一。据报道，猪是本病原唯一的自然宿主和储存宿主，猪只不分大小和性别均对伪狂犬病病毒易感，而病猪和带毒猪是最主要的传染源，由感染猪排出的病毒又能通过多种途径感染其他动物，且猪伪狂犬病病毒感染的耐过猪都存在病毒的潜伏感染，并成为病毒携带者。目前，猪伪狂犬病对养猪业的危害极大，对于该病的防控，在一些欧美国家，通过使用标记疫苗和相应的鉴别诊断方法，很好地控制和根除了该病症，但在多数发展中国家，该病仍然频繁发生，给养猪业造成了巨大经济损失。

据研究，净化和根除猪伪狂犬病核心技术是基因缺失(标记)疫苗和鉴别诊断方法的研制与应用，并结合生物安全防控等措施。其中，gE基因是决定PRV毒力至关重要的基因之一，它在PRV感染细胞以及病毒的释放方面有重要作用，但它也是病毒复制的非必需基因。由于gE基因的缺失降低了PRV的毒力，因此在减毒PRV疫苗株中普遍缺失gE基因。目前，伪狂犬病疫苗毒株大多数是gE基因缺失的弱毒疫苗，因而可以通过检测gE基因实现对疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别诊断，为伪狂犬病的净化提供理论依据。因此，为了降低猪伪狂犬病给养猪业带来的巨大经济损失，更好的预防、控制和根除猪伪狂犬病，需要开发一种快速、简便、灵敏、低成本、可靠的诊断方法。

目前，针对PRV核酸、抗原和抗体的多种检测方法已被用于对该病的诊断与防控。这些方法通常包括从感染动物的组织样本中分离病毒，对组织切片进行免疫荧光分析，以及血清学分析等。其中，血清学检测主要包括病毒中和、乳胶凝集或酶联免疫吸附试验(ELISA)等；病原学诊断方法通常使用病毒分离、动物接种、聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)、液滴数字PCR、纳米颗粒辅助聚合酶链反应(NanoPCR)和环介导等温扩增(LAMP)等。虽然这些检测方法在猪伪狂犬病的诊断中都发挥了重要的作用，但常规诊断方法存在操作复杂、耗时，且需要经验丰富的技术人员、复杂和昂贵的仪器设备等缺点，不利于猪伪狂犬病的快速诊断，也不适合在资源有限的环境、基层和现场即时检测(point ofcare testing，POCT)。因此，建立一种简单快速、灵敏、特异的猪伪狂犬病病毒的检测方法，对该病的诊断、防控和根除具有重要意义。

重组酶介导的等温扩增反应(Recombinase Aided Amplification，RAA)是一种新型的等温体外核酸扩增技术，因其快速、且不需要昂贵的仪器，以及操作简单等特点，已被广泛用于对各种病原微生物的快速诊断。RAA技术主要依赖于三种蛋白：单链DNA结合蛋白(能和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解)、重组酶(能与引物形成复合物，促进引物与模板DNA的同源序列配对，启动DNA复制)和DNA聚合酶(用于扩增和延伸)。RAA反应在37-42℃条件下30min内即可得到与传统PCR反应相当的扩增产物，进一步结合exo探针技术和核酸外切酶III，还可以实现数据的实时读取，具有灵敏度高、特异性强、能实现现场快速检测等特点。另外，由于FAM是一种绿色荧光基团，其在蓝光下可以被激发出绿色荧光，因此可以结合便携式蓝光仪器对RAA扩增产物进行可视化的判断，适用于资源有限的环境、基层和现场即时检测，在核酸快速检测方面具有巨大的应用前景。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于重组酶介导等温扩增方法检测猪伪狂犬病病毒的RAA引物对和探针，以实现基于RAA方法能够简单、快速、灵敏、特异地检测出猪伪狂犬病病毒；

本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种基于重组酶介导等温扩增方法检测猪伪狂犬病病毒的试剂盒；

本发明所要解决的第三个技术问题在于提供一种基于重组酶介导等温扩增方法检测猪伪狂犬病病毒的方法。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种检测猪伪狂犬病病毒的RAA引物对和探针：

所述引物对包括用于鉴定猪伪狂犬病病毒gE基因的上游引物PRV-gE-F和下游引物PRV-gE-R，其中，所述上游引物PRV-gE-F和下游引物PRV-gE-R的序列如下：

上游引物PRV-gE-F：

5’-GCTGACCGCCTGCCCCTTCGACGCCTTCGGCGAG-3’；

下游引物PRV-gE-R：

5’-GCCGCGGTGGCGACGAGCGTGTAGTCCCAGGTG-3’；

所述探针PRV-gE-Probe的序列如下：

5’-GCACACGAACGCCACCGCGGACGAGTCGGGGCTGTACGTGCTCGTGATGAC-3’。

优选的，所述探针PRV-gE-Probe自5’端起第33位碱基T标记FAM发光基团，第34位碱基G被四氢呋喃THF代替，第35位碱基T标记BHQ1淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰；所述探针PRV-gE-Probe的序列如下：

5’-GCACACGAACGCCACCGCGGACGAGTCGGGGC(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)ACGTGCTCGTGATGAC[C3-spacer]-3’。

本发明还公开了一种检测猪伪狂犬病病毒的RAA试剂盒，所述试剂盒包括所述的RAA引物对和探针。

具体的，所述试剂盒还包含适宜于重组酶介导等温扩增反应的试剂体系，以及荧光基础反应单元。

具体的，所述试剂体系包括反应缓冲液、去核酸酶水、醋酸镁。

具体的，所述荧光基础反应单元包含单链DNA结合蛋白、重组酶和聚合酶，所述荧光基础反应单元以冻干粉的形式存在。

具体的，所述的检测猪伪狂犬病病毒的RAA试剂盒，所述试剂盒(25mL体系)包括：

本发明还公开了一种所述的检测猪伪狂犬病病毒的RAA试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)以常规方法提取待测样品DNA；

(2)以提取的DNA为模板，进行RAA扩增，控制42℃下恒温扩增30min；

(3)结果判定。

以上所述RAA检测方法反应条件为在42℃下恒温扩增30min。以提取的DNA为模板，加入试剂盒中检测猪伪狂犬病病毒的RAA引物和探针以及包含重组酶介导等温扩增的试剂组成RAA反应体系进行RAA扩增。

具体的，所述步骤(3)中，所述结果判定步骤是通过荧光定量检测仪或蓝光检测仪进行判断的；

质控标准为：阴性对照无扩增曲线或可视化结果为无色，且阳性对照出现扩增曲线或可视化结果为绿色，则实验数据有效，否则实验结果为无效，需要重新检测；

结果描述及判定：待检测样品无扩增曲线或可视化结果为无色，样品判为阴性；出现扩增曲线或可视化结果为绿色，样品判为阳性。

本发明还公开了所述检测猪伪狂犬病病毒的RAA引物对和探针或所述的检测猪伪狂犬病病毒的RAA试剂盒在猪伪狂犬病病毒检测领域的应用。

本发明所述检测猪伪狂犬病病毒的RAA引物对和探针，针对于猪伪狂犬病病毒的RAA检测，筛选出适宜于RAA快速检测的上游引物PRV-gE-F、下游引物PRV-gE-R和探针PRV-gE-Probe。所述引物对和探针可以实现对猪伪狂犬病病毒的快速检测，具有简单快速、反应灵敏、特异性优的特点。

本发明所述检测猪伪狂犬病病毒的RAA试剂盒，基于所述RAA引物对和探针进行猪伪狂犬病病毒的扩增，只需在37-42℃恒温条件下反应30min即可完成，且整个反应过程对仪器设备要求低，耗时短，操作简单，扩增所得产物可以通过便携式蓝光仪进行肉眼可视化的结果判断，适用于基层现场诊断和即时检测(point of care testing，POCT)等方面，可以真正实现便携式快速核酸检测，可为猪伪狂犬病的诊断、防控和区域净化提供技术支持。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为本发明引物和探针的特异性检测结果图；其中，图1中A是RAA扩增结果，图1中B是RAA可视化的结果；其中1：猪圆环病毒2型，2：猪瘟病毒，3：猪流行性腹泻病毒，4：猪德尔塔冠状病毒，5：猪繁殖与呼吸综合征病毒，6：猪A型塞内卡病毒，7：猪伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗株Bartha-K61，8：阴性对照，9：猪伪狂犬病毒野毒株HB1201；

图2为本发明引物和探针的灵敏性检测结果图；其中，图2中A是RAA扩增结果，图2中B是qPCR扩增结果，图2中C是RAA可视化的结果；其中，1：10⁴TCID₅₀DNA PRV，2：10³TCID₅₀DNA PRV，3：10²TCID₅₀DNA PRV，4：10¹TCID₅₀DNA PRV，5：10⁰TCID₅₀DNA PRV，6：10^- ¹TCID₅₀DNA PRV，7：阴性对照。

具体实施方式

本发明下述实施例中，所涉及到的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明下述实施例中，所述RAA冻干酶粉包含单链DNA结合蛋白、重组酶和聚合酶的冻干粉，购自潍坊安普未来生物科技有限公司。

实施例1猪伪狂犬病病毒RAA检测引物及探针的设计

通过NCBI查找到来自世界各国的272条公开的猪伪狂犬病病毒的gE基因序列，利用DNA Star软件对这272株PRV的gE基因进行比对分析,根据gE基因的保守区域用VectorNTI软件设计RAA的引物和探针。

RAA引物的设计遵循以下基本原则：引物长度应大于等于30bp，最好在30-35bp之间；扩增子长度不超过500bp，最好长度为100-200bp之间；GC含量大于30％，小于70％，最好在40％到60％之间；最好避免引物中存在许多重复的短序列；避免引物直接形成发夹结构，或引物二聚体的形成等等。为保证RAA扩增的灵敏性，需要对大量引物进行筛选，从而能获得更高灵敏性的引物组合。

最终筛选出了较好的引物和探针序列如下表1所示：

表1引物和探针序列

^a参考PRV HB1201毒株(GenBank:KU057086.1)的gE基因的位置。

综上，筛选的引物和探针具体序列如下：

上游引物PRV-gE-F：

5’-GCTGACCGCCTGCCCCTTCGACGCCTTCGGCGAG-3’；

下游引物PRV-gE-R：

5’-GCCGCGGTGGCGACGAGCGTGTAGTCCCAGGTG-3’；

探针PRV-gE-Probe：

5’-GCACACGAACGCCACCGCGGACGAGTCGGGGC(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)ACGTGCTCGTGATGAC[C3-spacer]-3’；

其中，所述探针PRV-gE-Probe自5’端起第33位碱基T标记FAM发光基团，第34位碱基G被四氢呋喃THF代替，第35位碱基T标记BHQ1淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰。

实施例2猪伪狂犬病病毒RAA反应体系的建立

配制RAA反应体系

控制所述RAA反应体系的总量为25μL，具体包括：

在RAA冻干酶粉中加入14.7μL的反应缓冲液A Buffer(如20％PEG缓冲液)、10pmol/μL PRV-gE-F和PRV-gE-R各1μL、10pmol/μL PRV-gE-Probe 0.6μL、去核酸酶水4.45μL、DNA模板2μL，在反应管盖上加1.25μL醋酸镁B Buffer，上下颠倒反应管使之充分混匀后瞬离，恒温42℃反应30min。

其中，阴性对照中的模板加入的是去核酸酶水，阳性对照中的模板为已知PRV毒株HB1201(GenBank accession no.KU057086.1)的DNA模板。

RAA反应体系扩增

将检测反应条件设置为：在42℃下恒温扩增30min。

在本实施例中，所述结果判定是通过蓝光检测仪器进行结果的可视化判断的，可视化结果是使用天根生化科技有限公司的便携式TGreen Monitor蓝光电泳监测仪(OSE-470M)在暗室中直接进行肉眼判断。

质控标准：阴性对照无扩增曲线或可视化结果为无色，且阳性对照出现扩增曲线或可视化结果为绿色，则实验数据有效，否则实验结果为无效，需要重新检测。

实施例3猪伪狂犬病病毒RAA特异性检测

为了考察本发明方法的特异性，本实施例分别用猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪A型塞内卡病毒、猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗毒株和猪伪狂犬病病毒野毒株作为反应模板，并设置阴性对照，按照前述实施例2中加样方法进行RAA核酸扩增。

检测反应条件为：42℃恒温扩增30min，检测结果见附图1所示。

通过图1中A-B中的结果显示，除了猪伪狂犬病病毒野毒株DNA模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线和可视化的绿色荧光结果，其他病毒及阴性对照组均未出现扩增曲线且可视化结果为无色。结果表明，本发明所使用的引物和探针可以实现对猪伪狂犬病病毒野毒株的特异性检测，不与其他相关病毒发生交叉反应。特异性良好。

实施例4引物探针的灵敏度检测

为了检测本发明方法的灵敏度，分别设置不同浓度的猪伪狂犬病病毒DNA模板，按照前述实施例2加样方法进行RAA核酸扩增。

参照DNA提取试剂说明书，用原始毒价为10^8.5TCID₅₀/mL猪伪狂犬病病毒的细胞毒，提取其DNA，调整浓度到10⁴TCID₅₀/2μL,然后10倍分别稀释到10³TCID₅₀/2μL，10²TCID₅₀/2μL，10¹TCID₅₀/2μL，10⁰TCID₅₀/2μL，10^-1TCID₅₀/2μL，分别取2μL作为反应模板，并设置阴性对照，按照前述加样方法进行RAA核酸扩增。同时用已发表文献(Wernike et al.,2014)中的qPCR方法进行对比，检测结果见附图2所示。

通过图2中A-C中的结果显示，本发明设计的RAA引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性，其RAA检测灵敏度可达到1TCID₅₀PRV DNA/反应，与qPCR检测方法灵敏度相当，可视化的灵敏度也能达到10TCID₅₀PRV DNA/反应。

实施例5对实际样品的检测应用

取临床组织病料样品共206份，按照DNA提取试剂说明书分别提取待检的206份临床样品，提取的DNA放在-20℃保存。

按照前述实施例2中加样方法进行RAA核酸扩增，同时用已发表文献(Haines etal.,2013)中的qPCR方法同时检测此临床样品进行对比，检测结果见下表2所示。

结果显示，参与检测的206份临床样品RAA检出阳性25份(12.14％)，qPCR检出阳性28份(13.59％)，可视化RAA检出阳性20份(9.71％)。RAA与qPCR的Kappa值为0.892，P＜0.001，可视化RAA与qPCR的Kappa值为0.765，P＜0.001。

表2临床样品检测结果

可见，本发明中的方法可以实现对猪伪狂犬病病毒进行简单快速、灵敏、可视化的检测。该方法耗时短，操作简单，适合在资源有限的环境、基层和现场即时检测，可以真正实现便携式的快速核酸检测，为猪伪狂犬病的诊断、防控和区域净化提供技术支持。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims

1.一种检测猪伪狂犬病病毒的RAA引物对和探针组合，其特征在于：

上游引物PRV-gE-F：

5’-GCTGACCGCCTGCCCCTTCGACGCCTTCGGCGAG-3’；

下游引物PRV-gE-R：

5’-GCCGCGGTGGCGACGAGCGTGTAGTCCCAGGTG-3’；

所述探针PRV-gE-Probe的序列如下：5’-GCACACGAACGCCACCGCGGACGAGTCGGGGCTGTACGTGCTCGTGATGAC-3’；

所述探针PRV-gE-Probe为exo探针，所述探针PRV-gE-Probe自5’端起第33位碱基T标记FAM发光基团，第34位碱基G被四氢呋喃THF代替，第35位碱基T标记BHQ1淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰，

标记后的所述探针PRV-gE-Probe的序列如下：

其中，所述上游引物PRV-gE-F的序列参考PRV HB1201毒株的gE基因的第984-1017位，所述下游引物PRV-gE-R的序列参考PRV HB1201毒株的gE基因的第1092-1124位，所述探针PRV-gE-Probe的序列PRV HB1201毒株的gE基因的第1023-1073位。

2.一种检测猪伪狂犬病病毒的RAA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的RAA引物对和探针组合。

3.根据权利要求2所述的检测猪伪狂犬病病毒的RAA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含适宜于重组酶介导等温扩增反应的试剂体系，以及荧光基础反应单元。

4.根据权利要求3所述的检测猪伪狂犬病病毒的RAA试剂盒，其特征在于，所述试剂体系包括反应缓冲液、去核酸酶水和醋酸镁。

5.根据权利要求3或4所述的检测猪伪狂犬病病毒的RAA试剂盒，其特征在于，所述荧光基础反应单元包含单链DNA结合蛋白、重组酶和聚合酶。

6.根据权利要求2-4任一项所述的检测猪伪狂犬病病毒的RAA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

反应缓冲液A Buffer 14.7μL；

10pmol/μL PRV-gE-F 1μL；

10pmol/μL PRV-gE-R 1μL；

10pmol/μL PRV-gE-Probe 0.6μL；

去核酸酶水 4.45μL；

DNA模板 2μL；

醋酸镁B Buffer 1.25μL。